Determinarea parametrilor de creștere la bacterii

1 Numărul de bacterii

Cea mai simplă și cea mai utilizată metodă pentru determinarea numărului de bacterii constă în
inocularea pe mediul solid, în cutii Petri, a diluțiilor succesive dintr-un anumit produs , respectiv
dintr-o cultură bacteriană în mediul solid.

Cuantificarea numărului celulelor se poate face mai operativ prin determinarea turbidității
mediului, cu ajutorul unui spectrofotometru. Se citește absorbanța la lungimea de undă de
600nm (A₆₀₀), sau la 660nm(A₆₆₀).Pentru a stabili relația între numărul de celule și absorbanță
, se fac mai întâi determinări paralele, atât la spectrofotometrul, cât și prin metoda diluțiilor
succesive.D upă stabilirea relației între absorbanță și numărul de celule determinat prin metoda
diluțiilor succesive, se poate aprecia numărul de celule din mediu, făcând doar măsurători
spectrofotometrice, mai puțin laborioase.Se păstrează întodeauna aceleași condiții experimentale:
tulpină bacteriană , mediul nutritiv, spectrofotometrul etc.

Absorbanța unei suspensii celulare măsurată cu spectrofotometre diferite poate varia până
la 50% și este convenabil să se facă o calibrare a relatiei între absorbanță și concentrația celulelor
pentru fiecare aparat utilizat. Relația între absorbanță și concentrația celulelor este lineară numai
până la valori ale absorbanței de 0,4-0,5.În consecință ,concentrațiile mai mari de celule trebuie
diluate în mod corespunzător.Având în vedere că începând din faza staționară a curbei de
creștere numărul bacteriilor moarte , neviabile, este foarte mare(50% în acestă fază , crescând
apoi în progresie geometrică ), determinarea numărului de celule vii prin metoda
spectrofotometrică are aplicabilitate doar pe parcursul fazei de creștere exponențială.Numai în
această fază se păstrează relația lineară între absorbanță și numărul de celule viabile determinat
prin metoda diluției.

Calculele care se fac în continuare se aplică culturilor aflate în faza de creștere exponențială.
În situația ideală, care se ia în considerare pentru explicarea modalității de calculare a
parametrilor creșterii bacteriilor , numărul de bacterii dintr-o cultură în faza de creștere
exponențială se dublează la fiecare generație. Deci pornind de la o celulă inițială vor fi 2 celule
după prima, 4 după a doua, 8 după a treia generație etc.
 Generația 0 1 2 3 4 5 6 7 8 n

N= numărul de celule 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N

Formula de calcul a lui N 2⁰ 2¹ 2² 2³ 2⁴ 2⁵ 2⁶ 2⁷ 2⁸ 2ⁿ

Astfel ,cunoscând numărul de celule din prima generație , se poate calcula numărul de
bacterii dupa n generații, conform formulei:

Nn=2ⁿ * N₀

Unde Nn = numărul de bacterii după n generații

N₀= numărul inițial de bacterii

2 Numărul de generații(n)

Formula Nn =2ⁿ*N₀ se poate scrie și sub forma 2ⁿ= Nn/N₀. Funcția logaritmică fiind
inversul ridicării la putere, se poate calcula numărul de generații (n) scoțând logaritmul în bază 2
din raportul Nn/N₀:

𝑁𝑛
n=log₂ 𝑁₀ ; sau n = log₂Nn-log₂N₀

Se poate face calculul și folosind log₁₀; după formula:

𝑙𝑜𝑔10 𝑁𝑛−𝑙𝑜𝑔₁₀𝑁₀
n= 0,3

0,3 (exact 0,30103) este log₁₀2 sau raportul între log₁₀ și log₂
3 Timpul de generație(ᶱ) este durata unui ciclu de creștere sau timul necesar pentru ca populația
să se dubleze. Dacă într-un interval de timp (t)sunt n generații, timpul de generație(ᶱ), exprimat în
ore sau minute , se calculează conform formulei:

𝑡
ᶱ=𝑛

4 Rata de creștere(r sau ᶮ) reprezintă numărul de generații( diviziuni celulare) într-o unitate de
timp, de regulă o oră. Se calculează conform formulei:

𝑛 1
r= 𝑡 = ᶱ

Exemplu:

Se inoculează un mediu de cultură cu o bacterie, într-o concentrație de 10⁴ celule /ml.După 10

ore , în mediul de cultură se găsesc 10¹⁰ celule/ml. Aplicând formulele de mai sus se obține:

Numărul de generații: n= log₁₀10¹⁰-log₁₀10⁴:0,3=(10-4):0,3=6:0,3=20

Timpul de generație:ᶱ=10*60:20=30 minute

ᶱ=10:20=0,5 h

Rata de creștere: r =20:10=2 generații/h ;sau

r=1:0,5=2 generații/h

Întrucât valoarea logaritmului numărului de bacterii determinat experimental este de regulă , un

număr cu multe zecimale, pentru calculul se rotunjește la cel mult două zecimale.De asemenea ,
pentru trecerea din log₂ în log₁₀, factorul de corecție (0,3- numitorul în formula exprimării
numărului de generație utilizând log₁₀) are o valoare ceva mai mare decât 0,3. Prin urmare ,
valorile obținute pentru numărul de generații și implicit pentru timpul de generație și pentru rata
de creștere , calculele prin aplicarea ambelor formule , nu sunt întodeauna identice, dar pentru
necesitățile curente, informația obținută este valabilă.
De astfel , pentru o apreciere cât mai exactă a parametrilor studiați , este necesar să se mai facă și
alte corecții. Formulele prezentate iau în considerație situația ideală, în care se divid toate
celulele și nu moare niciuna. Se apreciază însă că chiar în faza de creștere exponențială , până la
20% dintre celule mor. În acest caz , numărul celulelor nu se dublează la fiecare generație, ci
crește doar de 1,6 ori. În consecință , în toate formulele , 2 ar trebui înlocuit cu 1,6. Pentru
necesitățile curente, ca în cazul de față , se ia în considerație situația ideală, adică aceea în care la
fiecare generație numărul de bacterii se dublează.

5 Producția de biomasă

Biomasa sau masa celulară a bacteriilor prezente într-un anumit volum de mediu de cultură se
exprimă , de obicei, în mg substanță uscată/ml de cultură. Se poate exprima și în mg substanță
proaspătă /ml de cultură. Pentru calcularea producției de biomasă se procedează astfel:

- se notează și se cântăresc tuburile Eppendorf în care urmează să se facă determinarea

- în tuburi se pune câte 1 ml din cultura analizată
- se centrifughează 2 minute la 10.000 rotații pe minut(rpm)
- se îndepărtează supernatantul cu ajutorul unei pompe Pasteur conectată la o pompă cu vid,
sau scurgând bine supernatantul cu ajutorul hârtiei de filtru
- se cântăresc tuburile cu sedimentul.

Dacă exprimarea se face în mg substanță uscată, tubul cu sedimentul se usucă într-o etuvă la
80⁰C , 24 h, după revenirea la temperatura laboratorului cântărindu-se din nou.

O determinare mai precisă se poate face prin filtrarea unui volum determinat de mediu , prin
filtre( cu diametrul porilor mai mic decât al bacteriilor )care rețin bacteriile. Se cântăresc
filtrele înainte, după filtrare și uscarea lor , iar în final , exprimarea se face tot în mg substanță
uscată/ ml mediu.

Vasile Munteanu„Microbiologie generală” ed.Presa Universitară Clujeană , pag. 186-189