Modulul 5 – Biochimie

Curs 13. Determinarea grupelor sangvine şi a Rh-ului

Termenul de grupă sanguină (sau grup sanguin) este folosit atat pentru a caracteriza sângele unui individ în
funcție de prezența sau absența unui antigen pe suprafața eritrocitelor acestuia. Majoritatea antigenelor de grup
sanguin sunt de natură glicoproteică, oarecum stabile din punct de vedere genetic, unele fiind întâlnite la mai
multe specii de mamifere în forme identice. Această trăsătură a lor poate fi invocată drept argument în favoarea
unității lumii vii.
Deși aceste antigene sunt prezente și pe leucocite (nu și pe trombocite), în mod curent se consideră că doar
eritrocitele prezintă importanță pentru stabilirea grupelor sanguine.
Datorită faptului că reacția antigen-anticorp la care participă antigenele de grup sanguin și anticorpii lor
specifici este una de aglutinare (se soldează cu aglutinarea hematiilor) antigenele se mai numesc
și aglutinogene, iar anticorpii și aglutinine.
În practica medicală curentă prezintă importanță sistemele AB0 și Rh. Restul sistemelor de antigene sunt
utilizate în medicina legală, aplicațile lor cele mai importante fiind în stabilirea paternității și în diferite anchete
de filiație, însă în prezent aceste proceduri tind să fie înlocuite de către analiza ADN.
Importanța grupelor sanguine rezidă în indicarea compatibilității sau incompatibilității dintre donator și primitor
în cazul transfuziilor. Teoretic, compatibilitatea reprezintă situația în care întâlnirea antigenului de pe hematii cu
anticorpi specifici este exclusă.
Sistemul AB0
Sistemul AB0 se bazează pe existența a două aglutinogene, notate A și B, și a două aglutinine specifice: α (anti
A) și respectiv β (anti B). Landsteiner a observat o regulă a excluziunii reciproce, concretizată în faptul că
indivizii care prezintă pe eritrocite un aglutinogen nu au niciodată în plasmă aglutinina omoloagă. Un individ
poate dispune de unul, ambele sau de nici unul din aglutinogene. Întotdeauna există aglutinine corespunzătoare
aglutinogenului care lipsește, iar când sunt prezente atât A cât și B, nu vor exista aglutinine. Astfel, există 4
grupe principale în sistemul AB0:
Grupa Grupa Aglutinogen Aglutinine
(Landsteiner) (Janský) (antigen) (anticorpi)
0 I nu are α și β
A II A β
B III B α
AB IV A și B nu are

Recomandări pentru determinarea grupului sanguin ABO

 înaintea unei transfuzii;
 înaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potenţial asociate cu complicaţii hemoragice care ar
putea necesita transfuzii;
 monitorizarea imunohematologică antepartum şi postnatală a mamei şi copilului;
 la donatorii de sânge;
 pentru compatibilitatea de grup AB0 în transplantul de rinichi şi inimă.
Pregătire pacient – nu este necesară o pregătire prealabilă; sunt utile informaţii asupra unor
tratamente perfuzabile cu soluţii macromoleculare efectuate premergător determinării, transfuzii în
ultimele 120 zile, boli infecţioase cu germeni Gram negativi cu/fără septicemie, boli maligne
(carcinom, limfom, mielom).
Specimen recoltat – a) sânge capilar din pulpa degetului; b) sânge venos.
Recipient de recoltare – b) vacutainer fără aditivi sau gel activator (capac roşu sau incolor); pentru
metoda automată: vacutainer de 4 mL ce conţine EDTA (capac mov închis).
Cantitate recoltată – b) cât permite vacuumul.
Cauze de respingere a probei – specimen puternic hemolizat.
1
 Modulul 5 – Biochimie

Stabilitate probă – testul se efectuează imediat, dacă acest lucru nu este posibil, proba se
păstrează 48 ore la 2-8°C; pentru metoda automată proba de sânge are o stabilitate de 7 zile la 2-
8°C.
Prelucrare necesară după recoltare – după coagularea completă la temperatura camerei se
îndepărtează serul şi cheagul. Din hematiile rămase se prepară o suspensie 10% în plasma proprie
sau în ser fiziologic. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepară o suspensie de 5% hematii în
mediu special de suspensie. Pentru metoda automată proba de sânge va fi centrifugată în vederea
obţinerii plasmei şi va fi introdusă în analizor (plasma va rămâne deasupra hematiilor).
Metode de determinare:
a. metoda directă/globulară (Beth-Vincent) de determinare a grupului sanguin AB0 utilizând seruri
anti-A, anti-B şi anti-AB, cu următoarele variante:
– hemaglutinare pe placă. Se utilizează doi martori: martor AB (hematiile pacientului cu ser AB) şi
martor auto (hematiile şi serul propriu).
– aglutinare şi gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce conţin un gel impregnat cu reactivul specific
antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) – test direct de grupaj
ABO şi de determinare a Ag RH1( D) şi a Ag RH 1,2,3 ( DCE).
Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reacţie pozitivă se validează numai dacă microtubul de
control este negativ. Reactia pozitivă se apreciază în funcţie de mărimea aglutinatelor de la + la
++++.
La fiecare rulare a probelor se utilizează un sânge de control de grup şi Rh cunoscute.
b. metoda automată de hemaglutinare pe plăci cu godeuri (în Laboratorul Central Synevo)
Plăcile de lucru (Erytype S) conţin 12 stripuri test cu câte 8 godeuri fiecare (1 strip = testare completă
AB0 şi factor Rh ).
Grupul sanguin se va determina atât prin metoda directă, globulară (Beth – Vincent) ce pune în
evidenţă antigenele eritrocitare cu ajutorul serurilor test (seruri monoclonale uscate, ce căptuşesc o
parte din godeurile de reacţie), cât şi prin metoda indirectă, plasmatică (Simonin), ce evidenţiază
anticorpii din plasma analizată cu ajutorul eritrocitelor test, aglutinarea având loc în godeurile
necăptuşite ale stripului de lucru. Un godeu de pe strip include controlul negativ al reacţiei.
Reacţia de aglutinare a hematiilor în metoda directă este potenţată de utilizarea bromelinei (enzimă
proteolitică ce clivează lanţurile polipeptidice de la suprafaţa hematiilor, reducând astfel sarcina
negativă a celulelor; prin urmare va creşte forţa de atracţie între hematii în prezenţa anticorpului
corespunzător).
În etapa finală, fiecare godeu al stripului de lucru este evaluat şi fotografiat automat de către analizor,
rezultatele fiind interpretate astfel:
 Reacţie pozitivă – prezenţa aglutinării ( intensitatea este apreciată de la 1+ – 4+ )
 Reacţie negativă – absenţa aglutinării
 Reacţie neconcludentă – reacţia +/- se va interpreta de către medic
Toate imaginile şi rezultatele obţinute sunt verificate şi validate de către medic3.
Limite şi interferenţe
Rezultatul determinării grupului de sânge trebuie citit de două persoane şi trebuie eventual confirmat
pe o a doua probă de sânge.
Erori de citire datorate greşelilor de tehnică:
– sticlărie murdară; contaminare bacteriană;
– prezenţa de microcheaguri (falsă aglutinare);
– nu se respectă: proporţiile hematii/ser, ordinea de picurare a serurilor hemotest (aglutinări
contradictorii), timpul de citire – citire tardivă: margini uscate (falsă aglutinare), citire precoce (lipsa
aglutinării sau aglutinare slabă).
Erori datorate hematiilor
False aglutinări

2
 Modulul 5 – Biochimie

a) Prezenţa rulourilor (pseudoaglutinarea): utilizarea de soluţii macromoleculare (Dextran, HES),

tulburări de coagulare, probe de sânge incomplet coagulate, hiperfibrinogenemia, produşi de
degradare a fibrinei, agenţi fibrinolitici, disproteinemia, paraproteinemia, crioglobulinemia, creşterea
reactanţilor de fază acută, medicamente (doze mari de heparină, sulfat de protamină), factori
reumatoizi, creşterea colesterolului, bilirubinei, leucocitoza, enzime leucocitare. Martorul AB este
pozitiv; spălarea hematiilor permite efectuarea corectă a probei globulare.
b) Autoaglutinarea
 Prezenţa de aglutinine la rece (martorul auto este pozitiv). Proba de sânge şi reactivii se
preincubează la 37ºC, iar testarea se efectuează la cald.
 Hematii acoperite de aloanticorpi: nou-născut din sarcină incompatibilă (în sistemul Rh, AB0), pacient
transfuzat cu sânge incompatibil.
 Determinarea grupului sanguin pe sânge recoltat din cordonul ombilical: gelatina Wharton, substanţă
macromoleculară care înconjoară eritrocitele, dă aspect de pseudoaglutinate. Pentru îndepărtarea ei
este necesară spălarea hematiilor de cel puţin 6 ori înaintea determinării.
 Prezenţa complexelor imune medicamentoase.
c) Poliaglutinarea
 În septicemiile cu bacilli Gram negativi sunt expuse criptoantigene (T), prin acţiunea enzimatică a
agenţilor bacterieni, recunoscute de anticorpi (anti-T) prezenţi în majoritatea serurilor umane. Martorul
AB este pozitiv.
Aglutinări absente sau slabe sau aspect de dublă populaţie: aglutinarea nu este totală, cu prezenţa de
hematii libere (aglutinatele apar pe un fond roz):
 sânge vechi;
 antigene slabe: nou-născuţi, prematuri;
 subgrupe A sau B slabe;
 atenuarea antigelor (în leucemii, limfoame, boală Hodgkin);
 pacient cu grup A sau B transfuzat cu sânge grup 0, hemoragie materno-fetală;
 prezenţa în cantitate mare de substanţă A sau B în plasmă (cancer de stomac, pancreas) care
neutralizează anticorpii test (hematiile trebuie spălate pentru îndepărtarea acestora);
 prezenţa unei chimere sau mozaic (excepţional, ex.: post-alotransplant medular).

Determinare RH
Prelucrare necesară după recoltare – după coagularea completă la temperatura camerei se
îndepărtează serul şi cheagul. Din hematiile rămase se prepară o suspensie 40% în plasma proprie
sau în ser fiziologic. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepară o suspensie de 5% hematii în
mediu special de suspensie. Pentru metoda automată proba de sânge va fi centrifugată în vederea
obţinerii plasmei şi va fi introdusă în analizor (plasma va rămâne deasupra hematiilor).
Metodă de determinare:
– hemaglutinare pe placă cu reactiv anti-D IgM monoclonal. Determinarea se efectuează cu două
tipuri diferite de anticorpi monoclonali, iar testarea include martorul autolog (martor albuminos – se
testează eritrocitele pacientului cu mediul în care sunt conţinuţi Ac monoclonali), precum şi hematii
martor de grup 0, Rh pozitiv şi Rh negativ.
– aglutinare şi gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce conţin un gel impregnat cu reactivul specific
antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) – test direct de grupaj
AB0 şi de determinare a Ag RH1( D) şi a Ag RH 1,2,3 ( DCE).
La fiecare rulare a probelor se utilizează un sânge de control de grup şi Rh cunoscute.
– metoda automată de hemaglutinare pe plăci cu godeuri (în Laboratorul Central Synevo)
Plăcile de lucru (Erytype S) conţin 12 stripuri test cu câte 8 godeuri fiecare (1 strip = testare completă
ABO şi factor Rh ). Pentru determinarea Rh se utilizează 2 seruri anti-D IgM monoclonale uscate ce
căptuşesc două din godeurile stripului.
Interpretarea rezultatelor
Pentru metoda de hemaglutinare pe placă
Primitori de sânge şi nou-născuţi:
 Rh(D) pozitiv dacă se obţin rezultate clar pozitive (>=2+) cu ambele seruri test anti-D, iar controlul
auto este negativ;

3
 Modulul 5 – Biochimie

 Rh(D) negativ dacă se obţin rezultate clar negative cu ambele seruri test anti-D, indiferent de
rezultatul controlului auto.
Este obligatorie testarea suplimentară dacă se obţin rezultate slab pozitive (<=2+) sau discordante cu
serurile test, iar controlul auto este negativ, precum şi dacă se obţin rezultate pozitive cu ambele
seruri test, iar controlul auto este pozitiv.
La donatori, dacă testul iniţial pentru D este negativ, trebuie efectuat un al doilea test care detectează
D slab (acest lucru nu este necesar la primitorii de sânge, care trebuie transfuzaţi cu sânge Rh
negativ). De asemenea determinarea prezenţei D slab la femeia gravidă elimină tratamentul inutil cu
imunoglobulină anti-D. Înaintea etichetării unui pacient ca D slab trebuie să ne asigurăm că nu a fost
recent transfuzat cu eritrocite Rh pozitive.
Pentru metoda pe carduri
Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reacţie pozitivă se validează numai dacă microtubul de
control este negativ. Reacţia pozitivă se apreciază în funcţie de dispersia aglutinatelor în microtub de
la + la ++++, astfel : – rezultat pozitiv ( ++++) ; – rezultat slab pozitiv ( + până la +++ ) ; – rezultat
negativ ( – ).
Interpretarea rezultatului în microtubul RH1 (D)
Un rezultat pozitiv în microtubul RH1(D) indică prezenţa antigenului RH1(D) pe suprafaţa hematiilor
investigate. Cardurile AB0/RH folosite în laborator nu permit detecţia tuturor antigenelor D slab
imunogene şi nici fenotipul RH1 parţial categoria VI(DVI)
Pentru aceste antigene particulare trebuie să se execute teste suplimentare.
Interpretarea rezultatului în microtubul RH1,2,3 (DCE)
Un rezultat pozitiv în tubul RH1,2,3(DCE) indică prezenţa antigenului RH1 (D) şi/sau RH2 (C) şi/sau
RH3 (E) la suprafaţa hematiilor de testat.
Pentru metoda automată
După ce a avut loc reacţia de aglutinare fiecare godeu al stripului de lucru este evaluat şi fotografiat
automat de către analizor, rezultatele fiind interpretate astfel:
 Reacţie pozitivă – prezenţa aglutinării (intensitatea este apreciată de la 1+ – 4+)
 Reacţie negativă – absenţa aglutinarii
 Reacţie neconcludentă – reacţia +/- se va interpreta de către medic
Toate imaginile şi rezultatele obţinute sunt verificate şi validate de către medic.
Limite şi interferenţe
Reacţii fals pozitive (martor albuminos pozitiv)
 hematii în fişicuri/rulouri (mielom, macroglobulinemie Waldenström) – se reface determinarea după
spălarea hematiilor;
 poliaglutinarea;
 anemii hemolitice cu autoanticorpi la cald (prezenţa de anticorpi IgG pe suprafaţa hematiilor) – se
reface grupajul cu un reactiv din care se elimină albumina, care conţine Ac anti-D aglutinanţi capabili
să aglutineze hematiile în suspensie salină (anti-D salin).
Reacţii fals negative
 anemia hemolitică a nou-născutului (blocarea situsurilor antigenice D de către anticorpii materni);
 individ cu Rh D slab – posibilă aglutinare slabă şi tardivă; aceste cazuri se îndrumă către un serviciu
de specialitate, unde determinarea D slab se face cu ajutorul testului antiglobulinic indirect cu anti-D
IgG (incompleţi policlonali).

Bibliografie
1. Curs de imuno-hematologie, Institutul de Hematologie, Bucureşti, 1993.