EXTRACIA N SISTEME APOASE BIFAZICE

Cu toate avantajele extraciei cu solveni fa de alte metode de separare, utilizarea sa este limitat la extracia unor componente biologice cu structur simpl i stabilitate relativ ridicat. Moleculele de natur proteic sunt polare, iar solubilitatea lor n solveni organici nepolari este redus. n plus, solvenii organici pot provoca denaturri ale substanelor proteice n timpul extraciei. Datorit acestui fapt, pentru separarea din faza apoas a proteinelor prin extracie lichid lichid, este necesar gsirea unui solvent care, spre deosebire de solvenii organici uzuali, s aib capacitate mare de solubilizare pentru proteine, s nu le denatureze i s produc o tensiune interfacial sczut. Deoarece solventul care corespunde cel mai bine acestor deziderate este chiar apa, singura problem care rmnea de rezolvat era gsirea lacunei de miscibilitate, respectiv a zonei n care un sistem apos devine eterogen, aprnd dou faze nemiscibile ntre ele.
Obinerea unor faze apoase nemiscibile ntre ele este posibil prin adugarea unor polimeri hidrofili n soluiile apoase. La atingerea anumitor proporii ntre concentraiile celor doi polimeri acetia devin incompatibili i se produce separarea a dou faze cu un coninut ridicat de ap, mediu adecvat extraciei biopolimerilor. Unele sisteme de extracie se bazeaz pe combinaii polimer/sare, care induc un efect similar.

Primele sisteme apoase eterogene au fost observate nc din 1896 de ctre Beijerinck, n cercetrile efectuate asupra unor soluii apoase de gelatin i agar, iar mai recent de ctre Albertsson, care a pus n eviden coexistena fazelor apoase nemiscibile ntre care se pot partiiona macromolecule i diverse particule. Formarea sistemelor apoase bifazice Sistemele apoase bifazice (SAB) se pot utiliza n procesele de separare a proteinelor prin extracie L L. Tehnica se bazeaz pe incompatibilitatea a doi polimeri hidrofili diferii la dizolvarea lor ntr-un solvent uzual cum este apa, sau pe incompatibilitatea dintre un polimer hidrofil i o sare anorganic. Lacunele de miscibilitate pot aprea n diferite sisteme apoase; acestea se bazeaz pe interaciuni polimer polimer, polimer sare, sau pe termoseparare. Un caz aparte l reprezint extracia bazat pe afinitate, care poate fi privit i ca un proces de extracie reactiv [129]. Majoritatea polimerilor hidrofili, naturali sau sintetici, sunt solubili n ap. La concentraii sczute ale polimerilor n soluia apoas, sistemul este omogen. La o anumit concentraie a polimerilor, strict determinat i msurabil prin metode turbidimetrice, se produce separarea fazelor. Valorile concentraiilor la care sistemul devine eterogen depinde de masa molecular a polimerilor, scznd cu creterea acesteia. Cel mai cunoscut i studiat sistem pe baz de polimeri este cel bazat pe polietilenglicol (PEG) i dextran (fig. 1).

Fig. 1. Diagrama de echilibru a sistemului PEG / Dextran la 4 i 20 C Curba care trece prin punctele AFB poart denumirea de curb binodal. Orice punct situat sub aceast curb reprezint o soluie omogen de PEG i dextran n ap. Punctele situate pe aceast curb reprezint rapoartele concentraiilor de PEG, respectiv dextran, la care se produce separarea fazelor. Deasupra curbei binodale sistemul este bifazic, fiind format din dou faze apoase nemiscibile: o faz apoas superioar, faza uoar, bogat n PEG i o faz apoas inferioar, faza grea, bogat n dextran. n punctul M, de exemplu, sistemul la echilibru este format din faza uoar superioar, de compoziie corespunztoare punctului A i din faza grea inferioar de compoziie corespunztoare punctului B. Dreapta care unete punctele A i B poart denumirea de linie de legtur sau conod. Toate amestecurile eterogene obinute pentru proporii ntre concentraiile PEG i dextranului situate pe aceeai conod vor avea aceeai compoziie a fazelor, diferind doar prin volumele ocupate de aceste faze. Raportul volumelor fazelor formate se poate exprima prin raportul dintre distanele de la punctul corespunztor la extremitile conodei:
=

n care Vsup i Vinf reprezint volumele fazei superioare, respectiv inferioare. Punctul F este aanumitul punct critic, n care conoda este reprezentat de un singur punct pe curba binodal. n acest punct, adugarea unei cantiti infinitezimale de ap conduce la formarea a dou faze apoase nemiscibile, de volum i compoziie identice. Ca urmare, orice component adugat va avea un coeficient de distribuie KN = 1, coeficientul de distribuie reprezentnd raportul dintre concentraia componentului n faza superioar, Ci, sup i concentraia componentului n faza inferioar, Ci, inf:
KN= ( Csup, Cinf concentraiile componentului n faz superioar, respectiv inferioar, la echilibru).

Cu creterea lungimii conodei, compoziia fazelor la echilibru devine din ce n ce mai diferit, iar coeficientul de distribuie se modific n mod corespunztor, permind realizarea separrilor.

SAB pot fi obinute i prin amestecarea, n anumite proporii, a polimerilor cu electrolii (fig. 2), acestea fiind uneori mai performante dect SAB care conin numai polimeri. Cele mai utilizate SAB sunt redate n tab. 1
Polietilenglicol Alcool polivinilic Polivinilpirolidon Dextran Metoxi-polietilenglicol Polietilenglicol Alcool polivinilic Polivinilpirolidon Hidroxi-propildextran Dextran Metilceluloz Hidroxi-propildextran Dextran Hidroxi-propildextran Dextran Dextran Dextran K3PO4 K3PO4 K3PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, Na2SO4, formiat de Na (K), tartrat de Na (K) K3PO4

Polipropilenglicol

Alcool polivinilic Metilceluloz Etil-hidroxiceluloz Hidroxi-propildextran Polipropilenglicol Metoxi-polietilenglicol Polietilenglicol

Fig. 2. Diagrama de echilibru a sistemului PEG 4000 / Fosfat de potasiu

Polivinilpirolidon

Pe lng sistemele polimer polimer i polimer sare exist i alte alternative de SAB. O dezvoltare recent o constituie utilizarea detergenilor neionici cu grupri hidrofile oxietilenice. La temperaturi sczute exist o singur faz, format din lichidul de fermentaie i micelele de detergent, detergentul interacionnd mai ales cu proteinele hidrofobe. La creterea temperaturii peste o anumit valoare (dependent de sistem), apare turbiditatea care indic apariia unei faze noi. Aceast temperatur mai este numit i punct de tulburare (cloud point). Valoarea sa depinde n special de numrul mediu al gruprilor oxietilenice din detergent. De exemplu, un detergent C12EO5 are punctul de tulburare la 23 25 C. Separarea fazelor, datorat hidratrii reversibile a gruprilor polare de la extremitile moleculei conduce la formarea unei faze mbogite n detergent i a uneia srcite n detergent. Micelele sufer un proces de agregare n structuri laminate avnd proteina hidrofob ntr-o aa-numit faz coacervat cu un coninut de 70 80% ap [130]. Procesul este redat schematic n fig. 4.23. Un proces similar este i extracia cu micele inverse, discutat n subcapitolul 4.3. Anumii copolimeri polietilen (PE) polipropilenoxid (PPO) prezint de asemenea proprietatea de deshidratare reversibil a gruprilor oxidice ntr-un domeniu atractiv de temperatur [131133]. Iniial se folosete un SAB de tip polimer polimer pentru trecerea proteinei n faza bogat n copolimer PE/PPO. Dup aceast prim separare, soluia de de copolimer este nclzit deasupra punctului de tulburare, ceea ce duce la separarea fazelor i trecerea aproape integral a proteinei n faza srac n polimer.

Fig. 3. Soluia apoas de detergent sub i peste punctul de tulburare

Mecanismul extraciei biopolimerilor Extracia biopolimerilor se realizeaz prin stabilirea unor interaciuni de tip van der Waals ntre molecula proteic i polimerul hidrofil, sau ntre gruprile proteinelor, cu solubilizarea acestora ntr-o anumit faz. Un rol important n solubilizarea proteinelor l are hidrofobicitatea polimerilor adugai n soluia apoas. Pentru cei mai utilizati utilizai polimeri, hidrofobicitatea crete n ordinea: dextran sulfat < carboxi-metildextran < dextran < hidroxi-propildextran < metilceluloz < alcool polivinilic < polietilenglicol < polipropilenglicol Pentru un acelai polimer, hidrofobicitatea crete cu masa molecular. Din aceste considerente, coeficientul de repatiie al unei molecule proteice i, implicit, gradul de extracie vor fi influenate semnificativ de modificarea masei moleculare a polimerului. De exemplu, n funcie de prelucrarea ulterioar a extractului, n sistemul PRG/ dextran/, sau PEG/sare, se poate obine o concentraie mai mare a proteinei n faz apoas superioar dac masa molecular medie a PEG este redus, sau o concentraie superioar n faza apoas inferioar pentru mase moleculare medii mai ridicate ale PEG. n acelai timp, distribuia masei moleculare a polimerului controleaz hidrofobicitatea relativ a celor dou faze, respectiv gradul de extracie. Acest fenomen a condus la obiner ea unor separri selective ale unor enzime. Dac sistemul de extracie conine un polimer cu o larg distribuie a masei moleculare, faza apoas superioar va include acea fraciune a polimerului cu cea mai mare mas molecular. Astfel, chiar n condiiile n care dou sisteme de extracie se gsesc pe aceeai linie de legtur, coeficientul de distribuie al proteinei se va modifica cu masa molecular medie a polimerului, ca rezultat al modificrii volumelor celor dou faze. Lungimea liniei de legtur este o msur a coeficientului de distribuie. Dac aceasta tinde ctre 0, la punctul critic, compoziia celor dou faze va fi identic, iar coeficientul de distribuie este 1. Cu creterea lungimii, coeficientul de distribuie va fi tot mai diferit de valoar e 1, ceea ce conduce la mbogirea fazei superioare n molecule proteice.

Distribuia proteinelor ntre cele dou faze este descris de coeficientul de repartiie , K: K= ( Csup, Cinf concentraiile proteinei n faz superioar, respectiv inferioar, la echilibru).

Coeficientul de distribuie are o valoare constant pentru un anumit sistem de extracie, ns variaz cu concentraia iniial a proteinei. Deoarece la repartiia proteinei ntre cele dou faze apoase o influen deosebit manifest sarcina i energia superficial, Gerson (1980) a propus urmtoarea relaie de calcul a coeficientului de distribuie: -lg K=+, unde: ,,- constante care depind de aria interfacial, sarcina superficial i potenialul chimic standard. - diferena ntre energia superficial liber a celor dou faze - diferena ntre potenialul electric al celor dou faze. Pentru majoritatea enzimelor cu mase moleculare cuprinse ntre 20000 i 400000, coeficienii de distribuie variaz ntre 0,01 i 100. Albertson (1982) a propus o relaie mai extins de calcul a coeficientului de distribuie, lund n considerare sarcina electric, proprietile superficiale hidrofile i hidrofobe, configuraia moleculei proteice i natura interaciunilor cu solventul: ln K= ln Kel+ ln Khidrofob+ ln Khidrofil+ ln Kconf+ ln Kinteract, K reprezentnd cuantificarea factorilor considerai. n acest sens, modificarea compoziiei ionice, sau a pH-ului, influeneaz primii trei termeni ai ecuaiei pentru ambele faze. Pentru majoritatea sistemelor, aceast interdependen cauzeaz imposibilitatea stabilirii unei corelaii cantitative generale ntre coeficientul de repartiie i factorii de mai sus, obinerea unui grad maxim de extracie fcndu se prin metode experimentale. G=K Factori care influeneaz extracia moleculelor proteice Datorit migrrii ionilor din fazele apoase se stabilete un, potenial electric de o parte i de alta a interfeei de separare, acesta influennd hotrtor distribuia macromoleculelor cu sarcin electric (proteine, acizi nucleici). O modificare minor a concentraiei sau triei ionice poate conduce la modificri majore ale coeficientului de distribuie, aa cum rezult i din fig. 4.

Fig. 4. Influena compoziiei i a triei ionice a mediului asupra coeficientului de distribuie: a partiia enzimelor n funcie de concentraia fosfatului de potasiu ; b partiia amilazei n funcie de concentraia clorurii de sodiu Concentraia proteinelor nu manifest nici un efect asupra repartiiei acestora ntre cele dou faze doar n domeniul concentraiilor foarte reduse (sub 1 g/L), aceast limit depinznd de tipul proteinei. Valoarea pH-ului controleaz disocierea gruprilor ionizabile ale proteinelor i, implicit distribuia acestora ntre cele dou faze. Odat cu variaia pH-ului se produc modificri n disocierea ionilor polivaleni (PO43+), ceea ce va afecta potenialul electric dintre faze, respectiv distribuia proteinelor. n sistemele PEG sare, de ex., s-au constatat variaii de 2 3 ordine de mrime ale KN pentru intervale nguste de pH (fig. 4.26).

Fig. 5. Distribuia -amilazei pure n sisteme apoase bifazice PEG 4000 (10% masice) fosfat (11,5% masice) n funcie de pH [136] Afinitatea biospecific dintre moleculele proteice i anumii liganzi (liganzi de afinitate) ataai unuia dintre polimeri poate fi utilizat pentru mbuntirea separrii. Ca liganzi de afinitate se utilizeaz colorani, acizi grai, glutation etc. [91, 136, 138]. Rezultate deosebite au dat i ionii compleci de Cu(II)-iminodiacetat n sisteme PEG dextran sau PEG sare [139, 140]. Pentru extracia unui antibiotic glicopeptidic, vancomicina, a fost utilizat drept ligand de afinitate D-alanil-D-alanina n sisteme PEG 8000 dextran i PEG 8000 K3PO4. Sensibilitatea coeficienilor de distribuie la variaia temperaturii este redus. Temperatura modific forma diagramelor de echilibru de faze (fig. 1). La scderea temperaturii, separarea fazelor decurge la concentraii mai sczute de polimer n

sistemele PEG dextran, ceea ce nseamn un consum mai redus de polimeri, i la temperaturi mai ridicate n sistemele PEG sare, ducnd la creterea consumului de polimer. Temperatura modific de asemenea distribuia biomoleculelor (tab. 2 ), o temperatur mai sczut conducnd la o mai bun separare a proteinelor ntre ele. Scderea temperaturii conduce la creterea coeficientului de distribuie. Scderea temperaturii conduce ns la creterea viscozitii. Utilizarea polimerilor hidrofili mbuntete stabilitatea enzimelor, astfel nct extracia poate avea loc la temperatura camerei cu o pierdere minim a bioactivitii. Rcirea SAB nu este necesar dect n cazul n care sunt implicate proteine foarte fragile. Tabelul 2. Coeficientul de distribuie al lizozimei i catalazei n diverse SAB
Temp. [C] 4 25 40 4 25 40 4 25 40 4 25 40 KN lizozim 0,54 0,44 0,85 0,35 0,31 0,53 0,65 0,47 0,98 0,58 0,36 0,72 KN catalaz 0,046 0,063 0,174 0,014 0,016 0,020 0,22 0,21 0,43 0,052 0,042 0,068 Factor de separare 11,7 7,0 4,9 25 19,4 26,5 3,0 2,2 2,3 11,2 8,6 10,6 SAB 12,2 % Dextran 10 8,4 % PEG 4000 10,0 % Dextran 10 5,6 % PEG 20000 11,3 11,5 % Dextran 500 7,9 % PEG 4000 10,3 % Dextran 500 7,65 % PEG 20000

Aplicaii ale extraciei n sisteme apoase bifazice 1) Extracia n SAB are numeroase aplicaii n separarea celulelor, organelor celulare, proteinelor, acizilor nucleici, enzimelor intracelulare etc., att la scar de laborator, dar i la scar pilot sau industrial. O list a biomoleculelor purificate la scar pilot i industrial prin extracie n SAB este redat n tab. 2-3. Tablelul 3. Biomolecule purificate la scar industrial prin extracie n SAB
Acil-arilamidz Alcooldehidrogenaz -Amilaz Aspartat -decarboxilaz a/b Proteine clorofiliene Cromatofori Formaldehiddehidrogenaz Formiatdehidrogenaz -Galactozidaz Glucoz-6-fosfatdehidrogenaz -Glucozidaz Hexakinaz D-2-Hidroxiizocaproatdehidrogenaz Izoleucil-tRNAsintetaz Izopropanoldehidrogenaz NADkinaz Fosfofructokinaz Fosfolipaz Fosforilaz Hibrid protein stafilococal A -galactozidaz Proteine din zer

Extracia n SAB utilizeaz acelei principii ca i extracia fizic L L clasic. n consecin, se pot utiliza aceleai echipamente pentru amestecarea i separarea fazelor. Diferena rezid n proprietile diferite ale SAB n comparaie cu cele ale sistemelor clasice (faz apoas faz organic) ntlnite n extracia fizic L L, cea mai notabil diferen fiind tensiunea interfacial extraordinar de sczut (tab. 4.). Tabelul 4. Proprieti fizice ale SAB
Compoziia sistemului 9 % PEG 4000, 2 % dextran T-500 7 % PEG 4000, 1,25 % dextran brut 16 % PEG 4000, 13 % fosfat [kg/m3 ] 1010 1046 1085 sup [mPa.s] 3,0 2,7 12 inf [mPa.s] 94 2000 2,1 disp [mPa.s] 3,4 4,0 [mN/m] 1,25 Ref. bibl. [146] [146] [147 ]

n aplicaiile la scar mare, cele mai utilizate SAB sunt PEG dextran ap i PEG sare ap, datorit aplicabilitii cvasigenerale, viscozitii i diferenei de densitate acceptabile. n plus sunt netoxice i biodegradabile, fiind certificate de ctre farmacopeele din cele mai multe ri . Un dezavantaj ar fi costul ridicat al dextranului purificat (de ordinul sutelor de dolari pe kg). Reducerea costurilor se poate face prin nlocuire cu dextran brut, dextran brut hidrolizat sau amidon hidroxipropilic. Dextranul brut conduce la o soluie cu viscozitate mai ridicat, n timp ce dextranul hidrolizat reduce viscozitatea soluiei. 2) Purificarea ADN-ului: capacitatea de a purifica ADN-ul de la un eantion este important pentru multe procese biotehnologiei moderne. Cu toate acestea, probele deseori conin nucleaze care degradeaz ADN-ul int nainte de a poate fi purificat. S-a artat c fragmentele de ADN migreaz n faza uoar a unui sistem de separare polimer-sare. Dac liganzi care leag i dezactiveaz nucleazele se vor ncorpora n faza polimerului, nucleazele vor migra n faza grea a sistemului i vor fi dezactivate. Astfel acest sistem de polimer -sare este util pentru purificarea ADN-ului dintr-o prob i n mod simultan este protejat de nucleaze. 3) Industria alimentar: sistemul PEG-NaCl s-a dovedit a fi eficient n separarea moleculelor mici, ca peptidele i acizii nucleici. Aceti compui sunt deseori aromatizani sau odorizani. Acest sistem ar pytea fi folosit n industria alimentar pentru a elimina sau izola arome individuale.

Procesul tehnologic de extracie n siateme apoase bifazice