Microflora orala si boala parodontala:

noua tehnologie pentru diagnosticare in

medicina dentara.

Student: Botezat Alexandra gr 13

Indrumator: Dr Irina Ursarescu

Microflora orala si boala parodontala: noua

tehnologie pentru diagnosticare in medicina dentara.
Parodontita este o boala care afecteaza si distruge tesutul care sustine dintii.
Distrugerea tesuturilor rezulta dintr-un raspuns inflamatoriu prelungit intr-un
schimb ecologic in compozitia biofilmului subgingival. Trei specii bacteriologice care
constituie complexul rosu, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia si
Treponema denticola sunt considerate principalii patogeni implicati in parodontite.
In acest studiu, un test in timp real pe baza de PCR a fost proiectat pentru a detecta
si cuantifica speciile din complexul rosu, apoi utilizate pentru a investiga 146 probe
din pungi parodontale de la 66 de pacienti parodontotici si 80 de pacienti de la
consult. Rezultatele au demonstrat o prevalenta semnificativ mai mare a speciilor
din complexul rosu si o cantitate mai mare de P. gingivalis si T denticola in pungile
parodontale a pacientilor parodontotici.
Introducere
Parodontita reprezinta o boala cronica inflamatorie distructiva cu o infectie
bacteriana care rezulta din actiunea complexa a unui mic subset de patogeni
parodontali .
Dintr-un punct de vedere patologic, parodontitele pot fi definite ca prezenta
inflamatiei gingivale la locul unde a avut loc desprinderea patologica a fibrelor de
colagen din cement si epilteliul jonctional a migrat spre apical. Raspunsul
inflamatoriu a tesultului periodntal la infectie este influentat de factori de mediu la
fel de mult ca factorii genetici. Principalul factor microbian care contribuie la
aparitia parontitei este o modificare in compozitia microflorei orale, in timp ce
principalul factor imunologic este respunsul inflamator distructiv al gazdei .
Microbiota asociata cu sanatatea si boala parodontala a fost intensiv studiata timp
de mai bine de un secol de cateva generatii de cercetatori priceputi si clinicieni.
Microbiota orala este o entitate enorma complexa si dinamica care este profund
afectata de schimbarea perpetua a factorilor de mediu locali si presiunile selective
ale gazdei mediate. Prezenta unei microbiote comensale ce include si potentiali
patogeni este esentiala pentru dezvoltaterea deplina a imunitatii mucozale. Flora
orala normala este prin urmare o balanta intre patogeni si bacterii comensale care
necesita curatiri regulate pentru a fi mentinute. O descrestere a igienei orale este
urmata rapid de cresterea biofilmului oral pe suprafata dintelui si daca este
netratata se va transforma in inflamatie gingivala si posibil parodontita, pieredere
de os alveolar sau si pierderea dintelui. Este probabil ca si diferentele in

mecanismele de aparare ale gazdei incluzand profile de proteine antimicrobiene

determina daca colonizarea bacteriana dezvolta aparitia bolii
Datele recente estimeaza ca in cavitatea orala se pot gasi pana la 19000 de filotipuri bacteriene dar fiecare in parte vor avea doar o parte a numarului total de
patogeni. Intradevar exista o diversitate substantiala in compozitia microflorei intre
fiecare loc oral diferit al aceleasi parti. Cercetarile au indicat ca schimbarile dietei
combinata cu igiena slaba pot cauza o modifcare in compozitia bacteriilor orale. Mai
mult de atat, in studiile recente unele dovezi sugereaza ca microbiomul oral se
modifica odata cu inaintarea in varsta si dezechilibre in cavitatea orala care pot
duce la parodontita. Cateva metode au fost folosite pentru testarea microbiologica a
parodontitei.Oricum , multe tehnici nu au fost pe deplin acceptate datorita unei
sensivitati sau specificitati scazute .Mai mult de atat uneori ele unt incetinite ,
scumpe sau laborioase.In laboratoarele noastre(lab srl, ferrara,italy) am dezvoltat
un test rapid si senzitiv pentru a detecta si cuantifica cele 3 specii bacteriene mai
mult implicate in parodontita care constituie grupul rosu complex:Porphyromonas
gingivalis, tannerella forsythia si treponema denticola.Ambele p. gingivalis si t.
denticola apar concomitent cu semenle clinice ale distrugerii parodontale. Ele
apar mai ales legate topografic in biofilmul dezvoltat, arata o abilitate in vitro
pentru a produce un numar de proteine membrane asociate exterioare si sunt
considerate primii patogeni implicati in distrugerea clinica a tesuturilor
parodontale.Mai mult de atat ambele si T. forsythia, arata o mai mare prevalenta in
boli decat in tesuturi sanatoase sugerand ca aceste bacterii sunt asociate in mod
cert cu dezvoltarea locala a parodontitelor.
Prezenta si nivelul acestor patogeni pot fi evidentiate efectiv prin polimerizarea in
timp real si analiza lantului (din reactia in lant)
Descoperirile noastre sustin ipoteza conform careia detectarea si cuntificarea
bacteriilor din complexul rosu in fluidul cervical pot avea o legatura apropiata cu
prognosticul si diagnosticul parodontitei.
Materiale si metode
Un total de 146 indivizi au participat la studiu, 66 au fost afectati cu parodontita
cronica in timp ce 80 au constituit grupul control. Grupul de controlul a inclus 46
indivizi sanatosi si 34 afectati de gingivita moderata. Tabelul 1 insumeaza
principalele caracteristici ale grupului, o proba a pungii parodontale a fost obtinuta
dintr-un singur loc cu hartia de proba. ADN a fost extras si purificat utilizand
protocoale standard care includ 2 incubari consecutive cu lizozimi si proteinaza K
urmate de purificarea in spirala.

Reactia in lant de polimerizare in timp real

Primerii si probele oligonucleotidelor au fost create bazanduse pe 16S secvente de
gene rARN ale baza de date a microbiomului uman oral numarand 845 de intrari.
Toate secventele au fost aliniate pentru a putea gasi secvente de acelasi fel sau
pete mai putin conservate. Doua reactii in timp real a polimerizei in timp real au fost
efectuate pentru fiecare proba. Prima reactie cunatifica suma totala de bacterii care
utilizeaza doua primere degenerate si o singura proba potrivita cu o secventa
extrem de conservata a genei ARN-ului ribozomal 16S. A doua secventa a detectat
si cuantificat cele 3 specii ale complexului rosu intr-un multiplex PCR. Aceasta
reactie include un total de sase primeri si trei probe care au fost foarte specifice
pentru fiecare specie. Concentratiile oligonucleotidelor si conditiile PCR-ului au fost
optimizate ca sa asigure sensibilitatea, specificitatea si sa nu se inhibe in caz de
sumele target dezechilibrate. Testele de cuantificare s-au efectuat cu ajutorul
sistemului de detectare a secventelor Applied BioSystems 7500. Profilul de
amplificare a fost initiat cu 10min inainte de incubatie la 95 C pentru a activa
polimeraza urmata de o de amplificare in doua etape de 15s la 95 C si 60 s la 57 C
pentru 40 de cicluri. Toate aceste experimente au fost facute incluzand controale
randomizate pentru a exclude contaminarea reactivilor. Plasmidele continand
secvente tinta de ADN sintetic au fost folosite ca standard pentru analiza
cantitativa. Curbele standard pentru fiecare tinta au fost construite in reactie
Atriplex prin utilizarea unui amestec cu aceasi cantitate de plasmide,dar diluate,ele
astfel variind de la 101 la 107 exemplare. A fost o relatie liniara intre valorile de
prag ale ciclului complotat impotriva jurnalului de numarul de copii pe intreaga
gama de dilutii. Numarul de copii pentru preparatii individuale au fost estimate
folosind spectrofotometrul NanoDrop Thermo.
Cuantificarea totala a exemplarelor genomului bacterian in probele admise pentru
calcularea cantitatii relative de specii ale complexului rosu. Pentru a preveni probe
si contaminarea reactiei in lant, purificarea plasmidica si manipularea a fost
efectuata in laboratoare cu pipete dedicate.
Analize statistice
Statisticele descriptive au fost efectuate folosind foi de calcul Microsoft Excel.
Extinderea Freeman-Halton a testului Fisher de a calcula probabilitatea de a obtine o

distributie a valorilor intr-un tabel de contingenta 2X3 avand in vedere numarul de

observatii in fiecare celula. Raportul cotelor a fost realizat online, pe site-ul OpenEpi.
Cantitatea absoluta de bacterii a fost nominalizata impotriva incarcaturii totale
bacteriene obtinand cantitatea de bacterii relativa. Analiza intr-o directie a variatiei
a fost folosita sa determine daca au fost diferente semnificative intre valoarea
medie a RBA la trei grupuri de pacienti, sanatosi cu gingivita si cu parodontoza.
Rezultate
Aparitia si cantitatea de bacterie din complexul rosu din fluidul crevicular au fost
evaluate in 146 indivizi. Un singur specimen de la fiecare pacient a fost analizat de
PCR cantitativ in timp real, obtinand masuratori din totalul de bacterii din cele trei
specii implicate in parodontita si anume P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola. Aici
vom raporta un studiu preliminar axat in principal pe prevalenta acestor trei specii
printre grupurile de pacienti cu diferite diagnostice pentru a intelege daca prezenta
speciilor din complexului rosu si cantitatea lor relativa poate fi considerat factor
predictiv al parodontitei.
Prevalenta celor trei specii investigate la pacienti sanatosi cu gingivita sau cu
parodontite a fost aratata in tabelul 2. Fiecare specie au fost gasita printre pacienti
sanatosi, cu toate astea prevalenta a fost aproximativ dublu in grupul celor cu
parodontita. Valorile intermediare dar mai aproape de cele a pacientilor sanatoasi
au fost observate in randul pacientilor cu gingivita.

Extensia Freeman-Halton a testului Fisher de exactitate a indicat ca prevalenta a

fiecarei specie din complecul rosu este diferita printre grupurile de pacienti cu grad
ridicat de semnificatie statistica: P gingivalis = 2x10-8, T. forsythia = 1x10-8, si T.
denticola = 2x10-4. A fost observat un nivel mai ridicat de asociere cu parodontita
pentru T forsythia, intr-adevar raportul cotelor observat a fost de 6,1 atunci cand
indivizii sanatosi au fost in comparatie cu pacientii cu parodontite si 4,6 atunci cand
sunt in raport pacienti sanatosi si cei din grupul cu gingivita sau combinati, in
comparatie cu pacientii cu parodontita.
Rezultate a datelor cuantitative indica ca cantitati normale de P. gingivalis difera
semnificativ intre grupurile de pacienti F(2, 304) = 7.77 , valoarea P= 0.001; la fel si

pentru T. denticola F(2, 304) = 7.47, valoarea P= 0.001. Din contra nu a variat
pentru T forsythia F(@, 304)= 1,41, valoarea P =0.25. Valorile medii calculate au
fost reprezentante in graficul din figura 3.

Discutii
Reactia in lant de polimerizare este cea mai sensibila si cea mai rapida metoda de a
detecta microbi patogeni in specimenele clinice. In particular Valoarea
diagnosticului a PCR-ului este semnificativ mai mare cand patogeni specifici care
sunt greu de cultivat in vitro sau necesita o perioada de cultivare mai mare precu
bacteriile anaerobe implicare in debutul parodontitei. O recenta imbunatatire a
acestei tehnici in timp real al PCR-ului este aceea ca permite cuntificarea pentru
tintele ADN-ului utilizand sonde fluorogenice intr-o configurare de aproape. Pe langa
oportunitatea de la cunatifica tintele , avantajele de a efectua testul intr-un site
inchis in care tubul de reactie nu este deschis niciodata dupa aplificare, sunt de
mare valoare de a preveni contaminarea si rezultate false pozitive. In plus nevoia
unei sonde in plus fata de cei doi primeri PCR, creste in continuare specificitatea
reactiei.
In prezent investigatiile pe care le-am creat si am testat performantele unui test pe
baza unui PCR in timp real pentru a detecta si cunatifica bacteriile din complexul
rosu implicate in bolile parodontale. In particular am gasit ca P. gingivalis, T
forsythia, T. denticola au fost puternic legate de parodontite deoarece prevalenta lor
a fost mai mare printre pacientii cu parodontite. Prezenta acestor bacterii poate
creste semnificativ riscul de a dezvolta parodontite, fiind cuprins intre 6.1 sau 3.4.
Rezultatele analizei datelor cantitative a indicat faptul ca, cantitatea relativa de P.
gingivalis si T. denticola din pungile parodontale a fost sensibil mai mare la pacienti
afectati. Asta indica faptul ca atat prezenta cat si cantitatea relativa a bacteriilor din
complexul rosu sunt date relevante in diagnosticul bolilor parodontale.
Concluzii
Analiza moleculara a microflorei din pungile parodontale cu ajutoul PCR-ului
reprezinta o metoda ieftina si eficienta pentru a detecta si masura rapid specile

bacteriene din complexul rosu . Acest test a fost efectuat pe probe prelevate de la
un mare numar de pacienti si rezultatele demonstreaza ca acest test este o metoda
valoroasa pentru imbunatatirea diagnosticului bolii parodontale