CENTRUL DE TRANSFUZIE SANGUINA BUCURESTI

SUPORT DE CURS

LECTOR : Biolog Principal Alexandra Zagrean

Sef Lab Imunohematologie CTSMB

Tel : 0745 047 062

 MODUL DE CURS IMUNOHEMATOLOGIE
- ASISTENTI MEDICALI –

SCOP :
 acumularea unor informatii teoretice necesare elucidarii cazurilor cu
care se confrunta
 insusirea tehnicilor de determinare a grupajului AB
 insusirea tehnicilor de determinare a Rh-ului
 insusirea tehnicilor de compatibilizare

OBIECTIVE :
La finalul cursului participantii vor trebui sa fie capabili sa :

- poata identifica si inregistra corect o proba

- poata pregati materialele necesare
- poata prepara eritrocitele test de lucru
- poata determina corect un grup ABO
- poata diferentia variantele slabe A1 / A2 si A1B / A2B
- poata identifica o dificultate de grupaj
- poata determina corect un Rh
- poata determina un fenotip extins Rh-Kell
- poata identifica un Rh slab
- poata efectua corect o proba de compatibilitate
- poata face corect o substitutie de masa eritrocitara sau plasma
- poata utiliza corect un “O periculos “

Biolog Pr. Alexandra Zagrean

 Sistemul de grupaj ABO
Termenul de grupă sanguină (sau grup sanguin) este folosit pentru a caracteriza
sângele unui individ în funcție de prezența sau absența unui antigen pe suprafața
eritrocitelor acestuia. Majoritatea antigenelor de grup sanguin sunt de natură
glicoproteică, oarecum stabile din punct de vedere genetic, unele fiind întâlnite la mai
multe specii de mamifere în forme identice. Această trăsătură a lor poate fi invocată drept
argument în favoarea unității lumii vii.

Deși aceste antigene sunt prezente și pe leucocite (nu și pe trombocite), în mod curent se
consideră că doar eritrocitele prezintă importanță pentru stabilirea grupelor sanguine.

Datorită faptului că reacția antigen-anticorp la care participă antigenele de grup sanguin

și anticorpii lor specifici este una de aglutinare (se soldează cu aglutinarea hematiilor)
antigenele se mai numesc și aglutinogene, iar anticorpii și aglutinine.

În practica medicală curentă prezintă importanță sistemele AB0 și Rh. Restul sistemelor
de antigene sunt utilizate în medicina legală, aplicațile lor cele mai importante fiind în
stabilirea paternității și în diferite anchete de filiație, însă în prezent aceste proceduri tind
să fie înlocuite de către analiza ADN..

Alte sisteme

Există numeroase alte sisteme antigenice pe elementele figurate ale sângelui. Singurele
lipsite de antigene membranare specifice sunt plachetele.

Numărul fenotipurilor posibile, luând în calcul toate aceste sisteme, este de ordinul
miliardelor. De altfel, celulele care ajung în organism cu ocazia unei transfuzii, sunt până
la urmă distruse de sistemul imunitar în cel mult 7-10 zile, fiind practic imposibilă
obținerea unei identități complete între fenotipuile donatorului și ale primitorului

Principalele sisteme sint : Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran.

Este importanta cunoasterea acestor sisteme deoarece multe dintre ele sint imunogene si
la transfuzarea cu eritrocite incompatibile pacientul poate dezvolta anticorpi indreptati
impotriva antigenelor respective.

Depistarea prezentei acestor anticorpi se va face prin DAI si Testul Coombs ( direct si
indirect ) .Dupa depistare este necesara si identificarea prin IAI a acrestor anticorpi pe
teste enzimatice si Coombs .

Biolog Pr. Alexandra Zagrean

 Sistemul AB0
Sistemul AB0 se bazează pe existența a două aglutinogene, notate A și B, și a două
aglutinine specifice: α (anti A) și respectiv β (anti B). Landsteiner a observat o regulă a
excluziunii reciproce, concretizată în faptul că indivizii care prezintă pe eritrocite un
aglutinogen nu au niciodată în plasmă aglutinina omoloagă. Un individ poate dispune de
unul, ambele sau de nici unul din aglutinogene. Întotdeauna există aglutinine
corespunzătoare aglutinogenului care lipsește, iar când sunt prezente atât A cât și B, nu
vor exista aglutinine. Astfel, există 4 grupe principale în sistemul AB0:

Grupa Grupa Aglutinogen Aglutinine

(Landsteiner) (Janský) (antigen) (anticorpi)

0 (zero) I nu are α și β

A II A β

B III B α

AB IV A și B nu are

In prezent s-a renuntat la denumirea cu cifre romane datorita descoperirii subgrupelor.

Aglutinogenele sistemului AB0

Primele eritroblaste care prezintă pe membrană aceste antigene apar în luna a III-a de
viață intrauterină. Antigenele A și B au o structură de bază comună, ele formându-se
astfel: Un substrat mucopolizaharidic de bază este modificat, sub acțiunea unei gene H,
prin adăugarea unei molecule de L-Fucoză, rezultând substanța H, sau antigenul H,
comun pentru A și B. Este important de menționat faptul că substratul mucopolizaharidic
are structură comună cu cea a unui antigen specific pneumococului. De fapt gena H
codifică o glicoziltransferază, neapărat necesară pentru a sinteza atât A cât și B.

Aglutinogenele sau antigenele de grup mai sint denumite si Anti A = α si AntiB = β

 Biolog Pr. Alexandra Zagrean

CARACTERISTICI GRUP SANGUIN ABO

# Sistemul AB0 se bazează pe existența a două aglutinogene, notate A și B, și a două

aglutinine specifice: α (anti A) și respectiv β (anti B).
grup O (α, β ) grup A (β ) grup B (α ) grup AB ( 0 )

# Nu pot coexista antigenul si anticorpul corespunzator in singele circulant

# Trei alele sunt implicate în determinismul genetic al sistemului AB0: IA (sau A), IB (sau
B) și i. Relațiile funcționale dintre ele sunt următoarele:

 IA și IB sunt codominante, adică atunci când există amândouă caracterul rezultat

este intermediar, deoarece ambele gene funcționează în paralel.
 IA și IB sunt dominante față de i, adică atunci când i există în genotip alături de IA
sau IB va apărea caracterul corespunzător lui IA sau respectiv lui IB

Alela i mai este notată și I0 sau 0. Ea este nefuncțională, adică nu codifică sinteza
niciunei glicoziltransferaze. Genotipul ii corespunde grupei 0 și se caracterizează prin
prezența pe hematii a antigenului H, nemodificat. Locusul alelelor menționate este situat
pe cromozomul 9, brațul lung, banda 3, subbanda 4 (9q34).

Grupa (fenotipul) Genotipuri posibile

0 ii

A IAIA sau IAi

B IBIB sau IBi

AB IAIB
Biolog Pr. Alexandra Zagrean

Subgrupe AB0

S-a constatat o lipsă de omogenitate mai ales la grupa A în pivința afinității pentru
aglutininele specifice α. S-au descris astfel mai multe subgrupe A: A1, A2, A3, A5,... Am,
Aq, Ad, Ax. Subgrupa A1 este grupa A clasică.

Existența acestor subgrupe se datorează unor alele diferite IA. Cu cât indicele subgrupei
este mai mare, cu atât capacitatea de sinteză a antigenului A este mai mică, rămânând și o
cantitate de antigen H neconvertit în A. Rezultă deci fenotipuri intermediare între A și 0,
cu hematii de grupă A ce prezintă și antigen H, specific grupei 0. Subgrupele cele mai
frecvente sunt A2 și A3.

Foarte importante sint subgrupele A2 si A2B variante slabe ale grupelor A si respectiv
AB .Desi slab reprezentate in populatia din Romania ele pot pune probleme
transfuzionale

Diferentierea A1 / A2 se poate face datorita serurilor hemotest de inalta specificitate

AntiA1 si Anti H
Biolog Pr. Alexandra Zagrean

Sistemul Rh
Sistemul Rh clasifică sângele uman după prezența sau absența unor proteine specifice pe
suprafața hematiilor. Determinarea statutului Rh ține cont de cea mai frecventă dintre
acestea: factorul D, sau antigenul D.

Indivizii ale căror hematii prezintă antigen D pe membrană sunt considerați Rh+
(pozitiv), ceilalți Rh- (negativ). Spre deosebire de sistemul AB0, în sistemul Rh absența
antigenului nu presupune existența anticorpilor specifici; indivizii Rh- nu au în mod
normal în ser anticorpi anti D.

Statutul Rh se asociază obligatoriu grupei din sistemul AB0, astfel că "grupa sanguină"
este exprimată prin adăugarea semnului + sau - la grupa AB0; de exemplu: A+, B+, 0+,
0- etc. Aceste informații reprezintă minimul necesar în practica medicală pentru
realizarea unei transfuzii.

Fenotip extins Rh /Kell

Statistic fenotipul pt Rh negativ este ddccee dar exista si variante cu C si E care
trebuesc evitate in transfuzarea unui Rh negativ clasic .

Variantele fenotipice cele mai intilnite sint :

dd cc ee kk 87,62 %

dd Cc ee kk 6,44 %

dd cc Ee kk 1,11 %

dd cc ee KK 4,23 %

dd Cc ee KK 0,50 %

dd CcEe kk 0,10 %
 Biolog Pr. Alexandra Zagrean

CARACTERISTICI Rh

 factorul D este codificat de o genă (1-p36.2-p34) RHD

aceasta determină direct sinteza antigenului D, și are o presupusa alelă

recesivă d.

 antigenul d nu s-a putut identifica

Genotip Fenotip
RHD/RHD Rh+
RHD/RHd Rh+
RHd/RHd Rh-

Caracterul de Rh+ este dat de prezenta genei RHD în genotip implicit,

prezenta antigenului D pe suprafata eritrocitelor.
Caracterul de Rh- este dat de absenta genei RHD

 indivizii cu fenotip Rh+ pot avea genotip DD sau Dd, pe când cei Rh-
doar dd.
 in aceeași zonă a cromozomului mai există și un locus pentru alele:
C, c, E, e (locusul CE) RHCE

 alelele C/c si E/ e sint codominante

 ordinea pe cromozom este C-E-D, din acest motiv se tinde către

înlocuirea prescurtării DCE cu CED.

 pot exista 8 haplotipuri (haplotipul reprezintă configurația genelor pe

un singur cromozom dintr-o pereche):

Dce, DCe, DcE, DCE, dce, dCe, dcE, dCE

 36 de combinatii ( fiecare om are o pereche de crz )

 statistic cel mai des intilnit fenotip Rh negative : ddccee
  alele rare : Cw si Du
Biolog Pr. Alexandra Zagrean

Compatibilitate
Problema compatibilității se pune atunci când se dorește realizarea unei transfuzii
sanguine. Clasic, în sistemul AB0, există noțiunile de donator universal (cu referire la
grupa 0, care nu are aglutinogene) și de primitor universal (cu referire la grupa AB, care
nu are aglutinine). Ele nu sunt însă utile decât pentru transfuzii cu volum redus de sânge,
mai mic de 500 ml

În cazul transfuziei a peste 500 ml, se folosește exclusiv sânge izogrup, adică de aceeași
grupă cu a primitorului. Aceasta pentru că, deși de exemplu grupa 0 nu are aglutinogene,
are totuși aglutinine. Acestea devin de ajuns de diluate în sângele primitorului pentru a nu
da reacții sesizabile, dar la volume mari contactul lor cu aglutinogenele unui primitor de
grupă A, B sau AB poate determina aglutinarea intravasculară a eritrocitelor.

În afară de sistemul AB0, în cazul unei transfuzii este obligatoriu să se țină seama și de
grupa Rh+. Sângele Rh+ poate fi primit doar de indivizi Rh+, pe când cel Rh- se poate
administra la Rh- și Rh+ fără nici o problemă, deoarece în sistemul Rh nu există anticorpi
în absența factorului antigenic.

Practic prin compatibilizare se pun in contact anticorpii din serul primitorului cu

antigenele de pe eritrocitele donatorului .

Pentru tranfuzia de plasmă (care nu poate conține nici un fel de antigene, indiferent de
grupa donatorului, dar poate conține anticorpi) compatibilitatea nu mai ține cont de Rh,
ci doar de AB0. Aceasta doar dacă s-a exclus posibilitatea ca un donator Rh- să fi venit la
un moment dat în contact cu sânge Rh+. În practică, fiecare țară are reglementări oficiale
cu privire la această problemă. În România, se evită pe cât este posibil transfuzia de
plasmă la o grupă Rh diferită.

Notiunea de „ O periculos „ a aparut in momentul in care s-a descoperit

prezentza hemolizinelor anti -A si anti - B imune .Prezenta acestora face ca singele
total de grup O sa nu mai poata fi transfuzat decit strict izogrup .

Importanța grupelor sanguine rezidă în indicarea compatibilității sau incompatibilității

dintre donator și primitor în cazul transfuziilor. Teoretic, compatibilitatea reprezintă
situația în care întâlnirea antigenului de pe hematii cu anticorpi specifici este exclusa.
 Biolog Pr. Alexandra Zagrean

CONCEPTUL DE “ O PERICULOS “ - OP

# principiul donarii de singe total / masa eritrocitara

donator universal

O ( anti A, anti B )

A ( anti B ) B( anti A )

AB ( o )

primitor universal

Grupul O cu hemolizine ( anticorpi imuni ) Anti A si/sau Anti B este “O

periculos “

Cind avem de transfuzat cu un “ O periculos “ se transfuzeaza strict

izogrup !!!!
# in cazul transfuzarii de plasma schema este invers.

Biolog Pr. Alexandra Zagrean

ERITROCITE TEST / SPALAREA ERITROCITELOR

Pentru prepararea eritrocitelor test se urmeaza pasii :

- alegerea a 2-3 eprubete pe anticoagulant ( K3EDTA ) din

fiecare grup
- testarea grupelor ( cu seruri hemotest ) si inscriptionarea lor
- crearea de amestecuri din eritrocitele de acelasi grup in 3
eprubete notate O,A,B
- centrifugare / inlaturare supernatant
- adaugarea unei cantitati duble de SF si agitare usoara
- centrifugare / inlaturare supernatant = prima spalare
- adaugarea unei cantitati duble de SF si agitare usoara
- centrifugare / inlaturare supernatant = a doua spalare
- suspensie de eritrocite 10 %
- se vor pastra la frigider 2-3 zile sau pina se observa hemoliza
 Biolog Pr. Alexandra Zagrean

TESTUL COOMBS DIRECT SI INDIRECT

Testul Coombs evidentiaza aglutinatele foarte fine, pt depistarea si

identificarea aloanticorpilor, in probe de compatibilitate si anemii autoimune
cu ajutorul unui ser antiglogulinic uman polispecific .
Rolul cel mai important al serului antiglobulinic este de a evidentia prezenta
imunoglobulinelor de tip Ig G Fractiunea anti complement ( C3d ) are rolul
de a evidentia si rarii anticorpi detectabili doar prin capacitatea lor de a fixa
complementul.

Exista doua tipuri de efectuare a testului Coombs: cel direct si cel indirect.
Testul Coombs direct are capacitatea de a depista anticorpii ce s-au alipit
deja la suprafetele celulelor rosii ale sangelui. Aceasta conditie medicala
poate fi cauzata de o gama variata de boli, precum si de anumite
medicamente (quinidina, metildopa, si procainamida). Tocmai de aceea
testul este efectuat pentru diagnosticarea anemiei .

Testul Coombs indirect are capacitarea de a depista, in organism, anticorpii

nelegati inca de celulele rosii, si din acest motiv este doar arareori folosit
pentru diagnosticarea unei boli, gasindu-si utilitatea in stabilirea unei
eventuale reactii a organismului la transfuziile de sange.

In general un Test Coombs Direct pozitiv indica faptul ca hematiile sint

sensibilizate in vivo de imunoglobuline si/sau de complement.
Pentru rezultate optime este indicat ca determinarea sa fie facuta pe singe
proaspat recoltat pe nticoagulant tip citrat, EDTA sau CPD-A.

Testul Coombs direct ( TCD ) este folosit pentru a evidentia anemiile

hemolitice autoimune. Cu ajutorul lui se detecteaza acei anticorpi sau
proteinele complementului fixate pe suprafata erirocitelor.Aceasta detectie
se face cu ajutorul antiimunoglobulinei umane cunoscuta si ca Reactivul
Coombs .
Testul Coombs Indirect ( TCI ) se foloseste in testele de compatibilitate
transfuzionala.Ce ajutorul acestui test se determina anticorpii liberi in serul
pacientilor.Prin incubarea serului de la pacient cu eritrocite cu antigenicitate
cunoscuta, in prezenta antiimunoglobulinei polivalente , in cazul in care are
loc aglutinarea TCI va fi pozitiv
Biolog Pr. Alexandra Zagrean

PROBA DE COMPATIBILITATE

CLASICA:

Se folosesc placi cu godeuri speciale sau lame de microscop si

cutii Petrie tapetate cu hirtie de filtru umeda
Proba la cald : Proba la rece :
1 pic. ser pacient 1 pic. ser pacient
+ 1 pic. er.punga + 1 pic. er.punga
+ 1 pic. Papaina + 1 pic. Papaina
o
30 min 37 C 30 min temperatura
mediului
citire citire

IN CASETA :

Se folosesc casete Neutral si Coombs

Pentru casetele Neutral eritrocitele de compatibilizat vor fi
tratate enzimatic ( papaina, bromelina, ficina )
Pentru testul Coombs se adauga sol Bliss sau Liss *

BioVue DiaMed

* 50 μl Bliss *0,5 ml ID dil 2 + 10 μl hematii

10 μl er. in salin 50 μl er. In ID dil2
40 μl ser pacient /tub 25 μl ser pacient /tub
 incubare 15 min la 37o C incubare 15 min la 37o C
centrifugare 5 min centrifugare 10 min
lectura lectura

Biolog Pr. Alexandra Zagrean

Proba de compatibilitate DiaMed

Materiale, reactivi si echipament de lucru
ID distribuitor
ID pipeta
ID conuri pentru pipeta
ID tuburi ( eprubete ) pentru prepararea dilutiilor
ID stativ de lucru
ID centrifuga
ID incubator
Cartela ID Liss / Coombs
Cartela ID NaCl / Test enzimatic
ID - Diluent 2: solutie Liss modificata pentru dilutia hematiilor
ID Papaina sau ID Diluent 1
Principiul tehnicii
Are la baza tehnica de aglutinare in coloana de gel
Testele enzimatice sunt foarte utile cand se urmareste o crestere a
sensibilitatii in determinarea anticorpilor .Ele potenteaza reactivitatea
unor anticorpi mai ales a celor cu specificitate pentru sistemele
Rhesus,Kell,Kidd.
T.C.I. (Testul Coombs indirect ) este un test seric care evidentiaza
prezenta anticorpilor imuni in serul de analizat , in urma sensibilizarii “in
vitro “ a hematiilor test.
Testele saline sunt utilizate pentru determinarea anticorpilor care
reactioneaza cu precadere la + 4º C sau la 18º - 25 º C ( temperatura
camerei ) , cum ar fi anti M -N-P1 -Lea-Leb-1.
Esantioane de testat
Sange total sau sediment eritrocitar provenind din unitatile de
sange care urmeaza a fi transfuzate .
Serul sau proba primitorului .
Cand se foloseste ser in locul plasmei , serul trebuie sa fie limpede
si se recomanda o centrifugare la 1.500 g timp de 10 min , pentru a evita
prezenta rezidurilor de fibrina care pot da erori de interpretare . Cand
probele nu sunt imediat testate , plasma sau serul vor fi conservate la 2º -
8 º C pentru maximum 48 h . Se recomanda ca serul sau plasma de testat
sa nu fie recoltate de mai mult de 24 h.

Prepararea esantioanelor
Se pregateste o dilutie a hematiilor in iD -Diluent 2 , dupa cum
urmeaza :
Se distribuie 0.5 ml -Diluent 2 intr-o eprubeta curata.
Se adauga 10 microlitri sediment eritrocitar si se omogenizeaza
usor

Suspensia de hematii poate fi utilizata imediat

Metoda de lucru
Verificarea vizuala a cartelei ID
Nu trebuie utilizate cartele care prezinta:
 semne de uscare
 bule in coloana de gel
 sigiliul de aluminiu deteriorat
 picaturi de gel sau supernatant in partea
superioara a microtubului sau pe partea
interioara a foliei de aluminiu
Test Coombs indirect :
Se identifica microtubul corespunzator al cartele iD cu datele
primitorului sau ale donatorilor ( unitatea de sange )
. Se indeparteaza folia de aluminiu ce sigileaza microtubul
identificat , tinand cartela in pozitie vericala.
Se pipeteaza 50чl din suspensia eritrocitara a donatorului in
microtubul corespunzator .
Se pipeteaza 25 чl din serul sau plasma primitorului in
microtubul identificat cu datele primitorului sau donatorului .
Se incubeaza cartela 15 minute la 37 ºC in iD - incubator .
Se centrifugheaza cartela 10 minute in iD - Centrifuga .
Citirea ,interpretarea si inregistrarea rezultatelor .
Fotocopierea cartelei si arhivarea rezultatelor in dosarul
transfuzional
Testul enzimatic ( papaina sau bromelina) :
 Se identifica microtubul corespunzator cartelei iD cu datele
primitorului sau ale donatorului ( unitatii de sange )
Se indeparteaza folia de aluminiu de pe microtubul identificat ca
fiind necesar , tinand cartela in pozitie verticala..
Se pipeteaza 50чl din suspensia eritrocitara a donatorului in
microtubul corespunzator .
Se pipeteaza 25 чl din serul sau plasma primitorului in
microtubul identificat .
Se adauga 25 чl de iD -Diluent 1 sau iD Papaina in microtub.
Se incubeaza cartela 15 minute la 37 º C in iD Incubator .
Se centrifugheaza cartela 10 minute in iD -Centrifuga .
Citirea , interpretarea si inregistrarea rezultatelor .
Fotocopierea cartelei si arhivarea rezultatelor in dosarul
transfuzional .
Testul Salin :
Se identifica microtubul corespunzator ale cartelei ID cu datele
primitorului sau ale donatorului ( unitati de sange ) .
Se indeparteaza folia de aluminiu de pe microtubul identificat ca fiind
necesar , tinand cartela in pozitie varticala .
. Se pipeteaza 50чl din suspensia eritrocitara a donatorului in
microtubul corespunzator .
Se pipeteaza 25чl din serul sau plasma primitorului in microtub .
Se incubeaza cartela 15 minute la temperatura ambientala 18º -
25 ºC.
Se centrifugheaza cartela 10 minute in iD Centrifuga.
Citirea , interpretarea si inregistrarea rezultatelor.
Fotocopierea cartelei si arhivarea rezultatelor in dosarul transfuzional .

Citirea si interpretarea rezultatelor

Principiu:
- reactie pozitiva: hematiile aglutinate formeaza o linie
rosie la suprafata gelului sau sunt dispersate la diverse niveluri ale
coloanei de gel. Scala standardizata de lectura a rezultatelor pozitive,
confera siguranta si exactitate:
 4 ( ++++) : hematiile aglutinate formeaza o linie rosie
la suprafata gelului.
  3 ( +++ ) : hematiile aglutinate se gasesc la suprafata
gelului dar sunt prezente hematii aglutinate si in
treimea superioara a coloanei de gel.
 2 ( ++) : hematiile aglutinate sunt dispersate in
treimea superioara si medie a coloanei de gel
 1 (+ ) : hematiile sunt dispersate in treimea inferioara
a coloanei de gel cu cateva hematii libere in varful
microtubului
- reactie negativa: hematiile neaglutinate sedimenteaza
complet in buton compact la
fundul microtubului.
Interpretarea rezultatelor
Reactia negativa indica compatibilitatea intre primitor si donator .
Reactia negativa indica o incompatibilitate intre primitor si donator ,
datorita prezentei unor anticorpi in serul / plasma primitorului cu
specificitate fata de antigenele donatorului .Alte investigatii suplimentare
sunt necesare pentru identificarea antigenului .
 nu se stocheaza in apropierea unei surse de
caldura, de climatizare sau ventilatie
 datele de expirare sunt inscrise pe eticheta
ambalajului de conditionare
. ID Diluent 2 si ID Diluent 1
 se stocheaza la temperatura de 2 - 8 grade
Celsius
 datele de expirare sunt inscrise pe etichetele
ambalajului de conditionare
 inainte de utilizare se aduc la temperatura
camerei
Reactivi folositi in testarea pretransfuzionala – notiuni de baza

Principiul de baza al testelor pretransfuzionale se bazeaza pe reactia antigen-

anticorp. Aceasta consta in punerea in contact a unei surse de antigen
(eritrocitul) cu o sursa de anticorpi (plasma), intr-un mediu de reactie.
Clasic, testele pretransfuzionale se efectueaza mediu salin, pe lama, in
eprubeta sau pe placa de opalina (macrometoda). Reactia antigen-anticorp
este evidentiata prin prezenta aglutinatelor sau a hemolizei in mediul in care
este efectuata reactia.
In ultimii 20 de ani au aparut pe piata tehnologii noi pentru evidentierea
reactiei antigen-anticorp, in gel (Scangel, Diamed) sau pe microbile de sticla
(Orthobiovue) sau in mediu solid. Aceste tehnologii cunoscute sub
denumirea de micrometoda au ca numitor comun faptul ca sursa de antigen
sau sursa de anticorp este adaugata in mediul de reactie de catre producator.

Sursele de antigen pentru testare

-sunt reprezentate fie de suspensiile eritrocitare, preparate comerciale sau
preparate in laborator, fie de eritrocitele pacientului.
Suspensiile eritrocitare furnizate de laboaratoarele producatoare sunt
caracterizate din punct de vedere al antigenelor prezente pe suprafata
eritrocitelor, fenotipul fiind detaliat in antigrama. Folosind acesta sursa
cunoscuta de antigen, putem sa depistam sau sa identificam un anticorp
anti-eritrocitar.
Pe de alta parte, daca nu cunoastem antigenele prezente pe eritrocitele unui
pacient sau ale unui donator atunci, pentru aflarea identitatii acestora le
testam cu o sursa cunoscuta de anticorpi.

Surse de anticorpi pentru testare

- sunt reprezentate de serurile hemotest comerciale sau de plasma/serul
pacientului.
Serurile hemotest comerciale contin anticorpi anti-eritrocitari cu specificitate
cunoscuta si sunt folosite pentru a a identifica antigene eritrocitare
necunoscute.
Specificitatea anticorpilor prezenti in serul/plasma pacientului este precizata
prin testarea acestora cu o suspensie eritrocitara caracterizata fenotipic.

Testele pretransfuzionale
Inaintea oricarei transfuzii se fac urmatoarele teste:
1) determinarea grupei sanguine ABO Rh(D);
2) determinarea fenotipului eritrocitar in sistemul Rh-Kell sau a
fenotipului extins in alte sisteme Duffy (Fya,Fyb), Kidd (Jka, Jkb),
MNSs, P.
3) Depistarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari care pot sa apara ca
urmare a aunor transfuzii anterioare sau a sarcinilor
4) Identificarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari daca depistarea a
fost pozitiva
5) Testul de crossmatch sau de compatibilitate prin 3 tehnici: salin,
enzimatic, antiglobulina umana.

I. Notiuni de baza despre serurile hemotest

Serurile hemotest folosite pentru determinarea grupei sanguine produse de
diferite laboratoare trebuie verificate in cadrul Laboratorului de Referinta
Imunohematologie.
Au fost stabilite urmatoarele standardele minime pe care trebuie sa le
indeplineasca un reactiv pentru a putea fi calificat in transfuzie:
- specificitatea - reprezinta capacitatea reactivului de a recunoaste un
anumit determinant antigenic, de ex. un reactiv anti-D trebuie sa
reactioneze numai cu hematiile D pozitiv dar nu trebuie sa reactioneze
cu hematii D negativ
- intensitatea reactiei de aglutinare – de ex. reactivul anti-A trebuie sa
de o reactie de aglutinare puternica (3+ sau 4+) cu eritrocitele care au
antigenul A.
Reactivii nu trebuie folositi dupa expirarea datei de folosire. Exceptie de la
acesta regula fac numai serurile foarte rare cu conditia ca rezultatele
controlului de calitate sa fie corespunzatoare.
Fiecare producator de seruri hemotest prezinta in prospectul de folosire
descrierea reactivului, tehnica de utilizare, performantele caracteristice,
interpretarea rezultatelor si limitele. In procedurile de operare standard si
instructiunile de lucru scrise de la nivelul laboratorului trebuie sa existe
informatiile din prospectele reactivilor. Pastrati toate prospectele reactivilor
pentru a putea dovedi oricand corectitudinea tehnicii folosite. De fiecare data
cand se schimba producatorul reactivilor sau lotul, instructiunea de lucru
trebuie revizuita prin introducerea modificarilor specifice noului producator.
Inainte de introducerea noilor reactivi in lucru, pe langa revizuirea
instructiunii trebuie facuta si validarea acestora prin efectuarea controlului
de calitate.

Controlul de calitate al reactivilor

Reprezinta procedura tehnica prin care se determina daca reactivul respectiv
identifica in mod corect ceea ce trebuie sa identifice si daca indeplinesc
criteriile acceptabile de performanta.
Fiecare laborator stabileste protocoale de control de calitate si de validare
atat ale echipamnetelor cat si ale reactivilor pe care ii foloseste.
Este obligatorie documentarea efectuarii controlului de calitate a reactivilor
adica trebuie consemnate in formularele elaborate in sistemul de
management al calitatii urmatoarele:
- data testarii
- rezultatele obtinute
- identitatea persoanei care a efectuat testarea
In procedura trebuie consemnate de asemenea masurile corective care
trebuie luate daca reactivii testati nu corespund criteriilor de performanta.
Se efectueaza de asemenea inspectia macroscopica, prezenta turbiditatii sau
aspectul neclar putand fi semne ale contaminarii bacteriene.

Seruri monoclonale vs seruri policlonale

Reactivul hemotest ideal contine o suspensie concentrata de molecule de
imunoglobulina inalt specifice, uniform reactive si bine caracterizate.
Produsele comerciale sunt seruri monoclonale sau seruri policlonale.
Reactivii policlonali au in compozitie imunoglobuline secretate de un
numar mare de clone de limfocite ca urmare a unui raspuns imun la un
antigen eritrocitar. Se obtin din plasma umana provenita de la persoanele
imunizate.
Reactivul monoclonal are in compozitie imunoglobuline secretate de o
singura clona de limfocite, fiind obtinute inustrial cu ajutorul hibridoamelor
(hibridom = celula hibrid formata din fuziunea unei celule mielomatoase,
capabila de multiplicare si un limfocit capabil sa secrete un anumit tip de
imunoglobulina).
Reactivul monoclonal, fiind produsul unei clone care se multiplica la
nesfarsit, contine un singur tip de anticorp cu o specificitate definita.
Acesti reactivi au inlocuit reactivii policlonali in bancile de sange datorita
inaltei specificitati si a timpului scazut de reactie. In tabelul 1 sunt
prezentate avantajele si dezavantajele reactivilor monoclonali.

Tabel 1 Reactivi monoclonali avantaje, dezavantaje

Avantaje
- productie nelimitata
- sunt standardizati
- variatii mici intre loturi
- fara contaminare cu alti
anticorpi
- timpul de aglutinare mult
mai scazut fiind de tip IgM
- pot fi folositi pentru
fenotiparea hematiilor cu
TCD +
Dezavantaje
- specificitatea poate fi relativa
deoarece un determinant
antigenic poate fi comun
pentru mai multe antigene
eritrocitare
- specificitatea unica poate sa
nu determine intotdeauna o
reactie deorece eritrocitele
pot sa nu exprime in
totalitate acel determinant

In concluzie reactivii monoclonali pot fi folositi in transfuzie cu conditia

respectarii stricte a urmatoarelor indicatii:
- citirea cu atentie a inscrisurilor de pe ambalaj
- respectarea tehnicii de lucru din instructiunile de folosire
- luarea in consideratie a formulei prezentate de producator
Concentratia proteinelor din formula reactivului variaza in functie de
producator fiind cuprinsa intre 3% si 8%.
Reactivii monoclonali pentru determinarea ABO
Reactivii sunt resuspendati intr-un diluent cu o concentratie scazuta de
proteine care contine maximum 6% albumina bovina. Reactia de aglutinare
apare imediat, timpul de reactie este scurt, variaza intre 30 - 90 sec. in
functie de producator. Pentru a evita orice confuzie legata ordinea
distribuirii serurilor hemotest ABO exista un cod de culoare al reactivilor.
Reactivul anti-A este intotdeauna albastru, reactivul anti-B este intotdeauna
galben iar reactivul anti-AB este intotdeauna alb.
Reactivii monoclonali pentru determinarea antigenelor Rh
Dintre antigenele sistemului Rh antigenul D este cel mai imunogen si de
aceea este obligatorie determinarea lui inaitea oricarei transfuzii.
Pe piata exista mai multe categorii de reactivi pentru determinarea
antigenului D:
- reactivi cu continut crescut de proteine
- reactivi IgM salin
- reactivi IgG modificati chimic
- reactivi monoclonali.
In prezent, reactivii monoclonali sunt folositi aproape in exclusivitate pentru
tiparea antigenului D la pacienti.
In instructiunea de folosire este precizat si materialul pe/in care trebuie sa se
efectueze reactia, de ex. «reactivul poate fi folosit pentru determinarea pe
lama, in eprubeta sau pe microplaca ».
Cand se foloseste reactivul Rh control?
Reactivul Rh control este indicat in testarea de rutina numai daca reactivul
anti-D folosit in laborator are o concentratie crescuta de proteine si daca
producatorul recomanda folosirea controlului. Reactivul Rh control are rolul
de a face diferenta intre situatiile de reactii fals pozitive care apar in
deterrminarea antigenului D. Concentratia crescuta de proteine si solutiile
macromoleculare care intra in formula reactivului anti-D au rolul de a
favoriza aglutinarea. Reactivul Rh control contine numai proteine in
concentratie mare si solutii macromoleculare nu si anticorpii anti-D.
Reactii fals pozitive in determinarea ag. D apar in urmatoarele situatii:
- eritrocitele de testat sunt sensibilizate de prezenta unui auto-anticorp
asa cum se intampla in anemiile hemolitice autoimune
- eritrocitele de testat provin de la un pacient care are o concentratie
anormal de mare a proteinelor serice in plasma asa cum se intampla
in mielomul multiplu sau boala Waldenstrom. In acest caz, daca
eritrocitele nu sunt spalate in prealabil poate sa apara fenomenul de
rulou sau de pseudoaglutinare.
In aceste situatii exista posibilitatea de a determina in mod eronat antigenul
Rh(D) pozitiv. De aceea prezenta unei reactii pozitive cu reactivul Rh
control invalideaza rezultatul obtinut cu reactivul anti-D.
Reactivii monoclonali anti-D au un continut scazut de proteine in formula
lor, asemanator cu reactivii monoclonali hemotest ABO. In consecinta nu
apar reactii fals pozitive legate de eventuala prezenta pe suprafata
eritrocitelor a auto-Ac. Totusi, reactii fals pozitive pot sa apara daca exista o
concentratie mare de aglutinine la rece sau de proteine plasmatice in proba
de testat.
In concluzie, folosirea Rh control in cazul in care Rh (D) se determina cu
reactivi monoclonali se face conform recomandarilor producatorului.
II. Reactivii antiglobulina
Testul antiglobulina umana, cunoscut si sub denumirea de testul Coombs,
este folosit pentru detectarea anticorpilor de tip IgG si a complementului
exsitente fie pe suprafata eritrocitului fie in ser. Exista 2 categorii de reactivi
amtiglobulina umana:
- reactivi antiglobulina polispecifici care contin atat anti-IgG cat si anti-
c3d
- reactivi antiglobulina monospecifici care contin numai anti-IgG sau
numai anti-c3d
Reactivul monospecific anti-c3d nu reactioneaza cu moleculele de
imunoglobuline (Ig). Acesta detecteaza in mod specific numai proteinele
complementului care au fost atasate pe suprafata eritrocitului ca rezultat al
activarii cascadei complementului pe calea clasica. In general moleculele de
IgM sunt cele care favorizeaza atasarea particulei c3d a complementului pe
eritrocit. In vivo, eritrocitele sensibilizate cu c3d apar in situatii patologice si
sunt distruse fie printr-un proces de hemoliza intravasculara fie eliminate din
circulatia de catre splina.
Reactivii antiglobulina sunt folositi pentru urmatoarele determinari de
laborator:
- efectuarea testului Coombs direct si indirect
- depistarea si identificarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari
- testul de compatibilitatea intre primitor si donator
Controlul de calitate pentru reactivii antiglobulina
Standardele de laborator cer sa existe un sistem de control pentru reactivii
antiglobulina in scopul eliminarii reactiilor fals negative si al validarii
rezultatelor negative.

III. Suspensiile eritrocitare – reactivi pentru testarea anticorpilor

Suspensiile eritrocitare pentru deteminarea anticorpilor ABO (proba

Simonin sau reverse)
Preparatul comercial contine eritrocite test de grup O, A1,A2, B si
detecteaza prezenta anticorpilor anti-A si anti-B.
Procesul de obtinere a reactivilor consta in selectarea eritrocitelor de la
anumiti donatori, spalarea acestora pentru indepartarea oricaror urme de
anticorpi si resuspendarea lor in intr-o solutie tampon pentru a minimiza
hemoliza si pierderea antigenicitatii. Concentratia finala a suspensiei
eritrocitare trebuie sa fie de 2-5%. Preparatele contin eritrocite provenite de
la mai multi donatori.

Suspensiile eritrocitare pentru depistarea ( screening) anticorpilor anti-

eritrocitari
Reactivii sunt necesari pentru determinarea prezentei anticorpilor anti-
eritrocitari in serul indivizilor. Pacientii sau donatorii pot sa aiba aloanticorpi
anti-eritrocitari ca urmarea a unui proces anterior de imunizare, prin sarcina
sau transfuzie.
Pentru siguranta transfuzionala acesti aloanticorpi trebuie determinati atat la
pacient inainte de a primi transfuzia cat si la donator. In caz contrar
aloanticorpul prezent la primitor poate duce la accidente hemolitice severe
daca in sangele transfuzat exista antigenul corespunzator.
Preparatul comercial consta in 3 suspensii eritrocitare distincte al caror
fenotip este cunoscut si prezentat in antigrama care insoteste produsul.
Eritrocitele din suspensie provin de la donatori de grup O deorece acestea nu
reactioneaza cu anticorpii din sistemul ABO. Preparatele contin eritrocite
provenite de la un singur donator si sunt asfel alese de catre producator incat
sa depisteze si anticorpii cu reactivitate slaba.
De asemenea eritrocitele selectionate trebuie sa fie tipate pentru acele
antigene capabile sa detecteze anticorpii cu semnificatie transfuzionala: D,
C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb.
Suspensiile eritrocitare se pot prezenta in 2 feluri:
- sub forma nativa, resuspendate in ser fiziologic
- sub forma de eritrocite tratate enzimatic (papaina, bromelina, ficina)
Prin tratarea enzimatica a eritrocitelor creste sensibilitatea reactiei antigen
anticorp.
In apropierea datei expirarii se poate constata o scadere a reactivitatii
suspensiilor eritrocitare pentru screening, de aceea nu pot fi folosite dupa
acesta data.
Inspectia reactivilor este obligatorie inaite de folosire, hemoliza, decolorarea
sau aglutinarea eritrocitelor sunt semne care indica o eventuala contaminare
bacteriana.

Panelul de suspensii eritrocitare pentru depistarea/identificare

anticorpilor anti-eritrocitari
Panelul este folosit pentru a identifica specificitatea unui anticorp odata ce
acesta a fost depistat prin screening.
Preparatul comercial consta de data acesta din minimum10 suspensii
eritrocitare distincte al caror fenotip este cunoscut si prezentat in antigrama
care insoteste produsul.

IV. Lectinele
Lectinele reprezita o alternativa la folosirea serurilor hemotest. Sunt extrase
din semintele unor plante (vezi tabel 2) si au ca specificitate anumite
antigene de grupe sanguine. Aceste extracte contin proteine care se comporta
identic cu anticorpii dar nu sunt imunoglobuline. Lectinele se leaga in mod
specific de carbohidratii anumitor antigene eritrocitare cu aparitia aglutinarii.
In tabelul 2 sunt prezentate principalele lectine folosite in laboratorul de
imunohematologie.

Tabel 2 Lectine folosite in serologia grupelor sanguine

Lectine Specificitatea antigenica
Dolichos biflorus A1
Ulex europaeus H
Vicia graminea N
Iberis amara M

V. Alte metode folosite pentru detectarea reactiei antigen-anticorp -

micrometoda

Reactivii mentionati mai sus sunt fabricati pentru a detecta reactia de

aglutinare in eprubeta sau pe lama. Recent au aparut tehnologii noi care
evidentiaza reactia antigen-anticorp, sub forma unor cartele de plastic sau
microplaci, in care reactivul furnizat este deja incorporat intr-un mediu de
reactie, gel sau mediu solid.

Tehnologia de aglutinare in gel

Tehnologia, descoperita de Lapierre in 1985, foloseste particule de gel din
dextran-acrilamida in care este incorporat reactivul dorit. Acesta compozitie
este introdusa in coloanele de reactie ale cartelei de plastic, fiecare cartela
avand 6 coloane de reactie. Reteaua de gel are rol atat de mediu de reactie
cat si de filtru. Astfel, aglutinatele care apar ca urmare a reactiei antigen-
anticorp nu pot sa treaca in urma centrifugarii prin acesta retea si raman in
partea de sus a coloanei de reactie. Daca nu se produce reactia de aglutinare,
atunici eritrocitele pot sa treaca prin acesta retea in urma centrifugarii,
formand un buton eritrocitar in partea de jos a coloanei. Pentru a scadea
timpul de incubare se pot adauga in camera de reactie potentiatori care
sensibilizeaza reactia, cum ar fi solutii cu forta ionica scazuta ( solutii LISS
– low ionic strenght solution).
In functie de reactivul pre-existent in cartele, cu aceasta tehnologie se pot
efectua toate determinarile de imunohematologie:
- determinarea de grup sanguin ABO Rh(D)
- determinarea fenotipului eritrocitar Rh (C, c, E, e) –Kell (K)
- depistarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari prin 3 metode, salin,
enzimatic si antiglobulina
- identificarea anticorpilor iregulari anti-eritrocitari
- testul Coombs direct (antiglobulina)
- testul Coombs indirect
- testeul de compatibilitate prin metoda enzimatica si prin testul coombs
indirect
- testul pentru precizarea antigenului D slab

Ideile importante ale prezentarii

1. Reactivii folositi in laboratorul de imunohematologie pun in evidenta
reactia antigen-anticorp, aglutinarea sau hemoliza fiind un indicator al
prezentei acestei reactii.
2. Reactivii folositi pot fi impartiti in 4 categorii:
- seruri hemotest care contin anticorpi cu o specificitate cunoscuta
- suspensii eritrocitare care sunt caracterizate fenotipic, adica prezinta
antigene cu specificitate cunoscuta
- reactivi antiglobulina care detecteaza prezenta Ig sau a
complementului pe eritrocitele de testat sau in serul de testat
- potentiatori care cresc capacitatea de depistare a anticorpilor
3. Reactivii sunt folositi cu scopul de:
- a determina de grup sanguin ABO Rh(D)
- a determina fenotipului eritrocitar Rh (C, c, E, e) –Kell (K)
- a depista anticorpii iregulari anti-eritrocitari prin 3 metode, salin,
enzimatic si antiglobulina
- a identifica anticorpii iregulari anti-eritrocitari
- a efectua testul Coombs direct (antiglobulina)
- a efectua testul Coombs indirect
- a efectua testul de compatibilitate prin metoda enzimatica si prin testul
coombs indirect
- a efectua testul pentru precizarea antigenului D slab
4. Personalul care efectueaza testele de imunohematologie trebuie sa
cunoasca instructiunile de folosire furnizate de producator, de asemenea
limitele de determinare ale reactivilor precum si importanta efectuarii
controlului de calitate.