Tema – Utilizarea Tehnicilor Cromatografice

pentru Evaluarea Calitatii Produselor

Agroalimentare

Masterand: Coroaba Marius

Prof. univ. dr. Temocico Georgeta

1.1. DESCRIEREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE
Cromatografia constituie un termen colectiv care include setul de tehnici de laborator
folosite pentru separarea amestecurilor. Cromatografia permite studiul separării moleculelor, pe
baza diferențelor de compoziție și a structurii lor. Constituie o metodă preferată multor altor
tehnici, întrucât nu produce modificări moleculare în compoziția substanțelor chimice implicate.
Cromatografia poate fi extrem de utilă pentru recunoaşterea prezenţei sau absenţei unor
componenţi în amestec, servind, de asemenea, ca precursor pentru alte analize chimice calitative
sau pentru analize spectroscopice.
Cromatografia implică prepararea unei soluții de testare, care va interacționa în mod
diferit cu suportul staţionar, conducând la separarea de molecule similare. Moleculele cu afinităţi
mai puternice la suportul staţionar, se vor misca mai încet decat moleculele cu afinităţi mai slabe.
In acest mod, diferitele tipuri de molecule din soluție pot fi separate.
Principiul de bază al cromatografiei este acela conform căruia diferitele substanţe
chimice au diferite grade dizolvare într-un lichid și puteri diferite de aderare la o suprafață solidă.
Astfel, prin cromatografie se pot identifica componentele chimice într-un amestec și separarea
lor, făcându-le vizibile pe o suprafață. Astfel de separări, folosind tehnici de cromatografie, se
pot face folosind diverse suporturi cum ar fi: plăci de sticlă (Thin Layer Cromatography),
molecule insolubile (Liquid Cromatography), gaze volatile (Gas Cromatography) etc.
Analiza cromatografică este rezumată la următoarele etape fundamentale:
1. proba este dizolvată în faza mobilă; => 2. faza staţionară, cel mai frecvent fiind un lichid
adsorbit la suprafaţa unor particule de solid - folosite pentru împachetarea coloanei; => 3.faza
mobilă, este trecută peste faza staţionară nemiscibilă; aceasta se numeşte eluţie; => 4. solutul,
care are afinitate pentru faza mobilă, se va mişca foarte încet prin coloană; => 5. componentele
probei se vor separa în benzi discrete, vizibile la detector, rezultând cromatograma.

1.2. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE

Conform litertaturii de specialitzate există cinci categorii de cromatografii: de adsorbţie,
de partiţie, cu schimb de ioni, prin excluziune moleculară şi de afinitate.Tehnicile cromatografie
pot fi clasificate în două grupe: cromatografia planară şi cromatografia pe coloană.
Cromatografia de lichide, cromatografia de gaze şi cromatografia de fluide supercritice,
reprezintă clase generale, care se bazează pe tipurile de faze mobile şi faze staţionare, dar şi pe
tipurile de echilibre în transferul solutului între faze. Fazele mobile sunt constituite de gaze,
lichide, respectiv fluide supercritice.
Cromatografia de adsorbţie foloseşte o fază staţionară solidă şi o fază mobilă reprezentată
de un lichid sau un gaz. Solutul este posbil să fie adsorbit la suprafaţa particulelor solide, iar
echilibrul dintre starea adsorbită şi soluţie produce separarea moleculelor solutului.
Cromatografia de partiţie, utilizează o faza staţionară care este un film subţire pe suprafaţa unui
suport solid. Solutul realizează un echilibru între lichidul staţionar şi faza mobilă (lichidă sau
gazoasă).
La cromatografia de schimb ionic, anionii sau cationii au legături covalente cu o fază
staţionară solidă, adesea constituită de o răşină sau o fază solidă tare şi amorfă. Este folosită o
fază mobilă lichidă. Ionii solutului cu sarcină opusă vor fi atraşi de faza staţionară, urmare a
forţelor electrostatice.
 Cromatografia de excluziune a dimensiunii, denumită şi cu gel permeabil sau de filtrare
cu gel. Tehnica permite separarea moleculelor după mărime, moleculele mari având parcursuri
cu viteză mai mare decât moleculele mici, fără să existe interacţiuni bazate pe atracţie. Faza
mobilă gazoasă sau lichidă va trece printr-un gel poros, fiind excluse astfel doar moleculele mari
care curg fără a intra în gel, acestea eluând primele.
Cromatografia de afinitate se bazează pe interacţiunea dintre molecule de solut şi
molecule legate covalent la faza staţionară. La trecerea unui amestec prin coloană, numai un tip
de molecule de solut reacţionează cu moleculele legate.
Cromatografia lichidă, în special cromatografia lichidă de înaltă performanță, permite
detectarea compușilor precum: aldehide, proteine, aminoacizi, compuși fenolici și carbohidrați.
Pe de altă parte, cromatografia gazoasă este mai adecvată pentru analiza compușilor
volatili sau semi-volatili; unele substanțe precum acizii grași din trigliceride, trebuie extrase din
proba de alimente; altele precum alcoolii, pot fi injectaţi direct în coloana. Cel mai frecvent
folosiţi detectori pentru tehnicile cromatografice, implică: spectroscopia în domeniul ultraviolet
vizibil, fluorescenţa, electrochimică, spectroscopia de masă, detectorul de ionizare în flacără,
detectorul cu captură de electroni, nasul electronic, etc.

1.3. GAZ CROMATOGRAFIA

Aşa cum a fost menţionat anterior, echipamentul cromatograf este format din patru
sisteme: sursa de gaz, eşantionarea, coloana și sistemul detector. Sistemul de alimentare cu gaz
furnizează, în funcție de detectorul ales, tipul de gaz necesar sau amestecul de gaze necesar.
Sistemul de eșantionare conține, de obicei, un injector automat care se află în interiorul unui
controler termostatic.
Injectorul poate avea un sistem de transport complex care preia probele, spală
containerele, pregăteşte substanţele derivative, efectuează o serie foarte complexă de proceduri
de pregătire a probelor înainte de injectarea probei în coloană. Coloana, constituie dispozitivul
principal care realizază efectiv separarea necesară, având un dispozitiv pentru controlul
temperaturii. Pentru detecţie, există o gamă largă de detectori disponibili, fiecare având
parametri unici de operare și propriile sale caracteristici de performanță. Alegerea potrivită a
detectorilor depinde de natura probei.
Substanțele analizate prin intermediul tehnicii gaz cromatografie trebuie să fie volatile și
ar trebui să fie vaporizate și mutate într-o coloană lungă de un gaz purtător inert. Coloana este
umplută cu material specific acoperit cu un lichid non-volatil.
Extracţia unui analit utilizează partiţionarea unui material între două faze și se bazează pe
solubilitatea sau insolubilitatea în diverși solvenți. Extracția este utilă pentru pregătirea probei și
pentru purificare, constituind de multe ori un prim pas în analiza calitativă.
Există câteva tipuri de procese de extracție, cum ar fi lichid-solid, lichid-lichid, extracţie
în fază solidă și microextracţie în fază solidă.
În cazul extracției lichid-solid, un solvent hidrofil sau hidrofob, acid, neutru sau bazic, se
adaugă la un solid. Materialul insolubil poate fi separat prin gravitație sau filtrare în vid, iar
materialul solubil este extras în solvent. O secvență de solvenți, prin varierea polarităţii sau pH-
ului, poate fi folosită pentru a separa amestecuri complexe în grupuri, pentru ca mai apoi, soluția
să fie filtrată şi apoi injectată în cromatograf.
 Dacă cele două faze sunt lichide nemiscibile, tehnica se numeşte extracție lichid - lichid.
Uzual, o fază este apoasă (hidrofilă), iar cealaltă este un solvent organic hidrofob.
Extracţia în fază solidă folosește afinitatea soluțiilor dizolvate sau suspendate într-un
lichid (cunoscută ca fază mobilă), pentru un solid prin care trece proba (cunoscut ca fază
staționară), în vederea separării unui amestec în componente dorite și “nedorite”. Rezultatul
obţinut, este acela prin care, fiecare din analiții de interes sau impurități nedorite în eșantion sunt
reținute pe fază staţionară. Porțiunea care trece prin faza staționară este colectată sau eliminată,
în funcție de conţinut (substanțele analizate dorite sau impuritățile nedorite).
Microextracţia în fază solidă implică utilizarea unei fibre căptuşite cu o fază de extragere,
care poate fi un lichid (polimer) sau un solid (adsorbant), care extrage diferite tipuri de substanțe
de analizat (inclusiv volatile și nevolatile) de la diferite tipuri de medii care pot fi în fază lichidă
sau gazoasă. Cantitatea de analit extrasă prin fibră este proporțională cu concentrația sa în probă.
Apoi fibra este transferată duzei de injectare a gaz cromatografului unde este realizată desorbția
și analiza analiților.
Aplicațiile cele mai tipice ale gaz cromatografiei, pentru evaluarea produselor alimentare,
se referă la analiza cantitativă și calitativă a compoziției produselor alimentare, produselor
naturale, aditivilor alimentari, aromelor și componentelor aromatice. Oferă informaţii despre o
varietate de produse de transformare și contaminanți cum ar fi pesticidele, substanţe fumigante,
poluanți de mediu, toxine naturale, medicamente de uz veterinar, produse de ambalare. Oferă
informații utile despre compoziția băuturilor distilate, iar utilitatea sa a fost dovedită la analiza
băuturilor spirtoase precum vodca, coniac, rom şi brandy.
Detectarea pesticidelor, vitaminelor, zaharurilor și acizilor organici din legume, fructe și
sucuri de fructe, a fost de asemena posibilă prin intermediul gaz cromatografiei; împreună cu
analiza discriminatorie lineară și metoda celor mai mici pătrate parţiale, gaz cromatografia
permite diferențierea sucurilor de mere. Microextracţia în fază solidă – gaz cromatografia și
metoda celor mai mici pătrate parţiale a permis identificarea falsurilor la produsele din fructe
proaspete preparate sub formă de pure. Pot fi identificaţi compuși ai sulfului, acizi grași, compuși
ai aromei și componentele organoclorurate din lapte.

1.4. LICHID CROMATOGRAFIA DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ

Reprezintă o metodă de analiză calitativă utilizată în evaluarea produselor alimentare
pentru separarea, identificarea și cuantificarea compușilor (Heftman E., 2004).
Cromatografia lichidă de înaltă performanță este o tehnică de separare care implică
injectarea unui volum mic de proba lichidă într-un tub plin cu particule mici (3-5 μm în
diametru ). Componentele individuale ale probei sunt deplasate în jos în tubul împachetat
(coloană) cu un lichid (faza mobilă), forțat prin coloană prin presiunea înaltă furnizată de o
pompă.
La cromatografia lichidă, probele sunt transportate de-a lungul coloanei de lichid mișcat
de gravitație. În principiu, cromatografia lichidă și cromatografia lichidă de înaltă performanță,
acţionează în mod similar, însă cea de-a doua, prezintă unele avantaje prin comparaţie, cum ar
fi: viteza, eficienţa, senzitivitatea și ușurința de operare. Compușii dintrun eșantion sunt separaţi
unii de alţii prin stratul de împachetare al coloanei, prin diverse interacțiuni chimice și fizice
între moleculele acestora și particulele de împachetare.
 Aceşti compuşi separaţi, sunt identificaţi la ieșirea din coloană printr-un dispozitiv de
scurgere (detector), care îi măsoară. Detectorul se poate baza pe mai multe tehnici, cum ar fi cele
spectrofotometrice, de fluorescență sau de detectare electrochimică. Rezultanta detectorului este
cromatograma. Sistemul lichid cromatograf de înaltă performanță, este constituit din patru
componente principale: pompa, injector, coloană și sistemele detector.
Pompa. Sistemul de pompare forțează trecerea unui lichid (faza mobilă) prin coloană, la o
anumită rată de curgere, o rată normală de curgere fiind cuprinsă în intervalul de 1 - 2mL/min.
Pompele tipice pot ajunge la presiuni în intervalul 6000-9000 psi (400 - 600 bari). În timpul
experimentului cromatografic, o pompa poate furniza o compoziție de fază mobilă constantă
(izocratic) sau cu creșterea compoziției de fază mobilă crescătoare (gradient).
Injectorul. Injectorul servește pentru introducerea probei de lichid în curentul de curgere
al fazei mobile. Volumele probelor tipice sunt de 5 - 20μl. Injectorul trebuie să fie rezistent la
presiunile ridicate ale sistemului de lichid. Atunci când utilizatorul are multe probe pentru
analiză sau când injectarea manuală nu mai are caracter practic, se recomandă utilizarea unui
automat de probe, aceasta constituind versiunea automatizată.
Coloana. Sistemul coloană este considerat inima cromatografului. Fază staționară a
coloanei separă componentele probei de interes, folosind diferiți parametri fizici și chimici.
Pompa trebuie să forţeze deplasarea fazei mobile prin coloană, rezistența la deplasare cauzând o
presiune crescută în cromatograf. Este deosebit de important să se ia în considerare faptul că
alegerea corectă a pachetului coloanei și a fazei mobile, reprezintă cei mai importanți factori în
obţinerea celei mai bune performanţe pentru lichid cromatograful de înaltă performanţă.
Detectorul. Detectorul poate determina moleculele individuale care ies (eluent) de la
coloana. Un detector servește pentru a măsura cantitatea acestor molecule, astfel încât, chimistul
poate analiza cantitativ componentele probei. Detectorul furnizează o ieșire la un înregistrator
numit cromatogramă. Pentru a separa cei mai mulţi compuși există patru moduri principale de
separare: cromatografie în fază inversă, cromatografia în fază normală sau de adsorbție,
cromatografia de schimb ionic și cromatografia de excludere sterică.