Lp Diluția spermei

Diluția spermei de taur

Orice diluant, indiferent de modalitatea de conservare care urmează,

trebuie să asigure substanțele energetice necesare metabolismului, substanțele
tampon, antioxidante și cele protectoare ale membranei spermatozoizilor la
temperaturi sub cea a corpului, la care se conservă sperma. Componentele de
origine animală precum gălbeșul de ou și laptele asigură această protecție. Există
păreri potrivit cărora este posibil ca unele vaci să dezvolte reacție imunitară
împotriva acestor proteine din dozele de spermă și vacile să aibă o rată de gestație
foarte scăzută, fiind propus ca înlocuitor laptele de soia (Thun, 2002, cit. de Ball,
2007).
Pentru fiecare dintre grupele de substanțe care intră în alcătuirea
diluanților s-au făcut numeroase încercări pentru a se găsi compoziția biochimică
și concentrația care asigură cele mai bune rezultate apreciate pe baza ratei de
concepție a vacilor.
Tehnica de diluare include etape diferite în funcție de modul în care
urmează a se conserva sperma.

Diluția în vederea conservării prin refrigerare

Se folosesc atât medii de diluție pe bază de soluții saline cât și pe bază de
lapte proaspăt sau lapte praf, dar cei mai folosiți sunt diluanții sintetici.
Un diluant salin foarte simplu este diluantul pe bază de gălbenuș de ou
citratat (G.O.C.), cu următoarea compoziție și mod de preparare: la 100 ml apă
bidistilată se adaugă 2,9 g citrat de sodiu. Din amestec se iau 80 ml și se combină
cu 20 ml gălbenuș de ou. Se aseptizează cu 500 u.i. penicilină și 500 µg
streptomicină/ml.
Diluantul pe bază de gălbenuș de ou glucozocitratat (G.O.G.C). La 100
ml apă bidistilată se adaugă 1,4 g citrat de sodiu 3 g glucoză anhidră. Se
omogenizează și din conținut se iau 80 ml care se amestecă cu 20 ml gălbenuș de
ou.
Un diluant simplu, pe bază de lapte proaspăt, conține 90 ml lapte degresat
și sterilizat și 10 ml gălbenuș de ou. Toate mediile de diluție se aseptizează cu
antibiotice.
Tehnica diluării include două etape:
- diluţia iniţială (prediluţia), la 37oC, imediat după verificarea mobilității
și concentrației, în raport de 1/1 şi în condiţii de izotermie;
- diluţia finală (definitivă), la 18-20oC, tot în condiţii de izotermie. Se
adaugă restul cantității de diluant, conform raportului final de diluţie, calculat în
funcţie de concentraţia spermei brute şi a celei diluate în spermatozoizi/mm3 sau
pe ml.
Formula de calcul este următoarea:
G.D.F.=(C1/C2)xMxV, în care:
G.D.F – gradul de diluție finală;
C1 = concentraţia spermei brute în spermatozoizi/ml;
 C2 = numărul de spermatozoizi vii pe care dorim să-i avem în doză;
M = mobilitatea spermatozoizilor după deconservare, exprimată în
sistemul zecimal;
V = volumul dozei de spermă exprimat în ml.
Exemplu pentru calcularea volumului de diluant și a numărului de
recipiente pentru ambalare (fiole) necesare pentru diluția unui ejaculat,
cunoscându-se:
Concentrația spermei brute -1,5 mld. spermatozoizi/ml;
Numărul de spermatozoizi vii din doză- 15 mil/doză
Mobilitatea – 0,6 (60%)
Volumul dozei – 1 ml
Volumul ejacularului – 5 ml
G.D.F.=(1,5x109/15x106)x0,6x1=102x0,6=60
În acest caz, la un volum de spermă se adaugă 59 de volume de diluant.
Raportul de diluție final este 1/59. Rezultă volumul diluantului de 295 ml (59x5)
Numărul de doze se calculează împărțind volumul total (ejaculat +
diluant) la volumul dozei: Nr. doze=(5 ml+59x5 ml)/1=300
Pentru sperma de taur gradul de diluție oscilează frecvent între 20 și 40.
Într-o doză trebuie să se asigure între 12 milioane și 15 milioane spermatozoizi
mobili. Mobilitatea minimă admisă pentru sperma de taur conservată prin
refrigerare este de 60%, determinată înainte de a fi însămânţată.
După diluare, se apreciază mobilitatea spermatozoizilor şi dacă aceasta nu
a scăzut cu mai mult de 10% faţă de mobilitatea spermei brute, diluţia se
consideră că a fost efectuată în condiţii bune şi se trece la repartizarea în doze a
spermei. Repartizarea spermei în doze se face cu ajutorul unor seringi
semiautomate, în fiole de sticlă care se închid apoi la flacără oxiacetilenică, sau în
fiole care se închid cu dop de plută sau din material plastic (Tănase, 2000).

Diluția în vederea conservării prin congelare

În scopul congelării spermei se folosesc două medii de diluţie care se
deosebesc numai prin aceea că unul conţine, în plus, o substanţă crioprotectoare.
Se pot folosi diluanţi salini, pe bază de lapte sau sintetici care se prepară
după tehnicile descrise. Cantitatea necesară de diluant se separă în două părţi
egale (A şi B). Diluantul B conţine în plus faţă de diluantul A 14-16% glicerină
chimic pură, astfel încât concentraţia de glicerină, în final, să fie de 7-8%.
Diluantul A se împarte în două părţi inegale: o parte (A1) mai redusă (5-
10%) se păstrează la termostat reglat la 37oC, iar cealaltă parte, (A2) se lasă la
temperatura camerei. Diluantul B se păstrează la frigider sau într-o vitrină
frigorifică la 2-4oC.
Diluţia parcurge 3 etape: iniţială, intermediară şi finală.
Diluţia iniţială se face la temperatura de 37oC, în condiţii de izotermie, în
raport de 1/1, cu diluantul A1, direct în paharul colector gradat. După efectuarea
acestei prime diluţii, paharul cu sperma astfel diluată se scot de la termostat şi se
aşază alături de fracţiunea A2 a diluantului, la temperatura laboratorului (18-
20oC).
 Diluţia intermediară se face după circa 20-30 de minute, când cele două
componente ating aceeaşi temperatură, la temperatura laboratorului, adăugându-se
diluantul A2 într-un raport care să asigure jumătate din cantitatea totală de diluant
calculată prin raportul final de diluţie.
După diluţia intermediară, paharul cu sperma se introduce într-o vitrină
frigorifică sau la frigider, alături de fracţiunea B a diluantului.
Diluţia finală se face la temperatura de 2-4oC, tot în condiţii de izotermie,
după 50-60 de minute de la efectuarea diluţiei intermediare. Întrucât glicerina este
o substanţă toxică pentru spermatozoizi, diluantul glicerinat se adaugă treptat, în
volume fracționate la interval de 5-10 minute, picătură cu picătură, sub o
permanentă agitare a recipientului cu spermă.
Exemplu:
volumul ejaculatului V= 5 ml
concentraţia spermei brute în spermatozoizi/ml: C1 = 1 mld
numărul de spermatozoizi vii pe care dorim să-i avem în doză: C2 = 15
milioane
mobilitatea spermatozoizilor după decongelare: M = 0,3
volumul dozei de spermă: v = 0,25 ml
G.D.F.=(1x109/15x106)x0,3x0,25=5
R.D.F=1/4
Cantitatea de diluant =RDFxV=4x5 ml=20 ml
A=B=10 ml
A1 este egal cu volumul ejaculatului= 5 ml
A=A1+A2=10 ml; A2=5 ml
Număr doze: 20 ml diluant+5 ml spermă=25 ml
25 ml (volum total)/0,25 (volumul dozei)=100 doze

Diluția spermei în vederea congelării în granule

Congelarea spermei sub formă de granule se bazează pe răcirea rapidă a
acesteia, în alveolele unei plăci de zăpadă carbonică rezultând pastile cu un
volum de 0,1 ml. Diluția inițială se face în raport de 1/1 la 370C, iar după 15
minute, timp în care sperma prediluată este menținută la 200C, se adaugă restul de
diluant (conține crioprotector) calculat pe baza RDF. Raportul de diluție este
foarte strâns (1/2-1/4).
La calcularea gradului de diluție finală se are în vedere faptul că volumul
dozei este de 0,1 ml, iar mobilitatea spermei decongelate din granule este sub
30%.

Diluția spermei în vederea conservării la temperatura camerei

Se folosesc diluanți salini cu adaos de gălbenuș de ou și glucoză. Diluția se face în
două etape, asemănător diluării pentru refrigerare.

Diluția spermei de berbec

 Diluția spermei în vederea conservării sub formă lichidă (la
temperatura laboratorului și prin refrigerare)
După recoltare, sperma se poate fracționa și inocula fără o diluție
prealabilă, fecunditatea ovinelor fiind foarte bună, dar timpul de folosire a
spermei brute este limitat la 2-3 ore. Pentru păstrarea un timp mai îndelungat este
obligatorie diluția. Se folosesc diluanți salini cu adaos de glucoză și gălbenuș de
ou sau diluanți sintetici.
Volumul mic al ejaculatului la berbec precum și ritmul rapid de lucru care
trebuie menținut în laborator, nu permite calcularea raportului de diluție pentru
fiecare ejaculat. Astfel, pentru ejaculate cu mobilitate și concentrație apropiate se
folosește același raport de diluție. La ejaculatele cu spermă deasă și mobilitate de
0,9 se folosește diluția 1/7; la cele cu spermă deasă și mobilitate 0,7-0,8 și la cele
cu spermă mijlocie și mobilitate 0,9 se folosește diluția 1/3; la ejaculatele cu
densitate mijlocie și mobilitate 0,7-0,8 diluția este ½.
Sperma de berbec și în special cea de țap conține enzima fosfolipaza A
care scindează lecitina din gălbenușul de ou rezultând compuși nefavorabili
menținerii viabilității spermatozoizilor. Din acest motiv se poate îndepărta plasma
seminală prin centrifugare, se pot folosi proporții scăzute de gălbenuș de ou care
este un protector al membranelor spermatozoizilor sau se pot găsi diluanți care să
tamponeze efectul amintit (diluantul TRIS).
Diluția se face în două etape:
- diluția inițială, în raport de 1/1, în paharul colector, imediat după
recoltare;
- diluția finală se face după 20-30 minute, timp în care sperma prediluată
s-a menținut la temperatura laboratorului împreună cu restul diluantului calculat
pe baza raportului de diluție.
În cazul în care raportul de diluţie este mai larg (1/5-1/7), pentru mărirea
vâscozităţii materialului seminal, se poate adăuga la compoziţia diluantului 2-3%
gelatină sau polivinil pirolidon etc.

Diluția spermei în vederea conservării prin congelare

Tehnica de diluare este asemănătoare celei descrise la taur. Raportul de
diluție se stabilește în funcție de mobilitate și desime. Pentru un număr mai precis
de spermatozoizi mobili pe doză, pentru calculul G.D.F. se folosește formula:
G.D.F.=(C1/C2)xMxV, în care:
G.D.F – gradul de diluție finală;
C1 = concentraţia spermei brute în spermatozoizi/ml;
C2 = numărul de spermatozoizi mobili pe care dorim să-i avem în doză
(minim 200 milioane);
M = mobilitatea spermatozoizilor după decongelare, exprimată în
sistemul zecimal.
Se folosesc doi diluanți, diferența dintre ei fiind reprezentată de faptul că
diluantul II cu care se face diluția finală conține agentul crioprotector. Diluantul II
reprezintă jumătate din volumul total de diluant calculat inițial.
Tehnica diluării cuprinde 3 etape:
 - diluţia iniţială în proporţie de 1:1 cu diluantul I, cu un conținut de 20%
gălbenuş de ou. Operaţiunea se face pe baie de apă la 30oC;
- diluţia intermediară se realizează cu același diluant, la temperatura camerei
după 20-30 de minute, urmând răcirea treptată până la +4oC. Echilibrarea spermei diluate
se face la 4-5oC, timp de 1-2 ore;
- diluţia finală se face cu diluantul II (diluant salin cu 20% galbenuș de ou și 8 %
glicerină), la temperatura de refrigerare. Cantitatea care se foloseşte din diluantul II este
egală cu cea a diluantului I folosit pentru primele două diluții. Se adaugă într-o repriză sau
două, picătură cu picătură. Această diluare finală se face cu câteva minute înainte de
aspirarea spermei în paiete.

Diluția spermei de armăsar

Sperma de armăsar, după recoltare, oricare ar fi temperatura la care se

păstrează, nu conţine nici un spermatozoid viu după circa o oră. Deci
însămânţarea cu spermă brută trebuie să se facă în primele 5 minute de la
recoltare (Tănase, 2000). Dacă nu este posibil, sperma trebuie să fie diluată
imediat după recoltare, rolul diluantului fiind acela de a neutraliza efectele nefaste
ale plasmei seminale.
Pentru diluarea spermei de armăsar se folosesc mai multe formule de
medii de diluţie: pe bază de tartrat de sodiu şi potasiu, glucoză, peptonă, gălbenuş
de ou şi antibiotice. Un alt diluant folosit cu bune rezultate în Franţa este
constituit pentru un volum de 2 litri din: 1l de lapte semiecremat şi sterilizat, 1l de
soluţie (glucoză 50 g + lactoză 3 g + rafinoză 3 g + citrat de sodiu 0,6 g + citrat de
potasiu 0,82 g + penicilină 100000 U.I.) (Palmer, 1984, cit. de Tănase, 2000).
Diluanții pe bază de lapte pot asigura păstrarea spermei la temperatura
laboratorului timp de 6 ore. Laptele degresat sau laptele praf pot reprezenta medii
de diluție eficiente pentru conservarea spermei prin refrigerare. Diluanții pe bază
de lapte sunt mai efcienți când este prezentă plasma seminală, în timp ce mediile
de diluție care conțin gălbenuș de ou sunt recomandați după îndepărtarea plasmei
(Palmer, 2007, cit. de Noakes, 2009).
Indiferent de mediul de diluţie folosit, la 100 ml se adaugă 500000 U.I.
penicilină şi 0,5 g streptomicină.
Sperma se recoltează cu ajutorul vaginului artificial la interval de 48 de
ore, se filtrează, apoi se diluează imediat la 32oC în condiţii de izotermie, astfel
încât după diluţie să se asigure 20 milioane spermatozoizi/ml.

Diluția spermei de vier

Cel mai frecvent, sperma de vier se conservă la temperatura de 170C,

deoarece spermatozoizii acestei specii sunt foarte sensibili la șocul termic. Există
o mare variabilitate individuală a capacității de conservare de care trebuie să se
țină seama când se face diluția spermei. Cei mai buni diluanți s-au dovedit a fi cei
sintetici care reușesc să evite toxicitatea plasmei seminale pentru spermatozoizi în
cea mai mare parte, prin adăugarea de substanţe organice. În sperma de vier
diluată se produce frecvent aglutinarea datorită pierderii sarcinii electrice negative
ca urmare a surplusului de ioni metalici liberi (Ca, Fe, Mg). De aceea mediul de
diluţie trebuie să conţină neelectroliţi (zaharuri), substanţe ce conţin şi o sursă
exogenă de energie. Pentru menţinerea pH-ului în limite normale, în mediul de
diluţie sunt încorporaţi anioni polivalenţi (citratul de sodiu), gălbenuş de ou sau
lecitină. Pentru a proteja spermatozoizii de efectul nefavorabil al şocului termic în
mediul de diluţie se introduc substanţe chelatoare (complexon III). Rezultate bune
se obţin cu medii pe bază de glucoză-citrat-bicarbonat-complexon III - cu adaos
de antibiotice cu rol bacteriostatic sau bactericid (Tănase, 2000).
În timpul conservării, distrugerea membranelor este mai puternic corelată
cu fecunditatea decât afectarea mobilității (Martinez-Rodrighez, 2007).
Lipoproteinele cu greutate moleculară mică îmbunătățesc rata de
supraviețuire la decongelare (Jiang, 2007). Substanțele antioxidante
(hidroxitoluen butilat, alfa tocoferol) au efecte benefice asupra duratei de
conservare. Au fost testate diferite proteine care se leagă de membraba
spermatozoizilor în timpul sedimentării spermei și încetinesc degradarea
proteinelor membranare cauzate de temperatura redusă (Caballero, 2009).
O altă grupă importantă o formează diluanţii pe bază de lapte de vacă,
proaspăt sau preparat din lapte praf, sau din lapte+soluţie glucoză 6%+gălbenuş
de ou 3% şi antibiotice (Feredean, 1964). Alţi autori recomandă ca mediul de
diluţie pentru sperma de vier, laptele integral cu adaos de soluţie de glucoză 3,5%
şi 2% gălbenuş de ou, iar cercetători din China au obţinut rezultate satisfăcătoare
prin folosirea unui mediu alcătuit din părţi egale de lapte degresat, soluţie de citrat
de sodiu 2,9%, soluţie de glucoză 5%, la care se adaugă 10-20% gălbenuş de ou şi
antibiotice.
Laptele poate constitui singur sau în amestec cu alte substanţe, un bun
diluant pentru sperma de vier, fiind un mediu biologic complex, cu conţinut
favorabil de lipide (lecitină, cefalină), proteine (cazeină, lactalbumină,
lactoglobulină) şi aminoacizi esenţiali (metionină, treonină, lizină, triptofan),
glucide (lactoza), substanţe minerale, acid citric, enzime şi vitamine. Acest diluant
este foarte uşor de preparat, laptele trebuind să fie proaspăt şi să se încălzească
înainte de folosire, la 85-90oC, timp de 10-15 minute.
Pentru congelare este nevoie de de crioprotectori care să nu fie toxici și să
limiteze degradarea membranelor spermatozoizilor la decongelare (Rodrighez,
2007). Glicerolul 2-3 % realizează acest obiectiv (Hernandez, 2008). Amida,
metilamida sau dimetilacetamidă 5% pot îmbunătăți reușita congelării.
Pentru congelarea spermei de vier, mediile de diluţie trebuie să includă
glucoză, citrat de sodiu cu tampon format din soluţie tricină- tris, la care se
adaugă gălbenuş de ou, glicerină 3-4% şi antibiotice (Crabo, 197; Nouk, 1971, cit.
de Tănase, 2000).
Mediile sintetice produse de unităţi specializate sub formă de pulbere,
însoțite de instrucțiuni de folosire sunt cele mai folosite în prezent în practica
însămânţărilor artificiale la suine.
Tehnica diluării spermei este cât se poate de simplă. Diluţia trebuie să se
facă foarte repede după recoltare, la temperatura de 33oC, prin adăugarea treptată
a diluantului peste spermă, în condiţii de izotermie, într-o baie de apă a cărei
temperatură este reglată la acest nivel.
Gradul de diluţie se stabileşte pe baza concentraţiei, mobilităţii
spermatozoizilor şi a numărului de spermatozoizi mobili pe doza de însămânţare
(3-5 miliarde).
Exemplu pentru calcularea necesarului de diluant pentru un ejaculat cu
volum de 300 ml, o concentrație de 200x106 spermatozoizi/ml, mobilitate la
recoltare 80%, volumul dozei 80 ml cu 4x109 spermatozoizi/doză.
- se calculeză numărul de spermatozoizi mobili/ejaculat:
300 ml x 200x106 (spermatozoizi/ml) x 0,8 (mobilitate)=48x109
spermatozoizi mobili/ejaculat;
- se calculează numărul de doze care se pot obține și volumul lor total:
48x109 (spermatozoizi mobili/ejacualt) : 4x109 (spermatozoizi pe doză)= 12 doze
x 80 ml/doză = 960 ml (volum total care se repartizeză în doze);
- se calculează volumul de diluant 960 ml – 300 ml = 660 ml.
Există softuri care calculează automat volumul de diluant și numărul de doze pe
baza elementelor precizate în exemplul de calcul (fig.6.17).

A B
Fig. 6.17 Sistem de calcul al numărului de doze (A) și producerea lor (B)
După efectuarea diluţiei iniţiale în raport de 1/1, paharul cu spermă se
menţine 20-30 minute la temperatura laboratorului, apoi se adaugă treptat, în
condiţii de izotermie, restul cantităţii de diluant, apoi sperma se repartizează în
doze, constituite din recipiente din material plastic de diferite forme, având o
capacitate de 80-100 ml.

Diluția spermei de câine

Diluția spermei se face cu diluanți speciali în funcție de modalitatea de

conservare.
În vederea refrigerării există mai mulți diluanți comerciali, majoritatea
necesitând adăugarea gălbenușului de ou. Diluția se face în condiții de izotermie
(temperatura laboratorului). pH-ul diluantului trebuie să fie cuprins între 6,9 și 7,1
(Igna, 2007). Frecvent se recomandă diluarea după centrifugare pentru
îndepărtarea secrețiilor prostatei, deși procedeul cauzează deteriorări a structurii
unei proporții dintre spermatozoizi (Șonea, 2012). Pentru congelare se folosește
20% gălbenuș de ou în diluant și concentrații de 4-11% crioprotectori (glicerol,
DMSO). Se pot folosi și diluanți pe bază de lapte proaspăt degresat sau lapte praf
degresat.
Rata de diluție se stabilește astfel încât să se asigure 50-100 de milioane
spermetozoizi pe doza de 0,5 ml (Igna, 2007).

Diluția spermei de păsări

În vederea diluării spermei de păsări se recomandă următoarele :

- diluanții pentru sperma de cocoș să aibă un conținut scăzut de electroliți,
mai ales cloruri ;
- diluantul să conțină glutamat-L sodic deoarece în cadrul metabolismului
spermatozoizilor de cocoș se utilizează glutamat exogen în cantități mari ;
- utilizarea glucidelor cu greutate moleculară mare;
- pH-ul diluantului trebuie să fie de 8,5 pentru sperma de cocoș și 8
pentru sperma de curcan.
Când sperma diluată nu se congelează, diluanţii pot fi constituiţi din
simple soluţii tampon, urmărindu-se îndeosebi acţiunea protectoare pentru
capacitatea fecundantă a spermatozoizilor. Aceste soluţii sunt alcătuite din apă
bidistilată la care se adaugă fosfaţi de sodiu şi potasiu (65 g/l) pentru a asigura o
presiune osmotică de 380-400 mosm/l.
Dozele de spermă pentru însămânţarea artificială a păsărilor trebuie să
conţină 100-120 milioane de spermatozoizi mobili, raportul de diluţie cel mai
frecvent fiind de 1/2-1/3, fără a depăşi 1/5 (Tănase, 2000).