Laborator 5 Medicina

Proteine I.
Aplicațiile reacțiilor de identificare a proteinelor.
Denaturarea proteinelor. Tehnici de fracţionare a amestecurilor proteice. Dializa.

A. Aplicaţile reacţiilor de identificare. Denaturarea proteinelor

Datorită structurii şi proprietăţilor lor, peptidele şi proteinele prezintă o serie de reacţii

caracteristice care permit separarea şi identificarea lor în diferite medii biologice:
- reacţii datorate legăturii peptidice;
- reacţii de culoare datorate naturii radicalilor aminoacizilor din lanţul polipeptidic;
- reacţii de precipitare.

Reacţia biuretului
Principiu: Proteinele, peptidele şi polipeptidele reacţionează cu ionii de cupru (Cu+2), în mediu
alcalin, formând un complex proteic sau peptidic cupro-alcalin, de culoare violetă. Această
reacţie este datorată prezenţei în molecula proteinelor a legăturilor peptidice (-CO-NH-).
Reacţia se numeşte reacţia biuretului, deoarece cel mai simplu compus care dă această
reacţie este biuretul, compus rezultat prin condensarea la cald a două molecule de uree.
Condiţia esenţială ca reacţia biuretului să fie pozitivă este legată de existenţa a cel puţin două
legături peptidice în structura compuşilor respectivi.
Aminoacizii, ureea, acidul uric, precum şi alţi compuşi azotaţi simpli nu interferă.
Pe reacţia biuretului se bazează una dintre metodele colorimetrice pentru determinarea
cantitativă a proteinelor.
Reactivi:
1. Cazeină, ovalbumină 1 %;
2. NaOH 10 %;
3. CuSO4 2 %.
Mod de lucru:
- într-o eprubetă se pipetează circa 2 ml soluţie de proteină;
- se alcalinizează mediul prin adăugarea a circa 1 ml NaOH 10%;
- se adaugă 4-5 picături de CuSO4 2 % şi se agită;
- apare o coloraţie violetă de diferite nuanţe, în funcţie de concentraţia proteinelor.

Reacţii de culoare ale proteinelor datorate aminoacizilor componenţi

Toate proteinele dau pozitivă reacţia cu ninhidrina, o reacţie generală, ca şi reacţia
biuretului, precum şi reacţiile specifice diferiţilor radicali ai aminoacizilor din lanţul
polipeptidic:
- reacţia xantoproteică pentru fenilalanină şi tirozină;
- reacţia Millon pentru fenilalanină şi tirozină;
- reacţia Pauly pentru histidină şi tirozină;
- reacţiile Hopkins – Cole şi Pettenkofer pentru triptofan;
- reacţia cu isatina pentru prolină şi hidroxiprolină;
- reacţia cu acetat de plumb şi nitroprusiat de sodiu pentru aminoacizii cu sulf.
De remarcat faptul că există anumite proteine cu manifestări contradictorii:
- proteinele care nu conţin resturi de aminoacizi aromatici (clupeina, gelatina, salmina) nu
vor prezenta reacţiile specifice acestora;
- unele proteine, cum ar fi caseina şi ovalbumina, care conţin în lanţul lor polipeptidic toată
gama de aminoacizi, dau pozitive toate reacţiile, atât cele generale cât şi cele particulare.

1
Reacţii de precipitare a proteinelor
Sub acţiunea diverşilor factori fizici şi chimici, proteinele precipită, denaturându-se şi
devenind insolubile.
Reacţiile de precipitare a proteinelor pot fi de două tipuri:
- reacţii de precipitare reversibilă;
- reacţii de precipitare ireversibilă.
Reacţii de precipitare reversibilă
Proteinele existente sub formă dizolvată în soluţie trec sub formă de precipitat, fără să-şi
modifice structura primară şi implicit proprietăţile chimice şi biologice, sub acţiunea unor factori
chimici. După înlăturarea agentului de precipitare reversibilă, proteinele revin la proprietăţile
chimice şi biologice iniţiale, adică la starea lor “nativă”. (Tabel 1).
În precipitarea reversibilă este afectată structura secundară, respectiv legăturile de hidrogen
şi forţele electrostatice.
Tabel 1. Reacţii de precipitare reversibilă a proteinelor
Soluţii sau Eprubeta
solvenţi (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8
Soluţie proteină 2 2 2 2 2 2 2 2
(NH4)2SO4 1 - - - - - - -
Na2SO4 - 1 - - - - - -
BaCl2 - - 1 - - - - -
Alcool etilic - - - 1 - - - -
Acetonă - - - - 1 - - -
Cloroform - - - - - 1 - -
Dioxan - - - - - - 1 -
Butanol - - - - - - - 1
Din această categorie fac parte următoarele reacţii:
- reacţii de precipitare reversibilă a proteinelor în prezenţa unor săruri solubile, proces
numit “salifiere a proteinelor”. Grupele polare sau ionizabile reţin în jurul lor un strat de
molecule de apă prin forţe electrostatice şi punţi de hidrogen. Sărurile de amoniu, sodiu,
magneziu, bariu manifestă o pronunţată tendinţă de hidratare, acţionând ca agenţi de
deshidratare a moleculelor de proteine, care se aglomerează şi astfel precipită. Ionii sării
ce a precipitat proteina se îndepărtează prin dializă.
- precipitarea proteinelor cu solvenţi nepolari: alcool etilic, acetonă, cloroform, dioxan,
eter etilic etc. Solvenţii organici determină precipitarea proteinelor şi prin deshidratare,
dar şi pentru că micşorează constanta dielectrică a apei determinând creşterea forţelor de
atracţie dintre proteine F =( e1 x e2) / D, unde F = forţa de atracţie; e1 şi e2 = sarcinile
electrice; D = constanta dielectrică. De remarcat, faptul că precipitarea proteinelor în
aceste condiţii este reversibilă numai dacă se execută la temperaturi scăzute, deoarece la
temperatura camerei poate avea loc un început de precipitare ireversibilă.
Reactivi:
1. Cazeină, ovalbumină 1 %;
2. Soluţii saturate de sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, clorură de bariu;
3. Alcool etilic 96%, acetonă, cloroform, dioxan, butanol.
Mod de lucru:
- într-o serie de eprubete se pipetează aproximativ 2 ml soluţie de proteină;
- se adaugă apoi 1 ml de reactiv ales pentru precipitarea proteinelor conform tabelului 10;
- după 3-5 minute se observă apariţia unui precipitat;
- prin diluare cu apă distilată, precipitatul se dizolvă.
Reacţii de precipitare ireversibilă
În reacţiile de precipitare ireversibilă se produc modificări profunde în conformaţia şi
organizarea spaţială a moleculelor proteice, însoţite de pierderea proprietăţilor fizice, chimice şi
biologice iniţiale.
2
 Precipitarea ireversibilă induce denaturarea acestora, deoarece după înlăturarea agentului de
precipitare, proteinele îşi pierd solubilitatea şi, în consecinţă, nu mai manifestă proprietatea de a
trece în soluţie, rămânând în stare denaturată.
În cazul denaturării proteinelor, acestea suferă o dezorganizare, ca rezultat al desfacerii
diferitelor legături ce stabilizează structura secundară şi terţiară şi, în primul rând, a legăturilor
disulfurice.
Consecinţele denaturării proteinelor sunt următoarele:
- pierderea activităţii biologice;
- diminuarea solubilităţii;
- creşterea numărului de grupe –SH libere;
- modificarea vâscozităţii şi a presiunii osmotice;
- creşterea susceptibilităţii la hidroliza enzimatică.
Agenţii care provoacă denaturarea proteinelor sunt:
- agenţi fizici: agitarea, căldura, ultrasunetele, radiaţiile bogate în energie (raze
ultraviolete, raze X);
- agenţi chimici: acizi minerali, unii acizi organici, săruri ale metalelor grele, reactivi ai
alcaloizilor (Tabel 2).

Tabel 2. Reacţii de precipitare ireversibilă a proteinelor

Reactivi (ml) Eprubeta
1 2 3 4 5 6 7 8
Soluţie proteină 1% 2 2 2 2 2 2 2 2
Acid azotic concentrat 1 - - - - - - -
Acid percloric - 1 - - - - - -
HCl concentrat - - 1 - - - - -
H2SO4 concentrat - - - 1 - - - -
Acid picric 5% - - - - 1 - - -
Acid sulfosalicilic 20% - - - - - 1 - -
Acidfosfowolframic 10% - - - - - - 1 -
Acid tricloracetic 15 % - - - - - - - 1
Mod de lucru: Se pipetează în mai multe eprubete conform tabelului 11. Se observă apariţia
unor precipitate mai abundente în cazul acizilor organici.
Precipitarea termică (coagularea). Sub acţiunea căldurii, în mediu acid şi în prezenţa unor
electroliţi, proteinele precipită datorită procesului de denaturare rezultat ca urmare a
dezorganizării structurii spaţiale native.
Acţiunea denaturantă a căldurii poate fi însă anulată de un mediu puternic acid sau alcalin.
Într-un astfel de mediu, proteinele devin mai stabile ca urmare a modificării sarcinilor lor
electrice în sensul creşterii gradului de respingere dintre molecule.
În aceste condiţii, precipitarea nu se mai produce, proteinele menţinându-se în soluţie sub
formă dizolvată.
Reactivi:
1. Acid acetic 10 %;
2. Clorură de sodiu cristale.
Mod de lucru:
- într-o eprubetă se introduc 4-5 ml ser diluat;
- se adaugă câteva cristale de NaCl;
- se încălzeşte eprubeta în flacără;
- se observă apariţia unui precipitat;
- dacă se acidulează cu 4-5 picături de acid acetic înainte de încălzire, precipitatul nu mai
apare.
Aplicaţiile reacţiilor de precipitare ireversibilă. Reacţiile de denaturare a proteinelor sunt curent
folosite în laborator pentru:

3
 - separarea proteinelor din extractele şi lichidele biologice în care urmează să se dozeze o
serie de compuşi cum ar fi ozele reducătoare, produşii finali ai metabolismului proteic,
elementele minerale;
- stoparea reacţiilor enzimatice;
- identificarea proteinelor urinare.

B. Tehnici de fracţionare a amestecurilor proteice: fracţionarea cu săruri neutre şi solvenţi

orgnici, termoprecipitarea, precipitarea izoelectrică, gel filtarea. Dializa.

1. Fracţionarea proteinelor dintr-un extract proteic prin precipitare cu săruri neutre

Pentru o anumită proteină, solubilitatea ei creşte cu concentraţia unei sări neutră, atinge o
valoare maximă, după care scade treptat până când precipită din soluţie. Se poate spune că, în
funcţie de structură, fiecărei proteinei îi corespunde o anumită concentraţie de sare la care
precipită, astfel fiind posibilă separarea treptată a proteinelor dintr-un amestec proteic.
Această precipitare a proteinelor la concentraţii mari de sare se datorează faptului că ionii
sării acţionează ca agenţi de deshidratare, îndepărtând moleculele de apă ce hidratează
proteinele. Este o precipitare reversibilă deoarece, prin reluarea cu apă a precipitatului acesta se
redizolvă, nefiind afectată structura terţiară a proteinei.
Dintre sărurile neutre utilizate la fracţionarea amestecurilor proteice amintim: sulfatul de
amoniu, sulfatul de magneziu, sulfatul de amoniu, clorura de bariu, etc. Aceste săruri au o mare
solubilitate în apă, permiţând astfel obţinerea unor concentraţii variate la care proteinele să
precipite diferenţiat, dizolvarea lor în apă nu este un proces exoterm care să denatureze
proteinele, nu interferă chimic cu proteinele, permiţând separarea ei ulterioară.
Purificarea proteinei separate se face prin dializă.
Într-un extract proteic total sau alt amestec de proteine (albuş de ou, lapte) se introduce sulfat
de amoniu până la o concentraţie finală de 30 % saturaţie, care precipită o parte din proteine ce
pot fi separate prin centrifugare (fracţia F1). În supernatant se creşte concentraţia de sulfat de
amoniu până la 60 % saturaţie, când precipită o altă fracţie de proteine şi după centrifugare se
reţine fracţia F2. În supernatant se creşte din nou saturaţia în sare până la 90 %. Prin
centrifugarea suspensiei, se obţine o a treia fracţie proteică F3.
Cele trei fracţii proteice F1, F2 şi F3 sunt reluate în volume minime de apă distilată sau soluţii
saline şi analizate din punctul de vedere al concentraţiei proteice.
În cazul în care fracţionarea cu sulfat de amoniu a fost realizată în scopul purificării unei
proteine cu funcţie biologică, de exemplu a unei enzime prezente în extractul proteic iniţial, cele
trei fracţii sunt analizate şi din punctul de vedere al capacităţii catalitice respective.

2. Fracţionarea proteinelor prin precipitare cu solvenţi organici nepolari

Solvenţii organici de tipul acetonei, etanolului, cloroformului, etc., precipită proteinele din
soluţie datorită scăderii constantei dielectrice a mediului, mărind astfel forţa de atracţie dintre
moleculele cu sarcini electrice diferite.
În cazul în care în soluţie se găsesc proteine ce au încărcare electrică diferită, precipitarea lor
are loc la diferite constante dielectrice ale mediului. Astfel, modificând treptat concentraţia
solventului organic, în amestecul proteic, ele vor precipita pe rând, fiind posibilă separarea lor.

3. Fracţionarea proteinelor dintr-un extract proteic prin termoprecipitare

Principiu: La peste 400C, majoritatea proteinelor devin instabile şi încep să precipite ireversibil
din soluţie. Aceste procedeu permite izolarea enzimelor termorezistente, în condiţii în care restul
proteinelor denaturate precipită. Se testează activitatea enzimei termostabile, în supernatantul
obţinut după încălzirea amestecului proteic la 50-600C, timp de 10-15 minute şi centrifugarea
acestuia.

4
4. Fracţionarea proteinelor dintr-un extract proteic prin precipitare izoelectrică
Deoarece diferitele proteine globulare prezintă structuri primare deosebite şi comportarea lor
acido-bazică variază de la o proteină la alta.
La pH izoelectric, suma sarcinilor pozitive ale unei proteine globulare este egală cu suma
sarcinilor negative, macromolecula nu are o sarcină globală netă, dispar repulsiile electrostatice
între moleculele proteice vecine şi ele precipită din soluţie. La pH izoelectric, proteinele nu
migrează în câmp electric.
Când proteina are un conţinut mare de aminoacizi monoaminodicarboxilici (Asp, Glu), pH-
ul izoelectric este în mediu acid, iar dacă proteina are un conţinut mare în aminoacizi bazici
(Lys, Arg), pH-ul izoelectric este mai mare decât 7.
La o valoare de pH superioară celei a punctului izoelectric, o proteină va avea o sarcină
electrică netă negativă şi în câmp electric va migra către anod, iar la valori de pH mai mici decât
pH izoelectric, proteina va avea o sarcină netă pozitivă şi va migra către catod. Curbele de titrare
ale aminoacizilor şi pH-ul izoelectric se pot modifica în prezenţa sărurilor neutre care
influenţează gradul de ionizare a diferiţilor radicali R. Deoarece proteinele au valori diferite ale
pH-ului izoelectric (Tabel 2), ele pot fi separate una de alta prin ajustarea pH-ului amestecului la
pH-ul izoelectric al fiecăreia, proces numit fracţionare prin precipitare izoelectrică.

Tabel 2. Valorile pH izoelectric (pI) pentru unele proteine

Proteina Sursa Valoare pI
Pepsină Stomac de porc 1
Fosfatază alcalină E.coli 4,5
Ovalbumină Albuş de ou 4,6
Albumină serică Ser 4,9
Superoxid dismutază Eritocite bovine 4,95
Catalază Ficat bovin 5,4
Alcool dehidrogenază Ficat de cal 5,4
Hemoglobină Sânge 6.8
Mioglobină Muşchi 7
Ribonuclează A Pancreas bovin 9,45
Tripsină Pancreas bovin 10,5
Citocrom c Inimă de porc 10,65
Izolarea cazeinei din lapte
Principiu: Cazeina este insolubilă în etanol şi eter şi, pe baza acestei proprietăţi, se face
separarea ei de lipidele din lapte. Se ajustează pH-ul amestecului la valoarea 4,8,
corespunzătoare pH-ul izoelectric al cazeinei.
Reactivi:
1. Soluţie tampon acid acetic / acetat sodic 0,2 M, pH = 4,6;
2. Eter etilic;
3. Etanol 95 % (v/v);
4. Lapte proaspăt.
Mod de lucru:
Într-un pahar Berzelius de 250 ml se introduc 50 ml lapte şi se încălzesc la 400C. Se adaugă
50 ml tampon acid acetic-acetat de sodiu încălzit la 400C, agitând cu o baghetă. Dacă este
necesar, valoarea pH-ului se ajustează la pH 4,8 cu una dintre componentele soluţiei tampon. Se
răceşte conţinutul paharului la temperatura camerei şi, după 5-10 minute, se filtrează prin mai
multe straturi de tifon. Se spală precipitatul de mai multe ori, cu volume mici de apă, apoi se reia
în aproximativ 15 ml etanol. Suspensia se filtrează pe o pâlnie Büchner, iar precipitatul se spală
cu 15 ml, iar în final cu 25 ml eter sub vid. Urmele de solvent din precipitat sunt îndepărtate prin
presarea cazeinei între cele două coli de hârtie de filtru. După uscare, cazeina se cântăreşte şi se
calculează randamentul separării. Cazeina precipitată poate fi hidrolizată prin fierbere la 1100C
cu HCl 5,7 N, 2 - 3 ore, iar aminoacizii din hidrolizatul proteic pot fi identificaţi prin
cromatografie în strat subţire sau prin electroforeză.

5
5. Fracţionarea proteinelor prin gel –filtrare
Suportul cromatografic este reprezentat de o coloană umplută cu un gel din particule între
care există pori de aproximativ aceeaşi mărime. Printre acestea curge lichidul eluent, gelul fiind
îmbibat cu aceeaşi soluţie cu care se face eluţia.
Prin gel-cromatografie moleculele proteice sunt separate pe principiul cernerii moleculare.
Moleculele mari trec primele prin stratul cromatografic, iar cele mici, fiind reţinute, trec mai
încet.
Gel-filtrarea se poate folosi şi pentru desalefierea proteinelor precipitate cu (NH4)2SO4
acesta fiind cazul limită când proteina este total exclusă din gel, în timp ce ionii NH4+ şi SO42-
sunt total reţinuţi.
Pentru pregătirea gelului se foloseşte Sephadex-ul sau poliacrilamida (Bio-Gel). Sephadex-
ul este un dextran modificat, iar pentru fiecare tip de Sephadex există grade diferite de înreţelare
(G-10, G-25, G-50, G-100, G-50, G-200) şi de dimensiuni ale particulelor (superfine, fine,
medium, coarse). Gelurile compacte (cu grad de înreţelare mic, ce se umflă puţin) sunt utilizate
atunci când substanţele au masă moleculară mică. Gelurile cu matrice puţină se folosesc pentru
separarea moleculelor cu dimensiuni mari.
Moleculele cu masa situată în afara domeniului ales se vor elua liber. Celelalte se vor
dispune astfel:
- moleculele mai mari decât porii gelului se eluează împreună cu faza lichidă;
- moleculele mai mici vor penetra gelul şi se vor elua cu viteze diferite în ordinea descrescătoare
a greutăţii.
Se va aplica metoda de fracţionare pentru separarea proteinelor serice şi a hemoglobinei
dintr-un amestec.

6. Dializa
Dializa este procesul prin care se îndepărtează moleculele mici sau ionii dintr-o soluţie
proteică separată de o soluţie tampon dintr-un vas printr-o membrană semipermeabilă.
Particulele de dimensiuni mici vor difuza prin membrana semipermeabilă pentru a-şi
echilibra concentraţia între soluţia proteică şi soluţia tampon, denumită dializat. Proteinele având
greutăţi moleculare mari nu pot difuza prin porii membranei semipermeabile.
În laborator, dializa se foloseşte pentru îndepărtarea ionilor sărurilor neutre folosite pentru
separarea proteinelor, de exemplu ionii NH4+ şi SO42- rămaşi din (NH4)2SO4. Soluţia proteică ce
urmează a fi dializată este introdusă într-un sac semipermeabil, iar acesta este imersat în baia de
dializă. Soluţia din baia de dializă este agitată uşor cu un agitator magnetic pentru a facilita
echilibrul substanţei ce dializează şi soluţia din sacul permeabil.
Operaţia de dializă poate fi discontinuă, când se înlocuieşte în mod repetat lichidul din vasul
de dializă, mai ales la începutul operaţiei. Se poate realiza şi o dializă în curent continuu folosind
anumite dispozitive ce realizează umplerea şi golirea continuă a vasului cu soluţie de dializat.
Procesul de dializă stă la baza rinichiului artificial. La persoanele care au deficienţe în
elaborarea urinii (insuficienţă renală cronică, adenom de prostată, etc.), sângele trebuie epurat de
o serie de substanţe care, acumulându-se în organism, sunt incompatibile cu viaţa.
Sângele intoxicat vine în contact, prin intermediul unor membrane semipermeabile cu o
soluţie salină cu presiunea osmotică egală cu cea a plasmei sanguine (izotonă) şi se purifică.