TEHNOLOGIA DE OBTINERE A L-ASPARAGINAZEI DE UZ

TERAPEUTIC

• Obţinerea proteinelor terapeutice = una din cele mai importante direcţii de

dezvoltare a biotehnologiei moderne.
• În principiu, utilizarea în terapie a proteinelor se impune în cazurile în care
este necesară asigurarea unui grad înalt de specificitate a interacţiunii cu ţinta,
deseori cuplată cu necesitatea unei activităţi biocatalitice la un nivel care nu poate
fi atins de molecule sintetizate chimic.

Prezentare generala

• L-asparaginaza = exemplu foarte elocvent referitor la avantajele şi limitele

aplicării proteinelor în terapia umană.
• Scurt istoric:
 în urmă cu aproximativ 50 de ani s-a observat inhibarea limfoamelor
murinice prin injectare cu ser de cobai;
 10 ani mai târziu s-a dovedit că L-asparaginaza izolată din serul de
cobai este factorul activ, responsabil de efectul antitumoral al acestuia;
 în 1967 s-au efectuat primele teste clinice preliminare care au
demonstrat importanţa L-asparaginazei în tratamentul leucemiei
limfoblastice acute (ALL).
 de atunci şi până în prezent L-asparaginaza a rămas în atenţia
cercetătorilor, încercându-se obţinerea acestei enzime într-un grad de
puritate cât mai avansat, compatibil cu utilizarea acesteia în
chimioterapia anumitor forme de leucemie.

Mecanism de actiune

• Eficienţa tratamentului cu L-asparaginază rezultă din depleţia rapidă şi

completă a L-asparaginei din circulaţie, fapt datorat proprietăţii enzimei de a
hidroliza L-asparagina la acid L-aspartic şi amoniac.
• Depleţia L-asparaginei circulante are ca urmare inhibarea sintezei proteice
la nivelul celulelor maligne, în special al celor limfoide, care sunt incapabile de
a-şi sitetiza singure acest aminoacid, fiind dependente de L-asparagina exogenă.

Proprietăţi fizico-chimice şi biochimice ale L-asparaginazei

• L-asparginaza = enzima din clasa hidrolazelor, subclasa amidohidrolazelor,

ce catalizează hidroliza grupei amida din structura L-asparginei, care astfel se
transforma în acid L-aspartic şi amoniac.
• Masa moleculară: 141.000 daltoni
• Compoziţie: tetramer

1
 • Constanta Michaelis: KM = 1,25 x 10-5
• Punct izoelectric: pH = 4,9
• Specificitate: enzima purificată prezintă 2-4 % activitate faţă de glutamină
şi faţă de D-asparagină, raportat la acţiunea sa faţă de derivaţi sau analogi ai L-
asparaginei.
• Inhibitori: 5-diazo-4-oxo-L-norvalina (DONV); acest compus este şi un
substrat alternativ pentru enzimă.

Tehnologii de obtinere a L-asparaginazei

• L-asparaginaza este un agent antineoplazic utilizat în mod curent în

tratamentul leucemiilor limfoblastice acute (ALL), mai des pediatrie.
• Specificul acţiunii terapeutice a L-asparaginazei utilizate în medicaţii
complexe impune un grad avansat de puritate a enzimei, ca principiu activ din
forme farmaceutice injectabile, grad de puritate care se exprima prin activitatea
enzimatică specifică, dar şi prin lipsa pirogenilor şi a antigenilor.
• Utilizarea terapeutica a acestei enzime de impune atât conducerea adecvată
a procesului de biosinteză cât şi aplicarea unor metode eficiente de izolare şi
purificare a enzimei native.

Factori ce influenţează biosinteza microbiana a L-asparaginazei

• Printre factorii importanţi care influenţează procesul de biosinteză a L-

asparaginazei se numară:
 tulpina microbiana
 temperatura
 pH-ul
 transferul de oxigen
 compozitia mediului de cultura
 stadiul de creştere microbiana

Tulpini microbiene producatoare de L-asparaginaza

• Bacterii: E. coli, Erwinia carotovora, Erwinia chrysantemi, Erwinia
aroideae, Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis,
Wolinella succinogenes, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiela aerogenes, Seratia sp.
• Fungi: Cladosporium cladosporoides
• Drojdii: Saccharomyces cerevisiae

Biosinteza L-asparaginazei in tulpini de E.coli

• E. coli produce L-asparginiaza sub forma a 2 izoenzime: EC1 şi EC2.

• Cea mai intens studiată L-asparaginaza este izoenzima EC2

2
 • L-asparaginaza EC2 diferă de cealaltă formă prin câteva caracteristici
biochimice şi fizico-chimice, dintre care cele mai importante sunt prezentate în
tabelul următor.

Diferente intre izoenzimele EC1 si EC2

Caracteristici EC1 EC2
Spatiul
Localizarea Citoplasmatica
periplasmatic
Afinitate fata de
Mica Mult mai mare
substrat
Activitate
Forma inactiva Forma activa
farmacologica
Variatia activitatii
Activa si la pH <
enzimatice in functie de Inactiva la pH < 4
4
pH

20
15
µ mol NH3 /h

10 EC2
5
EC1
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Variatia activitatii enzimaticepH
in functie de pH

Influenta temperaturii asupra biosintezei L-asparaginazei EC2

• Pentru fiecare microorganism există o temperatura optimă de dezvoltare,
care se defineşte ca aceea temperatură la care dezvoltarea populaţiei microbiene
se face cel mai intens.
• Această temperatură nu coincide neaparat cu temperatura optimă pentru la
care are loc biosinteza enzimei.
• Ca atare, este necesar să se stabilească temperatura optimă pentru o anumita
activitate biologica, respectiv de formare a unei enzime.
• Escherichia coli este un microorganism mezofil
• Unii autori descriu modificări morfologice ale celulelor în funcţie de
temperatură şi mediu
• Temperatura optima pentru biosinteza L-asparaginazei in tulpinile de E.
coli este de 28-300C, fiind diferita de temperatura optima de crestere a biomasei
care este de 370C
3
 Influenta pH-ului asupra biosintezei L-asparaginazei EC2
• Concentraţia ionilor de hidrogen este de asemenea un factor important care
determină dezvoltarea culturii, precum şi tipul şi cantitatea de L-asparaginază
produsă de celulă.
• pH optim de dezvoltare a culturii si biosinteza a enzimei se situeaza in
intervalul 7,2-8,2.

Influenta aerarii asupra biosintezei L-asparaginazei EC2

• Tulpinile de Escherichia coli fac parte din microorganismele facultativ
aerobe, care işi orienteaza metabolismul în funcţie de cantitatea de oxigen
disponibilă.
• L-asparaginaza EC2 se formează în culturi statice de Escherichia coli
dezvoltate pe medii continand glucoza, in conditii de anaerobioză.
• O dată cu oprirea aerării culturii, activitatea specifică creşte exponenţial,
până la atingerea unui nivel maxim.
• Această cinetică a biosintezei enzimei a sugerat faptul ca in conditii de
aerobioza glucoza inhiba biosinteza enzimei.

Compozitia mediilor de cultivare a tulpinilor de E.coli producatoare

de L-asparaginaza EC2
• Surse de carbon si energie: glucoza (in conditii de aerare redusa), glicerina,
acizi organici, extract de porumb
• Surse de azot: extract de porumb, triptona, hidrolizate proteice, saruri de
amoniu, azotati
• Aminoacizi cu efect de stimulare a biosintezei L-asparagianzei: L-
asparagina, acidul L-aspartic, acidul p-aminobenzoic, glicina, alanina
• Saruri minerale
D.O.
0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 20
timp (ore)

Evolutia in timp a masei microbiene producatoare de L-asparaginaza

4
 4

3,5

2,5

2 activitate specifică

1,5

0,5

0
1,5 4 6 8 10 12 14 16 18
ore

Activitatea L-asparaginazei in mediul de fermentatie la diferite intervale de timp

de cultivare

Corelarea biosintezei enzimei cu faza de crestere a celulelor de E.coli

• Faptul ca unele enzime sunt produse într-o fază târzie a perioadei de
creştere se explică prin efectul combinat al modificării unor factori fizico- chimici
(concentraţia substratului, pH, produşi de metabolism).
• L-asparaginaza EC2 cu proprietăţi antileucemice se formează în faza târzie
logaritmică şi ajunge la maximum în faza staţionară de creştere.

Condiţiile optime de biosinteză a L-asparaginazei

• Compozitia mediului de cultura:
- extract de porumb
- sulfat de amoniu
- aminoacizi suplimentari
• Parametrii optimi ai bioprocesului:
 temperatura 28÷30 oC
 pH=6,5÷8,2
 agitare 200÷220 rpm
 aerare 0,40,5 l aer/l mediu/minut
 timp 18÷20 ore de cultivare

Prelucrarea post-biosinteza a mediilor de fermentatie continand L-

asparaginaza

Faza 1: separarea biomasei prin filtrare sau centrifugare

 corectarea pH-ului mediului final de fermentaţie la valoarea 6 – 6,5;

5
  adăugarea unui polimer sintetic cu efect floculant, în concentraţii cuprinse
între 0,1-0,5% (v/v) şi menţinerea suspensiei în regim de agitare 10-15
minute, apoi static 30 minute;
 decantarea supernatantului şi filtrarea sedimentului sub vid, în prezenţa
unui adjuvant de filtrare.
In aceste condiţii, dintr-un litru mediu de fermentaţie cu activitate 4,6 u/ml,
s-au obţinut în jur de 35 g biomasă umedă, conţinând aproximativ 50% substanţă
uscată.
Faza 2: tratament cu solventi organici pentru delipidizarea biomasei
 se folosesc 6-8 volume de acetonă, faţa de greutate biomasei umede.
 suspensia obţinută se menţine 10 minute sub agitare, apoi s-a filtrat sub vid.
 materialul rămas pe filtru se spala în continuare cu acetonă răcită, după care
se esoreaza bine.
 acetona reziduală se elimina prin uscare sub vid, la temperatura camerei, în
final obţinându-se un produs cu aspect de pulbere cenuşie şi activitate enzimatică
de 0,27 u/mg.
Faza 3: extracţia propriu-zisă a L-asparaginazei
 pulberea de biomasă uscată se tritureaza cu un amestec 1:1 de octanol şi
toluen, în concentraţie finală de 6% (v/g) faţă de cantitatea de biomasă luată în
lucru, pâna la obţinerea unei paste omogene.
 aceasta se trateaza apoi cu lizozim (2%0 g/g) şi EDTA (1,8 %0 g/g) şi se
suspenda în 20 volume de apă (raportat la cantitatea de biomasă uscată).
 extracţia se efectueaza menţinând suspensia de celule sub agitare, la
temperatura camerei, la pH 7-7,5.
 analiza din oră în oră a activităţii enzimatice în supernatant, comparativ cu
suspensia, a evidenţiat faptul că după 3 - 3,5 ore de regim în condiţiile menţionate,
85 % din activitatea L-asparaginazei se regăseşte în supernatant.
 mediul de extracţie se aciduleaza in final cu acid acetic 2M la pH=5, sub
agitare şi răcire la 2-50C.
 resturile celulare şi o parte din proteinele de balast se separa prin
centrifugare la 4000 rpm, sub răcire, apoi se reiau cu un volum egal de apă
acidulată la pH=5 şi se recentrifugheaza.
 cele două supernatante se reunesc, iar sedimentul conţinând biomasa
epuizată se îndepărteaza.
 evoluţia activităţii enzimatice pe parcursul prelucrării mediului de extracţie
este redată în tabelul urmator.
 din datele prezentate în acest tabel, rezultă că din 132 g biomasă prelucrată
în scopul extracţiei L-asparaginazei, se obţin 3 l extract acelular acid, cu activitate
enzimatică de 10 u/ml, corespunzoare unei activităţi specifice de 1,3 u/mg.

Extracţia L-asparaginazei

6
 Nr. Volum Greutate Activitate Enz. Conţ. proteic
Proba
crt. (ml) (g) U/ml(mg) U totale
total
mg/ml
mg
1. B. uscată - 132 0,27 35.343 -
2. Susp. 3h 2660 - 11,30 30.042 -
3. Sup.I 2660 - 11,20 29.750 -
4. Sup.II 340 - 0,86 292 -
5. Extr. total 3000 - 10,00 30.042 7,69 23.077

Faza 4: purificarea L-asparaginazei prin cromatografie de adsorbtie

• Ca adsorbant se utilizeaza bentonita, aplicandu-se următorul protocol
experimental:
• Materia primă: extract acelular brut, pH=5, având caracteristicile
menţionate în tabelul precedent;
Mod de lucru:
• adsorbţie: adăugarea bentonitei în soluţia de proteină enzimatică şi agitarea
suspensiei timp de 30 minute, la 0-5 0C, filtrare;
• desorbţie: suspendarea bentonitei cu adsorbit în soluţii tampon glicocol 0,5
M, pH = 9,5 (10 volume de eluant faţă de cantitatea de bentonită uscată folosită
la adsorbţie), agitarea suspensiei la 0-50C, timp de 30 minute, filtrare.
• In condiţiile descrise, tamponul glicocol 0,5 M, pH 9,5, realizează desorbţia
selectivă a L-asparaginazei de pe bentonită şi un factor de purificare = 6 faţă de
extract, respectiv 4,5 faţă de enzima adsorbită.

Concluzii privind purificarea partiala prin cromatografia pe bentonita:

• Cantitatea de bentonită necesară pentru adsorbţia totală a L-asparaginazei
din extract corespunde raportului 4 g bentonită/g proteină, condiţii în care
activitatea specifică a enzimei adsorbite este cu 33 % mai mare decât valoarea
acesteia în extractul brut.
• Adsorbţia L-asparaginazei pe bentonită are loc la pH acid, cuprins între 4,5-
5,5.
• La valori mai mari de pH activitatea adsorbită scade, la fel ca şi
selectivitatea adsorbţiei.
• In ceea ce priveşte desorbţia de pe bentonită, cel mai eficient eluant al L-
asparaginazei este tamponul glicocol, a cărui putere de eluţie creşte odată cu pH-
ul, atingând valoarea maximă la pH=9,5, iar molaritatea eluantului nu influenţează
semnificativ desorbţia enzimei.
Faza 5: purificarea prin fracţionare cu sulfat de amoniu
Această treaptă de purificare se aplica soluţiei de enzimă în tampon
glicocol, rezultată în urma eluţiei de pe bentonită.

7
 • Soluţia respectivă se aduce la pH=8 cu acid acetic 2M, sub agitare în gheaţă
si se adăuga (NH4)2SO4, în porţii, sub agitare şi răcire la 0-50C, astfel încât să se
realizeze o concentraţie finală de 2,75 M (NH4)2SO4.
• Mediul se agita apoi 30 minute şi precipitatul format se separa prin filtrare
la vid şi se spala cu cantităţi mici de soluţie 2,75 M de (NH4)2SO4.
• Precipitatul format se reia în tampon fosfat 0,01 M si se trateaza în
continuare cu o nouă porţie de (NH4)2SO4, corespunzoare realizării unei
concentraţii finale de (NH4)2SO4de 4M.
• Precipitatul format se separa prin filtrare sub vid, se spala pe filtru cu soluţie
4M (NH4)2SO4, se esoreaza bine şi se reia în ml tampon fosfat 0,01 M pH=7.
• Suspensia rezultată se agita timp de 10 minute la temperatura ambiantă,
apoi se filtreaza.
• Precipitatul depus pe filtru se reia apoi încă de două ori in acelaşi tampon,
conform modului de lucru descris.
• Materialul solid separat pe filtru după ultima reluare se îndepărteaza, iar
filtratele reunite se dializeaza timp de 24 ore, faţă de t.f. 0,01M.
Faza 6: purificarea L-asparaginazei prin cromatografie de schimb ionic
• Schimbator de ioni: anionit slab bazic, DEAE-Sephadex A-50
• Protocol tehnologic:
 activarea schimbătorului de ioni în forma OH- prin hidratare, spălare
cu 5 volume soluţie NaOH 0,5 N, apoi cu apă distilată până la pH
neutru şi lipsă ioni Cl-;
 pregătirea coloanei cromatografice, prin echilibrarea cu soluţie
tampon fosfat pH=7, 0,01M;
 adsorbţie:
- în coloana cromatografică se introduce soluţia dializată de proteină
enzimatică obţinută în trapta anterioară de purificare.
- după ce se realizează sorbţia soluţiei proteice în materialul cromatografic,
acesta se spală cu un volum de soluţie tampon fosfat 0,01 M pH=7 egal cu
volumul coloanei şi apoi cu 2 volume din acelaşi tampon, dar de
concentraţie 0,025 M, folosind un anumit debit
 desorbţie: enzima reţinuta pe coloana cromatografică se eluează cu
o soluţie tampon fosfat 0,1 M, pH=7, eluţia efectuându-se cu acelaşi
debit, în fracţiuni
Concluzii privind purificarea prin cromatografie de schimb ionic
• Aplicarea procedeului de purificare pe DEAE-Sephadex A-50 conduce la
obţinerea unei soluţii de L-asparaginază cu activitate specifică de 90-100 u/mg
proteină, corespunzătoare unui factor de purificare faţă de etapa anterioară de
4,62.
Faza 7: Concentrarea soluţiei purificate de L-asparaginază
Pentru realizarea condiţiilor optime de izolare a L-asparaginazei prin
precipitare cu alcool etilic, se efectueaza o concentrare preliminară a soluţiei
enzimatice printr-o reprecipitare cu sulfat de amoniu.
8
 • In soluţia eluată de pe DEAE-Sephadex se adauga o cantitate (NH4)2SO4
corespunzătoare unei concentraţii finale a acestuia de 4M.
• Mediul de reacţie se menţine sub agitare la +50 0C timp de 30 minute, iar
precipitatul proteic se separa prin filtrare sub vid, se spala cu o cantitate mică de
soluţie (NH4)2SO4 4M, se esoreaza bine şi apoi se reia în soluţie tampon glicocol
0,01M, pH=7,8.
• Soluţia obţinută se dializeaza 24 ore faţă de acelaşi tampon
• Se obţine în final o soluţie dializată cu 460 u/ml activitate enzimatică şi 4,6
mg/ml conţinut proteic, respectiv cu o activitate specifică de 100 u/mg proteină.
Faza 8: Izolarea L-asparaginazei purificate
• L-asparaginaza din soluţia obţinută în faza anterioară precipită prin adaos
de alcool etilic, în raport de 1,5 volume faţă de volumul soluţiei concentrate de
enzimă; adăugarea alcoolului etilic se efectueaza sub agitare, la temperaturade
+50C.
• După adăugarea alcoolului etilic soluţia se opalicizeaza uşor,
transformându-se treptat într-o suspensie fină, care se menţine sub agitare timp de
două ore, la temperatura sus-menţionată.
• Precipitatul format se separa apoi prin filtrare sub vid şi se usuca sub vid,
la temperatura ambiantă.
• În final se obţine un produs cu o activitate specifică de120 u/mg proteină.
Aplicarea procedeelor de purificare în succesiunea menţionată conduce la
un randament global de 36% raportat la activitatea enzimatică din finalul
fermentaţiei, şi un factor de purificare global = 90, faţă de enzima din extractul
acelular brut

Alta varianta de prelucrare post-biosinteza pentru izolarea L-asparaginazei

microbiene
Conţinut
Nr. Activitate Activitate
Treapta de purificare total proteină
crt. enzimatică specifică
(mg)
12.000-
1. Extract brut 3.500 0,2-0,25
14.000
2. Tratare cu MnCl2 1.800 2.400 1,3
3. Gel filtrare (biogel P-150) 1.200 2.200 1,8
Cromatografie schimb ionic
4. 50-80 1.600 20-32
(DEAE-celuloză)
Cromatografie pe
5. 3-6 800 150-250
hidroxiapatită
6. Electroforeza preparativă 1,5-2 600 150-250

Efecte adverse ale L-asparaginazei

9
 • Utilizarea în terapeutică a L-asparaginazei este limitată de toxicitatea
acesteia.
• Efectele adverse ale tratamentului cu L-asparaginază se manifestă prin:
 hiper sau hipotensiune
 spasm laringian
 stres respirator
 edeme faciale
 inhibarea sintezei proteinelor plasmatice, ceea ce duce la apariţia
hipoalbulinemiei şi a hiperglicemiei, cu scăderea concentraţiei de
insulină şi lipoproteine pancreatită hemoragică acută, hiperlipidemii.

Direcţii principale de modificare a L-asparaginazei native

• Pentru diminuarea sau eliminarea efectelor negative ale L-asparaginazei, s-

au întreprins numeroase cercetări de obţinere a unei L-asparaginaze cu toxicitate
redusa
(1) modificarea chimică a enzimei prin conjugare cu polimeri sintetici sau
natural: polietilenglicolul(PEG), copolimerul etilen//anhidridă maleică, poli-DL-
lizina, acidul sialic, dextran, chitosan;
(2) imobilizarea L-asparaginazei prin entrapare în matricea unui hidrogel
biocompatibil ca de exemplu, polietilenglicol-albumină (PEG-BSA), sau
încapsulare (ex. nanoparticule de poli(lactidă-co-glicolidă)-PLG, conţinând L-
asparaginază.

Avantaje ale modificarii L-asparaginazei native

• Se poate obţine creşterea duratei de retenţie plasmatică a proteinei

terapeutice şi respectiv a biodisponibilităţii acesteia.
• Prin conjugarea cu polimeri naturali sau sintetici se pot masca
determinanţii antigenici ai enzimei de origină bacteriană, alterându-i-se astfel
imunogenitatea.
• Prin derivatizarea proteinei enzimatice sub forma unor conjugate cu
polimeri biodegradabili se poate obţine în plus o creştere semnificativă a greutăţii
moleculare efective a acesteia şi reducerea interacţiilor cu alte molecule.
• Aceste modificări crează noi proprietati ale suprafete proteice, pe care
interacţiile cu receptorii (precum cei implicaţi în “clearance-ul” plasmatic sau în
recunoaşterea de catre sistemul imun), au loc in mod diferit fata de enzima nativa

PEG-ASPARAGINAZA

10
 • Enzima obtinuta prin conjugarea L-asparaginazei native cu
polietilenglicolul
• Polietilenglicolul este un polimer organic biocompatibil, format din unităţi
repetitive de etilenoxid.
• Nefiind un polimer natural, degradarea polietilenglicolului pe cale
enzimatică se realizează lent, ceea ce prelungeşte timpul de înjumătăţire a
substanţei modificate cu ajutorul lui.
• Conjugarea proteinelor cu PEG ajută la mascarea acestora faţă de factorii
care provoacă degradarea rapidă, precum şi faţă de complexarea şi inactivarea
datorată imunoglobulinelor din fluidul sanguin.

Obtinerea PEG-asparaginazei

• Pentru ca legătura dintre proteină şi polietilenglicol să se realizeze în

condiţii blânde (spontan), este necesară obţinerea unui intermediar reactiv, cu
caracter electrofil, capabil de a se cupla cu grupările nucleofile ale moleculei ce
urmează a fi modificată.
• Pentru a evita riscul reticulării moleculei de PEG, datorat existenţei a două
grupe hidroxil, se foloseşte un derivat al polietilenglicolului:
monometoxipolietilenglicolul (m-PEG).

Etapele obtinerii conjugatului PEG-Asparaginaza

1) Activarea primara a m-PEG prin transformarea grupelor OH in grupe

carboxil
11
2) Activarea grupei carboxil sub forma de ester prin tratarea cu N-
hidroxisuccinimidă în urma căreia rezultă succinimidilsuccinil-
monometoxipolietilenglicolul.
Reacţia se desfăşoară în mediu apos în prezenţa carboiimidei.

12
3) Cuplarea m-PEG activat cu L-asparaginaza

Conjugatul PEG-Asparaginaza nativa

Principalele avantajele farmacocinetice şi farmacologice ale

conjugatului PEG–L-asparaginază
• creşterea solubilităţii în medii apoase şi organice;
• modularea răspunsului imun;
• favorizarea trecerii prin membranele celulare;

13
• creşterea timpul de înjumătăţire al enzimei;
• biodisponibilitate superioara.

Eficacitatea terapeutica a L-asparaginazei

• tratamentul leucemiilor limfoblastice acute
• remisiunea completă a bolii în aproximativ 80 % din cazuri, când este
folosită ca unic agent terapeutic
• în terapia combinată s-a constatat o remisiune a bolii la aproximativ 95 %
dintre pacienţii trataţi.

14