Compoziția și arhitectura membranelor

Una dintre abordarile folosite pentru intelegerea functiei unei membrane este studiul compozitiei
acesteia pentru a deteremina ce componente sunt comune tuturor membranelor si care componente sunt
unice si indeplinesc functii specifice. Cea mai mare pondere din masa membranelor este atribuita
proteinelor si lipidelor polare precum si carbohidratilor prezenti sub forma de glicoproteine si
glicolipide.

Fiecare tip de membrana are lipide si proteine caracteristice

Proportiile proteice si lipidice variaza in functie de membrana (Tabel 1) reflectand o diversitate de roluri
biologice. De exemplu, anumiti neuroni au teaca de mielina, o membrana plasmatica extinsa ce
inconjoara celula de mai multe ori, functionand ca un izolator electric pasiv. Teaca de mielina este
constituita in principal din lipide, in timp ce membrana bacteriilor cu multe situsuri pentru procesele
catalizate enzimatic, contine mai multe proteine decat lipide.

Tabel 1. Proportii proteice si lipidice in diferite membrane.

Pentru studiul compozitiei membranare este necesara izolarea membranei. Cand celulele eucariote sunt
supuse forfecarii mecanice, membranele plasmatice sunt rupte si fragmentate, eliberand componentii
citoplasmatici si organitele legate de membrana precum mitocondriile, cloroplastele, lizozomii si nucleii.

Celulele au mecanisme de control asupra tipului si cantitatii de lipide membranare pe care le sintetizeaza
si pot directiona lipide specifice spre organitele tinta. Orice regn, specie, tesut, celula sau organit are un
set caracteristic de membrane lipidice. Membranele plasmatice sunt bogate in colesterol, fara
cardiolipina detectabila (Figura 2). Acest fel de distributie este inversat in cazul mitocondriilor.
 Figura 2. Compozitia lipidica in membrana plasmatica sau in organitele membranare ale
hepatocitului unui cobai.

Compozitia proteica a membranelor din diferite surse variaza chiar mult mai mult decat in cazul
lipidelor, ceea ce reflecta specializarea functionala. Cateva proteine membranare sunt legate covalent de
oligozaharide. De exemplu, in glicoforina, o glicoproteina a membranei plasmatice eritrocitare, 60% din
masa este constituita din complexe de oligozaharide atasate covalent de resturi de aminoacizi specifice.
Resturile de serina, treonina si asparagina sunt cele mai comune locuri de legare. Gruparile zaharice de
la suprafata glicoproteinelor influenteaza plierea proteinelor, stabilitatea si destinatia intracelulara,
jucand si un rol semnificativ in legarea liganzilor de receptorii glicoproteici de la suprafata.

Cateva proteine membranare sunt atasate covalent de una sau mai multe lipide, ancore hidrofobe ce
mentin proteinele in cadrul structurii proteice.

Proprietatile fundamentale ale tuturor membranelor

Membranele sunt impermeabile pentru majoritatea solutilor polari sau incarcati electric, dar permeabile
pentru compusi nepolari. Cu ajutorul microscopului electronic, membranele au o structura trilaminara in
sectiune transversala. Dovezile obtinute prin microscopie electronica, studiile de compozitie chimica,
studiul proprietatilor fizice de permeabilitate si miscare a proteinelor individuale si a lipidelor din
membrane, au dus la dezvoltarea modelului mozaicului fluid (Figura 3). Fosfolipidele creeaza un bistrat
in care gruparile nepolare sunt indreptate spre miezul bistratului, iar gruparile polare sunt spre exterior,
interactionand cu faza apoasa din ambele parti. Proteinele sunt incorporate in acest bistrat prin interactii
hidrofobe. Exista proteine transmembranare care strabat membrana si proteine care se observa doar pe o
parte a stratului bilipidic. Orientarea proteinelor este asimetrica, cele de pe o parte a membranei difera
de cele de pe cealalta parte, conferind asimetrie functionala. Acest model al mozaicului fluid se poate
modifica constant, spre deosebire de un mozaic clasic, intalnit in constructii. Aceasta fluiditate se
datoreaza legaturilor slabe, necovalente.

Figura 3. Modelul mozaicului fluid.

Bistratul lipidic este elementul structural de baza al membranei

Glicerofosfolipidele, sfingolipidele si sterolii sunt practic insolubile in apa. Atunci cand sunt amestecate
cu apa formeaza spontan agregate lipidice microscopice, formand un cluster prin contactul dintre
gruparile lor hidrofobe si prin interactiile gruparilor hidrofile cu apa din jur. Acest proces de formare
reduce suprafata hidrofoba expusa la apa, avand ca rezultata cresterea entropiei. Interactiile hidrofobe
intre moleculele de lipide furnizeaza forta termodinamica necesara pentru formarea si mentinerea
acestor clusteri.

In functie de precizia conditiilor si de natura lipidelor se pot forma trei tipuri de agregate atunci cand
lipidele amfipatice sunt amestecate cu apa (Figura 4). Micelele sunt structuri sferice ce pot contine intre
cateva duzini sau cateva mii de molecule amfipatice. Aceste molecule sunt agregate astfel incat regiunile
hidrofobe se afla in interior fara sa contina molecule de apa, si capetele hidrofile se gasesc la suprafata
in contact cu apa. Formarea micelelor este favorizata atunci cand sectiunea transversala a capetelor este
mai mare decat cea a lanturilor de acil. Aceste cazuri se intalnesc la acizii grasi liberi, la lizofosfolipide
(fosfolipide carora le lipseste un acid gras) si la detergenti (ex: dodecil sulfat de sodiu).

Figura 4. Agregate lipidice amfipatice ce se formeaza in apa.

Un alt caz de agregat este acela al bistratului in care doua monostraturi de lipide formeaza un strat
bidimensional. Formarea bistratului este favorizata atunci cand sectiunea transversala a capetelor si a
lanturilor de acil este similara ca dimensiune. Aceasta situatie este intalnita la glicerofosfolipide si
sfingolipide. Portiunile hidrofobe din fiecare monostrat exclud apa si interactioneaza una cu alta, iar
capetele hidrofile sunt in contact cu apa pe fiecare suprafata a bistratului. Datorita faptului ca regiunile
hidrofobe de la capetele bistratului sunt in contact cu apa, bistratul este relativ instabil si se pliaza
spontan pentru a forma o sfera goala numita vezicula. Continuitatea la suprafata a veziculelor elimina
expunerea regiunilor hidrofobe, permitand bistratului sa atinga o stabilitate maxima in mediul apos.
Formarea veziculei creeaza de asemenea un spatiu apos separat. Este probabil ca precursorii primelor
celule vii sa fi semanat cu aceste vezicule lipidice, iar componentii aposi sa fi fost separati de mediul
inconjurator printr-un invelis hidrofob.

Bistratul lipidic are o grosime de 3 nm. Miezul hidrocarbonat format din grupari metilice si metilenice
provenite de la acizii grazi sunt aproximativ la fel de nonpolari precum decanul, iar veziculele formate
in laborator din lipide pure (lipozomi) sunt in esenta impermeable pentru solutii polari la fel ca bistratul
lipidic din membranele biologice (cu toate acestea, membranele biologice sunt permeabile si pentru
solutii pentru care au transportori specifici).

Lipidele membranei plasmatice sunt distribuite asimetric intre cele doua monostraturi, cu toate ca
aceasta asimetrie nu este absoluta ca in cazul proteinelor membranare. In membrana eritrocitelor, lipide
ce contin colina (fosfatidilcolina sau sfingomielina) se gasesc de obicei inspre partea extracelulara, in
timp ce fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina si fosfatidilinositolii sunt observate pe partea spre mediul
intracelular (citoplasmatic). Daca se modifica distributia lipidelor intre monostraturi se produc anumite
consecinte biologice. De exemplu, atunci cand fosfatidilserina se muta inspre mediul extracelular,
plachetele sangvine isi pot indeplini rolul de formare de cheaguri de sange. In cele mai multe cazuri
insa, aceasta expunere a fosfatidilserinei marcheaza celula pentru distrugere prin moarte celulara
programata.

Trei tipuri de proteine pot diferi in modul de asociere cu membrana

Proteinele membranare integrale sunt asociate puternic cu bistratul si pot fi indepartate doar de agenti ce
interfera cu interactiile hidrofobe, precum detergentii, solventii organici sau denaturantii (Figura 5).
Proteinele periferice sunt asociate prin interactii electrostatice si legaturi de hidrogen cu domeniile
hidrofile ale proteinelor integrale si cu gruparile polare ale lipidelor membranei. Aceastea pot fi eliberate
in conditii relativ blande ce intervin in interactiile electrostatice si legaturile de hidrogen. Agentul des
utilizat in acest caz este carbonatul la pH ridicat. Proteinele amfitropice se gasesc si in citosol si asociate
membranei. Afinitatea pentru membrana rezulta in unele cazuri din interactiile necovalente ale proteinei
cu proteine sau lipide membranare, iar in alte cazuri din prezenta uneia sau a mai multor lipide atasate
covalent de proteine amfitropice. In general, asociatia reversibila a proteinelor amfitropice cu membrana
este reglata; spre exemplu fosforilarea sau legarea ligandului pot forta o modificare conformationala in
proteina, epunand un situs de legare al membranei care anterior era inaccesibil.

Figura 5. Proteine integrale, periferice si amfitropice. Proteinele membranare pot fi diferentiate dupa
conditiile necesare pentru eliberarea lor din membrana. Cele mai multe proteine periferice sunt
eliberate prin schimbari de pH sau tarie ionica, eliminarea ionilor de Ca printr-un agent de chelare,
sau aditie de uree sau carbonat. Proteinele integrale sunt extrase cu detergenti care distrug
interactiile hidrofobe cu bistratul lipidic si formeaza clusteri tip micela in jurul proteinelor
individuale. Proteinele integrale atasate covalent de membrana lipidica, precum glicozil
fosfatidillinositol (GPI) pot fi eliberate prin tratament cu fofolipaza C. Proteinele amfitropice sunt
uneori asociate cu membrana alteori nu, in functie de procesele regulatorii precum palmitolarea
reversibila.

Multe proteine membranare traverseaza bistratul lipidic

Topologia proteinelor membranare (localizarea relativa a domeniilor proteinelor cu bistratul lipidic)

poate fi determinata cu reactivi care reactioneaza cu lanturile laterale ale proteinei dar nu pot traversa
membrana-(reactivi chimici polari care reactioneaza cu aminele primare ale reziduurilor de lizina de
exemplu, sau enzime precum tripsina care scindeaza proteinele dar nu pot traversa membrana).
Eritrocitul uman este convenabil pentru asemenea studii deoarece nu are organite legate de membrana;
membrana plasmatica este singura membrana prezenta. Daca o proteina membranara aflata intr-un
eritrocit intact reactioneaza cu un reactiv impermeabil pentru membrana, aceasta proteina trebuie sa aiba
cel putin un domeniu expus mediului extracelular. Tripsina scindeaza domeniile extracelulare dar nu
afecteaza domeniile ingropate in bistrat sau pe cele expuse doar pe suprafata interna, doar daca
membrana plasmatica este rupta, iar aceste domenii devin accesibile pentru enzima.

Experimentele cu reactivi specifici topologiei arata ca glicoproteina glicoforina a eritrocitului

traverseaza membrana plasmatica. Domeniul amino-terminal (tinand seama de lanturile carbohidrate)
este pe suprafata externa si este scindat de tripsina. Capatul carboxil terminal patrunde spre zona interna
a celulei unde nu poate reactiona cu reactivii impermeanti. Atat capatul amino-terminal cat si cel
carboxil-terminal contin multe reziduuri de aminoacizi polari sau incarcati care sunt asadar hidrofili. Cu
toate acestea, un segment din centrul proteinei contine in special reziduuri de aminoacizi hidrofobi,
sugerand ca glicoforina are un segment transmembranar (Figura 6).
 Figura 6. Dispunere transmembranara a glicoforinei in eritrocite.

Aceste experimente nanocristalografice releva ca orientarea glicoforinei in membrana este asimetrica:

segmentul amino-terminal este mereu spre mediul extracelular. Studii similare ale altor proteine
membranare arata ca fiecare are o orientare specifica in bistrat, oferindu-i membranei o lateralitate
distincta. Pentru glicoforina si pentru toate celelalte glicoproteine ale membranei, domeniile glicozilate
sunt gasite invariabil pe fata extracelulara a membranei. Aranjamentul asimetric al acestor proteine
confera o asimetrie functionala. Toate moleculele unei pompe ionice, de exemplu, au aceeasi orientare
in membrana si pompele ionice in aceeasi directie.

Proteinele integrale sunt tinute in membrana prin interactii hidrofobe cu lipidele

Atasamentul ferm intre proteinele integrale si membrana sunt rezultatul interactiilor hidrofobe intre
lipidele membranei si regiunile hidrofobe ale proteinei. Cateva proteine au o singura secventa hidrofoba
in mijloc (ca la glicoforina) sau la capatul terminal amino sau carboxil. Altele au multiple secvente
hidrofobe care in conformatie de α-helix sunt suficient de lungi pentru a traversa bistratul lipidic.

Una dintre cele mai studiate proteine ce traverseaza membrana, bacteriorodopsina, are sapte secvente
interne foarte hidrofobe si traverseaza bistratul lipidic de sapte ori. Bacteriorodopsina este o pompa de
proton sensibila la lumina impachetata in retele regulate in membrana mov a bacteriei Halobacterium
salinarum. Cristalografia cu raze X releva o structura cu sapte segmente α-helicale, fiecare traversand
membrana, conectate prin bucle nonhelicale la interiorul si la exteriorul membranei. In secventa de
aminoacizi a bacteriorodopsinei, sapte segmente de aproximativ 20 de reziduuri hidrofobe pot fi
identificate, fiecare formand un α-helix care deschide membrana. Cele sapte elici formeaza un cluster
impreuna si sunt orientate nu chiar perpendicular pe bistratul plan. Interactiile hidrofobe intre
aminoacizii nepolari si acizii grasii ai lipidelor membranei ancoreaza ferm proteina in structura
membranei.

Proteinele membranare cristalizate aranjate prin cristalografie, de obicei includ molecule de fosfolipide,
care se presupune ca sunt pozitionate in cristale asa cum sunt in membranele native. Multe dintre aceste
molecule de fosfolipide stau pe suprafata proteinei, capul lor intractioneaza cu reziduurile de aminoacizi
polari la suprafata si la interiorul membranei. Aceste lipide anulare formeaza un invelis cu doua straturi
(anulus) in jurul proteinei, orientate aproximativ asa cum se asteapta de la fosfolipide, intr-un bistrat.
Alte fosfolipide se gasesc la interfata dintre monomerii subunitatilor proteinelor membranare, unde
formeaza o „etansare cu grasime”. Iar unele sunt incorporate adanc intr-o proteina membranara, de
multe ori cu gruparile polare cu mult sub planul bistratului. De exemplu, succinat dehidrogenaza are
cateva molecule de fosfolipide adanc incorporate.

Topologia proteinelor membranare integrale poate fi uneori prezisa de secventa proteinelor

Determinarea structurii tridimensionale a unei proteine membranare -topologia ei- este in general mult
mai dificila decat determinarea secventei de aminoacizi, fie direct sau prin secventierea genelor.
Secventele de aminoacizi sunt cunoscute pentru mii de proteine membranare, dar relativ cateva structuri
tridimensionale au fost stabilite prin cristalografie sau prin spectroscopie RMN. Prezenta secventelor ce
nu pot fi rupte, formate din 20 de reziduuri hidrofobe intr-o proteina membranara este de multe ori luata
ca dovada a faptului ca aceste secvente traverseaza bistratul lipidic, functionand ca ancore hidrofobe sau
ca formeaza canale transmembranare. Practic toate proteinele integrale au cel putin o asemenea
secventa. Aplicarea acestei logici asupra tuturor secventelor genomice conduce la concluzica ca in multe
specii, intre 20% si 30% dintre toate proteinele sunt proteine integrale.

Ce putem prezice despre structura secundara a portiunilor de intindere ale membranei din proteinele
integrale? O secventa α-helicala formata din 20-25 de reziduuri este suficient de lunga pentru a cuprinde
grosimea bistratului lipidic. Un lant polipeptidic inconjurat de lipide, ce nu are molecule de apa pentru a
forma legaturi de hidrogen, va tinde sa formeze α-helixuri si β-sheets, in care in lantul interior, legatura
de hidrogen este maxima. Daca lanturile laterale ale tuturor aminoacizilor intr-un helix sunt nepolare,
interactiile hidrofobe cu lipidele din jur vor stabiliza mai tare helixul.

Cateva metode simple de analiza a secventelor de aminoacizi produc predictii corecte ale structurii
secundare a proteinelor transmembranare. Polaritatea relativa a fiecarui aminoacid a fost determinata
experimental prin masurarea schimbului de energie libera alaturi de miscarea acelui lant lateral de
aminoacid de la un solvent hidrofob la trecerea in apa. Aceasta energie libera de transfer, exprimata ca si
index de hidropatie variaza de la foarte exergonic pentru reziduurile polare sau incarcate la foarte
endergonic pentru aminoacizii cu lanturi hidrocarbonate aromatice sau alifatice. Indicele de hidropatie
totala (hidrofobicitatea) unei secvente de aminoacizi este estimata insumand energiile libere de transfer
ale fiecarui reziduu din secventa. Pentru a scana o secventa a unei polipeptide pentru potentialul
segmentelor de-a lungul membranei, un cercetator calculeaza indicele de hidropatie pentru segmente
succesive (numite ferestre) cu o marime data, de la 7 la 20 de reziduuri. Pentru o fereastra formata din
sapte reziduuri, de exemplu, indicii pentru reziduurile de la 1 pana 7, de la 2 la 8, de la 3 la 9, etc. Sunt
reprezentati grafic ca in Figura 7. O regiune cu mai mult de 20 de reziduuri cu indice de hidropatie mare
se presupune a fi un segment transmembranar. Atunci cand secventele unor proteine membranare cu
structuri tridimensionale cunoscute sunt scanate in acest fel, putem gasi o buna corespondenta intre
predictibilitate si cunoasterea segmentelor ce cuprind membrana. Analiza hidropatiei prezice un singur
helix hidrofob pentru glicoforina si sapte segmente transmembranare pentru bacteriorodopsina - in acord
cu studiile experimentale.

Figura 7. Grafice de hidropatie. Indicele de hidropatie este pus in grafic, in ciuda numarului de
reziduuri, pentru doua proteine membranare integrale. Indicele de hidropatie pentru fiecare reziduu
de aminoacid intr-o secventa cu lungime definita, sau „fereastra” este folosit pentru a calcula
hidropatia medie mentru acea fereastra. Axa orizontala arata numarul de reziduuri din mijlocul
ferestrei. (a) glicoforina din eritroctele umane are o singura secventa hidrofoba intre reziduuri 75 si
93. (b) bacteriorodopsina, cunoscuta din studii fizice independente ca avand sapte elice
transmembranare, are sapte regiuni hidrofobe. Cu toate acestea graficul de hidropatie este ambiguu
in regiunile 6 si 7. Cristalografia de raze X a confirmat ca aceasta regiune are doua segmente
transmembranare.

Pe baza secventelor de aminoacizi si a graficelor de hidropatie, pentru multe proteine de transport se

presupune ca au regiuni helicale multiple ce traverseaza membrana. Atunci cand predictiile sunt
potrivite cu studiile chimice ale localizarii proteinei, presupunerea ca regiunile hidrofobe corespund cu
domeniiile ce traverseaza membrana este justificata mai bine.

O alta caracteristica remarcabila a multor proteine transmembranare cu strcutura cunoscuta este prezenta
rezidiilor de tirozina si de triptofan la interfata dintre lipide si apa. Lanturile laterale ale acestor rezidii
servesc aparent ca ancore de interfata pentru membrana, capabile sa interactioneze simultan cu faza
lipidica centrala si cu fazele apoase pe fiecare parte a membranei. Alta generalizare despre locatia
relativa a aminoacidului fata de bistrat este descrisa prin regula pozitiv-interior: rezidiiile de lizina,
histidina si arginina din proteinele membranare apar mai des pe fata citoplasmatica a membranelor.

Nu toate proteinele membranare integrale sunt compuse din α-helixuri transmembranare. Un alt motif
structural comun in proteinele membranare bacteriene este cel de β-barrel, in care 20 sau mai multe
segmente transmembranare formeaza β-sheet-uri care se aliniaza intr-un cilindru (Figura 8). Aceeasi
factori care favorizeaza formarea α-helix-urilor in interiorul hidrofob al unui bistrat lipidic stabilizeaza,
de asemenea si structurile β-barrel: atunci cand nicio molecula de apa nu este disponibila pentru legaturi
de hidrogen cu oxigenul provenit de la gruparea carbonil sau cu azotul din legatura peptidica, legatura
de hidrogen maximala intre lanturi confera cea mai stabila conformatie. β-sheet-urile planare nu
maximizeaza aceste interactii si nu sunt in mod general gasite in interiorul membranei; β-barrel-urile
permit toate legaturile de hidrogen posibile si sunt in mod aparent comuni printre proteinele
membranare. Porinele, proteine ce permit anumiti soluti polari sa traverseze membrana externa a
bacteriilor gram-negative (ex: E. coli), au multe lanturi de β-barrel ce aliniaza pasajul transmembranar
polar.

Figura 8. Proteine membranare cu structura β-barrel. Trei proteine provenite din membrana externa
de E. coli sunt expuse, cu vizualizare in planul membranei.
O polipeptida este mai extinsa in conformatie β decat intr-un α-helix; doar sapte pana la noua rezidii cu
conformatie β sunt necesare pentru traversarea membranei. Sa ne amintim ca in conformatie β, lanturile
laterale alternante se proiecteaza deasupra si dedesubtul plierii (sheet). In lanturile β ale proteinelor
membranare, fiecare reziduu secundar din segmentul ce traverseaza membrana este hidrofob si
interactioneaza cu bistratul lipidic; lanturile laterale aromatice sunt gasite de obicei la interfata lipid-
proteica. Celelalte reziduuri pot fi sau nu hidrofilice. Graficul de hidropatie nu este util pentru a prezice
segmentele transmembranare pentru proteinele cu motif de β-barrel, dar pe masura ce datele despre
motifele β-barrel cresc , predictiile secventelor conformatiilor β transmembranare ar putea deveni
realizabile.

Lipidele atasate covalent pot ancora anumite proteine membranare

Cateva proteine membranare contin una sau mai multe lipide legate covalent, ce pot fi de anumite tipuri:
lanturi lungi de acizi grasi, izoprenoizi, steroli, sau derivati glicozilati ai fosfatidilinositol. Lipidul atasat
furnizeaza o ancora hidrofoba care se insereaza in bistratul lipidic si mentine proteina la suprafata
membranei. Puterea interactiei hidrofobe intre bistrat si un singur lant hidrocarbonat legat de o proteina
abia este de ajuns pentru a ancora proteina fix, dar multe proteine au mai mult de o singura grupare
lipidica atasata. Alte interactii, cum sunt atractiile ionice intre reziduurile incarcate pozitiv ce contin
lizina si capetele de lipide incarcate negativ, contribuie probabil la stabilitatea structurii. Asocierea
acestor proteine legate de lipide cu membrana este cu siguranta mai slaba decat cea cu proteinele
membranare integrale, iar asta este, in cel putin cateva cazuri, reversibila. Dar tratamentul cu carbonat
alcalin nu elibereaza proteinele GPI-legate, care sunt prin definitie, proteine integrale.

Dincolo de ancorarea proteinei de membrana, lipida atasata poate avea un rol specific. In membranele
plasmatice, proteinele cu ancore GPI sunt exclusiv pe fata externa si formeaza clusteri in regiuni
specifice, in timp ce alte tipuri de lipide legate de proteine se afla exclusiv pe fata interna. In celulele
epiteliale polarizate (cum sunt celulele epiteliale intestinale) in care suprafata apicala si cea bazala are
roluri diferite, proteinele legate de GPI sunt directionate specific spre suprafata apicala. Atasamentul
unei lipide de o proteina membranara nou sintetizata are o functie tinta, directionand proteina spre
locatia destinata ei in membrana.