Onofrei Alexandra Mihaela

Grupa 4, Seria A
Anul VI

Rolul proteinazei 3 în cariile dentare

 Introducere
Caria dentară este una dintre cele mai frecvente boli umane, cu o prevalență
ridicată în dentiția mixtă la nivel mondial. Cariile progresează rapid dacă sunt netratate,
ducând la durere și infecție; prin urmare, diagnosticul precoce și prevenirea lor au o
importanță deosebită. Analizele salivare au fost utilizate pentru a ajuta la evaluarea
riscului de carii prin măsurarea capacității de tampon a salivei și a conținutul bacterian.
Studii recente au indicat de asemenea că o analiză a fluidului oral este foarte importantă
în evaluarea severității cariilor. Saliva este compusă predominant din apă (99,5%); de
asemenea conține proteine (0,3%), substanțe anorganice și urme de substanțe (0,2%).
Originea și funcția unor proteine salivare (de exemplu, alfa-amilază, anhidrază carbonică,
cistatine, staterine, histatine și proteine bogate în prolină) și a compușilor anorganici au
fost studiate, dar proteazele salivare nu au fost încă elucidate complet. Cuvântul
„protează” se referă la orice enzimă care catalizează reacțiile de proteoliză. Clase diferite
de proteaze pot efectua aceeași reacție prin mecanisme catalitice complet diferite. În
cavitatea bucală, proteazele sunt derivate din bacterii sau sunt secretate de glandele
umane. Proteazele sunt derivate, de asemenea, și din mucoasa orofaringiană și din
fluidele creviculare. Astfel de enzime joacă variate, dar importante roluri în controlul
metabolic, făcând orice analiză a proteazelor din cavitatea orală semnificativă.
Câteva studii recente au indicat că persoanele care prezintă carii afișează niveluri
ridicate de metaloproteinază-8 (MMP-8) .Cu toate acestea, nu se exclude asocierea
cariilor cu alte proteaze, inclusiv o altă protează orală semnificativă, proteinaza 3 (PR3).
O proteină serină din familia chimotripsinei, PR3 este păstrată în granulele primare ale
neutrofilelor polimorfonucleare (PMN) și este implicată într-o varietate de boli
inflamatorii infecțioase, cum ar fi bolile pulmonare, precum și procese inflamatorii
neinfecțioase, cum ar fi glomerulonefrita, artrita și pemfigoidul bulos. Cu toate acestea,
rolul PR3 în cariologie este în prezent necunoscut. Scopul acestui studiu a fost, prin
urmare, investigarea asocierii dintre proteazele salivare și carii în Chengdu, China, în
Onofrei Alexandra Mihaela
Grupa 4, Seria A
Anul VI

special la copiii cu vârsta de 6 ani cu diferite grade de evoluție a cariilor. Mai precis, am
analizat rolul PR3 în cariile dentare și efectul său asupra Streptococcus mutans, o
componentă a florei normale din cavitatea orală care este frecvent asociată cu leziunile
carioase dentare.

 Materiale și metode
Declarație

Toate probele de salivă umană au fost colectate de la copii de 6 ani de la grădinița Yong
din Chengdu, China cu aprobare și sub supraveghere.

Colectarea

Un număr de 128 de copii sănătoși cu și fără carii au fost incluși în studiu. Fiecare copil a
fost examinat sub lumină naturală cu ajutorul unei sonde și oglinzi dentare. Criteriile de
sănătate ale Organizației de sănătate au fost folosite în determinarea indicilor pentru dinții
cariati leziune cavitare și necavitare), absenți ( din cauza cariilor) și a dinților obturați.

Copiii au fost împărțiți în trei grupuri în funcție de severitatea leziunilor carioase: un grup
de 46 de copii fără carii, al doilea grup format din 49 de copii cu leziuni carioase medii și cu
indicele pentru dinți cariati, absenți sau obturați de 1-4 și al treilea grup format din 33 de
copii cu leziuni carioase severe și cu indicele pentru dinti cariati, absenți sau obturați de 5-15.

Înainte de prelevarea salivei toți copiii au fost instruiți să nu mănânce sau să bea cu 12
ore înainte și să se spele pe dinți dimineața. Au fost colectate 5 ml de salivă, nestimulată,
între orele 8:00-10:00.

După colectare, saliva a fost păstrată la rece și trimisă imediat după la laborator. Probele
au fost centrifugate la 1000g timp de 2 minute, iar supernatantul a fost depozitat la -80° C
până la utilizare.

Analiza proteazelor și a rezultatelor

Onofrei Alexandra Mihaela
Grupa 4, Seria A
Anul VI

În acest studiu, 1 ml de supernatant de salivă de la fiecare participant din grupul de copii

fără carii și 1 ml de supernatant de salivă de la fiecare participant din grupul cu leziuni
carioase severe au fost testate utilizând o protează umană Array Kit (Sisteme R&D,
Minneapolis, MN, SUA), care măsoară expresia proteică relativă a 34 de proteaze umane.
Pentru analiza imaginii, radiografia a fost scanată cu un CanoScan LiDE 700F (Canon,
Beijing, China) și analizată folosind ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda,MD,
SUA).

Test de concentrație PR3

Concentrațiile de PR3 la toți cei 128 de donatori au fost măsurate folosind un test de
imunoadsorbție legat de o enzimă (ELISA). Produsul concentrației de PR3 a fost analizat
spectrofotometric la o lungime de undă de 450 nm. Rezultatele au fost analizate folosind un
cititor Flash Varioskan (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA).

Măsurarea pH-ului

PH-ul fiecărei probe de salivă a fost testat folosind un metru pt pH SevenEasy S20
(Tehnologia de protecție a mediului Shanghai Joystech,Shanghai, China).

Testul antibacterian

A fost achiziționat PR3 uman (Cloud-Clone, Wuhan, China). O suspensie proaspătă

microbiană (Streptococcus mutans UA159) (diluată la o valoare a densității optice (OD) de 0,2)
și un mediu pentru cultivare (BHI) au fost transferate într-o placă de microtitru cu 96 de godeuri
(20 ml de suspensie și 80 ml mediu BHI per godeu). La o placă cu opt rânduri, s-a adăugat o
soluție tampon de fosfat steril (PBS) la primul rând (100 ml pe godeu) ca martor. S-au făcut
două diluții repetate de PR3 cu o concentrație cuprinsă între 2000 și 31,5 ng*ml−1; apoi, aceste
diluții au fost adăugate la cele șapte rânduri rămase. Fiecare soluție mixtă folosită la testul
bacterian a conținut 20 ml de suspensie bacteriană, mediu 80 ml BHI și 100 ml PR3 soluție per
godeu. A fost utilizată o concentrație finală de PR3 de 15,75 până la 1000 ng*ml−1. Fiecare placă
a fost incubată la 37 ° C timp de 24 de ore, după care valoarea densității optice a fiecărei soluții
Onofrei Alexandra Mihaela
Grupa 4, Seria A
Anul VI

mixte a fost măsurată la 600 nm la 3 ore folosind un cititor multimod Varioskan Flash. Trei
probe au fost utilizate pentru test.

Analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată cu ajutorul programului SPSS19.0 (SPSS, Chicago, IL,
SUA). Datele numerice sunt prezentate ca o deviație standard +/-. Diferența a fost analizată
printr-o analiză unidirecțională a variației (ANOVA). Diferențele au fost considerate
semnificative atunci când P<0,05.

 Rezultate

Prevalența cariilor la pacienți a fost de 64,06%. Media indicelui pentru dinții obturați,
descompuși sau absenți (DMFT) pentru grupul total a fost de 2,39 +/- 2,89, femeile prezentând
valori semnificativ mai mici decât bărbații (P=0,19). Media indicelui pentru dinții obturați,
absenți sau descompuși pentru grupurile cu leziuni carioase medii și severe a fost de 1,98+0,83
și, respectiv, 6,33+2,76, diferența dintre aceste grupuri fiind una semnificativă (P<0.01).
Rezultatele proteazei sugerează că densitatea de pixeli pentru metaloproteinaza-8 pentru copiii
fară leziuni carioase a fost semnificativ mai mică decât cel pentru grupul cu leziuni carioase
severe. În schimb, densitatea de pixeli pentru PR3 pentru grupul fară carii a fost semnificativ mai
mare decât cea pentru grupul cu leziuni carioase severe.

Se măsoară apoi concentrația proteinazei 3 între cele trei grupuri (absența cariilor, carii
medii, carii severe) care este semnificativ diferită (P=0,009; o valoare generală a lui P).
Concentrația medie a proteinazei 3 pentru grupul fără carii (17,82 +/- 7,31) ng* ml−1 a fost mai
mare comparativ cu cea pentru grupul cu leziuni carioase medii (12,79+/-6,19) ng* ml−1 și pentru
grupul cu leziuni carioase severe (11,07+/-7,10) ng*ml−1 ( P=0,02 și respectiv P=0,003). Cu
toate acestea, nu există o diferență mare între grupurile cu leziuni carioase medii și severe
Onofrei Alexandra Mihaela
Grupa 4, Seria A
Anul VI

(P=0,434), bazată pe concentrația medie a proteinazei 3. Între sexe (masculin (14.63+/-6,69) ng*
−1 −1
ml ; feminin (13,52+/-8,52) ng*ml ¿ , nu există nicio diferență semnificativă (P=0.574) în
concentrația proteinazei 3. De asemenea nu există o diferență majoră între valorile medii ale pH-
ului salivar din cele trei grupuri ( grupul fără carii pH = 7,13+/-0,23, n=46; grupul cu leziuni
carioase medii, pH = 7,02+/-0,30, n=49; grupul cu leziuni carioase severe, pH = 6,96+/-0,25,
n=33). Nu se observă o diferență semnificativă (P=0.23) între valorile pH-ului salivar de la
bărbați și femei. Cu toate acestea, există o corelație pozitivă între concentrația de salivă și
concentrația de proteinază 3 ( r=0,87; P<0,01).

În ceea ce privește susceptibilitatea S. mutans la proteinaza 3, există o diferență

semnificativă (P>0.05) între valorile densității optice la grupurile cu concentrația proteinazei 3
între 15,75 și 125 ng*ml−1după 24 h de incubare. Cu toate acestea, când concentrația proteinazei
3 crește la 250 ng*ml−1 sau mai sus, se observă o diferență majoră în valorile densității S. mutans
după 12 h de incubare ( P<0,05).

 Discuție

Saliva umană conține o gamă largă de proteaze care au funcții biologice importante.
Examinarea diferențelor de protează sub condiții fiziologice diferite sau stări patologice, folosind
o nouă abordare, ne poate ajuta să evaluăm mai bine bolile orale și sistemice. S-a constatat în
urma studiului că media totală al dinților descompuși, absenți sau obturați a fost 2,39+/-2,89,
indicând o severitate a cariilor la nivel scăzut în funcție de standardele propuse. Prevalența
cariilor în studiul nostru a fost de 64,06%, iar prevalența cariilor din Anglia, Finlanda și SUA
sunt mai mici, cu 4%, 6% și, respectiv, 20,2% decât în studiul nostru. Aceste rezultate
evidențiază necesitatea copleșitoare de educație pentru sănătatea orală în rândul preșcolarilor,
atât de părinți, cât și de grădinițe, în special în zonele periferice, afectate de sărăcie. Drept
urmare, dezvoltarea și implementarea strategiilor de promovare a sănătății orale sunt
recomandate.
Onofrei Alexandra Mihaela
Grupa 4, Seria A
Anul VI

Rezultatele de protează au sugerat că nivelul de probe cu metaloproteinază-8 de la

subiecți cu leziuni carioase a fost mai mare decât cel din probele fără carii. Această constatare
este în concordanță cu studiile anterioare, care au indicat faptul că prezența cariilor se corelează
puternic cu nivelurile salivare ale metaloproteinazei-8. S-a raportat că metaloproteinazele joacă
un rol important în patogeneza cariei dentare, deoarece degradarea colagenului este inițiată de
metalopeptidaze. Totuși, nivelurile de proteinază 3 și alte proteaze din carii sunt mai scăzute în
mediul fără acarieni, iar o explicație pentru această observație a lipsit până în prezent. Funcțiile
biologice cunoscute ale proteinazei 3 includ următoarele: degradarea componentelor matricei
extracelulare, clivarea de mediatori inflamatori, activarea plachetei, inducția apoptozei celulelor
endoteliale, reglarea feedbackului negativ al granulopoezei și distrugerea organismelor
granulomatoase. S-a descoperit că acei copii rezistenți la carii, fie de sex feminin sau masculin,
au prezentat concentrații mai mari de proteinază 3 în salivă ; astfel cu cât cariile sunt mai grave,
cu atât concentrația de proteinază 3 este mai mică. Acest lucru sugerează că proteinza 3 poate
acționa ca un factor de protează în evoluția cariilor dentare, nivelurile scăzute ducând la o
severitate mai mare a acestora. Astfel, analiza nivelurilor de proteinază poate ajuta la evaluarea
gravității cariilor.

PH-ul salivei a fost, de asemenea, măsurat în acest studiu. Copiii fără carii au produs
salivă cu un nivel de pH ceva mai ridicat decât copiii cu carii dentare severe. În sprijinul acestei
analize, un raport al lui Kuriakoseet a arătat că pH-ul salivei de la copiii care sufereau de carii
dentare dureroase a fost semnificativ mai mic decât cel de la copiii rezistenți la carii. Cu toate
acestea, în studiul nostru, nu s-a observat nici o diferență semnificativă după compararea celor
trei grupuri cu leziuni carioase diferite. Acest rezultat sugerează că utilizarea unui pH salivar
propriu nu poate fi util pentru evaluarea gravității cariilor dentare și că acesta ar trebui luat în
considerare împreună cu placa dentară și alte componente din cavitatea bucală. S-a raportat că
pH-ul optim pentru proteinaza 3 este de 8,0. În acest studiu, a fost evidențiată o corelație
semnificativ pozitivă între concentrația proteinazei 3 și pH, cu un pH mai mare care a dus la
creșterea concentrației de proteinază. În cavitatea bucală, un mediu alcalin poate avea efecte
favorabile activității enzimei prin proteinaza 3 sau alte proteaze. Mecanismul bactericid al
proteinazei 3 a fost, de asemenea, studiat. Unele rapoarte sugerează că această proteinază poate
apărea chiar și în infecțiile fungice. Cu toate acestea, rolul ei în cariologie este încă necunoscut.
Onofrei Alexandra Mihaela
Grupa 4, Seria A
Anul VI

Datele noastre confirmă faptul că S. mutans, parte a florei orale, asociată cu leziunile carioase
dentare, este de asemenea susceptibilă la proteinaza 3. Această susceptibilitate poate fi mediată
de un efect bacteriostatic sau un efect asupra creșterii bacteriene. Atunci când concentrația de
proteinază 3 crește la 250 ng*ml−1 sau mai sus, creșterea bacteriană este inhibată semnificativ
după 12 h de incubare. Totuși, concentrația proteinazei 3 în cavitatea orală este de aproximativ
3–30 ng*ml−1. Astfel, este necesar un studiu suplimentar pentru a determina dacă concentrația
de proteinază 3 poate atinge 250 ng*ml−1 sau mai mult în cavitatea orală. Sunt necesare studii
suplimentare pentru a explora semnificația fiziologică a concentrației de proteinază 3 necesară
pentru a inhiba creșterea bacteriană și pentru a determina dacă aceasta poate fi utilizată ca
măsură preventivă pentru cariile dentare. În concluzie, analizele noastre indică faptul că
proteinaza 3 este asociată cu severitatea leziunilor carioase dentare, nivelurile scăzute fiind
asociate cu o severitate mai mare a cariilor. Mai mult, rezultatele testului antibacterian au arătat
că S. mutans este susceptibil la proteinaza 3.