UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE

ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ A BANATULUI

,,Regele Mihai I al României din Timişoara”

FACULTATEA DE INGINERIE ALIMENTARĂ

Metode clasice și moderne de determinare a

apei din produsde agroalimenare

Timisoara
2019

Scurt istoric
 Reactiile enzimatice au fost folosite din timpurile cele mai vechi
pentru fabricarea vinului, a otetului, a berii si a branzei.
Lavoisier (1789) a facut un bilant de materiale al fermentatiei, aratand ca
oxigenul, hidrogenul si carbonul din zahar se regasesc in alcoolul si bioxidul
de carbon ce iau nastere.
Payen si Persoz(1833) au izolat, prin precipitarea cu etanol, prima enzima,
amilaza.
Un moment istoric deosebit de important este recunoasterea clara, de
catre Berzelius, in 1835, a caracterului catalitic al reactiilor enzimatice,
precum si a rolului esential pentru viata animalelor si a plantelor jucat de
aceste reactii.
In anul 1940,cercetatorul american Edward Howell a facut, in acelasi
domeniu, o si mai mare descoperire: cercetand substantele vitale propriu-
zise si anume, enzimele, a dovedit ca ele sunt purtatori vietii din orice
organism viu,fiind deci si materia vie din alimentele noastre.

Clasificare si nomenclatura:

Enzimele se clasifica in functie de tipul de reactie pe care il

catalizeaza in 6 mari clase astfel:
1. oxidoreductaze
2. transferaze
3. hidrolaze
4. liaze
5. izomeraze
6. ligaze sau sintetaze

Enzimele reunite intr-o anumita clasa sunt ulterior clasificate in

subclase si subsubclase in functie de unele detalii privind gruparile chimice
asupra carora actioneaza, cofactorii implicatii in reactie respective etc. De
asemenea, fiecare enzima este caracterizata printr-un cod format din patru
cifre, care contine informatii despre enzima. Prima cifra din cod reprezinta
apartenenta la una din cele sase mari clase de enzime
Pectinliazele fac parte din clasa liazelor avand codul 4.2.2.10.
Alte nume : pectin - trans eliminaza, endo-pectin liaza,
polimetilgalacturonic transeliminaza, pectin metiltranseliminaza, pectoliaza,
PL;PNL;PMGL.
Nume sistematic : (1→4)-6-O-metil-α-D-galacturonan liaza.

2
 Reactia catalizata :

Clivarea eliminatorie a esterului metal-(1-4)--galacturonic pentru

formarea de oligozaharide cu grupe 4-deoxi-6-O-metil-alfa-D-galacto-4-
enuronozilice la capetele lor nereducatoare.

Structura:

Structura primara a unui segment dintr-o catena polipetidica sau a unei

proteine este reprezentata de secventa aminoacizilor si nu inglobeaza
arnjamente spatiale ( cu exceptia configuratiei α- atomului de carbon).
Aceasta definitie nu include pozitiile legaturilor disulfurice si deci nu este
identica cu “structura covalenta”.
Structura secundara a unui segment dintr-o catena polipeptidica
reprezinta aranjamentul spatial local al principalilor atomi care constituie
scheletul catenei, fara a tine seama de conformatia resturilor R si de relatiile
cu alte segmente.
Structura tertiara a unei molecule de proteina sau a unei subunitati
dintr-o molecula de proteina este reprezentata de aranjamentul tuturor
atomilor in spatiu, fara a considera relatiile cu molecule vecine sau
subunitati.
Structura cuaternara a enzimelor reprezinta cel mai inalt nivel de
organizare a macromoleculelor proteice. Proteinele cu mase moleculare mari
si foarte mari sunt constituite din mai multe catene polipetidice.

Substrat:

Pectin liazele manifestă specificitate pentru substrate înalt esterificate,

acţiunea lor aleatoare conducând la formarea de oligo-D-galacturonaţi
nesaturaţi. Majoritatea pectin liazelor purificate şi caracterizate sunt de
origine fungică.
Activitatea acestui tip de liaze este afectată de distribuţia grupărilor
esterificate în catena poli-D-galacturonanică. Studiile realizate pe substrate
cu diferite grade de esterificare şi cu o distribuţie diferită a grupărilor
esterificate, au arătat o activitate mai mare asupra substratelor deesterificate
enzimatic comparativ cu cea manifestată pe substrate deesterificate în mediu
alcalin. Pectinele deesterificate enzimatic au o distribuţie regulată a
grupărilor esterice, în timp ce deesterificarea chimică conduce la o
distribuţie statistică a acestor grupări.

3
 Pectinele înalt esterificate sunt cele mai bune substrate pentru pectin
liaze. Pectaţii, amidele acidului pectic şi glicilesterii pectinei nu sunt
degradaţi de pectin liaze.
Modul de acţiune al pectin liazelor a fost pus în evidenţă prin analiza
produşilor rezultaţi în urma scindării tetra-, penta- şi hexa-galacturonaţilor

Substrat Produşi de reacţie

 O-O-O + -O-
O
O-O-O-O-O-O
 O-O + -O-O-O

O-O-O-O-O  O-O + -O-O

O-O-O-O  O + -O-O

O – rest de acid galacturonic esterificat

  rest de acid galacturonic esterificat, cu o dublă legătură între C4 şi C5

Modul de acţiune al pectin liazelor

Influenta parametrilor:

Influenta pH-ului. Majoritatea pectin liazelor au pH-ul optim în

domeniul acid şi valori mici ale constantei Michaelis. Aproximativ 10% din
pectin liazele izolate şi caracterizate s-au dovedit a fi enzime care acţionează
la pH alcalin. O pectin liază cu afinitate mică este enzima izolată din
Penicillium italicum, enzimă cu KM mare faţă de pectina 86% metilată (15
mg/ml), dar şi cu activitate catalitică mare. Afinitatea scăzută a acestei
enzime a fost explicată prin repulsiile electrostatice care apar între enzimă şi
substrat, ambele fiind încărcate negativ la pH 9,0. După depăşirea
dificultăţilor de formare a complexului enzimă-substrat, activitatea catalitică
este mare. Proprietăţile pectin liazei din Penicillium italicum s-au
modificat în urma imobilizării covalente pe nylon.

4
 Creşterea stabilităţii enzimei imobilizate a permis utilizarea acesteia
în 12 cicluri de degradare a pectinei.
PH-ul mediului în care sunt menţinute enzimele afectează starea de
ionizare a aminoacizilor constituenţi, influenţează structura secundară şi
terţiară a moleculelor proteice, afectând, astfel, activitatea catalitică.Există o
corelaţie directă dintre valoarea pH-ului mediului şi
stabilitatea enzimelor.
Temperatura optima este de 300 C
Metodele de dozare se bazeaza pe masurarea vitezei catalizate in
anumite conditii de pH si temperature, viteza ce reprezinta viteza de
transformare a substratului in urma actiunii catalitice a enzimei.

Activatori si inhibitori:

Manifestarea activităţii catalitice a pectin liazelor nu necesită neapărat

prezenţa ionilor de calciu în mediu (excepţie enzima din Fusarium
oxysporum), dar ionii divalenţi de calciu, cupru, magneziu, mangan şi
mercur, în concentraţie 2mM, s-au dovedit a fi activatori pentru unele pectin
liaze. Activitatea pectin liazică s-a dovedit a fi inhibată de: acidul p-
cloromercuri-fenil-sulfonic, anhidridă maleică, N-etilmaleimida şi de unii
hormoni ai plantelor sau analogi ai acestora.

Aplicatii ale pectinliazelor:

Enzimele pectinolitice sunt absolut necesare în extracţia,

clarificarea şi depectinizarea sucurilor de fructe. Clarificarea acestora
decurge şi sub acţiunea enzimelor pectinolitice din fructe, dar procesul de
autoclarificare este prea lent pentru a fi utilizat la scară industrială. În
procesele industriale sunt utilizate preparate concentrate de enzime
pectinolitice produse de microorganisme, preparate care realizează o
degradare rapidă a polimerilor pectici. Clarificarea diferitelor sucuri necesită
acţiunea sinergică a mai multor tipuri de enzime pectinolitice. Astfel,
sucurile de mere au fost clarificate rapid prin combinarea activităţilor
endopoligalacturonazice (din Aspergillus niger) şi pectinesterazice (din
Aspergillus oryzae).
Exopoligalacturonazele nu au avut efecte în astfel de procese,
aceste enzime fiind adsorbite în proporţie destul de mare pe protopectina din
mere. Sucurile de grapefruit, sucuri mai rezistente în procesele care implică
degradarea polimerilor pectici, au fost clarificate cu ajutorul unei pectin
liaze izolate din Aspergillus sojae.

5
 Clarificarea sucurilor de citrice, sucuri cu pH foarte acid a putut fi
realizată prin acţiunea combinată a pectinesterazei ce se găseşte în aceste
sucuri şi a poligalacturonazei din Corticium rolfesii. Poligalacturonaza
biosintetizată de Corticium rolfesii are o utilitate deosebită, deoarece ea
acţionează la un pH foarte scăzut - 2,5 -, pH la care reacţia enzimatică se
desfăşoară în condiţii apropiate de cele aseptice.
Enzimele pectinolitice sunt utilizate pentru macerarea fructelor şi
vegetalelor, pentru obţinerea alimentelor pentru sugari şi a piureurilor.
Enzimele pectinolitice sunt utilizate în procesele de vinificaţie, mai ales
pentru obţinerea vinurilor din soiuri de struguri bogate în substanţe pectice.
Extracţia aromelor şi a pigmenţilor vegetali se poate face cu ajutorul acestor
enzime.
Acţiunea combinată a enzimelor pectinolitice, celulazelor şi hemicelulazelor
poate conduce la lichefierea fructelor.

Clasificare si nomenclatura

In functie de tipul de reactie pe care il catalizeaza, enzimele se impart in sase

mari clase:
Oxidoreductaze
Transferaze
Hidrolaze
Liaze (sintaze)
Izomeraze
Ligaze (sintetaze)

Conform clasificarii facute de NC-IUBMB, liazele sunt enzime care

catalizeaza reactii cu ruperea legaturii C-C, C-O, C-N fara participarea apei
si fara oxidare, rezultand si o rearanjare interna a moleculei. In cazul in care
liaza elimina molecule de apa, atunci ea poarta denumirea de dehidrataza.
Liazele pot functiona ca sintaze atunci cand reactia inversa este mai
importanta.
Conform sistemului de clasificare si numerotare zecimala stabilit de
Comsia de Enzimologie (Enzyme Commission - EC), in anul 1973, liazele
se impart (si in functie de legatura pe care o rup) in:
EC 4.1 - Carbon-carbon liaze
EC 4.2 – Carbon-oxigen liaze
EC 4.3 – Carbon-azot liaze
EC 4.4 – Carbon-sulf liaze
EC 4.5 – Carbon- halogen liaze

6
EC 4.6 – Fosfor-oxigen liaze
EC 4.99 – Alte liaze.

L-Cistein-liaza (EC 4.4.1.10) - face parte din clasa 4, liaze; subclasa 4

ce contine liaze care catalizeaza ruperea legaturii carbon- sulf; sub-subclasa
1, ce contine liaze carbon-sulf, care catalizeaza eliminarea sau inlocuirea
gruparilor H2S.
Membrii sub-subclasei EC 4.4.1:
EC 4.4.1.1 - L-cistation cistein-liaza
EC 4.4.1.2 - L-homocistein hidrogen sulfid-liaza
EC 4.4.1.3 - S,S-dimetil-β-propiotetin dimetil-sulfid-liaza
EC 4.4.1.4 - S-alchil-L-cistein S-oxid alchil-sulfat-liaza
EC 4.4.1.5 - (R)-S-lactolglutation metilglioxal-liaza
EC 4.4.1.6 - S-alchil-L-cistein alchil-tiol-liaza
EC 4.4.1.8 - L-cistationin L-homocistein-liaza
EC 4.4.1.9 - L-cistein hidrogen-sulfid-liaza
EC 4.4.1.10 - L-cistein-liaza
EC 4.4.1.11 - L-metionin metantiol-liaza
EC 4.4.1.13 - L-cistein-S-conjugat tiol-liaza
EC 4.4.1.14 - S-adenozil-L-methionin metiltioadenosin-liaza
EC 4.4.1.15 - D-cistein sulfid-liaza
EC 4.4.1.16 - L-selenocistein selenid-liaza
EC 4.4.1.17 - holocytochrome-c apocytochrome-c-liaza
EC 4.4.1.19 - (2R)-2-O-fosfo-3-sulfolactat hidrogen-sulfit-liaza
EC 4.4.1.20 - C4 glutathion-liaza
EC 4.4.1.21 - S-(5-deoxi-D-ribos-5-yl)-L-homocistein homocistein-liaza
EC 4.4.1.22 - S-(hidroximetil)glutation formaldehid-liaza
EC 4.4.1.23 - (R)-2-hidroxipropil-CoM:2-mercaptoetansulfonat liaza
EC 4.4.1.24 - 3-sulfolactat bisulfit-liaza
EC 4.4.1.25 - L-cisteat bisulfit-liaza.
Parametrii caracteristici cistein-liazei:
1.Surse
Tesut -sursa Organism-specie
Embrion; ficat Pui – sp. Gallus gallus
Tesut muscular Sp.Callopanchax, sp. Epiplatys, sp.
Neoselachii, sp.Rivulus .
Membrana Turturica –sp.Caudata, Chamaeleo .
vitelina
2.Greutate moleculara: 120.000 D
3. pH optim = 8,7 – 8,8

7
4.Substraturi: 2-mercaptoetanol; 3-mercaptopropionat; tioglicolat; L-
cisteina;etantiol;metantiol.
5.Inhibitori: L-Serina

Structura:
Enzimele sunt substante de natura proteica. Acestea reprezinta
macromolecule, compuse din lanturi polipeptidice, avand o masa moleculara
cuprinsa intre 10.000-1.000.000 Daltoni.
La enzime, ca si la alte proteine, functia este determinata de structura.
O enzima poate fi:
O proteina monomera, ce contine un singur lant polipeptidic, cu aproximativ
o suta de aminoacizi; sau
O proteina oligomera, constituita din mai multe lanturi
polipeptidice, care actioneaza impreuna ca un tot unitar.
Fiecare monomer, alcatiut din proteine, se prezinta sub forma unui lant lung
de aminoacizi, care se pliaza intr-un mod particular pentru a realiza un
produs tridimensional. Monomerii individuali se pot apoi combina prin
interactii (legaturi) non-covalente cu scopul de a forma proteine oligomere.
Majoritatea enzimelor sunt mai mari decat substratele asupra carora
actioneaza si doar o mica portiune din enzima, alcatuita din aproximativ 10
aminoacizi intra in contact direct cu substratul.Aceaste structuri spatiale
includ o regiune, de legatura intre enzima si substrat, este denumita situsul
activ al enzimei – partea care realizeaza efectiv functia biologica a acestor
proteine.Unele enzime contin situsuri care depind de cofactori, necesari
pentru cataliza, altele au situsuri de legatura pentru molecule mici.

Fig. 1. Structura tridimensionala a enzimei –tertiara

Reactia catalizata:

8
Cofactor: Piridoxal-fosfat

Metabolismul cisteinei:

9
 Aplicatiile cistein-liazei in chimia alimentara:
- se utilizeaza in industria vinurilor - in vederea dezvoltarii aromelor
intense de fructe(fructul pasiunii, grapefruit, agrise)la anumite sortimente de
vin(Escherichia Coli);
- se foloseste pentru eliberarea de tioli aromatici in timpul fermentatiei
alcoolice la vin, cu scopul de a-i spori varietatile, de exemplu in cazul
sortimentului Sauvignon Blanc (Saccharomyces Cerevisiae).

10
 Bibliografie:

1. http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=4.4.1
2. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
3. http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?enzyme+4.4.1.1
4. “Introducere in enzimologie” I.F. Dumitru, Dana Iordachescu
5. www.brenda.com

11