METODE DE EXTRACTIE ŞI PURIFICARE A PROTEINELOR –I

Separarea şi purificarea proteinelor este indispensabilǎ studierii structurii şi

proprietǎţilor lor. Extractia proteinelor dintr-un tesut animal sau vegetal este o etapa
intermediara in purificarea proteinelor. Metodele de extractie permit separarea acestor
compusi chimici de restul componentelor celulare si tisulare (exemplu, lipide) in vederea
purificarii si caracterizarii lor ulterioare. Există dificultǎţi considerabile, mai ales datoritǎ
faptului cǎ majoritatea proteinelor reprezintǎ combinaţii macromoleculare cu o structurǎ
foarte labilǎ, care în cursul izolǎrii şi purificǎrii poate fi modificatǎ. Aceste modificǎri pot
altera structura proteinei şi pot conduce de asemenea, la pierderea proprietǎţilor biologice
sau la modificarea unor parametri fizico-chimici.
Pe de altǎ parte solubilitatea proteinelor ridicǎ probleme în alegerea procedeului
de purificare. Astfel, proteinele insolubile deşi pot fi separate uşor de componentele
lipidice, glucidice sau de proteinele solubile, de regulǎ sunt separate foarte greu unele de
altele. Acest lucru se datorează în principal, faptului cǎ majoritatea metodelor de
purificare se bazeazǎ pe procese ce se petrec în soluţie.

a) Metode de precipitare
Precipitarea proteinelor reprezintǎ trecerea din stare dizolvatǎ în stare insolubilă
(precipitat). Precipitǎrile pot fi reversibile sau ireversibile.
Ionii anorganici în concentraţie mare precipitǎ proteinele prin spargerea sferei de
hidratare ce înconjoarǎ şi stabilizeazǎ molecula proteicǎ dizolvatǎ, pentru a se dizolva ei
înşişi în apa extrasǎ.
Fenomenul acesta se numeşte salifiere. Concentraţia salinǎ de precipitare variazǎ
de la o proteinǎ la alta, ceea ce permite fracţionarea proteinelor dintr-un amestec
neomogen. Sǎrurile de sulfat de amoniu, sulfat de magneziu şi sulfat de sodiu, precipitǎ
în mod reversibil proteinele, cu pǎstrarea activitǎţii biologice.
Metoda de fracţionare cu ajutorul sǎrurilor constǎ într-o precipitare fracţionatǎ a
proteinelor, adǎugând treptat la extractul proteic total cantitǎţi din ce în ce mai mari de
sǎruri neutre (de obicei sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, amestecuri de fosfaţi primari şi
secundari de potasiu, dar uneori şi citrat sau fosfat de amoniu), fie sub formǎ de cristale,
fie sub formǎ de soluţii saturate.
Sarea se adaugǎ în porţiuni mici şi dupǎ fiecare adaos precipitatul obţinut se
separǎ prin centrifugare. În concentraţii mari, sǎrurile neutre scad solubilitatea proteinelor
determinând precipitarea lor. Întrucât fiecare proteinǎ precipitǎ la o anumitǎ concentraţie
a unei sǎri neutre, teoretic este posibilǎ precipitarea fracţionatǎ treptatǎ a proteinelor
prezente într-un extract tisular şi / sau celular dintr-un amestec.
Precipitarea fracţionatǎ a proteinelor cu ajutorul sǎrurilor neutre se bazeazǎ pe
faptul cǎ la concentraţii mari ionii sǎrii prin numǎrul şi afinitatea lor pentru apǎ
îndepǎrteazǎ o mare parte a moleculelor de apǎ care în mod obişnuit hidrateazǎ suprafaţa
proteinelor, determinând astfel precipiarea lor din soluţie. Precipitarea proteinelor este un
fenomen reversibil: introducerea în sistem a unei cantitǎţi suficiente de apǎ provoacǎ
dizolvarea precipitatului ceea ce denotǎ cǎ structura terţiarǎ a proteinelor nu a fost
modificatǎ. Procedeul este folosit şi la scarǎ industrialǎ pentru prepararea unor proteine
biologic active.
Precipitarea fracţionatǎ a proteinelor din soluţie prin adǎugarea treptatǎ de sulfat
de amoniu este o metodǎ cu largi utilizǎri pentru separarea proteinelor din medii
biologice complexe.
Albuminele şi globulinele se deosebesc dupǎ uşurinţa cu care sunt precipitate de
cǎtre sulfatul de amoniu. Globulinele precipitǎ când soluţiile care le cuprind sunt
aproximativ semisaturate în sulfat de amoniu, (NH 4)2SO4, pe când albuminele precipitǎ la
concentraţii mai mari de 75% saturaţie.
Solubilitatea proteinelor este influenţatǎ de pH prin efectul de ionizare produs
asupra moleculelor proteice. Existǎ o valoare a pH-ului la care proporţia sarcinilor
electopozitive ale moleculei de proteinǎ este egalǎ cu cea a sarcinilor electronegative, caz
în care sarcina electricǎ netǎ a proteinei devine nulǎ. pH-ul cu o asemenea valoare poartǎ
denumirea de punct izoelectric al proteinei. Solubilitatea unei proteine este minimǎ la
punctul izoelectric, iar la variaţii mici ale concentraţiei solventului, se poate produce o
creştere a solubilitǎţii cu menţinerea unui minim la punctul izoelectric. La punctul
izoelectric, solubilitatea proteinelor este minimǎ, datoritǎ atracţiilor electrostatice ce se
exercitǎ între moleculele ionizate a cǎror sarcinǎ electricǎ netǎ este nulǎ. Solubilitatea
proteinelor creşte în domeniile de valori de pH acid sau bazic care delimitează valoarea
punctului izoelectric. La concentraţii saline scǎzute, solubilitatea multor proteine creşte
odatǎ cu forţa ionicǎ a solventului datoritǎ mǎririi polaritǎţii acestuia. La concentraţii
saline mari, solubilitatea proteinelor este diminuatǎ pânǎ la precipitare datoritǎ
competiţiei dintre proteine şi ionii minerali ai solventului pentru moleculele de apǎ.
Influenţa pH-ului la punctul izoelectric relevǎ o repulsie minimǎ între moleculele
proteice, moleculele având tendinţa de a forma agregate care precipitǎ.
Valoarea pI este o caracteristicǎ a fiecǎrei proteine, cunoaşterea lui având o
importanţǎ atât analiticǎ, cât şi preparativǎ. Combinarea eletroforezei cu precipitarea la
punctul izoelectric (“isoelectric focussing”) constituie o metodǎ modernǎ şi extrem de
sensibilǎ pentru separarea şi izolarea diverselor proteine din amestecuri.

Aplicatie practica:
Precipitarea la punct izoelectric a ovalbuminei din albusul de ou

Materiale şi metode utilizate

a)Materiale
Pentru realizarea experimentelor se utilizeaza ouǎ proaspete de gǎinǎ, de la care
am separat galbenuşul.
b)Metode de izolare a formei native de ovalbuminǎ
Se iau douǎ ouǎ proaspete de gainǎ, se sparg şi se separǎ albuşul de
gǎlbenuş. Se reţin cele douǎ albuşuri şi li se mǎsoarǎ volumul.

Albuşurile separate se supun agitării magnetice, timp de 40 minute la

temperatura camerei (25oC), pentru ruperea membranelor.

Pentru precipitarea proteinelor albuşului de ou se adaugǎ un volum egal de

soluţie saturatǎ de sulfat de amoniu cu cel al volumului de albus. Soluţia saturatǎ de
sulfat de amoniu se adaugǎ treptat prin picurare cu ajutorul unei pâlnii de separare.
Dupǎ adăugarea întregii cantităţi de soluţie saturatǎ de sulfat de amoniu, proba se mai
agită încǎ 10 minute la temperatura camerei (25oC).
 Se filtreazǎ amestecul pentru înlǎturarea membranelor.

Filtratul obţinut se centrifugheazǎ 20 minute la 2 000 x g, la temperatura

camerei (25oC). În urma centrifugării se înlǎturǎ depozitul şi se reţine supernatantul.

La supernatantul obţinut se adaugǎ treptat o soluţie de acid acetic 2 M, pânǎ

când întreaga probǎ are un pH=4,6 (punctul izoelectric al ovalbuminei).

Precipitatul se centrifugheazǎ apoi 20 minute la 2 000 x g, la temperatura

camerei (25oC).

În urma acestei centrifugǎri se reţine precipitatul, care se solubilizeazǎ apoi

într-un volum minim de tampon fosfat 10 mM, pH 7.
METODE DE EXTRACTIE ŞI PURIFICARE A PROTEINELOR- II

b) Metode de cromatografie
Toate tipurile de cromatografie au la bază principiul, separării de molecule dintr-o
probă, în urma interacţiunii acestora cu două faze distincte din punct de vedere fizic: o
fază mobilă şi o fază staţionară sau fixă.
Faza mobilă poate fi un gaz sau un lichid şi are rolul de a desprinde proba de pe
faza staţionară lichidă sau solidă. O anumită probă biologică poate conţine unul sau mai
mulţi componenţi moleculari care se distribuie între faza mobilă şi cea staţionară.
Moleculele cu afinitate redusă pentru faza staţionară sunt rapid desprinse şi eluate
din sistem de către faza mobilă.
Faza mobilă va fi colectată la diferite intervale de timp diferite fracţiuni
conţinând compuşi diferiţî din proba biologică. Astfel biomoleculele se separă ca urmare
a distribuţiei lor distincte între cele două faze: faza mobilă şi faza staţionară.

TIPURI DE CROMATOGRAFIE
Tehnicile de cromatografie după scopul urmărit sunt analitice şi preparative.
Tehnicile analitice de cromatografie determină puritatea unei probe biologice.
Tehnicile preparative de cromatografie urmăresc purificarea a unor cantităţi mari
de produs biologic.
În funcţie de mecanismul de separare, cromatografia se împarte în:
- cromatografie de partiţie;
- cromatografie de adsorbţie;
- cromatografie de afinitate;
- cromatografie de excludere moleculară.
Nu există o distincţie clară între aceste tipuri de cromatografii.
Astfel toate tipurile de separări cromatografice sunt într-o anumită măsură procese
adsorbtive. Totuşi în anumite cazuri efectele adsorbtive sunt minore faţă de factorii
nespecifici de solubilitate care determină separarea diferitelor tipuri de molecule
biologice.
 Cromatografia de partiţie se bazează pe distribuţia solutului între cele două faze
lichide. Distribuţia solutului se bazează în primul rând pe diferenţa de solubilitate între
cele două faze. Distribuţia se poate determina prin utilizarea coeficientului de repartiţie,
Kp, unde:
Concentraţia substanţelor dizolvate în faza staţionară
Kd =
Concentraţia substanţelor dizolvate în faza mobilă
Faza staţionară constă într-un lichid imobilizat pe un suport solid. În această
categorie intră următoarele tipuri de cromatografie:
- cromatografia pe hârtie,
- cromatografia în strat subţire,
- gaz- lichid cromatografia.
Cromatografia de adsorbţie se referă la utilizarea unor schimbători de ioni ca
fază staţionară sau suport, care prezintă interacţiuni specifice între moleculele de solut şi
situsurile de legare de la suprafaţa fazei staţionare.
Aceste interacţiuni sunt reversibile şi pot fi de natură ionică, legături de hidrogen
sau interacţiuni hidrofobe.
Tehnicile de cromatografie de adsorbţie sunt reprezentate de cromatografia
schimbătoare de ioni.
Tehnicile de cromatografie de adsorbţie sunt utilizate pentru separarea în special a
macromoleculelor de tipul proteinelor şi acizilor nucleici.
Tehnicile de cromatografie de partiţie sunt utilizate mai ales pentru separarea
moleculelor mici de tipul aminoacizilor, monozaharidelor, acizilor graşi.
Cromatografia de afinitate constă în separarea unui component dintr-un amestec
pe baza reţinerii selective pe un suport insolubil pentru care manifestă un anumit grad de
afinitate.
Cromatografia de excludere moleculară constă în separarea componentelor
dintr-un amestec cuprinzând mai multe specii moleculare pe baza mărimii lor moleculare.
1. Cromatografia de partiţie
a) Cromatografia pe hârtie
În acest caz, distribuţia moleculelor de solut are loc între faza staţionară
reprezentată de hârtie de filtru care este puternic hidratată şi faza mobilă reprezentată de
un solvent. Această hârtie de filtru posedă anumite caracterisitici, fiind destinată special
analizei cromatografice.Între cele două faze, pe măsura deplasării solventului, de-a lungul
hârtiei, are loc o redistribuire continuă a acestor componente din amestecul ce urmează a
fi supus separării. Viteza de deplasare a acestor componente pe suportul de hârtie este
diferită datorită faptului că fiecare component prezintă un anumit coeficient de repartiţie
între cele două lichide
Pentru a reflecta repartiţia diverselor molecule între cele două faze lichide, cât şi
pentru a aprecia deplasarea sau “migrarea” pe hârtie a fiecărui component separat, s-a
introdus noţiunea de coeficient Rf , ce reprezintă raportul dintre distanţa (d) parcursă de
către fiecare component separat dintr-un amestec şi distanţa (D) parcursă de solvent.
Rf= d/ D.
Valoarea lui Rf este subunitară şi este caracteristică pentru un anumit component,
în condiţii identice de efectuare a cromatografiei. Cu cât un component are un R f mai
mare , cu atât el va migra mai rapid pe hârtia cromatografică.
Aplicaţii: separarea aminoacizilor liberi sau proveniţi din hidroliza proteinelor
izolate dintr-un material biologic.
Documentul analitic obţinut după separarea, colorarea şi identificarea
aminoacizilor se numeşte cromatogramă.
Acest tip de cromatografie, oferă posibilitatea determinării cantitative a unei
anumite fracţiuni izolate chiar dacă aceasta este în cantitate foarte mică. De asemenea
spoturile care apar pe cromatogramă pot fi tăiate, iar substanţele sunt extrase cu solvenţi
corespunzători.
Tipuri de cromatografie pe hârtie: în funcţie de direcţia de migrare a
solventului şi, respectiv, de separare a aminoacizilor, cromatografia pe hârtie prezintă mai
multe variante: cromatografie descendentă; cromatografie ascendentă; cromatografie
bidimensională;cromatografie circulară.
b) Cromatografia în strat subţire
Acest tip de cromatografie implică separarea pe un suport de material adsorbant –
dispus într-un strat subţire şi uniform- a unor componente dintr-un amestec supus
analizei. Stratul adsorbant poate fi constituit din următoarele tipuri de materiale: celuloză,
alumină, silicagel.
 Separarea se realizează în prezenţa unei faze mobile (solvent) adecvate care irigă
stratul subţire, determinând repartizarea diferită şi respectiv individualizarea
componentelor sub formă de spoturi. Acest tip de cromatografie se bazează atât pe
fenomene de partiţie cât şi de adsorbţie. Componentele supuse analizei cromatografice se
separă pe suportul care formează stratul subţire de adsorbant datorită competiţiei dintre
aceste componente şi solventul de irigare pentru centrii activi ai adsorbantului. Pe baza
afinităţii diferite a componentelor din amestecul de analizat pentru adsorbant, a gradului
de solubilitate în faza lichidă mobilă care irigă stratul subţire, precum şi a puterii de
adsorbţie selectivă a stratului, aceste componente se vor repartiza diferenţiat pe stratul
subţire deplasându-se pe distanţe diferite. Adsorbantul, substanţele de separat, lichidul de
irigare şi forţa capilară care pune în mişcare lichidul de irigare imprimă fiecărei substanţe
din amestecul de analizat o viteză caracteristică de migrare şi îi determină o anumită
poziţie pe stratul subţire. Ca şi în cromatografia pe hârtie, poziţia unui component separat
prin acest tip de cromatografie este definită tot prin valoarea Rf.
Avantajul cromatografiei în strat subţire este viteza ridicată comparativ cu cea a
cromatografiei pe hârtie. Permite identificarea unor substanţe necunoscute dintr-un
amestec.
Cromatogramele obţinute prin ambele tehnici (cromatografie pe hârtie şi
cromatografie în strat subţire) trebuie repetate, deoarece orice schimbare a condiţiilor de
mediu (temperatură, umiditate) poate afecta standardele.

c) Gaz- lichid cromatografia permite separarea substanţelor volatile. În acest

caz, faza staţionară este reprezentată de un solid inert ( de exemplu, pământ de diatomee)
care este impregant cu un lichid uşor volatil ( de exemplu, ulei de silicon sau polietilen
glicol). Solidul inert este împachetat într-o coloană îngustă şi relativ lungă (0.5 cm
diametru, 1-20 m lungime), în care este menţinut la o temperatură ridicată (în jurul valorii
de 200 ºC) şi care poate fi modificată în timpul analizei. Un tip recent de coloană numită
coloană capilară are un diametru interior de 0.25 mm, iar lungimea de 10-100 m.
Lungimea coloanei de cromatografie depinde de gradul de rezoluţie necesar.
Faza mobilă este reprezentată de un gaz inert (Ar, He, sau N 2), în care proba
analizată este evaporată. Rata de migrare a compusului prin coloană este determinată de
diferenţa de solubilitate dintre faza mobilă şi lichidul imobilizat. Componentele din probă
aflate în gazul de eluţie sunt detectate prin monitorizarea unor proprietăţi fizice cum ar fi
conductivitatea termică sau fenomenul de ionizare. Un astfel de detector este celula de
conductivitate termică care măsoară rezistenţa electrică dependentă de temperatură a
unui filament incandescent. Unitatea detectoare constă dintr-un filament de platină
străbătut de curentul electric. Rata de răcire a filamentului depinde de fluxul de gaz din
sistem şi de conductivitatea termică a gazului. Deoarece în timpul analizei gaz-
cromatografice, fluxul de gaz rămâne constant, doar schimbările conductivităţii termice
ale vaporilor din sistem vor modifica rezistenţa electrică a filamentului.
De obicei vaporii substanţelor organice separate din amestecurile supuse analizei
au conductivităţi termice mai mici decât gazul care reprezintă faza mobilă. Când gazul
care conţine vapori de compuşi organici, trece peste filament, rezistenţa electrică a
filamentului scade. Această schimbare a curentului este amplificată şi înregistrată de un
înregistrator. Variaţia rezistentei electrice depinde de cantitatea de vapori organici din
faza mobilă. Prin măsurarea semnalului electric determinat de un anumit compus organic
se poate cuantifica compusul respectiv în sistem. Fiecare compus aprae după un anumit
timp, numit timp de retenţie sub forma unui ”peak”. Timpul de retenţie reprezintă
intervalul de timp de la injactarea probei în sistem şi până la apariţia unui semnal sub
formă de peak pe înregistrator. Înălţimea peak-ului, repectiv aria sa depinde de cantitatea
de compus din sistem. Identificarea compusului se face prin compararea timpului de
retenţie al unui compus organic cu cel al unui etalon.
Celula de conductivitate termică are un nivel redus de sensibilitate de
aproximativ 5 μg. Un alt tip de detector cu nivel de sensibilitate mult mai mare este
detectorul cu ionizare în flacără a cărui nivel sensibilitate atinge pragul de 10 -15 μg copus
separat din amestec.

2. Cromatografia de adsorbţie
a) Cromatografia pe schimbători de ioni implică trecerea pe o coloană
încărcată cu un anumit schimbător de ioni, a unui amestec de obicei, proteic; aceste
proteine sunt separate, respectiv fracţionate, pe baza procesului de schimb ionic.
 Mecanismul separării (fracţionării) cromatografice se bazează pe stabilirea unor
multiple legături de natură electrostatică între sarcinile electrice ale macromoleculelor
analizate (proteine, acizi nucleici) şi sarcinile electrice de semn contrar ale
schimbătorului de ioni.
Sub acţiunea unui eluent care conţine un ion cu o afinitate mai mare pentru
schimbătorul de ioni, aceste legături electrostatice pot fi desfăcute; macromoleculele sunt
eliberate de pe schimbătorul de ioni şi astfel sunt eluate din coloană. Între ionul
eluentului şi macromoleculele legate electrostatic la suprafaţa schimbătorului de ioni,
există o competiţie, aceste macromolecule fiind înlocuite de ionul competitiv. Există o
corelaţie între numărul de legături electrostatice realizate de proteine cu răşina
schimbătoare de ioni şi concentraţia ionilor competitivi. Astfel, existenţa unui număr
mare de legături electrostatice reclamă concentraţii mai mari ale ionilor competitivi,
necesare pentru desfacerea acestor legături şi, implicit, pentru eliberarea şi ieşirea de pe
coloană (eluţia) proteinei respective. Aşadar separarea sau fracţionarea diferitelor tipuri
de proteine, care diferă între ele prin încărcătura lor electrică sau prin distribuţia diferită a
sarcinilor în molecula lor necesită concentraţii diferite ale ionului competitiv cu care se
face eluţia.
În general, separarea diferenţiată a proteinelor dintr-un amestec prin
cromatografie schimbătoare de ioni, respectiv stabilirea eterogenităţii proteinelor, se
realizează pe două căi:
- prin desfacerea legăturilor dintre proteină şi schimbătorul de ioni şi schimbătorul
de ioni, proces determinat de creşterea concentraţiei ionilor competitivi (respectiv
a sărurilor din eluent);
- prin reducerea numărului de sarcini electrice ale moleculelor proteice, proces
determinat de modificări ale valorilor de pH.
Schimbătorii de ioni se clasifică în funcţie de compartarea lor în procesele de
schimb ionic în:
- cationiţi sau schimbători de ioni cu proprietăţi acide;
- anioniţi sau schimbători de ioni cu proprietăţi bazice;
Ca şi schimbători de ioni se utilizează: derivaţi de celuloză (DEAE (dietil- amino-
etil)- celuloza- anionit puternic bazic; carboximetil celuloza- cationit moderat sau slab
 acid; sulfoetil celuloza- cationit puternic acid). Există anumite răşini schimbătoare de
ioni obţinute prin copolimerizarea stirenului sau a acidului acrilic cu divinil benzenul
(agent de introducere în moleculă a unor legături încrucişate).
Aplicaţii: Schimbătorii de ioni prezintă o importanţă deosebită în biochimia
analitică şi preparativă modernă, fiind utilizaţi pentru separarea, izolarea, purificarea
şi caracterizarea unor componente biochimice ca : proteine, peptide, enzime, acizi
nucleici, poliglucide, etc.

3. Cromatografia de afinitate
Acest tip de cromatografie se bazează pe abilitatea multor proteine de a se lega
specific (necovalent) de anumiţi liganzi. Astfel prin această tehnică se pot purifica aceste
proteine. O moleculă numită ligand, se leagă covalent de o matrice poroasă, inertă. Când
o soluţie proteică impurificată este trecută prin coloana cu matricea respectivă de care
este ataşat ligandul specific pentru proteina de interes, are rol legarea proteinei respective,
iar celelalte componente ale amestecului sunt eluate cu tampon din sistem. Proteina
legată este eliberată prin schimbarea condiţiilor de eluare cu un compus care are o
afinitate mai mare pentru ligand decât proteina respectivă.
Matricea cromatografică trebuie sa fie inertă din punct de vedere chimic, foarte
poroasă şi să aibă un număr mare de grupări funcţionale capabile de legarea covalentă a
ligandului. O astfel de matrice este cea de agaroză care are ca şi grupări funcţionale un
număr mare de grupări hidroxil. Dacă ligandul are o grupare aminică primară care nu este
esenţială pentru legarea proteinei de interes, ligandul se ataşează covalent la agaroză în
două etape:
1) agaroza reacţionează cu bromura cianogenă devenind “activată”;
2) ligandul reacţionează cu agaroza activată pentru a se lega covalent de aceasta.
O variantă a cromatografiei de afinitate este cromatografia de imunoafinitate
care utilizează anticorpi monoclonali care prezintă afinitate doar de pentru proteina de
interes.
4. Cromatografia de excludere moleculară
Principiul acestei metode cromatografice constă în separarea compuşilor organici
dintr-un amestec prin trecerea prin“sita moleculară” creată de reţeaua unui gel hidrofil.
 Anumite substanţe hidrofile de tipul dextranului (cu denumirea comercială
Sephadex) sau poliacrilamidei (Biogel-P) prezintă proprietatea ca în contact cu apa sau
soluţii saline să se imbibe rapid, formând geluri de diferite porozităţi. Gelurile obţinute
sunt insolubile în mediu apos şi sunt stabile într-un interval larg de pH (2-9). Asemenea
geluri împachetate sub formă de coloane cromatografice sunt folosite pentru fracţionarea
diferitelor amestecuri de componente biochimice pe baza mărimii moleculelor, respectiv
a taliei lor moleculare.
Filtrarea în gel reprezintă o metodă de separare cromatografică a diferitelor
substanţe dintr-un amestec pe baza diferenţelor de mărime moleculară. Gelul are
proprietatea unei site moleculare (“ molecular sieving”) al cărui efect se manifestă prin
deplasarea diferenţiată a moleculelor ce parcurg coloana de gel, în funcţie de
dimensiunile acestora. În lichidul care filtrează din coloană apar mai întâi molecule cu
dimensiuni mari (nereţinute), apoi cele cu dimensiuni mici (reţinute). De aceea acest
proces de separare a componentelor pe baza diferenţei de dimensiune a moleculelor
poartă denumirea de cromatografie de excludere moleculară sau gel-filtrare.
Teoria gel-filtrării
Moleculele cu dimensiuni mici pot difuza în lichidul din interiorul particulelor
care compun gelul, si astfel eluţia lor din coloană este încetinită. Moleculele cu
dimensiuni mari nu pot penetra particulele de gel şi, în consecinţă, trec în faza lichidă
exterioară care înconjoară aceste particule, înaintând astfel liber prin coloană odată cu
lichidul care curge prin stratul de gel. Aceste molecule sunt eluate primele din coloană,
deoarece viteza lor de curgere este mai mare decât a moleculelor mici care difuzează în
interiorul particulelor de gel.
În funcţie de dimensiunea moleculelor, fiecare substanţă prezintă μn anumit
coeficient specific de distribuţie (Kd) între faza interioară (volumul lichidului din
interiorul particulelor de gel) şi faza exterioară (volumul lichidului din afara acestor
particule). Coefientul de distribuţie are o valoare cuprinsă între 0 şi 1.
Substanţele cu Kd =0, sunt complet excluse din lichidul existent în interiorul
reţelei de gel, fiind nevoie de un anumit volum de eluent V0 pentru îndepărtarea lor.
Substanţele cu Kd =1 vor fi excluse din coloană după irigarea acesteia cu un
volum suplimentar de eluent (Vi).
 În funcţie de aceste volume, volumul necesar de eluent (Ve)pentru îndepărtarea
tuturor compuşilor organici dintr-un amestec introdus în coloana, este dat de formula:
Ve= V0+ Kd Vi.
Aplicaţii:
- izolarea şi fracţionarea macromoleculelor (proteine, enzime etc);
- concentrarea substantelor cu masă moleculară mare, în vederea analizei lor
ulterioare;
- desalifierea moleculelor proteice.

O variantă a tipurilor de cromatografie cu fază mobilă lichidă este lichid

cromatografia de înaltă performanţă (HPLC= High – Performance Liquid
Chromatography). Această tehnică constă în forţarea fazei mobile să treacă prin coloana
foarte fin împachetată şi compactă ceea ce determină crearea unei suprapresiuni la nivelul
injectorului pentru probă. Această presiune poate atinge valori de până la 400 barr, în
funcţie de debitul fazei mobile, de vâscozitatea fazei mobile şi de dimensiunile fazei
staţionare. Această tehnică are o rezoluţie şi viteză de analiză net supeioare celorlalte
tehnici de cromatografie.

Aplicatie practica:

Purificarea formei native de ovalbuminǎ prin cromatografie pe Blue-Sepharose

Cromatografia de afinitate ca metodǎ de separare calitativǎ, dar şi cantitativǎ, se

bazeazǎ pe specificitatea legǎrii dintre componentul de separat (proteina) şi o anume
substanţǎ. Legarea celor doi compuşi se face prin interacţiuni necovalente extrem de
specifice. Substanţa care prezintǎ afinitate faţǎ de proteinǎ se gǎseşte de obicei
imobilizatǎ pe un suport inert. Deşi legarea este specificǎ, forţele implicate sunt în
general interacţiuni chimice, cum sunt legǎturile de hidrogen. Alegerea tamponului şi
concentraţiei se bazeazǎ pe minimalizarea interacţiunilor nespecifice şi maximizarea
atracţiilor specifice dintre ligand şi proteinǎ. Eficienţa legǎrii ligandului poate fi
determinatǎ în câteva moduri: mǎsurarea diferenţei de adsorbţie în UV înainte şi dupǎ
cuplare, dizolvarea unei porţiuni de gel ce conţine ligandul, fǎcându-se apoi o dozare de
proteinǎ, analiza aminoacizilor sau dozarea întregii cantitǎţi de azot.
Un eluent este ales atunci când are o afinitate mai mare pentru ligand decât
proteina, în aşa fel încât sǎ înlocuiascǎ proteina. Dacǎ nu se cunosc eluenţii specifici
pentru proteina de interes, atunci poate fi folositǎ eluarea nespecificǎ (de exemplu,
folosirea unui gradient de sare, modificarea pH-ului sau a temperaturii). O altǎ cale este
aceea de a creşte concentraţia tamponului de eluţie la un nivel imediat sub cel la care
proteina doritǎ începe sǎ fie eluatǎ, urmatǎ de o creştere superficialǎ a gradientului.
Cromatografia pe Blue-Sepharose conţine ca şi ligand, colorantul Cibacrom
Blue F3G-A, care prezintǎ afinitate pentru mai multe enzime. Colorantul albastru este
ataşat covalent la gelul de agarozǎ şi poate lega mai multe proteine incluzând kinaze,
dehidrogenaze şi alte enzime care au ca şi cofactori NAD. De asemenea, mai leagǎ câteva
proteine neenzimatice ca albumina, lipoproteinele, factorii enzimatici din sânge. Unele
proteine se combinǎ biospecific cu colorantul datoritǎ structurii similare pentru cofactorul
nucleotidic, în timp ce albumina şi interferonul se leagǎ într-o manierǎ mai puţin
specificǎ, prin interacţiuni electrostatice şi/ sau hidrofobe de liganzi anioici de tip
aromatic.
Proteinele adsorbite biospecific pot fi eluate cu concentraţii scǎzute de cofactori
liberi, în timp ce proteinele legate mai puţin specific necesitǎ folosirea unor concentraţii
mai mari de cofactori sau sare. Studii cristalografice utilizând raze X, aratǎ cǎ Cibacrom
Blue F3G se leagǎ specific de alcool dehidrogenaza din ficat. Blue Sepharose CL 6B
permite purificarea câtorva proteine fǎrǎ a fi necesarǎ o preparare îndelungatǎ a unui şir
de geluri. Concentraţia colorantului cuplat este de aproximativ 2μM/ ml de gel hidratat.
Capacitatea de legare a proteinelor este diferitǎ: pentru albumina sericǎ este de
aproximativ 5mg/ ml de gel hidratat în tampon fosfat de sodiu la 200 C.
Purificarea formei native de ovalbuminǎ se realizeazǎ prin cromatografie de
afinitate pe coloanǎ, utilizând Blue-Sepharose (BioRad). Aceastǎ matrice inertǎ nu
poate reţine ovalbumina, însǎ reţine majoritatea proteinelor din albuşul de ou.

Coloana de cromatografie utilizatǎ conţine un volum de 60 ml Blue Sepharose.

Cantitatea de proteinǎ care se încarcǎ pe coloanǎ nu trebuie sǎ depǎşeascǎ concentraţia
de 10 mg proteinǎ/ ml. de Blue Sepharose.
 Proba de ovalbuminǎ se încarcǎ pe coloanǎ şi se elueazǎ cu un volum de
coloanǎ de tampon forfat 10 mM, pH 7.

Fracţiile de ovalbuminǎ obţinute sunt colectate în eprubete separate, iar apoi li

se mǎsoarǎ absorbanţa la 280 nm (spectrofotometru Jasco V-530 UV-VIS).

Pentru a reutiliza coloana de cromatografie, aceasta trebuie regeneratǎ.

Regenerarea coloanei de Blue Sepharose se face prin spǎlarea acesteia cu apǎ distilatǎ
(de minim cinci ori), iar apoi cu 300 ml soluţie de uree 6 M + clorurǎ de sodiu 2 M.
 METODE DE DOZARE A PROTEINELOR

Existǎ mai multe metode pentru determinarea concentraţiei proteice, acestea

depinzând de cantitatea de proteinǎ accesibilǎ determinǎrii, de prezenţa unor compuşi
care pot interfera în calitatea metodei utilizate. Majoritatea tehnicilor de dozare a
proteinelor au la baza principiul spectrofotometriei si colorimetriei. Pentru intelegerea
acestor tehnici este necesara cunoasterea notiunilor generale de fotometrie.

NOŢIUNI GENERALE DE FOTOMETRIE

Definiţii
Fotometria se ocupă cu studiul şi măsurarea mărimilor caracteristice radiaţiilor luminoase, mai
exact cu studiul absorbţiei energiei luminoase la trecerea prin soluţii.
Colorimetria se ocupă cu studiul şi măsurarea intensităţii culorii unor compuşi coloraţi generaţi
prin reacţii chimice prin compararea directă cu o soluţie etalon
Spectrofotometria se ocupă cu studiul şi măsurarea absorbţiei energiei luminoase în funcţie de
concentraţia soluţiei unor compuşilor chimici incolori.

Lumina naturală contine toate lungimile de undă, începând cu domeniul ultraviolet (UV),
continuând cu cel vizibil (VIS) şi terminând cu infraroşu (IR).
Când lumina trece printr-o soluţie a unei substanţe , ea suferă o serie de modificări dependente
de natura substanţei. O radiaţie de o anumită lungime de undă şi energie parcurgând un mediu,
poate fi absorbită parţial sau total. În cazul în care nu există nici o absorbţie, mediul este transparent
iar energia radiaţiei care străbate mediul rămâne practic nemodificată, dar poate scădea în mod
apreciabil viteza radiaţiei. Când o parte din energia radiantă este absorbită, în dreptul lungimii de
undă absorbite, apar în spectru, linii sau benzi întunecate. În acest caz se vorbeste de spectrul de
absorbţie al compusului respectiv.
Diferitele lungimi de undă ale radiaţiei luminoase sunt absorbite în mod diferit în funcţie de
particularităţile energetice ale moleculelor străbătute. Absorbţia radiaţiei este echivalentă cu un
transfer de energie către mediul parcurs, depinzând de energia radiaţiei şi de natura moleculelor din
mediul parcurs.
Starea de excitaţie a unei molecule care a absorbit o cuantă luminoasă este de foarte scurtă
durată (10-12 sec.). De obicei această energie se pierde foarte repede sub formă de caldură.
Măsurarea absorbţiei radiaţiei în funcţie de energia ei respectiv de lungimea ei de undă, ca şi de
particularităţile mediului parcurs, constituie domeniul spectrofotometriei de absorbţie.

Principiu
Dacă un mediu absorbant, având o anumită grosime, este parcurs de o radiatie luminoasă
monocromatică de intensitate I0, o parte a acestei radiaţii este absorbită (I a), iar o parte este

transmisă (It). În acest caz, I0 = Ia+ It. De aici rezultă că transmisia (T) este egală cu raportul .

unde: I0 = intensitatea luminoasă a fasciculului iniţial;

Ia = intensitatea luminoasă absorbită;
It = intensitatea luminoasă transmisă (a fasciculului care a traversat mediul).
Ca urmare, absorbţia reprezintă micsorarea energiei cinetice a unui fascicul la traversarea
lui printr-o soluţie.
Conform legii Lambert – Beer, între intensitatea radiaţiei transmise şi intensitatea radiaţiei
incidente există următoarea relaţie exponenţială:

It= I0 x e-kcd de unde:

e = baza logaritmilor naturali;

k = constanta de absorbtivitate;
d = grosimea stratului parcurs;
c = concentratia molară (M) a soluţiei.

Trecând de la logaritmi naturali la cei zecimali, obţinem:

sau
unde ε = coeficientul de absorbanta (extinctie) molară.

Relaţia dintre ε şi k este dată de raportul

Atât coeficientul de absorbtivitate (k) cât şi coeficientul de absorbanta molară (ε) depind de
lungimea de undă a radiaţiei luminoase şi de proprietăţile absorbante ale substanţei.
Coeficientul de absorbanta molară reprezintă absorbanţa unei soluţii de concentraţie 1M,
având grosimea stratului de 1 cm.
 Transmisia scade logaritmic cu concentraţia şi grosimea stratului de soluţie străbătut.
Logaritmul zecimal cu semn schimbat al transmisiei (-lgT sau lg1/T) este direct proporţional
cu concentraţia şi grosimea stratului. De obicei, grosimea stratului soluţiei este constantă şi
reprezintă lăţimea cuvei de spectrofotometru, care în condiţii standard, este de 1 cm. Logaritmul
cu semn schimbat al transmisiei procentuale se numeste absorbanţă (A) sau densitate optică

(DO).

După legea Lambert – Beer, absorbanta este direct proportională cu concentraţia soluţie (A=
ε c d ).
Pornind de la valoarea absorbantei A= 2- lgT şi dând diferite valori transmisiei, obţinem
următoarea corespondenţă între absorbanta (A) şi transmisie (T):

A ∞________________________________________________0
2 1

1 10
T 0_________________________________________________100%
Această corespondenţă între A şi T se poate observa cu uşurinţă pe scala instrumentului
de măsură: galvanometrul spectrofotometrului SPEKOL- Zeiss Jena sau a altor fotometre.
Din relaţia : A= ε x c x d se poate calcula concentraţia (c):

Este necesar să se cunoască valoarea coeficientului de absorbanta molară (ε M), care se

exprimă în M-1cm-1 şi care depinde strict de lungimea de undă. De exemplu: ε M pentru NADH sau
NADPH este 6.22x103 M-1cm-1 la lungimea de undă λ=340 nm şi de numai 3.4x10 3 M-1cm-1 la
lungimea de undă λ=365 nm. Pentru uşurarea calculelor, în laborator se foloseşte submultiplul
coeficientului de absorbanta molara εM, adică coeficientul de absorbanta milimolara , εmM.
O importanţă cu totul deosebită o are în biochimie cunoşterea lui εmM pentru cele două
piridinnucleotide reduse NADH şi NADPH, deoarece marea majoritate a reacţiilor enzimatice de
determinare a unor metaboliţi au la bază reacţia directă sau în sistem de reacţii cuplate, o reacţie
catalizată de o dehidrogenază NAD(P)- dependentă ce evoluează cu reducerea sau oxidarea
acestor piridinnucleotide.
Formulele de calcul utilizate în cazul unor astfel de determinări vor fi prezentate în cadrul
lucrărilor respective.
 Prezentăm mai jos spectrul de absorbţie al piridinnucleotidelor reduse şi oxidate.

Aparatura utilizată în fotometrie

Instrumentele utilizate pentru măsurarea intensităţii radiaţiei luminoase se numesc în
general fotometre. În funcţie de lăţimea benzii spectrale utilizate, aceste aparate se împart în
colorimetre (fotocolorimetre) şi spectrofotometre.
În funcţie de lăţimea benzii spectrale şi de tehnica de măsurare, metodele utilizate la
determinări bazate pe absorbţia radiaţiei luminoase se împart în metode colorimetrice şi metode
fotometrice.
Metodele colorimetrice se bazează pe compararea absorbţiei a două soluţii de
concentraţii diferite ale aceleiaşi substanţe colorate. Măsurătorile se execută într-un domeniu larg
al spectrului, eventual în lumina albă, rezultatele obţinute fiind independente de puritatea
spectrală a luminii utilizate. În colorimetrie nu se fac determinări de absorbanta, ci numai
comparări vizuale (colorimetrie vizuală) sau fotoelectrice (fotocolorimetrie). Exemple de
colorimetre sunt: colorimetrul Dubosq, fotometrul Pulfrich şi fotocolorimetrul FEK-M. În timp ce
colorimetrul Dubosq utilizează lumina albă, fotometrul şi fotocolorimetrul utilizează lumina
monocromatică realizată de filtre colorate. Aceste măsurători sunt considerate imprecise şi de
aceea nu vor constitui obiectul descrierilor noastre.
Instrumentele utilizate în spectrofotometria de absorbţie se numesc spectrofotometre.
Indiferent de tipul de construcţie si de gradul de automatizare, principalele părţi componente ale
unui spectrofotometru sunt: sursa luminoasă, monocromatorul, dispozitivul cuvelor, dispozitivul
fototraductor, instrumentul de măsură şi dispozitivul de înregistrare a datelor.
Sursa luminoasă pentru domeniul vizibil al spectrului este o lampă de incadescenţă cu
filament de wolfram (cu domeniul de emisie între 330-1000 nm), iar pentru domeniul ultraviolet-
lămpi cu descărcare în gaze, cum ar fi cea cu deuteriu (care emite între 200-400 nm) sau cu
mercur. Spre deosebire de lampa de deuteriu, care asigură un spectru continuu în domeniul UV,
lampa de mercur emite radiaţii discontinue. Benzile de emisie ale lămpii cu mercur sunt la 334
nm, 365 nm, 405 nm, 436 nm şi 546 nm.
Monocromatorul este un selector de radiaţii spectrale care permite obţinerea unui
fascicul de radiaţie monocromatică. Lumina monocromatică este alcătuită din radiaţii care au o
singură lungime de undă (λ) şi care este percepută de ochiul omului ca având o singură culoare.
În cazul fotometrelor, monocromatorul este reprezentat de filtre de culoare, iar în cazul
spectrofotometrelor, de prisme sau reţele (grile) de difracţie.
În cazul fotometrelor cu linii spectrale, sursa de lumină este o lampă cu mercur, care
emite benzi de emisie. Cu ajutorul unor filtre de interferenţă, se izolează radiaţii monocromatice
cu lăţimea benzii de 1nm. Aceste aparate sunt convenabile pentru majoritatea analizelor
biochimice dintr-un laborator clinic.
Spectrofotometrele moderne au radiaţia monocromatică exprimată ca număr de undă ( ) şi
nu ca lungime de undă (λ), cu precizarea că numărul de undă se exprimă în cm-1, iar lungimea de undă
în nm (mμ).
Raţiunea este că energia unei cuante de lumină (foton) este direct proporţională cu

numărul de undă şi invers proporţională cu lungimea de undă:

Lungimea de undă Număr de undă

λ [nm]

200 50 000
300 33 333
400 25 000
500 20 000
600 16 666
700 14 286
800 12 500
900 11 111
1000 10 000

Dispozitivul cuvelor cuprinde lăcaşurile pentru una sau mai multe cuve care conţin
soluţiile de cercetat. Cuva martor conţine numai solventul, în general apă distilată, în timp ce
cuva de măsurat conţine soluţia de analizat. Cuvele pot fi din sticlă sau masă plastică pentru
soluţii care absorb energia luminoasă în domeniul vizibil al spectrului sau din cuarţ pentru
domeniul ultraviolet. Grosimea standard a stratului de soluţie din cuva de reacţie este de 1 cm.
Sistemul portcuvă poate fi termostatat sau netermostatat, după caz.
Se utilizează termostatarea cuvelor când se urmăreşte activitatea enzimatică.
 Dispozitivul fototraductor reprezintă instrumentul care permite transformarea energiei
luminoase transmise de soluţie în energie electrică. Fototraductoarele utilizate sunt diferite din
punct de vedere al sensibilităţii lor şi al domeniului spectral utilizat.
Acestea pot fi: fotodiode, fotocelule sau fotomultiplicatoare.

Instrumentul de măsură poate fi un galvanometru sau un potenţiometru înregistrator şi

afişaj digital sau înregistrare pe hârtie.

Dispozitivul de înregistrare a datelor, prezent la spectrofotometrele moderne dotate cu

microprocessor, este reprezentat de diferite tipuri de imprimante grafice.
Cele mai moderne tipuri de spectrofotometre sunt computerizate, operaţiile putând fi
automatizate, iar prelucrarea datelor facându-se automat.

Din punct de vedere constructiv, diferitele tipuri de spectrofotometre pot fi clasificate

astfel:
- spectrofotometre monofascicul;
- spectrofotometre dublu fascicul: a) cu fascicule identice (fascicul despicat sau
“split beam”);
b) cu fascicule neidentice (cu dublu fascicul cu λ
diferite sau “double beam wave-length”);
- spectrofotometre cu “succesiune de diode” (“diode array spectrophotometer”).

Spectrofotometrul monofascicul este prevăzut cu un singur monocromator, cuva martor

şi cuva cu probă fiind plasate succesiv în calea fasciculului monocromatic unic.
În cazul spectrofotometrului VSU-2 (Zeiss Jena), fotocurentul este determinat prin
compensare potenţiometrică şi se raportează la fotocurentul cuvei martor.
Spectrofotometrul Spekol (Zeiss Jena), pe care îl vom utiliza la efectuarea determinărilor
practice, lucrează la lungimi de undă cuprinse între 350-700 nm, având ca sursă de lumină o
lampă de incandescenţă cu filament de wolfram, iar ca monocromator, o reţea de difracţie.
În cazul spectrofotometrului Spekol, pentru citirea absorbanţei se foloseşte metoda
deviaţiei: se aşează succesiv în calea luminii monocromatice, cuva martor şi apoi cuva cu probă şi
se citeşte deviaţia acului indicator al galvanometrului care este etalonat în valori de transmisie şi
de absorbanta.
 Etalonarea aparatului se face faţă de apă distilată, pentru transmisia 0 (zero) - când
fasciculul de lumină monocromatică este obturat şi pentru transmisia 100% - când energia
fasciculului trece integral prin cuva cu apă distilată.
Etalonarea aparatului se execută pentru fiecare schimbare a lungimii de undă cât şi în
cazul aceleiaşi lungimi de undă – când citirile durează mai mult deoarece aparatul prezintă o
alunecare în timp a semnalului electric.
Spectrofotometrul cu dublu fascicul identic este prevăzut cu un singur monocromator.
Despicarea fasciculului este realizată de un disc “despicator” (“chopper”), care se roteşte cu
turaţie mare. Radiaţia monocromaţică trece alternativ fie prin spaţiul gol al discului “chopper”, fie
este reflectată de disc spre o oglindă realizându-se un al doilea fascicul paralel, de aceeaşi
lungime de undă.
În calea unuia dintre fascicule este plasată cuva martor, iar în calea celui de-al doilea,
cuva cu probă. Instrumentul de măsură înregistrează diferenţa de absorbanta dintre cele două
cuve, la aceeaşi lungime de undă.
Un astfel de aparat este Specord UV-VIS (Zeiss Jena) care permite înregistrarea automată
a spectrului de absorbţie al unui compus chimic.
Spectrofotometrul cu dublu fascicul cu lungimi de undă diferite este prevăzut cu
două monocromatoare care lucrează independent. Radiaţia monocromatică a unuia dintre
monocromatoare este reflectată de o oglindă spre discul “chopper” care la rândul lui o reflectă
spre cuva unică cu probă. Radiaţia monocromatică a celui de-al doilea monocromator, la altă
lungime de undă, poate străbate cuva de reacţie cu probă alternativ, când în calea sa, discul
“chopper” prezintă spaţiul gol. Aceeaşi cuvă de reacţie este deci străbătută alternativ de două
radiaţii monocromatice, instrumentul de măsură înregistrând diferenţa de absorbanta la cele două
lungimi de undă diferite. Aparatul este astfel utilizat pentru înregistrarea spectrelor diferenţiale.
Spectrofotometrul cu “succesiune de diode” este o realizare recentă.
Principiul de construcţie al acestui aparat este complet diferit de cel al
spectrofotometrelor clasice, aparatul neavând nici o piesă în mişcare.
În cazul spectrofotometrelor clasice, realizarea unei lumini monocromatice cuprinsă între
200nm şi 900nm, necesită rotirea monocromatorului, ceea ce durează un anumit interval de timp.
La spectrofotometrul cu succesiune de diode, sursa de lumină emite lumină albă, cuprinsă
între 200nm şi 900nm, care trece integral prin cuva de reacţie. O parte dintre aceste radiaţii sunt
absorbite de compusul chimic din cuvă; ceea ce se transmite, purtând benzile de absorbţie
caracteristice compusului chimic, întâlneşte reţeaua de difracţie holografică, radiaţiile
monocromatice fiind reflectate pe o suprafaţă acoperită de o succesiune de diode, fiecare din ele
realizând un fotocurent proporţional cu intensitatea radiaţiei monocromatice incidente. Se
realizează astfel instantaneu (sub 0.1 sec.) întregul spectru de absorbţie al compusului cercetat.
Prelucrarea datelor se face de către un computer.
Spectrofotometrul permite realizarea unui studiu dinamic în timp al întregului spectru de
absorbţie al unui compus chimic.

Determinarea concentraţiei unui compus cu ajutorul curbei de etalonare

Curba de etalonare (curba standard) urmăreşte stabilirea corelaţiei între concentraţia unui
compus şi absorbanta sa în limitele legii Lambert – Beer. Se porneste de la faptul că două probe
prelucrate identic, una de concentraţie cunoscută, numită standard şi alta de concentraţie
necunoscută, numită proba de analizat, vor avea extinctii proporţionale cu concentraţiile
compusului respectiv. Este deci suficient să se măsoare absorbanta unei probe de concentraţie
cunoscută pentru ca apoi să se poată calcula concentraţia probei de analizat. Pentru mai multă
rigurozitate, se măsoară absorbanta mai multor probe cu concentraţie cunoscută, în ordine
crescătoare. Absorbantele se citesc faţă de proba martor, care conţine toţi reactivii utilizaţi la
analiză cu excepţia compusului care trebuie determinat. Valorile obţinute se reprezintă grafic
aşezând pe ordonată valorile absorbantei iar pe abscisă cele ale concentraţiei. Se obţine o linie
care trece prin origine şi care este dreaptă pe o anumită porţiune. În afara domeniului de
liniaritate, legea Lambert-Beer nu mai este respectată şi, în consecinţă, această porţiune a curbei
nu poate fi utilizată. Raportând absorbantele unor soluţii de concentraţie necunoscută la curba
standard se poate determina pe abscisă concentraţia lor.
În domeniul de liniaritate, curba standard este caracterizată de un factor de pantă (F) care

reprezintă raportul dintre concentraţia soluţiei şi absorbanta obţinută. Deci Deoarece

concentratia se poate exprima în μg sau μmoli, factorul de pantă devine: , sau

De regulă, F se calculează ca medie a valorilor individuale a fiecărui punct de pe curba

standard. Înmulţind direct absorbanta probei necunoscute (ΔAp) cu factorul de pantă F, se poate
afla direct concentraţia probei necunoscute. Trebuie menţionat că atât curba de etalonare cât şi
factorul de pantă al curbei sunt proprii setului de reactivi şi aparatului cu care se lucrează.
Schimbarea reactivilor sau a aparatului de fotometrare impune efectuarea unei noi curbe standard.
 Aplicatie practica: determinarea concentratiei ovalbuminei purificate
Concentraţia proteinei poare fi determinatǎ spectrofotometric prin absorbţie în
UV la 280 nm şi prin metodele colorimetrice: Lowry, Bradford şi Gornall.

1) Absorbţia în UV la 280 nm: În luminǎ ultravioletǎ, proteinele prezintǎ un maxim de

absorbţie la λ=280 nm datoritǎ existenţei aminoacizilor cu nucleu aromatic (tirozinǎ,
triptofan). În soluţii apoase, proteinele manifestǎ activitate opticǎ levogirǎ datoratǎ
aminoacizilor constituenţi care prezintǎ o aceeaşi activitate opticǎ. Pe aceastǎ proprietate
se bazeazǎ metoda spectrofotometricǎ de determinare cantitativǎ a proteinelor. Citirea
probelor se desfǎşoarǎ rapid, fǎrǎ adiţia altui reactiv în probǎ. Dependenţa dintre
concentraţia proteinei şi extincţie este liniarǎ.
Toate fractiunile obtinute dupa eluarea probei pe coloana de Blue Sepharose
sunt masurate spectrofotometric la 280 nm. Probele cu continut proteic (cele care au
absorbtie, extinctie mai mare de 0.5) sunt retinute si colectate intr-un vas separat. Se va
determina concentratia proteica totala pe baza metodei Gornall.
METODA GORNALL DE DOZARE A PROTEINELOR

Principiul metodei: peptidele şi proteinele formează cu ionul de cupru (Cu2+) în mediul

alcalin un complex de culoare violetă (“reacţia biuretului”) care se fotometrează la 546 nm.
Reactivi necesari:
1. reactiv Gornall (reactiv biuret): 1.5 g Cu SO 4·5H2O + 6 g tartrat de Na şi K
(KNaC4O6H4 ·4H2O = sare Seignette) se dizolvă în 500 ml apă distilată. Se adaugă, sub agitare,
300 ml NaOH- 10% (masă/ volum) şi se aduce la 1000 ml cu apă distilată. Reactivul este stabil
timp de câteva luni la temperatura camerei. Apariţia de precipitat indică faptul că reactivul trebuie
schimbat.
2. Soluţie de dezoxicolat de sodiu - 5% în apă (masă/ volum). Se păstrează în congelator
timp îndelungat.
3. Soluţie etalon de albumină serică bovină – 10mg/ ml.

Tehnica de lucru:
 Într-o eprubetă de 10 ml se pipetează 0.05 ml ser şi 0.45 ml apă distilată, apoi se adaugă 2
ml reactiv Gornall şi se agită. După 15 minute, se citeşte absorbanta la 546 nm, în cuve de
d=1cm. Paralel cu proba de ser se lucrează proba martor şi probele etalon. Se lucrează conform
tabelului următor:

Nr. ml H2O ml etalon ml ser ml reactiv mg. A ΔA

eprubetei distilată Gornall proteină
0 0.5 - - 2 -
E1 0.4 0.1 - 2 1
E2 0.3 0.2 - 2 2
E3 0.2 0.3 - 2 3
E4 0.1 0.4 - 2 4
P 0.45 - 0.05 2 ?

Calculul concentratiei de proteină se face pe baza curbei de etalonare şi a factorului de

pantă, F ţinând cont de cantitatea de ser luată în determinare. Proteinemia se exprimă în mg/ ml
ser. Serul normal are o concentraţie de circa 70 mg/ ml.
Daca absorbanta probei proteice este mai mica decat absorbanta celui mai mic
standard (E1), concentratia proteica se determina prin metoda Lowry.

3) Metoda Lowry de dozare a proteinelor

METODA LOWRY DE DOZARE A PROTEINELOR

Principiul metodei:
Peptidele şi proteinele (legaturile peptidice din componenta lor) formează cu reactivul
cupru -tartrat în mediu alcalin un complex proteină-cupru care ulterior va reduce reactivul
fosfomolibdeno-fosfowolframic la un compus de culoare albastră, care se fotometrează la 660
nm.
Avantajul metodei: permite determinarea unei cantităţi de proteină în probă de minim 5
μg, spre deosebire de metoda Gornall care permite dozarea unei cantităţi de proteină de minim 1
mg.

Reactivi necesari:
 1. Carbonat de sodiu anhidru- 2% (masă/ volum) în Na OH 0.1N- 25 ml= reactiv A;
2. CuSO4·5H2O-0.5% în tartrat de sodiu -1% (ambele masa/ volum)- 100 ml= reactiv B;
3. Reactiv cupro- tartric alcalin= reactiv C, preparat prin amestecarea a 1 ml reactiv B cu
50 ml reactiv A; se prepară înaintea utilizării şi nu se păstrează;
4. Reactiv Folin-Cicâlteu = reactiv D: 100 g Na2WoO4·2H2O+ 25 g NaMoO4·2H2O+700
ml apă bidistilată+ 500 ml soluţie 80% (volum/volum) de acid ortofosforic+ 100 ml HCl
concentrat se introduc într-un balon de 2 l prevăzut cu refrigerent vertical şi se fierb 10 ore pe
becul de gaz. După fierbere se adaugă 150 g Li2SO4 şi 50 ml apă bidistilată+ 2-3 picături de
brom. Amestecul se fierbe încă 15 minute pentru îndepărtarea excesului de brom. După răcire
se completează volumul la 1000 ml cu apă bidistilată. Această soluţie are o concentraţie de
2N. La determinare, această soluţie se diluează 1:1 (volum/volum) cu apă bidistilată. Reactivul
concentrat se poate păstra timp îndelungat în sticlă brună.
5. Soluţie etalon de albumină serică bovină (BSA) – se dizolvă 20 mg în 100 ml apă
bidistilată şi se păstrează la congelator.

Tehnica de lucru:
Într-un balon cotat de 100 ml se pipetează 0.1 ml ser (plasmă sau sânge) cu
micropipeta. Se aduce la 100 ml cu apă bidistilată şi se amestecă pentru a se realiza o
diluţie de1:1000. Pentru determinare se utilizează 0.1 ml ser diluat. Se pipetează conform
tabelului următor:
Nr. ml H2O ml etalon ml ser ml ml μg.
eprubetei distilată diluat reactiv C reactiv proteină
D
0 0.500 - - 2 Agitare 0.25 -
E1 0.450 0.050 - 2 şi 0.25 10
E2 0.400 0.100 - 2 repaus 0.25 20
E3 0.350 0.150 - 2 10 0.25 30
E4 0.300 0.200 - 2 minute 0.25 40
P 0.400 - 0.100 2 0.25 ?
După 20 minute, se citeşte absorbanta la 660 nm, în cuve de d=1cm.
Calculul concentraţiei de proteină se face pe baza curbei de etalonare şi a factorului de
pantă, ţinând cont de cantitatea de ser luată în determinare şi de diluţia efectuată.
 ANALIZA CALITATIVǍ A OVALBUMINEI PURIFICATE PRIN
ELECTOFOREZA ÎN GEL DE POLIACRILAMIDǍ

Proteinele conţin în molecula lor sarcini electropozitive şi electronegative

datoritǎ prezenţei grupǎrilor ionizabile ale aminoacizilor constituenţi.
În mediul alcalin proteinele au tendinţa de a fi încǎrcate electronegativ datoritǎ
reacţiei:
-
R-COOH RCOO +H2O
Iar în mediul acid au sarcini net electropozitive datoritǎ reacţiei:
R-NH2 R-NH3+H2O.
Pe baza acestei comportǎri, dacǎ un amestec de proteine este plasat într-un câmp
electric proteinele cu sarcinǎ negativǎ migreazǎ spre anod, cele cu sarcinǎ pozitivǎ spre
catod, iar cele pentru care pH-ul soluţiei de migrare reprezintǎ tocmai pH izoelectric vor
rǎmâne pe linia de start.
Viteza cu care are loc migrarea unei proteine depinde de raportul dintre sarcinile
electronegative şi electropozitive din macromoleculǎ, precum şi de forma şi dimensiunile
moleculei şi este aşadar o proprietate caracteristicǎ a unei proteine la un pH dat. Pe baza
acestei proprietǎţi electroforeza este o metodǎ utilizatǎ frecvent pentru separarea
proteinelor.
Electroforeza pe gel de poliacrilamidǎ cu dodecilsulfat de sodiu, este o metodǎ
excelentǎ cu ajutorul cǎreia se poare identifica şi monitoriza o proteinǎ în timpul
purificǎrii şi evalua omogenitatea fracţiunilor purificate. SDS-PAGE este folositǎ cu
regularitate pentru estimarea greutǎţilor moleculare ale subunitǎţilor proteice şi pentru
determinarea compoziţiei în subunitǎţi a proteinei purificate. SDS-PAGE poate fi de
asemenea utilizatǎ ca metodǎ preparativǎ pentru a furniza suficientǎ proteinǎ pentru
studiile ulterioare.
Trebuie subliniat cǎ electroforeza este mai mult o metodǎ de verificare a puritǎţii
unui preparat proteic, decât o metodǎ efectivǎ de separare. Pentru reducerea numǎrului de
variabile în procesul de separare amestecul proteic se supune în prealabil acţiunii unui
detergent anionic: dodecilsulfat de sodiu (SDS). Moleculele de detergent vor înconjura
moleculele proteice, în numǎr cu atât mai mare cu cât masa molecularǎ a substanţei
proteice este mai ridicatǎ. Se obţin astfel agregate anionice a cǎror sarcinǎ este corelatǎ
cu suprafaţa molecularǎ (implicit volumul, respectiv masa molecularǎ). În câmp electric,
dupǎ o anumitǎ perioadǎ de timp aceste agregate se vor distribui dupǎ sarcina lor.
Interacţiunea cu SDS distruge toate legǎturile proteice necovalente, determinând
molecula sǎ se deplieze. Un tratament concomitent cu un agent reducǎtor precum β-
mercaptoetanol (βME), denatureazǎ în continuare proteina pânǎ la subunitǎţile
constituente. Mobilitatea electroforeticǎ a complexelor rezultate detergent-polipeptid, va
fi în funcţie de greutatea molecularǎ. Astfel SDS polipeptidele migreazǎ prin gel într-o
manierǎ ce poate fi prezisǎ, complexele cu greutate molecularǎ micǎ migrând mai rapid
decât cele cu greutate molecularǎ mare. Aceasta înseamnǎ cǎ greutatea molecularǎ a unei
proteine poate fi estimatǎ în funcţie de mobilitatea ei relativǎ în timpul SDS-PAGE şi cu
o bandǎ unicǎ într-un astfel de gel este un criteriu al puritǎţii proteinei. Greutǎţile
moleculare ale proteinelor se determinǎ comparând mobilitatea lor cu a unor proteine a
cǎror masǎ molecularǎ se cunoaşte, numite proteine marker.
Separarea proteinelor se face aproape întotdeauna pe geluri (uneori se poate
realiza şi pe suporturi solide precum hârtia). Utilizarea gelurilor reticulate prezintǎ
avantajul eliminǎrii curenţilor convectivi, care în mediu lichid ar deranja separarea. În
plus, prin reticulare apare o reţea de clasare, care amplificǎ eficacitatea separǎrii. Cel mai
adesea se utilizeazǎ ca gel un pat de poliacrilamidǎ reticulatǎ, prin copolimerizarea
acrilamidei cu N,N’-metilenbisacrilamidǎ. Relevarea se face cu ajutorul unor coloranţi
specifici (Coomasie Briliant blue). Datoritǎ utilizǎrii SDS şi a gelului de poliacrilamidǎ,
metoda poartǎ numele de SDS-PAGE.
Cele mai multe electroforeze se fac în camere verticale, gelul fiind expus între
douǎ plǎci de sticlǎ. Plǎcile au rolul de a asigura uniformitatea gelului, iar pentru
încǎrcarea probelor în gel se realizeazǎ godeuri cu ajutorul unui pieptene de plastic.
Celulele de electroforezǎ sunt în aşa fel alcǎtuite, încât prezintǎ douǎ compartimente
umplute cu tampoane diferite pentru electrozi.
Cea mai satisfǎcǎtoare metodǎ de a recupera proteinele separate prin SDS-PAGE
pentru studiile ulterioare este aceea de a le extrage din benzile excizate din gel. Astfel se
efectueazǎ mai întâi o electroforezǎ analiticǎ pentru a furniza parametrii necesari pentru
separarea proteinei de interes. Apoi se efectueazǎ o electroforezǎ preparativǎ în care
markerii coloraţi sunt migraţi de o parte şi de alta a proteinei de interes care nu este
coloratǎ şi care este apoi imediat excizatǎ dupǎ electroforezǎ.

Aplicatie practica: Analiza calitativǎ a ovalbuminei prin SDS-PAGE

Puritatea ovalbuminei native izolatǎ din albuşul de ou de gǎinǎ poate fi verificatǎ
prin electroforezǎ analiticǎ în gel de poliacrilamidǎ 10 % (SDS-PAGE - Sodium Dodecyl
Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).
Principiul electroforezei
La un pH neutru, proteinele au o sarcină electrică net pozitivă sau negativă în
funcţie de structura lor primară. Migrarea macromoleculelor aflate în soluţie, în câmp
electric în funcţie de sarcina electrică, mărimea şi forma lor se numeşte electroforeză.

Principiul SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

Această metodă de elctroforeză utilizează pentru migrare un gel puternic hidratat
de poliacrilamidă, a cărui porozitate poate fi reglată pentru a evita fenomenul de sită
moleculară a gelului. Solventul utilizat pentru dizolvarea proteinelor conţine un detergent
anionic numit dodecil sulfat de sodiu, care se leagă de regiunile hidrofobe ale proteinelor,
cauzând despachetarea lor şi eliberarea lanţurilor polipeptidice din agregatele moleculare.
Prin adăugarea la soluţia proteică a agentului reducător, β-mercaptoetanol, punţile
disulfurice (-S-S-) dintre lanţurile polipeptidice ale unei proteine sunt rupte, fiecare lanţ
polipeptidic putând fi analizat separat.
În funcţie de mărimea moleculei, se va ataşa o anumită cantitate de SDS. În gelul
de poliacrilamidă, moleculele mai mari vor migra mai lent decăt moleculele mai mici,
deorece viteza migrării este determinată nu numai de câmpul electric ci şi de efectul de
sită moleculară a gelului.
Astfel o mixtură de proteine va fi separată în benzi distincte, în funcţie de
greutatea moleculară.
Urmează o etapă de colorare cu un colorant proteic, Coomasie blue.
Reactivi necesari:
 - reactivi pentru prepararea gelului de migrare;
- reactivi pentru prepararea gelului de concentrare;
- tampon pentru pregătirea probelor cu proteină;
- tampon de migrare;
- soluţie de colorare;
- soluţie de decolorare;
- proteine marker de greutate moleculară.

Echipamente necesare:
- plăci de sticlă pentru solidificarea gelului;
- pieptene;
- camera de electroforeză formată din două compartimente: central sau de sus (-)şi
compartimentul lateral sau de jos (+);
- redresor;
- baie de apă pentru denaturarea probelor proteice.

Tehnica de lucru

- se alege gelul de migrare cu porozitatea dorită în funcţie de greutatea moleculară

(GM) a proteinelor care se aşteaptă să fie separate. Se utilizează frecvent
următoarele concentraţii de acrilamidă (Aa):
- 15 % - pentru proteine cu GM = 10000 – 20000 Da;
- 10 % - pentru proteine cu GM = 20000 – 100000 Da;
- 7,5 % - pentru proteine cu GM = 35000 – 500000 Da.
Viteza de migrare este proporţională cu LOGARITMUL greutăţii
moleculare a proteinei.

ATENŢIE! Acrilamida (Aa) are efecte neurotoxice grave. Trebuie utilizate mănuşi
pentru prepararea gelului de migrare cât şi a gelului de concentrare.
 - se prepară câte 10 ml gel de migrare 10% poliacrilamidă pentru 2 plăci după
următoarea reţetă:
3.5 ml Aa + BisAa (29 %)
3.85 ml H2O ditilată
2.5 ml tampon Tris pH = 8,8
100 l dodecil sulfat de sodiu (SDS ) 10 %
50 l persulfat de amoniu (PA)10 % (agent de polimerizare).
- se degazează la vid circa 1 min.
- se adaugă 7.5 l TEMED pentru declanşarea polimerizării gelului.
Notă: Acest tip de gel serveşte la separarea proteinelor în benzi distincte în funcţie de
greutatea lor moleculară.
- se pipetează repede amestecul între plăcile de sticlă pentru a evita polimerizarea în
vârful pipetei.
- se pune deasupra câte 1 ml de apă distilată pentru ca gelul să polimerizeze fără ondulări
sau menisc ridicat.
- se lasă să polimerizeze cel puţin o oră;
- se prepară câte 6 ml gel de concentrare (5 % Aa; 0,1 % SDS) pentru 2 plăci de
electroforeză;
- se prepară gelul de concentrare după următoarea reţetă:
1 ml (29,2 Aa + 0,8 % BisAa)  5 %
1.5 ml tampon Tris HCl 0,5 M pH = 6,8
60 l SDS 10 %
40 l PA 10 %
3.4 ml H2O distilată.
- se adaugă 5 l TEMED pentru declanşarea polimerizării gelului de concentrare.
Notă: Acest tip de gel serveşte la concentrarea sau alinierea proteinelor dispuse în
godeuri înainte de intrarea în gelul de migrare.
- se îndepârtează apa de la suprafaţa gelului de migrare şi se toarnă gelul de concentrare.
- se pune pieptenele pentru formarea godeurilor;
- se lasă cel puţin 1 oră pentru polimerizare.
- se pregătesc probele proteice pentru electroforeză.
-se determină concentraţia proteinelor în amestecul proteic care va fi supus electroforezei.

ATENTIE!!!
- proteinele mai diluate de 1 mg/ml se concentrează prin precipitare cu acid tricloracetic
10 % (conc. finală). (De obicei se iau 200 l proteină+ 200 l TCA 20 % STOC).
- se prepară un volum final de proteină de 200 l  200 g proteină.
- volumul de tampon pentru prepararea probelor (TP) reprezintă 1/4 din volumul final.
- se calculează volumul de probă proteică (în funcţie de concentraţia proteică
determinată), pentru a se ajunge la 200 μg proteină în 200 μl volum final.
- se completează cu apă la 200μl după adăugarea volumului corespunzător de TP.
- proteina diluată se ţine 3 – 5 min. pe baie de apă la 100 oC.
Concentraţia soluţiei proteice optime pentru separare electroforetică este de
1g/μl.
Concentraţia proteinei pe godeu trebuie să fie cuprinsă între 5 g - 30 g într-un
volum 5 l - 50 l.
Observaţie: - pentru un amestec proteic cu o singură fracţiune se introduc câte 5 –
10 g proteină / godeu;
- pentru un amestec proteic cu mai multe fracţiuni se introduc până la 30
g proteină / godeu.
- se prepară concentraţia corespunzătoare pentru proteinele marker de greutate
moleculară
Notă : proteinele marker de greutate moleculară sunt proteine a căror greutate moleculară
este cunoscută. Aceste proteine se separă prin electroforeză în benzi distincte permiţând
aflarea prin comparaţie a greutăţii moleculare a proteinelor din probă.
Observaţie: - optim pentru markeri este o cantitate de 2 - 5 g proteină, pentru a avea o
bandă foarte îngustă.(pentru calcularea GM).
- pentru alte proteine a căror puritate se testează, se iau 10 - 20 g proteină
(10 pentru stabilirea GM; 20 pentru stabilirea altor impurităţi).
- se fixează plăcile în camera de electroforeză.
- se scoate pieptenele.
- proteinele marker de greutate moleculara se pun în godeurile marginale 5 -10 l (5 – 10
g proteină);
- se pun probele în restul godeurilor.
- se pune tamponul de migrare în compartimentul central, respectiv în compartimentul
periferic.
Notă:Tamponul de migrare se foloseşte cca. 30 ore. Tamponul de la anod (jos)se
acidulează în timp (după 20 h de funcţionare). Se poate neutraliza cu NAOH până la pH
= 8,6 – 9 şi se mai poate utiliza o dată, apoi se aruncă. Se trece tamponul de la catod (sus)
la anod şi se mai poate utiliza cca. 20 ore; la anod se pune un tampon nou.
- se conectează electrozii;
- se setează redresorul la un voltaj constant de 15V/ placă sau 30 V / 2 plăci , pentru
străbaterea gelului de concentrare şi respectiv 20 – 25 v / placă sau 40 – 50 v / 2 plăci,
pentru deplasarea în gelul de migrare.
- migrarea probelor proteice are o durată de circa 4 ore: 1 oră pentru a intra probele din
gelul de concentrare în gelul de migrare şi circa 3 ore pentru deplasarea probelor proteice
în gelul de migrare
- migrarea durează până când frontul (cu albastru de bromfenol ) ajunge la 1,5 cm de
marginea inferioară a gelului.
- se depărtează plăcile de sticlă şi se desprinde gelul de migrare.
- se ţine gelul la colorat 2 – 12 ore în soluţie de Coomasie Blue - optim – colorarea se
face sub agitare orizontală.
- se decolorează gelul utilizănd următoarea soluţie de decolorare:
10 % acid acetic
2,5 % metanol
- se poate efectua o decolorare rapidă – 1 – 2 ore la cald ţinând tava 15 – 20 min. pe baie
de apă la cald, cu uşoare agitări orizontale. Atenţie să nu se lipească gelul. Se întoarce
gelul de pe o parte pe alta.
-se poate efectua o decolorare lentă (optimă) ţinând gelul la decolorat la temperatura
camerei timp de 24 – 48 h. Decolorarea se face lent prin difuzie.
 NOŢIUNI GENERALE DE SPECTROFLUORIMETRIE

Definiţii:
Fluorescenţa este fenomenul emisiei de lumină sub acţiunea unei radiaţii
absorbite, emisie care are loc atâta timp căt durează şi absorbţia. Pentru anumite structuri
moleculare foarte rigide, o parte din energia radiaţiei emise este eliberată lent, fenomen
numit fotoluminiscenţă şi este măsurat prin spectrofotometrie de emisie.

Principiul fluorescenţei:
Sub acţiunea radiaţiei luminoase, o substanţă minerală sau organică aflată în soluţie
absoarbe o parte din energia luminii incidente. Interacţiunea fotonilor cu moleculele de
substanţă determină trecerea electronilor de valenţă de pe orbitalul de bază (nivel
fundamental) pe un orbital cu un nivel energetic superior. În acest mod, moleculele ajung
în stare de excitaţie.
Moleculele nu rămân mult timp (10-12 secunde) în starea de excitaţie şi se relaxează
trecând pe un nivel energetic mai scăzut. Pentru majoritatea moleculelor, starea de
relaxare se datorează unui proces colizional, de transfer de energie cu moleculele
solventului precum şi cu alte molecule din soluţie. Unele dintre moleculele excitate emit
excesul de energie sub formă de lumină (fluorescenţă), revenind la nivelul fundamental.
(Fig. 1).
În Fig. 1, săgeata continuă indică absorbţia fotonilor de către moleculele de
substanţă ai căror electroni trec de pe orbitalul fundamantal pe un orbital cu un nivel
energetic superior.
În urma pierderii prin coliziune cu moleculele solventului a energiei vibraţionale,
moleculele excitate se relaxează foarte rapid ajungând la un nivel vibraţional mai redus.
Săgeata punctată indică revenirea la nivelul energetic iniţial prin eliberarea energiei
sub forma de lumină (fluorescenţă).
Lumina emisă prezintă două caracteristici importante:
- are o lungime de undă mai mare, adică o energie mai mică decât lumina de
excitaţie. O parte din energia de excitaţie se pierde sub formă de căldură. Energia
eliberată prin emisie este suficientă doar pentru a întoarce molecula excitată la un
nivel vibraţional mai ridicat din starea fundamentală (Fig. 1);
- lumina emisă este compusă din numeroase lungimi de undă care formează un
spectru de emisie. Acest spectru apare deoarece fluorescenţa fiecărei molecule
presupune reîntoarcerea în mod particular a moleculei la unul dintre nivelele
vibraţionale ale stării fundamentale. Spectrul prezintă totuşi un maxim de emisie
la o anumită lungime de undă.
 Stare excitată

Nivel Nivele vibraţionale Stare fundamentală

energetic

Nivele vibraţionale

Distanţa dintre atomii moleculei

Fig.1 Diagrama nivelului energetic ce descrie fluorescenţa

Intensitatea fluorescenţei este definită sub forma unui randament cuantic (φ) ce
reprezintă un raport între numărul de fotoni emişi şi numărul de fotoni absorbiţi.
Din punct de vedere analitic este importantă relaţia dintre concentraţia soluţiei şi
intensitatea fluorescenţei. Intensitatea radiaţiei de fluorescenţă emisă în toate direcţiile
este egală cu intensitatea radiaţiei absorbite (dată de legea Lambert –Beer, vezi referatul:
Noţiuni generale de fotometrie) multiplicată cu randamentul cuantic al fluorescenţei:

F=[I0 (1-10-εcd)] (φ) unde:

F = intensitatea radiaţiei de fluorescenţă emisă;
I0 = intensitatea luminoasă a fasciculului iniţial;
ε = coeficientul de extincţie molară;
c = concentratia molară (M) a soluţiei;
d = grosimea stratului parcurs de lumină;
φ = randamentul cuantic .
Dacă soluţia este atât de diluată încât cantitatea de lumină absorbită este foarte
mică, relaţia de mai sus devine:

F= [I0 (2.3 εcd] (φ)

 La concentraţii mici, intensitatea radiaţiei de fluorescenţă (F) este direct
proporţională cu concentraţia (c). La concentraţii mari, această proporţionalitate nu se
mai poate menţine, deoarece soluţia fiind opacă, lumina nu mai poate pătrunde prin
soluţie, iar ca urmare, excitaţia nu se mai poate produce.
Intensitatea fluorescenţei poate fi influenţată de mai mulţi factori:
- factori interni: numărul de nivele vibraţionale disponibile pentru tranziţie,
rigiditatea moleculelor;
- factori externi: modificări ale conformaţiei spaţiale ale macromoleculelor datorită
interacţiunii dintre macromolecule (acizi nucleici, proteine) şi molecule mici (liganzi)
determinând creşterea sau scăderea randamentului cuantic.
Scăderea fluorescenţei într-un sistem biochimic poate fi cauzat de: 1) reacţii
chimice ale speciilor fluorescente cu molecule adăugate în sistem, 2) transfer de energie
prin coliziune cu moleculele din sistem, 3) transfer de energie la distanţă (transfer de
energie de rezonanţă).
Creşterea intensităţii fluorescenţei pentru anumite molecule de colorant
fluorescent poate fi accentuată într-un mediu nepolar sau în urma legării rigide de
anumite macromolecule (proteine). Studiile de fluorescenţă pot astfel furniza informaţii
despre structura şi funcţiile biomoleculelor.
Spectrofluorimetrul reprezintă instrumentul de bază pentru măsurarea
fluorescenţei (Fig 2). Structura sa este asemănătoare cu cea a spectrofotometrelor dar are
două deosebiri semnificative:
- prezintă două monocromatoare: unul pentru selecţia lungimii de undă de excitaţie
iar celălalt pentru analiza luminii emise;
- fototraductorul este orientat la 90ºC faţă de fasciculul de excitaţie pentru a
elimina interferenţa cu lumina transmisă prin proba din cuvă.
Sursa luminoasă utilizată pentru cele mai multe spectrofluorimetre pentru
domeniul ultraviolet, vizibil si infrarosu apropiat este o lampă de xenon (cu domeniul de
emisie între 200-1400 nm). Sursa luminoasă poate fi însă, pentru domeniul vizibil al
spectrului, o lampă de incadescenţă cu filament de wolfram (cu domeniul de emisie între
330-1000 nm), iar pentru domeniul ultraviolet, lămpi cu descărcare în gaze, cum ar fi cea
cu deuteriu (care emite între 200-400 nm) sau cu mercur. Spre deosebire de lampa de
deuteriu, care asigură un spectru continuu în domeniul UV, lampa de mercur emite
radiaţii discontinue. Benzile de emisie ale lămpii cu mercur sunt la 334 nm, 365 nm, 405
nm, 436 nm şi 546 nm.
Lumina este apoi direcţionată prin sistemul optic la monocromatorul de excitaţie
care este un selector de radiaţii spectrale (una sau un anumit interval de radiaţii cu
anumite lungimi de undă). Fasciculul de excitaţie trece apoi prin cuva cu proba de
analizat.
Monocromatorul poate fi reprezentat de filtre de interferenţă, prisme sau reţele
(grile) de difracţie. Cu ajutorul unor filtre de interferenţă, se izolează radiaţii
monocromatice cu lăţimea benzii de 1 nm.
Cuvele pot fi din sticlă sau masă plastică pentru soluţii care absorb energia
luminoasă în domeniul vizibil al spectrului sau din cuarţ pentru domeniul ultraviolet.
Cuvele prezintă spre deosebire de cele utilizate în spectrofotometria de absorbţie, patru
feţe transparente. Sub acţiunea fasciculului de excitaţie, moleculele de substanţă din cuvă
emit lumina în unghi drept faţă de fasciculul care a pătruns prin pereţii cuvei. Fasciculul
emis este apoi analizat de monocromatorul de emisie. În cele mai multe cazuri, se
utilizează analiza intensităţii fluorescenţei la o lungime de undă preselectată, de obicei
lungimea de undă unde emisia este maximă.
Dispozitivul fototraductor reprezintă instrumentul care permite transformarea
energiei luminoase emise de soluţie în energie electrică. Fototraductoarele utilizate sunt
diferite din punct de vedere al sensibilităţii lor şi al domeniului spectral utilizat.
Acestea pot fi: fotodiode, fotocelule sau fotomultiplicatoare.
Instrumentul de măsură poate fi un galvanometru, potenţiometru înregistrator cu
afişaj digital sau înregistrare pe hârtie.
Dispozitivul de înregistrare a datelor, prezent la spectrofluorimetrele moderne
dotate cu microprocessor, este reprezentat de diferite tipuri de imprimante grafice.

Monocromator
de excitaţie Sistem optic Cuva cu proba
de examinat

sursa de lumină

fante

monocromator
de emisie

Inregistrator

Fototraductor
 Fig. 2 Schema generală de funcţionare a unui spectrofluorimetru

Cele mai moderne tipuri de spectrofluorimetre sunt computerizate, operaţiile

putând fi automatizate, iar prelucrarea datelor făcându-se automat.

Intensitatea fluorescenţei poate fi exprimată în funcţie de tipul de instrument de

măsură sub formă de unităţi de microamperi sau în unităţi procentuale.

Aplicaţii ale spectrofluorimetriei:

- fiind o metodă mult mai sensibilă decât spectrofotometria, permite dozarea unor
concentraţii mici de substanţă.
- permite elucidarea conformaţiei spaţiale, precum şi modificări ale acesteia în
anumite condiţii. Această aplicaţie se bazează pe proprietatea anumitor
biomolecule de a avea fluorescenţă intrinsecă determinată de structura lor
primară. Astfel de exemple sunt, proteinele, datorită aminoacizilor aromatici din
structura lor (fenilalanina, tirozina, triptofanul), acizii nucleici datorită bazelor
azotate (adenină, guanină, uracil, citozină), unele coenzime (NAD, FAD) datorită
restului adeninic sau dihidropiridinic.
- se pot caracteriza anumite situsuri de legare specifice din structura proteinelor pe
baza fluorescenţei extrinseci. Anumite substanţe (fluoresceina, sulfonat de 1-
anilino-8-naftalen etc) prin legare în regiuni nepolare, hidrofobe ale
macromoleculelor proteice, emit o fluorescenţă crescută. În acest mod se pot
caracteriza anumite situsuri de legare a coenzimelor şi respectiv a substratelor de
enzime.

Aplicatie practica: Determinarea modificarilor conformationale ale

ovalbuminei prin spectrofluorimetrie

Ovalbumina nativã este o glicoproteinã monomericã de 45kDa ce reprezintã

aproximativ 54% dintre proteinele albuşului. Existã mai mulţi conformeri ai ovalbuminei
native obţinuţi în diferite condiţii de pH şi temperaturã, care aparţin familiei serpinelor
(inhibitori serin proteazici).
Ovalbumina nativã se poate transforma în timp, în mod spontan, în forma S prin
pãstrarea ouãlor timp de o lunã la 30˚C. Conformerul S se poate obţine şi prin incubarea
ovalbuminei native timp de 16 ore la 55˚C, pH 10. Conformerul I se obţine prin
incubarea ovalbuminei native timp de 30 minute la 97˚C.
S-ovalbumina are o structurã secundarã asemãnãtoare cu cea a formei native.
 I-ovalbumina are cu 8% mai puţine α- helixuri şi cu 9% mai multe foi β- pliate decât
forma nativã.
Diferenţele de conformaţie spaţialã între diferitele forme de ovalbuminã pot fi
observate şi pe baza studiilor de fluorescenţã.
Pentru obţinerea izoformelor de ovalbuminǎ s-a utilizat ovalbumina nativǎ izolatǎ şi
purificatǎ prin cromatografie de afinitate pe coloanǎ de Blue Sepharose.

Proba de ovalbuminǎ nativǎ se împarte în douǎ pǎrţi egale, o parte se foloseşte pentru
obţinerea formei S a ovalbuminei, iar cealaltǎ pentru prepararea izoformei I a
ovalbuminei.

Conformerul S se obţine prin incubarea ovalbuminei native în soluţie de tampon

fosfat 10 mM la 55o C, 16 ore la pH 10.

Conformerul I al ovalbuminei se obţine prin incubarea ovalbuminei native în soluţie

de tampon fosfat 10 mM, la 97oC timp de 30 minute, pH 7.

Dupǎ prepararea izoformelor de ovalbuminǎ (S şi I), diferenţele dintre structurile

tridimensionale ale acestora pot fi vizualizate prin realizarea spectrelor de fluorescenţǎ
extrinsecǎ şi intrinsecǎ.

Spectrul de emisie de fluorescenţǎ intrinsecǎ al triptofanului este acelaşi atât pentru

ovalbumina nativǎ, cât şi pentru S-ovalbuminǎ si I-ovalbumina se determina la
spectrofluorimetru utilizand o lungime de undǎ de excitaţie este de 295 nm. Spectrul de
emisie de fluorescenţǎ se înregistreaza în intervalul 300-420 nm.
Spectrele de emisie de fluorescenţǎ determinate de legarea colorantului anionic 1-
anilino 8-naftalen sulfonat (ANS) sunt determinate la o lungime de undǎ de excitaţie de
405 nm, cu o emisie de fluorescenţǎ în intervalul 450-600 nm.