7 _ r- T. .„...

VOM amuţii vâscoase, in strugurii mucegăiţi, găsesc cantităţi semnificative de

gume şi mucilagii, ca şi în pieliţele boabelor de hibrizi americani (Noah, Delaware, Othelo,
Isabelle). Caracterul coloidal al gumelor şi mucilagiiior sporeşte vâscozitatea mustului şi vinului.
1.3.9. Enzimele din struguri
Enzimele sunt proteine sau protide specializate în cataliza reacţiilor biochimice din must
şi vin. După Willstatter, enzimele sunt biomoleeule complexe formate dintr-un suport coloidal de
natură proteică, termolabil şi nedializabil, catalitic inactiv numit apoenzimă, la care se adaugă una
sau mai multe componente neproteice active, termostabile şi ultrafiltrabile, numite coenzinte.
Complexul apoenzimă + coenzimă = holoenzimă, căruia i se atribuie activitatea enzimatică.
Rolul coenzimei, denumită şi cofactor, este îndeplinit de macromoleeule cu structuri
chimice foarte diferite (vitamine, trifosfo-ribonucleotide) sau simpli ioni metalici. Rolul
cofactorilor este indispensabil pentru manifestarea activităţii catalitice a enzimei sau pentru
potenţarea acestei activităţi. Activitatea optimă a unor enzime este condiţionată de prezenţa
concomitentă atât a coenzimei cât şi a ionului metalic.
Situsuriie enzimatice. Biomoleculele de enzime au în structura lor anumite zone cu o
79
 C. ŢĂRDEA, Gh. SÂRBU, Angela ŢĂRDEA

secvenţă de aminoacizi şi conformaţie specifică, denumite sltusuri. Aceste zone sunt

esenţiale pentru manifestarea activităţii catalitice a enzimelor (situs catalitic) sau pentru
funcţia de reglare a unor secvenţe de reacţii (situs allosteric).
Situsul catalitic reprezintă zona de care se leagă în mod specific substratul de reacţie.
Include grupările chimice active ale catenelor laterale de la radicalii aminoacizilor (-NH 2,
-SH, -OH, -COOH), care participă la stabilirea legăturii dintre enzimă şi substrat,
determinând astfel reacţia specifică enzimatică.
Situsul allosteric se întâlneşte la enzimele oligomere, constituite din două sau mai
multe subunităţi (protomeri), denumite enzime allosterice. Pe lângă situsul catalitic,
enzimele oligomere au un al doilea situs numit situs allosteric, care explică mecanismele de
reglare enzimatică a unor reacţii (conformaţiile posibile pe care le pot lua moleculele de
enzime).
Caracteristicile enzimelor. Ca biocatalizatori, enzimele se caracterizează prin
următoarele însuşiri generale (Neamţu G. şi colab., 1993):
- acţionează în cantităţi extrem de mici şi au o acţiune catalitică foarte puternică;
- nu se consumă şi nu se transformă, prin reacţiile catalizate;
- determină reacţii extrem de rapide, fiind cei mai eficienţi catalizatori;
- orientează şi măresc viteza reacţiilor biochimice, determinând scăderea energiei de
activare a moleculelor de substrat asupra cărora acţionează;
- nu modifică starea finală de echilibru a reacţiilor, ci numai viteza cu care se
realizează starea de echilibru;
- se disting printr-o specificitate de acţiune, ceea ce înseamnă că transformarea unui
substrat într-un produs de reacţie este catalizată de un anumit tip de enzimă.
Reacţiile enzimatice. Mecanismul prin care enzimele îşi exercită funcţia catalitică se
explică astfel: - asocierea enzimei (E) cu substratul (S) asupra căruia acţionează şi formarea
unui complex intermediar enzimă-substrat (ES) disociabil;
- molecula de substrat activată (S*) este transformată în produsul de reacţie (P), timp în care
enzimă se eliberează şi se fixează din nou pe o altă moleculă de substrat. In funcţie de sensul
lor de evoluţie, reacţiile catalizate de enzime pot fi:
- reversibile, de tipul E + S <-» ES* P + E
- ireversibile, de tipul E + S ES* —» P + E
Pentru trecerea de la starea iniţială a substratului (S) la starea activată tranzitorie
(S*), în timpul transformării S —> P este nevoie de o anumită cantitate de energie, denumită
energie de activare. Energia de activare exprimă diferenţa dintre nivelul de energie a stării
de tranziţie a moleculelor de substrat activat şi nivelul energetic al moleculelor de substrat
aflate în starea iniţială. Ca orice

80
catalizator, enzimele reduc energia de activare a moleculelor de substrat (S),
determinând o stare de tranziţie a acestora, stare cu un nivel energetic mai scăzut.
Clasificarea enzimelor. în funcţie de tipul general al reacţiilor chimice pe care
Ie catalizează, enzimele se împart în şase clase şi anume: oxidoreductaze, transferaze,
hidrolaze, liaze, izomeraze şi ligaze (sintetaze). Fiecare clasă la rândul ei, se subdivide
în subclase şi subsubclase.
în struguri, respectiv în must, se întâlnesc enzime din clasele
oxidoreductazelor, hidrolazelor şi liazelor.
13.9.1. Hidrolazele
Enzimele din clasa hidrolazelor catalizează reacţiile de scindare hidrolitică a
moleculelor de substrat, prin clivajul legăturilor dintre un atom de carbon şi alţi
atomi, sub acţiunea apei. Reacţia generală este:
R, - O - Rj + H20 —°laZ<l- R, - OH + R2 - OH

Legăturile chimice care pot fi scindate cu ajutorul hidrolazelor sunt: legătura

glicozidică, legătura peptidică şi legătura esterică. în struguri, hidrolazele sunt
reprezentate prin glucozidaze, pectolaze şi proteinaze.
Invertaza sau zaharaza. Este o p-D-fructofuranozidazâ care scindează
legătura 0-fructozidicâ din zaharoză, cu formarea de a-glucoză şi 0-ffuctozâ:

Glucoza > Faictozâ

Zaharoza (formulei
canformoţionotâ)

încă din 1860, Berthelot a pus în evidenţă rolul invertazei în transformarea

zaharozei în zaharuri fermentescibile. Această enzimă este prezentă încă din strugurii
verzi şi acţionează rapid, la concentraţii de numai 2-3 g de zaharoză existentă în
struguri. Manifestă activitate maximă în mediu acid ca cel al mustului, unde face
invertirea zahărului care se adaugă prin operaţiunea tehnologică de şaptalizare.
Pectolazele sau pectinazele. Sunt reprezentate în struguri prin două tipuri de
enzime care degradează membranele pectocelulozice şi uşurează eliberarea mustului din
pulpa boabelor: pectin-metil-esteraza (PME) care desface pectina prin hidroliză In acid
pectic cu eliberarea alcoolului metilic şi poligalacturonaza (PG) care desface pectina în
acizi uronici liberi (fig. 1.14).
Pieliţele boabelor sunt bogate în pectolaze, astfel încât prin zdrobirea strugurilor
mustul se îmbogăţeşte în aceste enzime. Din cauza pH-ului acid al mustului activitatea
PME este slabă, dar suficientă pentru a desface pectina şi a
 C. ŢÂRDEA. Gh. SÂRBU, Ana»la ŢÂRDEA

elibera alcoolul metilic în proporţie de 80% în decursul a 48 de ore. Activitatea PG este mult
mai lentă, deCompunerea pectinelor cu eliberarea acizilor uronici reaiizându-se în câteva zile.
Deoarece activitatea enzimelor pectolitice naturale din struguri este slabă, se folosesc
Fiţjura 1.14. Scindarea hidroliticS a pectinei prin acţiunea enzimelor

în vinificaţie preparatele enzimatice de tip industrial (Pectozin, Ultrazin). Acestea facilitează

extracţia mustului din boştinâ la presare, contribuind la mărirea randamentului în must;
eliberarea polifenolilor şi substanţelor odorante din pieliţele boabelor; deburbarea mustului;
limpezirea vinului.
Proteinazele (peptidaze) . Sunt hidrolaze care catalizează scindarea hidrolitică a
legăturilor peptidice din structura protidelor:
Proteinazele se găsesc în strugurii verzi, în cantităţi
i foarte mici. începând de la pârgă, ele devin foarte active. La
1
î' prelucrarea strugurilor se regăsesc în resturile de pulpă şi joacă
un rol important în declanşarea fermentaţiei alcoolice. în acest
---------CH - C0 -4- NH - CH
scop sunt ajutate şi de enzimele produse de către levuri
(exoenzime).
Rolul proteinazelor este de a elibera din peptide acizii
aminici cu catenă scurtă, pentru a putea fi asimilaţi de către
levuri. Se pare că proteinazele acţionează şi asupra
———CM - CO0H membranelor celulelor de levuri înainte de declanşarea
H N - CH fermentaţiei, pentru a le reda hidrofilia.
a
 TRATAT DE VINIFICAŢIE

13.9.2 Oxidoreductazele
Enzimele din clasa oxidoreductazelor catalizează reacţiile de fixare a oxigenului
molecular pe compuşii fenolici din must şi vin. Principalele tipuri de oxidoreductaze
întâlnite la struguri sunt enzimele: tirosinaza, polifenoloxidaza şi lacaza. Tirosinaza şi
polifemoloxidaza fac parte din enzimele proprii ale strugurilor, pe când lacaza este
produsă de ciuperca Botrytis tinerea care atacă strugurii la maturare.
Din punct de vedere chimic, oxidoreductazele sunt proteide care au în molecula
lor ioni de cupru (cuprioxidaze). Intervin în procesele de oxidoreducere din must şi
vin, prin transferul de electroni de pe metabolit, direct la oxigenul molecular. De aceea
mai sunt denumite şi transelectronaze.
Tirosinaza şi polifenoloxidaza. Sunt prezente în strugurii verzi (nematuraţi),
fiind fixate pe organitele celulare (mitochondrii, cloroplaste). Se regăsesc în resturile
de pulpă din must, unde activitatea lor este foarte intensă.
Tirosinaza manifestă o activitate specifică cresolazică asupra monofenolilor (P-
cresolu lui şi 1 -tirosinei), pe când polifenoloxidaxa are activitate specifică
catecholazică (de brunificare) asupra orto-difenolilor cum este pirocatechina
(catecholul). Iniţial s-a crezut că aceste două enzime pot manifesta acţiune cresolazică
numai cuplată cu cea catecholazică, motiv pentru care în literatura de specialitate mai
veche sunt întâlnite sub ambele denumiri, fără a se face distincţie între ele.
Tirosinaza catalizează în must şi vin reacţiile de oxidare a monofenolilor în
ortodifenoli, motiv pentru care se mai numeşte şi monofenoloxidază:

CH CH.
’
3

Polifenoloxidaza (PFO) oxidează di- şi trifenolii şi are o specificitate foarte

mare faţă de ortodifenoli pe care îi transformă în ortochinone:

Ortochinonele care rezultă au o reactivitate chimică mare şi formează în must

sau vin polimeri de culoare brună (se produce casarea brună a mustului sau vinului).
La pH-ul mustului şi vinului, activitatea tirosinazei şi polifenoloxidazei reprezintă cca.
80 % din activitatea lor optimă.

8
3
 Activitatea tirosinazei este influenţată de mai mulţi factori: cantitatea de
oxigen dizolvată în must sau vin, temperatură, pH şi S0 2 liber. Faţă de S02 este foarte
sensibilă, dozele de 50 mg S0 2 reducând activitatea tirosinazei în proporţie de 90%.
Prin încălzirea mustului la 55°C timp de 30 minute, tirosinaza este distrusă.
Mecanismul responsabil pentru brunificarea oxidativă a mustului a,fost mai
bine înţeles după ce Singleton şi colab. (1970) au descoperit prezenţa acidului 2- S-
glutationil-cafeoiltartric în must. S-a constatat că PFO are o acţiune importanta
asupra esterului cafeoiltartric, care este orto-difenolul cel mai abundent din must.
Conţinutul strugurilor în PFO poate constitui un parametru important pentru
calitatea recoltei. Prin determinarea PFO înaintea' recoltării strugurilor, se pot elabora
tehnologiile adecvate de vinifîcare primară care să conducă la realizarea de vinuri
stabile şi cu un conţinut redus în anhidridă sulfuroasă.
Lacaza. Are un spectru mult mai larg de acţiune decât tirosinaza şi
polifenoloxidaza. Atacă orto- şi para-difenolii, antocianir şi acidul ascorbic din must
şi vin. Oxidarea directă a antocianilor de către lacaza secretată de Botrytis cinerea,
este cauza principală a degradării rapide a culorii vinurilor roşii (casarea oxidazică a
vinurilor roşii).
Lacaza este stabilă la pH-ul acid al mustului şi vinului, deoarece este
constituită din aminoacizi bazici (serină, treonihă, metkmină). Faţă de S0 2 este puţin
sensibilă, dozele de 20-150 mg S0 2/l de must rezultat din strugurii mucegăiţi, reduce
activitatea lacazei numai în proporţie de 20%. La pH-ul mustului şi vinului, lacaza
este distrusă prin încălzire la 45°C timp de numai 10 minute. S-a constatat că
fungicidele antibotritice pe bază de piremethanil (Scala, Geox) distrug lacaza din
strugurii mucegăiţi. Este slab afectată de levuri în timpul fermentaţiei şi se regăseşte
în vin, punând serioase probleme de stabilitate biologică.

1.3.9.3. Liazele
Enzimele din clasa liazelor catalizează scindarea moleculelor de substrat la
nivelul legăturilor C-C, C-O, C-N şi C-S sau determină apariţia unei duble legături în
molecula substratului (între atomii )C=C( sau )C=0). Reacţiile catalizate de liaze
implică un mecanism diferit de scindare a moleculelor, întrucât nu intervine apa în
sensul hidrolizei substratului.
In struguri, respectiv în must, se întâlnesc următoarele tipuri de enzime din
clasa liazelor:
- carboxilazele, care fac decarboxilarea a-cetoacizilor (piruvic, oxalilacetic) şi
aminoacizilor;
- aldolaza care intervine în procesul de degradare anaerobă a glucozei;
- enolaza, implicată în cataliza reacţiei de degradare aerobă a glucozei.
Toate aceste enzime activează în procesul de fermentare alcoolică a
mustului, care după cum se ştie este un proces enzimatic.
 vinumor, ia institutul de Oenologie am Borueau*,.^___________
levuri manipulate care să contribuie la eliminarea proteinelor din vin, în vederea
înlocuirii bentonitei (Denis Dubourdieu şi colab., 1987). Pentru producerea vinurilor
spumante s-an construit levurile floculante, prin introducerea de gene codante pe o
proteină de suprafaţă la celulele de levuri. Astfel de levuri manipulate pot ii utilizate
pentru scurtarea perioadei de remuaj la producerea şampaniei.
în viitor, levurile nu se vor mai rezuma doar la transformarea mustului în vin;
ele vor îmbogăţi vinurile în arome, în esteri volatili etc.
5.4.2. Natura enzimatică a procesului de fermentaţie alcoolică
Din punct de vedere chimic, fermentaţia alcoolică reprezintă un proces foarte
complex, în care enzimele au rolul cel mai important. Ele catalizează reacţiile de
descompunere a zaharurilor din must şi de formare a produşilor de fermentaţie
(acidul piruvic, acetaldehida, etanolul, glicerolul,
alcoolii superiori etc.).
GLUCOZA Şl FRUCTOZA
^•4............................................................................................. . enzima Fosfohexoizomerazâ
enzima
Hexokinază
U -Fructoza 6 ~ P

► Glucoza 6 ~ P
enzima
Ut PructozS 1 - 6 ~
:
Fosfohexokinazâ
enzima Aldolazâ

Dihidrt
enzima Triozoizomerazâ
Figura 5.24. - Acţiunea specifică a enzimelor în etapele succesive
ale
procesului de Ghceroaldehidâ ~ P ■ enzima Deshidrogenazâ
fermentaţie alcoolică Ui I <.............
Fosfoenolpiruvat
■ enzima Piruvatkinaza
Acidpii . enzima PiruvatdecarboxilazS
I—► Acid
piruvic

(după Colette Navarre, 1991)

31
3
 C. ŢĂRDEA, Gh. SĂRBU, Angela ŢĂRDEA

Levurile deşi sunt organisme simple monocelulare, dispun de un echipament

enzimatic foarte complex şi anume: oxidoreductaze, transferaze, hidrolaze, liaze,
izomeraze, ligaze sau sintetaze. Dintre enzimele care activează tn procesul de
fermentaţie alcoolică, menţionăm: hexokinaza, aldolaza,
deshidrogenaza, fosfohexoizomeraza, fosfohexokinaza, triozoizomeraza,
piruvatkinaza. piruvatdecarboxilaza, aldodeshidrogenaza etc. Mai mult de 12 enzime
diferite provenite de la levuri, sunt implicate tn fermentaţia alcoolică.
Enzimele au acţiune specifică şi intervin în etapele succesive ale procesului de
fermentaţie alcoolică (figura 5.24). Acţiunea lor este cuplată cu un bilanţ energetic şi
transfer de electroni.

5.4.2.I. Rolul coenzimelor tn procesul de fermentaţie alcoolică Acţiunea enzimelor se

exercită prin componentele lor active, denumite coenzime. La procesul de fermentaţie
alcoolică, participă următoarele coenzime: Nicotinamid-Adenin-Dinucleotida oxidat
(NAD*) sau redus (NADH + H*), cocarboxilaza sau tiamino-pirofosfatul (TPP),
adenozin-trifosfatul (ATP), adenozin-difosfatul (ADP) şi coenzima A.
Nicotinamid-Adenin-Dinuclcotida (NAD), cunoscută mult timp sub denumirea
de difosfo-piridinnucleotidă (DPN) sau de codehidrază î. Este coenzima multor
enzime din clasa dehidrogenazelor. Configuraţia chimică a nicotinamidei-adenin-
dinucleotidei este următoarea:

adenină N
u
c
I
e
0 t
1 d
rrboză a

Aceasta
coenzimă rezultă din
unirea printr-o legătură difosfat a două nucleotide: o nucleotidă formată din riboză
(derivat al vitaminei PP) şi altă nucleotidă formată din riboză şi nicotinamidă
(derivat de la adenină).
Funcţia acestei coenzime este de a fixa reversibil ionii de hidrogen cedaţi de
substrat:
NAD* + 2H î* NADH + H*
Mecanismul de oxidoreducere are ioc la nivelul nucleului de piridină, care
poate lua fie o formă oxidată cu o sarcină pozitivă la atomul de azot, fie o formă
redusă fără sarcină Ia atomul de azot:

314
Forma oxidată (NHD+) Forma redusă (NHDH)
Cocarboxilaza sau tiamino-pirofosfatul (TPP), este coenzima enzimelor din
clasa decarboxilazelor. Configuraţia chimică este următoarea:
cr
P=T -OH
OH OH
CM - N*
2
CH—s

Această coenzimă reprezintă esterul fosforic al tiaminei (vitamina Bt). Funcţia

ei este de a decarboxila acizii cetonici şi a-i trece in aldehide, după schema
următoare:
TPP
R-CO-COOH--------------► R-CHO + C02

Pentru a putea acţiona, are nevoie de prezenţa ionilor de Mg2* în substrat.

Adenozintrifosfatul (ATP) şi adenozindifosfatul (ADP). Aceste coenzime
participă, la reacţiile enzimatice de transport a ionului fosfat (fosforilarea zaharurilor)
şi au un rol important in bilanţul energetic al procesului de fermentaţie. Configuraţia
celor două coenzime este aproape identică, cu deosebirea că adenozin difosfatul are o
moleculă de fosfat mai puţin:

Adeninft

Ribozâ
 A treia molecula de fosfat (molecula terminală) este fixată printr-o legătură
bogata în energic (legătură macroergică), Ruperea acestei legături cu formarea de
adenozin-difosfat şi o moleculă de acid fosforic este însoţită de energie; în acelaşi
timp trebuie furnizată energie din exterior pentru formarea celei de a treia legături
dintre ADP şi o moleculă de fosfat. Deci, avem de a face cu o reacţie exoenergetică,
capabilă să elibereze energie şi în acelaşi timp să refacă molecula de adenozin-
trifosfat.
Coenzima A (prescurtat CoA-SH). Conţine molecula unei vitamine B (acidul
pantotenic) sau mai exact compusul amidic al acidului pantotenic cu P-tioetilamina.
Configuraţia chimică este următoarea:

In coenzima A, panteteina se leagă de nucleotidă prin intermediul unui rest de

acid fosforic.
Activitatea coenzimei A se datoreşte, în primul rând, grupei SH. De această
grupă se leagă acetilul sub formă de tioester, care nu este altceva decât acetil
coenzima A. Coenzima A catalizează reacţiile de acetilare biologică, prin transferul
unei grupe acetil de la un donor la un acceptor. în cazul fermentaţiei alcoolice,
donorul cel mai important este acidul piruvic, rezultat din glicoliza zaharurilor.
Acesta se transformă în acetil-coenzima A (CH 3-CO-S-CoA), care prin hidroliză
formează acidul acetic.
Legătura dintre acetil şi restul de enzimă A este foarte bogată în energie (cca.
8200 cal/moi). Atunci când grupa acetil se transferă de la acetil-coenzima A la un
acceptor, această energie nu se pierde, reacţia fiind cuplată cu formarea unei molecule
de ATP foarte bogate în energie.

5.4.2.2. Mecanismul biochimic al fermentaţiei alcoolice

Degradarea biochimică a zaharurilor din must se petrece printr-un mecanism
de glicoliză, după schema Embaen-Meyerhof, prin care levuriie transformă hexozele
(C6) în acid piruvic; urmează apoi transformarea acidului piruvic în alcool etilic şi
dioxid de carbon. Schema după care se desfăşoară fermentaţia alcoolică este
prezentată în figura 5.25.