Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Lacazele
au o distribuţie mai redusă în regnul vegetal, în comparaţie cu
polifenoloxidazele. Polifenoloxidazele din ţesuturile mamiferelor au o
specificitate mult mai restrânsă, acţionează mai ales asupra tirozinei
şi dihidroxifenilalaninei.
Mulţi fungi conţin lacaze care sunt
glicoproteine, subunitatea de bază fiind un singur lanţ polipeptidic cu
70 kDa. Conţinutul de carbohidraţi este 10 45%, conţin 4 atomi÷ MM = 50
de cupru, iar pH-ul optim al lacazelor este cuprins între 4 şi 7,3 , în
funcţie de substrat. Rezultă că polifenoloxidazele şi lacazele au rol
deteriorativ, deoarece produc îmbrunarea enzimatică a produselor
vegetale proaspăt tăiate, în contact cu aerul, respectiv a unor
tesuturi animale (creveţi, moluşte) legumele şi fructele cele mai
afectate sunt cartofii, ciupercile, vinetele, merele, perele, caisele,
bananele.
I. Oxidoreductazele
a. Oxidoreductaze FAD
b. Oxidoreductaze NAD
i. Lipoxigenaza
ii. Polifenoloxidazele
iii. Ascorbat oxidaza
iv. Peroxidazele
v. Catalazele
III.
IV. Figura 6. Reacţia de reducere catalizată de dehidrogenazele NAD(P)H
dependente.
V. În Figura 6 este prezentată schema de reacţie tipică pentru obţinerea
alcoolilor chirali. În timpul reducerii compuşilor carbonilici, cofactorul
pierde un ion hidrură alături de alcoolul corespunzător obţinându-se
deci şi NAD(P)+. De aceea în cazul reducerilor enzimatice fie se
adaugă cofactor în raport stoechiometric cu substratul, fie acesta este
regenerat in situ [ [2] ]
VI. Cele mai multe din oxidoreductaze acţionează asupra substraturilor
solubile în apă. În multe cazuri acestea sunt temporar derivatizate ca
în cazul esterilor S-CoA a acizilor carboxilici. Substraturile tipice
pentru biotransformările microbiene ce prezintă interes în sinteze sunt
compuşi hidrofobi asupra cărora enzimele prezentate în Tabelul 2 nu
acţionează. Cu toate acestea, datorită implicării lor în calea glicolitică
concentraţia acestor enzime în celulă este proporţională cu abilitatea
celulei de a produce NAD(P)H. G-6-DH, 6-P-gluconat DH şi probabil
cetopantoil reductaza sunt implicate în producerea NADPH [ [13] ].
Polifenoloxidaza (EC.1.10.3.2) este cunoscută şi sub
denumirea catecholoxidaze, o-difenoloxidaza sau, mai recent,
oxigen oxidoreductaza – enzima din grupa oxidazelor clasei
oxidoreductazelor, care transportă electronii direct la oxigen.
Polifenoloxidaza este răspîndită în plante, găsindu-se în cantitate
mai mare în special în ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai
şi de tutun, boabe de cafea şi în diferite fructe: mere, piersici,
caise, banane, în struguri, etc. Polifenoloxidaza (PFO) are o masă
moleculară de 34000, reprezintă o proteină, ce conţine cupru (0,26
%). Ea poate cataliza oxidarea monofenolilor în difenoli
(activitatea crezolică) şi a o-difenolilor în o-chinone (activitatea
RRR
__ __ __
OH
OH O
O
Activitatea crezolica Activitatea catecolazica
+ 1/2 O2 + 1/2 O2
OH
monofenol
o-difenol chinona
PFO oxidează substanţele tanante (taninurile). Prin acţiunea
ei se explică brunificarea legumelor şi fructelor la uscare.
PFO are un rol important la respiraţia plantelor. După teoria
lui V.I. Paladin sistema polifenol-chinonă are un rol însemnat în
calitate de verigă intermediară la oxidarea diferitelor substanţe
organice în procesul respiraţiei plantelor.
Participarea PFO în acest proces poate fi redată prin schema
următoare:
OH
OH
O
O
+ 1/2 O2
o-difenol
o-chinona
H2O
Compus redus
Compus oxidat
R
R
Aşadar o cantitate mică de polifenol şi chinonă respectivă
poate de multe ori să fie supusă variabil oxidării şi reducerii.
Sistema PFO, polifenolilor şi chinonilor respectivi, poate
oxida acidul ascorbic în materia primă alimentară. Această situaţie
se ia în considerare la prelucrarea fructelor, legumelor şi
strugurilor, care conţin acid ascorbic.
Materia primă vegetală (fructe proaspete tăiate, legume şi
struguri) în contact cu oxigenul din aer se îmbrunează din cauza
53
polimerizării oxidative a chinonelor formate din mono- şi difenoli.
Pentru inactivarea PFO şi prevenirea formării chinonelor se
foloseşte tratamentul termic (de exemplu, blanşarea fructelor) sau
chimic – cu SO2 sau cu K2S2O5 etc.
Principiul metodei
Metoda determinării polifenoloxidazei se bazează pe
proprietatea ei de a oxida pirocatehina în orto-chinonă. Ortochinona
oxidează acidul ascorbic. Anume acidul ascorbic rămas în
mediu de reacţie se determină cantitativ prin metoda de titrare cu
0,02 n soluţie de iod.
OH
OH
O
O
+ 1/2 O2
o-chinona
H2O
pirocatehina
Acidul ascorbic
Acidul dehidroascorbic
Prin această metodă se determină activitatea
polifenoloxidazei numai în primele 2 minute de acţiune asupra
substratului.
Aparate
Enu
ţ
a Iorga, Gh. Campeanu74
3.6.6. Acid ascorbic oxidaza
Acid ascorbic oxidaza catalizeaza oxidarea, cu ajutorul oxigenului molecular,
aacidului ascorbic, care se adauga curent in panificatie. Acidul ascorbic este
transformat in acidL-dehidroascorbic, care, la randul sau, oxideaza glutationul in
prezenta de glutation reductaza.Glutationul oxidat devine in acest caz
indisponibil pentru a participa la reactii de tipul: 2 G-SH
→
2 G-S-S-G cu proteinele, consecinta fiind o “intarire” a aluatului
(glutenului).Acid ascorbic (AA)½ O
2
Acid ascorbic oxidazaDHA2GSHDHA reductazaGSSGAcid ascorbic (AA)
Figura 20.
Mecanismul de actiune al acid ascorbic oxidazei (Banu si altii, 2000).
Intr-un studiu s-a folosit o metoda spectrofotometrica continua pentru a se
determinanivelele de activitate ale acid ascorbic oxidazei (AOX) din probe de
faina apartinand a 13soiuri de grau diferite, cultivate in 2 anotimpuri. De
asemenea, s-a realizat un studiu al relatieidintre nivelul acid ascorbic oxidazei si
calitatea de panificatie si continutul de proteina alfainii. In cazul in care fainurile
au fost depozitate peste 300 de zile la 20°C, iar graul peste 2ani, activitatile
AOX si calitatea de panificatie au scazut. Faina continand activitate
AOXendogena mai mica a condus la un comportament asemanator ca si al celei
care a continutacid ascorbic singur si acid ascorbic si AOX Aquash. S-a
concluzionat ca nivelul AOX ingrau nu a fost critic in ceea ce priveste efectul de
imbunatatire a calitatii painii de catre acidulascorbic; acesta se bazeaza pe
oxigenul incorporat in timpul framantarii intensive
Enu
ţ
a Iorga, Gh. Campeanu74
3.6.6. Acid ascorbic oxidaza
Acid ascorbic oxidaza catalizeaza oxidarea, cu ajutorul oxigenului molecular,
aacidului ascorbic, care se adauga curent in panificatie. Acidul ascorbic este
transformat in acidL-dehidroascorbic, care, la randul sau, oxideaza glutationul in
prezenta de glutation reductaza.Glutationul oxidat devine in acest caz
indisponibil pentru a participa la reactii de tipul: 2 G-SH
→
2 G-S-S-G cu proteinele, consecinta fiind o “intarire” a aluatului
(glutenului).Acid ascorbic (AA)½ O
2
Acid ascorbic oxidazaDHA2GSHDHA reductazaGSSGAcid ascorbic (AA)
Figura 20.
Mecanismul de actiune al acid ascorbic oxidazei (Banu si altii, 2000).
Intr-un studiu s-a folosit o metoda spectrofotometrica continua pentru a se
determinanivelele de activitate ale acid ascorbic oxidazei (AOX) din probe de
faina apartinand a 13soiuri de grau diferite, cultivate in 2 anotimpuri. De
asemenea, s-a realizat un studiu al relatieidintre nivelul acid ascorbic oxidazei si
calitatea de panificatie si continutul de proteina alfainii. In cazul in care fainurile
au fost depozitate peste 300 de zile la 20°C, iar graul peste 2ani, activitatile
AOX si calitatea de panificatie au scazut. Faina continand activitate
AOXendogena mai mica a condus la un comportament asemanator ca si al celei
care a continutacid ascorbic singur si acid ascorbic si AOX Aquash. S-a
concluzionat ca nivelul AOX ingrau nu a fost critic in ceea ce priveste efectul de
imbunatatire a calitatii painii de catre acidulascorbic; acesta se bazeaza pe
oxigenul incorporat in timpul framantarii intensive (Every sialtii, 1996).
3.6.7. Hexozoxidaza
Hexozoxidaza (EC 1.1.3.5) (HOX) catalizeaza conversia unui numar de mono-
sioligoglucide la lactonele corespunzatoare, cu hidroliza, in continuare, la acizii
aldobionicirespectivi, concomitent cu formarea H
2
O
2
. Reactia catalizata de HOX poate fi reprezentataastfel:D-glucoza + O
2
δ
-D-gluconolactona + H
2
O
2
D-galactoza + O
2
γ
-D-galactogalactona + H
2
O
2
Figura 21.
Mecanismul de actiune al hexozoxidazei.
Utilizarea enzimelor in panificatie75
HOX a fost izolata din doua specii de alge rosii
Iridophycus flaccidum
(Bean siHassid, 1956) si
Chondrus crispus
(Sullivan si Ikawa, 1973; Kerchensteiner, 1978).Hexozoxidaza a fost purificata
din alga rosie
Chondrus crispus
si
s-a obtinut
secventaunei peptide din aminoacizi. Prin utilizarea HOX in sistemul aluat, s-a
obtinut o scadere aconcentratiei de grupari tiol libere, probabil din cauza
formarii puntilor disulfurice dintre proteine in fractia glutenica. S-a gasit o buna
corelatie intre reducerea continutului de gruparitiol si cresterea tariei aluatului,
asa cum reiese din masuratori la extensograf. Rezultatele aufost confirmate de
probe de coacere. Sunt necesare studii viitoare pentru a se vedea dacaformarea
legaturilor disulfurice este singura explicatie pentru functionalitatea
enzimei.Efectele sale benefice se pot datora, de asemenea, gelatinizarii
pentozanilor sau cuplarii proteine-pentozani.HOX a fost comparata cu GOX,
care este preferata, in mod obisnuit, ca alternativaenzimatica la agentii de
oxidare chimici, utilizati pentru imbunatatirea calitatii painii. Se presupune ca
mecanismul de actiune al HOX in aluat este identic cu cel al GOX, dar HOXeste
mai eficienta, la aceeasi doza, din cauza spectrului mai larg al substratului
utilizat si aafinitatii mai mari pentru glucoza (valoare K
m
mai mica).O analiza a mono- si diglucidelor din faina si din a
Lacaza (oxigenreductaza E.C. 1.10.3.1.) este o enzimă de
origine fungică secretată de mucegaiul Botrytis cinerea, care în
unele condiţii infectează struguri. Lacaza ca şi polifenoloxidaza
este o cuproproteidă dar are un spectru de acţiune mult mai larg,
oxidînd orto- şi para-difenolii, antociane şi acidul ascorbic din must
şi vin. Oxidarea directă a antocianelor este cauza principală a
degradării rapide a culorii vinurilor roşii (casarea oxidazică).
Tratarea mustului şi vinului cu bentonită şi SO2 puţin reduce
activitatea lacazei.
Determinarea lacazei în bobiţe, struguri şi vinuri,
cunoaşterea caracteristicilor fizico-chimice ale acestei enzime
(temperatura optimă, pH-ul optim, constantele, inhibitorii, etc.)
permit de a acţiona asupra proceselor de vinificaţie. Lacaza
denaturează în 10 minute prin încălzirea mustului, vinului la
temperatura 45 oC. Temperatura de 75 oC inactivează lacaza
complet.
Metodele de determinare a lacazei
Sînt utilizate două tipuri de metode:
•metode colorimetrice, utilizînd substraturi sensibile, care
formează după oxidare compuşi coloraţi, determinaţi prin
spectrofotometrie;
•metode polarografice, utilizînd electrozi specifici de
oxigen pentru determinarea cantitativă a oxigenului consumat din
mediu pe parcursul oxidării unui substrat specific de către enzimă.