Universitatea Lucian Blaga-Sibiu Fac.

AIAPM Specializare Managementul procesrii moderne a alimentelor

Coord.prof.univ.dr.biolog Letiia Oprean Masterand Lungu Ioan Sorin An I

-2010, Sibiu-

CUPRINS

Introducere Scurt istoric Activitatea catalitic a enzimelor Temperatura optim a reaciilor enzimatice Influenta pH-ului Specificitatea enzimelor Clasificarea enzimelor Invertaza Imobilizarea invertazei Monitorizarea activitii invertazei Obinerea invertazei din microorganisme Fazele tehnologice i parametrii de proces n obinerea invertazei Utilizri n industria alimentar Bibliografie

3 4 5 6 6 7 7 9 12 13 14 15 17 18

Introducere
2

n organismele vii se petrec cu o uimitoare uurin, la temperatura joasa i n soluie practic neutr, un numr mare de reacii pe care chimistul nu le poate efectua n laborator dect lucrnd la temperaturi i presiuni ridicate, n prezen de acizi sau de baze tari, de dizolvani neapoi sau de catalizatori heterogeni metalici. Printre aceste reacii se numr att degradri de molecule (hidrolize i oxidri), ct i sinteza de compui cu structura complicat. nelegerea mersului acestor reacii este important, n primul rnd pentru cunoaterea unor fenomene naturale de cea mai mare amploare i rspndire, n al doilea rnd pentru interesul practic pe care l prezint. Nu este absurd sperana c, o dat cunoscut mersul reaciilor din celulele vii, acestea vor putea fi imitate n laborator i n industrie sau chiar dirijate pe ci noi. S-a recunoscut nc de mult c organismele folosesc, pentru realizarea acestor transformri chimice, catalizatori organici, coninui n concentraii mici n celule sau n sucurile secretate de acestea, cum sunt sucurile digestiei, laptele, urina etc. S-a dat acestor catalizatori numele de fermeni sau enzime (de la enzyme, literal: in aluat).

Scurt istoric

Reaciile enzimatice au fost folosite din timpurile cele mai vechi pentru fabricarea vinului, a oetului, a berii i a brnzei. O cercetare sistematic a lor a fost ntreprins abia n epoca modern. n 1713, Reamur a observat dizolvarea crnii n sucul stomacal al ciorii. De asemenea, fiziologul Spallanzani (1783) a hrnit animale cu buci de carne nvelite n reele de srm i observat dizolvarea crnii n stomac. Stahl, fondatorul teoriei flagisticului, explic fermentaia ca un proces n care una din substanele prezente transmite micarea sa intern substanei care fermenteaz (1697). n 1680, van Leeuwenhoeck a observat la microscop celulele drojdiei de bere, dar aceast descoperire nu a fost luat n seam timp de dou secole. Lavoisier (1789) a fcut un bilan de materiale al fermentaiei, artnd ca oxigenul, hidrogenul i carbonul din zahr se regsesc n alcoolul i bioxidul de carbon ce iau natere. n cursul sec. al XIX-lea au fost preparate multe extracte de enzime. Astfel, dup ce Kirchoff a observat, n 1820, ca o component glutinoas din bobul de orz ncolit, numit mal, transforma cantiti de amidon mult mai mari dect propria sa greutate, ntrun zahr solubil, maltoza, Dubrunfaut a gsit, n 1830, ca extractul apos, limpede, de mal are aceeai aciune solubilizant asupra amidonului ca malul nsui. Din acest extract, Payen i Persoz (1833) au izolat, prin precipitarea cu etanol, prima enzim, amilaza (firete foarte impur), sub forma unui material solid alb, amorf, capabil s solubilizeze o cantitate de amidon de 2000 de ori mai mare dect propria sa greutate. n 1830, Robiquet i Boutron-Chalard au descoperit hidroliza amigdalinei, cu extract de migdale amare, iar n 1837, Liebig i Wohler au izolat enzima respectiv, numind-o emulsin. Printre primele enzime izolate (in stare impur) vom mai meniona: pepsina din sucul gastric (Schwann, 1836); tripsina, din sucul pancreatic (Kuhne, 1848); lipaza (Claude Bernard, 1849); invertaza (Mitscherlich, 1841; Berthelot, 1860); ureaza (Musculus, 1882) etc. Un moment istoric deosebit de important este recunoaterea clar, de ctre Berzelius, n 1835, a caracterului catalitic al reaciilor enzimatice, precum i a rolului esenial pentru viata animalelor i a plantelor jucat de aceste reacii. n anul 1940, cercettorul acelai domeniu, o i mai mare american Edward Howell a fcut, n 4 descoperire: cercetnd substanele vitale

propriu-zise i anume, ENZIMELE, a dovedit c ele sunt purttorii vieii din orice organism viu, fiind deci i materia vie din alimentele noastre (asta atta timp ct nu sunt distruse prin fierbere).

Activitatea catalitic a enzimelor

Enzimele sunt, precum s-a mai spus, catalizatori organici, produi de celula vie, acionnd asupra anumitor substane numite substraturi. n marea lor majoritate, enzimele catalizeaz reacia unei substane organice cu un compus anorganic liber sau cedat de alt compus organic (ap, acid fosforic, hidrogen, oxigen etc.). Legile catalizei se aplic firete i la enzime. Enzimele, ca toi catalizatorii, nu catalizeaz dect reacii termodinamic posibile, decurgnd n sensul stabilirii unui echilibru. Reaciile enzimatice prezint ns unele deosebiri caracteristice fa de reaciile catalitice obinuite, omogene sau heterogene. Cnd o reacie poate fi catalizat att de o enzim ct i de substane simple (acizi, baze sau ioni metalici) se constat de obicei c reacia enzimatic decurge cu viteza mult mai mare; cu alte cuvinte, reacia enzimatic are o energie de activare mult mai mic. Astfel s-a stabilit ca este necesar o concentraie de ioni de hidrogen de zece milioane de ori mai mare dect de invertaz pentru a hidroliza o anumit cantitate de zaharoz, ntr-un timp dat, la 370.

Temperatura optim a reaciilor enzimatice

Viteza reaciilor enzimatice crete, ca a celor mai multe reacii ntre molecule covalente, cu temperatura, potrivit cunoscutei reguli a lui van Hoff, i anume, o urcare a temperaturii cu 100 produce o cretere a vitezei de reacie cu un coeficient 1,5-3. Creterea acesta se observ ns numai la temperaturi relativ joase. O dat depit o anumit temperatur optim, la care viteza este maxim, aceasta scade, iar la temperaturi mai nalte reacia nceteaz. Fenomenul se explic prin faptul, semnalat mai sus, c la temperaturi mai nalte enzimele sunt inactivate prin denaturarea componentei proteice. Cele mai multe enzime devin complet inactive ntre 50-80 0. Temperatura optim nu poate fi ns exact definit, cci ea variaz n limite largi, cu concentraia enzimei, cu concentraia ionilor de hidrogen i cu prezena diferitelor impuriti ale preparatului enzimatic sau ale substratului.

Influenta pH-ului
Dup cum a artat Sorensen (1909), activitatea enzimelor depinde ntr-o foarte mare msura de concentraia ionilor de hidrogen din soluie (sau mai corect de activitatea termodinamic a ionilor de hidrogen, adic de pH-ul soluiei). Curbele reprezentnd variaia vitezei de reacie cu pH-ul prezint de obicei un maxim pronunat la un anumit pH, n timp ce la valori ale pH-ului diferind cu 1 fa de acest maxim, viteza de reacie prezint valori considerabil mai mici. Din cauza acestei particulariti, este necesar ca n cursul reaciilor enzimatice s se menin pH-ul optim constant, prin folosirea unui tampon.

Specificitatea enzimelor

O anumit enzim catalizeaz numai un numr mic de reacii i de multe ori o singur reacie, spre deosebire de catalizatori obinuii anorganici (acizi, baze, catalizatori de hidrogenare etc.) care activeaz practic toate reaciile posibile de un anumit tip. Se disting multe tipuri i grade de specificitate n aciunea enzimelor. n primul rnd trebuie menionata specificitatea stereochimic, care const n aceea c o enzim care catalizeaz reacia unui compus optic activ este fr aciune asupra enantiomerului su i n general, asupra izomerilor sterici ai acestui compus, supui acelorai condiii. Vom mai aminti aici dehidrogenaza lactic din muchi, o enzim care lucreaz n colaborare cu DPN, i care dehidrogeneaz acidul L-lactic la acid piruvic i hidrogeneaz acidul piruvic numai la acid L-lactic, fiind inactiv fata de acidul D-lactic. Din alt punct de vedere se disting ntre o aa-numit specificitate de reacie i o specificitate de substrat a enzimelor. Prima se refera la reactantul anorganic care ia parte la reacie: apa n reaciile de hidroliza, acidul fosforic n reaciile cu fosforilaza, hidrogenul n reaciile catalizate de dehidrogenaze etc.

Clasificarea enzimelor
Se cunosc n prezent cteva sute de enzime dar, avnd n vedere complexitatea proceselor chimice care au loc n organismele vii, numrul enzimelor aprut n natur trebuie s fie mult mai mare. Structura enzimelor este prea puin cunoscut pentru a putea servi ca baz a unei clasificri, de aceea enzimele se clasific dup tipul reaciilor pe care le provoac sau dup substraturile asupra crora acioneaz. Numele enzimelor se formeaz adugndu-se sufixul -az la numrul reaciilor provocate sau substraturilor lor, excepie fac numele istorice al unor enzime cum ar fi emulsina, pepsina i zimaza. n clasificarea adoptat aici enzimele sunt mprite (dup Hoffmann Ostenhof 1953) n cinci clase principale, fiecare divizat n mai multe subclase: 1. Hidrolaze 2. Transferaze

3. Oxido-reductaze 4. Liaze i sintetaze 5. Izomeraze i Racemaze La drept vorbind, aproape toate reaciile enzimatice sunt reacii de transfer al unor grupe de atomi de la un donor la un acceptor. Astfel, hidrolizele sunt reacii de transfer al unor grupe acil, glicozil, cedate de substrat, ctre ap ca acceptor, iar reaciile de oxidoreducere sunt reacii de transfer de hidrogen sau electroni, termenul de transferare se folosete ns, n nomenclatura curent, mai ales pentru transaminri, transmetilri, transacetilri. Dup o clasificare mai noua (Union of Biochemistry Commission of Enzymes 1961), enzimele sunt mprite n ase clase: 1. Oxido-reductaze 2. Transferaze 3. Hidrolaze 4. Liaze 5. Izomeraze 6. Ligaze (sintetaze) fiecare divizat la rndul ei n mai multe subclase, fiecare enzim este desemnat din patru cifre: ex. 1111 (hidrogenaza alcoolului) este o oxido-reductaza (clasa 1) acioneaz asupra grupei CHOH a donorului (subclasa 1) cu DPN sau TPN ca acceptor (subsubclasa 1) i este primul termen din aceasta ultima subdiviziune

Invertaza
8

Invertaza este o enzim de origine microbiologic (drojdii), vegetal (usturoi, pere, frunze de vi de vie) sau animal, sub aciunea creia molecula de zaharoz este scindat n cele dou molecule componente, fructoza i glucoza. Invertaza transform zaharoza n zahr invertit. Hidroliza zaharozei sub aciunea catalitic a acestei enzime nu poate avea loc dac fructoza nu poate trece pe un anumit acceptor (substrat). Albinele secret invertaz la nivelul glandelor faringiene iar omul i animalele la nivelul intestinului subire.

Insuficiena invertazei secretate de intestinul uman conduce la un anumit grad, mai mic sau mai mare de intoleran la zaharoz. De cele mai multe ori invertaza intestinal este epuizat din cauza consumului mare de produse care conin zahr rafinat. Deficitul de invertaz se poate asocia cu o insuficien a amilazei. n funcie de gradul carenei simptomele merg de la o digestie greoaie pn la diaree acid, rebel cu scaune pufoase. Invertaza este prezent n echipamentul enzimatic al numeroaselor tulpini de drojdii, fungi i la diferite bacterii, din care poate fi izolat i purificat prin diferite tehnici. Numele oficial al invertazei este beta-fructofuranozidaz aceast enzim (EC3.2.1.26), hidroliza care arat faptul c reacia catalizat de este reziduurilor terminale nereductoare n betabeta-fructofuranozice

fructofuranozide. De remarcat este faptul c -D-glucozidaza, care rupe unitatea

terminal de glucoz, poate de asemenea cataliza aceast reacie. Sucroza poate fi catalizat relativ uor; reacia are loc ntr-un mediu acid, fr ajutorul invertazei.

Reacia prin care invertaza rupe molecula de sucroz n glucoz i fructoz este prezentat mai jos:

Invertaza utilizat n industria alimentar are simbolul E-1103. O palet larg de pot, din aceast cauz, utilizeaz sucroza ca i nutrient. Comercial, invertaza este microorganisme pot produce invertaz i

10

biosintetizat n cea mai mare parte de drojdiile Saccharomyces cerevisiae sau Saccharomyces carlsbergensis. Chiar i n aceeai cultur de drojdii, invertaza exist n mai multe forme. De exemplu, invertaza intracelular are o greutate molecular de 135000 Da, n timp ce

varietile extracelulare au masa unei molecule de aproximativ 270000 Da.

Inhibarea enzimei este foarte important pentru cercetarea din domeniul medical. De exemplu, plumbul, mercurul, alte metale grele i gazele paralizante sunt extrem de otrvitoare pentru om deoarece pot fi inhibitori de enzime. De exemplu, Pb 2+ poate reaciona uor cu gruprile sulfhidril (-SH) din cadrul proteinelor: protein-SH + Pb2+ + HS-protein protein-S-Pb-S-protein + 2H+ Invertaza a fost probabil prima enzim utilizat la scar larg ntr-o form imobilizat. n perioada 1941 1946, acidul folosit fabricarea siropului golden nu a mai fost disponibil, aa c invertaza obinut din drojdii a fost folosit ca nlocuitor. Celulele de drojdie au fost autolizate, iar autolizatul a fost clarificat prin ajustare la pH 4,7, urmat de filtrare printr-un pat de sulfat de calciu i apoi absorbit pe crbune. Un strat de crbune coninnd invertaz a fost inclus n patul de crbune folosit deja pentru decolorarea siropului. Mrimile folosite au fost foarte variate, patul de crbune cu invertaz fiind de 60 cm grosime ntr-un pat de crbune de 610 cm grosime. Preparatul era foste stabil, factorii limitativi fiind contaminarea microbian sau pierderea puterii de decolorare mai repede dect pierderea activitii enzimatice. Procesul a fost costisitor, dar, nesurprinztor, produsul nu avut fineea aromei de material acid-hidrolizat, iar procesul de obinere a enzimei imobilizate a fost abandonat atunci cnd acidul a devenit disponibil 11

din nou. Totui, recent, a fost reluat folosind BrimacTM, unde stratul de crbune cu invertaz a fost stabilizat prin cross-linking i a avut un timp mediu de via de 90 de zile (pH 5.5, 50C). Rezistena lui se datoreaz n parte procesului de HFCS ca i ndulcitor slab colorat. Este imposibil producerea siropurilor invertite de calitatea echivalent prin hidroliz acid. Inversia enzimatic evit supra colorarea, cantitate mare de cenu, conversie relativ sczut i probleme de variabilitate ale arjei de hidroliz acid. Dei poate fi folosit invertaza pur (cu timp de reziden de aproximativ o zi), folosirea enzimelor imobilizate ntr-un PBR (cu timp de reziden de aproximativ 15 minute) face procesul mai competitiv; costul inversiei de 95% (la 50% (w/w)) nefiind mai mare dect costurile evaporrii finale (la 75% (w/w)). O productivitate la 16 tone de sirop invertit (greutate uscat) poate fi obinut folosind un litru de enzim granular.

Imobilizarea invertazei
Invertaza a fost prima dat imobilizat de Nelson i Griffin n 1916, ei folosind crbune activat. Invertaza poate fi mult mai uor imobilizat folosind alginat de calciu. Pentru aceasta se sugereaz ca preparatul curat de enzim s fie amestecat cu un volum egal de soluie de alginat de sodiu 2%, care este adugat apoi n picturi ntr-o soluie de clorur de calciu 1,5%. Se permite linitirea paturilor cteva minute nainte de folosire.

Monitorizarea activitii invertazei

12

Sucroza nu este un zahar reductor, ns, glucoza i fructoza, produsele aciunii invertazei asupra sucrozei, sunt. Apariia zaharurilor reductoare ntr-o reacie poate fi folosit pentru monitorizarea activitii invertazei. Pentru aceasta, se prepar un standard pentru determinarea curbei de calibrare cu soluii de glucoz de concentraii cunoscute ntre 1-10%, nregistrndu-se timpul necesar decolorrii soluiei acidifiate de manganat de potasiu. Pentru fiecare reacie se folosesc 10 ml dintr-o soluie de glucoz, 5 ml de acid sulfuric 1 M i 2 ml soluie 0,01 M de manganat de potasiu. Pentru monitorizarea activitii invertazei, se dizolv 10 g de sucroz n 100 ml ap. Se adaug 2 ml de preparat de invertaz. Se iau cte 2 ml din acest amestec de reacie la intervale de timp de 1 11/2 ore. Pentru fiecare prob se nregistreaz timpul necesar decolorrii soluiei acidifiate de manganat de potasiu, ca i anterior, dar substituind proba cu soluia de glucoz. Se folosesc curbele standard pentru estimarea cantitii de zaharuri reductoare prezente. Contrar celor mai multe enzime, invertaza prezint o activitate relativ mare la un pH de 3,5 5,5 cu un optim n apropierea valorii de 4,5. Activitatea enzimei ajunge la un maxim n jurul valorii de 550C. Valorile Michaelis-Menten pentru diferite enzime variaz mult, dar pentru cele mai multe dintre ele Km este cuprins ntre 2 mM i 5 mM. Valoarea Michaelis-Menten pentru enzimele libere este n general aproximativ 30 mM.

Obinerea invertazei din microorganisme

13

Una din principalele surse de obinere a enzimelor sunt drojdiile, care au un bogat echipament enzimatic, iar dintre acestea Saccharomyces cerevisiae este specia principal folosit n mod curent n diferite procese fermentative. Invertaza este o enzim care hidrolizeaz zaharoza n glucoza i fructoz i este prezent n echipamentul enzimatic al numeroaselor tulpini de drojdii (Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae), fungi (Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum) i la diferite bacterii (Clostridium pasteuranum, Streptococcus), din care poate fi izolat i purificat prin diferite tehnici.

Procesele membranare i-au gsit o aplicaie larg n domeniul biotehnologiilor datorit posibilitii de separare i concentrare eficient a compuilor termolabili (proteine, enzime, celule microbiene etc.). Aplicarea procedeelor membranare la separarea, purificarea i concentrarea enzimelor din medii biologice este justificat n plus de faptul c ele conduc la obinerea unor compui cu puritate avansat, asigurnd randamente mari de separare i conservarea tuturor calitilor acestor preparate.

Fazele tehnologice i parametrii de proces n obinerea invertazei

14

Parametrii de proces:

autoliza : timp de agitare: 1 or; turaie agitator: 1000rpm: temperatura de lucru: 50C; dup intervalul de 1 or se rcete la cca.20

ultrasonarea: frecvena: 40 KHz timp: 20 min.

15

ultrafiltrarea (membrane MEMBRAFIL-UF, cut-off: 7.000-10.000 Da): presiune: 6 bar temperatura: 20C microfiltrarea (membrane MEMBRAFIL-MF, diametrul porilor: 0,1-0,45mm): presiune: 2,5 bar temperatur: 20C Indicatorii de calitate ai produsului finit aspect: lichid vscos, de culoare bej, opalescent, fr impuriti mecanice; activitatea enzimatic specific (A.E. specific, mmoli/gSU.min): min. 100.000; perioada de conservare la 4C: - min. 1 lun (fr stabilizator)

Efecte socio - economice - obinerea unui produs de calitate ridicat cu utilizare n industria alimentar (la obinerea unor lichioruri de calitate, respectiv diferitelor produse zaharoase, ca de exemplu bomboanele fondante); - reducerea costurilor de obinere a invertazei active care introdus n mici proporii n masa zaharoas conduce la obinerea de produse cu caracteristici constante i termene de valabilitate crescute de cel puin dou ori, contribuind astfel la diminuarea pierderile de vnzare a produselor zaharoase fabricate.

16

Utilizri n industria alimentar

Invertaza este folosit n principal n fabricarea produselor de cofetrie, unde fructoza este preferat naintea sucrozei deoarece este mult mai dulce i nu cristalizeaz aa uor. Totui, folosirea invertazei este relativ limitat datorit unei alte enzime, glucozo-izomeraza, care poate i ea s converteasc glucoza la fructoz, mult mai ieftin. Din motive de sntate i gust, invertaza utilizat n industria alimentar necesit s fie nalt purificat. Invertaza este utilizat pentru prepararea siropurilor de zahr invertit, care este un ingredient al multor produse alimentare. Este folosit de asemenea pentru prevenirea cristalizrii zahrului n maripan i bomboane fondante umplute. Mult mai interesant este folosirea n crearea umpluturilor cremoase ale ciocolatei cu lichior i a ciocolatei mentolate desert. Invertaza poate fi folosit, de asemenea, pentru reducerea coninutului de sucroz al unor sortimente de sucuri de fructe.

BIBLIOGRAFIE

17

1. http://en.wikipedia.org/wiki/Invertase 2. http://greenwoodhealth.net/np/invertase.htm 3. http://www.invertase.net/single.htm 4. http://www.invertase.net/single.htm 5. http://images.google.ro/imgres?

imgurl=http://njsas.org/projects/light_polarization/invertase.gif&imgrefurl=http:// njsas.org/projects/light_polarization/sugars.html&h=140&w=717&sz=4&hl=ro& start=1&um=1&tbnid=bcYOpXzedOJqXM:&tbnh=27&tbnw=140&prev=/images %3Fq%3Dinvertase%26um%3D1%26hl%3Dro%26sa%3DG

6. http://www.membrane.itcnet.ro/PaginaInvertaza.htm 7. http://www.bioterapi.ro/dictionar/index_substante/index_substanteI.html#invertaz

a
8. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/iminvertase.html 9. http://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/MATERIALS/ENZYMES/invertase.html

18