Titlu: Evolutia experimentala si expresia genelor LmanV si LManVI in populatii de

masculi Drosophila melanogaster in urma infectarii cu Pseudomonas aeruginosa

Autor: Manasa Madalina Ioana

Abstract:

 de ce fac studiul

Obictivul acestui studiu este deteminarea nivelului de expresie al genelor LMan V si

LMan VI a organismelor Drosophila melanogaster in conditiile infectarii cu tulpina de
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, pentru a se putea denosn

Aceste gene sunt cunoscute ca fiind implicate in procesul metabolic al manozei si in

deglicozilarea proteinelor.

In mod asemanator, la om, este intalnita gena ortoloaga Hsap\MAN2B1.

 ce obtin

Introducere:

Dintre multe organisme studiate din punct de vedere genetic, Drosophila melanogaster
este cea mai frecvent utilizata. Aceasta este preferata datorita dimensiunii sale mici
(cativa milimetri), a rapiditatii cresterii si dezvoltarii (aproximativ 10 zile) si a capacitatii
mari de fecundare (cateva sute de descendenti de la o singura femela).
Scopul experimentului este determinarea nivelului de expresie a genelor LManV si
LManVI in conditiile infectarii masculilor de Drosophila melanogaster cu P. Aerginosa.

Aceasta bacterie Gram negativa cauzeaza aproximativ 20% din infectiile nosocomiale
de la nivelul spitalelor, fiind intalnita cel mai frecvent la pacientii ce prezinta arsuri,
pacienti ce sufera de leucemie, fibroza cistica sau sunt dependenti de droguri
intravenoase. Printre cele mai periculoase infectii cauzate de P. Aeruginosa, se
numara: endocardita, meningita, pneumonia, septicemia.

Materiale si metode

In cadrul experimentului s-au utilizat indivizi masculi Drosophila melanogaster, Oregon

(wild type) si indivizi mutanti gammaCop. S-au folosit masculii datorita faptului ca
acestia sunt mai simpli atat din punct de vedere structural cat si functional.

Lotul experimental de indivizi a fost realizat prin infectarea indivizilor cu o bacterie Gram
negativa, Pseudomonas aeruginosa, utilizand doua metode:

 intepare cu suspensie 2.4 x 109 CFU/mL

 ingestie, cu suspensie P. Aeruginosa 9 x 109 CFU/mL
Dupa infectarea prin ingestie, o parte dintre indivizi au fost prelucrati corp intreg
(precum indivizii infectati prin intepare), iar la o parte dintre acestia au fost prelucrate si
analizate doar intestinele, deoarece la acest nivel au loc schimbari.

Lotul de control este reprezentat de indivizii neinfectati, respectiv cei intepati cu ser
fiziologic si cei hraniti cu scroza, fara P. Aeruginosa.

In continuare, vom descrie rezultatele obtinute in cazul infectarii prin intepare.

Atat pentru lotul experimental, cat si pentru lotul de control s-au prelucrat cate trei replici
biologice, iar din fiecare dintre acestea s-au realizat cate trei replici tehnice.

Extractia ARN s-a realizat uilizand Kit-ul de extractie ARN din celule si tesuturi-
NucleoSpin® RNA Plus, conform recomandarilor producatorului, iar pentru
transformarea in ADN complementar s-a folosit kit-ul de revers transcriere si amplificare
- Luna Universal One-Step RT-q PCR de asemenea, conform recomandarilor
producatorului.

Au fost obtinute aproximativ 30-50 ng ADN complementar pentru fiecare dintre cele trei
replici tehnice, cantitatea totala de ARN reverstranscrisa in ADNc a fost de aproximativ
500 ng.

Variatiile nivelului de expresie ale genelor de interes au fost cuantificate prin intermediul
tehnicii qRT-PCR, ce utilizeaza SBR Green care se leaga specific de moleculele de
ADN dublu catenare.

Pentru a evidentia genele de interes s-a utilizat tehnica de screening MICROARRAY.

Astfel, au fost analizate genele Lman V si Lman VI iar drept referential, endogena
RpL32. Reactia qRT-PCR a fost facuta cu un aparat ABI Prism 7000 (Applied
Biosystems).

Secventele genelor de interes, respeciv secventele reverse ale acestora sunt

prezentate in tabelul 1.

Gena Secventa primer Secventa primer reverse

LManV 5’ CTTGATCAGCGATGTCTGCA 3’ 5’ TGGAGTTCCGTGATAGCGA 3’

LManVI 5’ CGTCCAGGAATTTCAATCCCA 3’ 5’ GCTTCATTCAGGTGGAGACC 3’

RPL32 5’CCGCTTCAAGGGACAGTATC 3’ 5’ GACAATCTCCTTGCGCTTCT 3’

Pentru fiecare dintre genele de la D. melanogaster, au fost obtinute noua valori Ct tinta
si cate noua valori Ct ale RpL32. In urma prelucrarii acestora aplicand formula lui Livak,
2-∆∆Ct (Livak si Schmittgen, 2001), a rezultat cate un set de 81 de valori/gena/tip de
replica biologica.

Graficele au fost obtinute utilizand aceste date in forma logaritmata, iar interpretarea
statistica s-a realizat cu aceleasi date, folosind testele ANOVA si Student T-test.

Analiza statistica a fost realizata cu ajutorul programului GraphPad Prism 8.3.0.

Rezultate

 statistica descriptiva
 grafice
 tabele

Discutii

Concluzii

Bibliografie

C.J. O'Kane, in Encyclopedia of Genetics, 2001, Drosophila melanogaster

Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., & Jadeja, L. (1983). Infections Caused by
Pseudomonas aeruginosa. Clinical Infectious Diseases.

http://flybase.org/cgi-bin/cvreport.pl?id=GO%3A0006013