Universitatea de Medicină și Farmacie “Gr.T.

Popa” Iași
Facultatea de Medicină Dentară
Studentă: Maftei Iris Mălina, grupa 4, seria A

Corelații inter-bacteriene în biofilmele subgingivale: un sondaj la scară largă

Abstract
Scop :Deși complexitatea ecologiei orale și diferențele ecologice dintre sănătate și boală sunt bine acceptate, nu
există o viziune clară asupra dinamicii în legătură cu boala. În acest studiu, prevalența și abundența a 20 de bacterii
orale cheie au fost evaluate în sănătate și boli și, mai important, a fost acordată o privire mai atentă relațiilor inter-
bacteriene.
Materiale si metode :O bază de date microbiologică orbită a fost analizată în acest studiu retrospectiv transversal.
Baza de date a fost construită pe baza analizelor microbiologice ale probelor de la 6308 pacienți, cu gradări de
parodontită (sănătoase până la parodontită). Au fost furnizate date privind abundența a 20 de bacterii orale și
adâncimea sondajului de pungă.
Rezultate :Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Eubacterium nodatum,
Porphyromonas micra și Porphyromonas intermedia au arătat o creștere clară a abundenței și prevalenței odată cu
creșterea adâncimii buzunarului. Matricele de corelație au ilustrat că aproape toate microorganismele au fost într-un
fel corelate cu alte specii și majoritatea acestor corelații au fost semnificative. Mai multe bacterii benefice au arătat
corelații puternice cu alte bacterii benefice.
Concluzie: Cunoașterea corelațiilor bacteriene poate deschide calea pentru noi opțiuni de tratament, concentrându-
se pe restabilirea echilibrului deplasat.

În prezent, bolile parodontale sunt considerate ca infecții polimicrobiene, dar pentru o lungă perioadă de timp
prezența mai multor bacterii patogene principale a fost considerată esențială la apariția parodontitei. În plus, se
presupune că începutul parodontitei a fost însoțit de o trecere de la microbiotă bucală sănătoasă, constând în
principal din bacterii anaerobe Gram-pozitive, zaharolitice și bacterii anaerobice facultative la una, care constă în
principal din specii Gram-negative și specii anaerobe obligatorii (Slots 1977, Paster et al. 2001). Studiile
Socransky et al. (1998) au consolidat această ipoteză, odată cu introducerea complexelor codate pe culori pentru
gruparea bacteriilor bucale în grupuri distinse, care sunt asociate cu sănătatea sau boala. Două complexe au fost
clar asociate cu boală parodontală, complex roșu, format din Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia și
Treponema denticola și complex portocaliu, care adăpostează Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum,
Prevotella nigrescens și Parvimonas micra. Bacteriile din aceste complexe au arătat o corelație puternică cu
adâncimea pungilor, cu creșterea prevalenței și a numărului, atunci când adâncimea pungilor a crescut. Mai mult,
bacteriile din complexe roșii au fost, de asemenea, foarte asociate cu sângerarea la sondare. Alte complexe, care
adăpostesc bacterii Gram-pozitive, cum ar fi speciile streptococice și speciile Actinomyces, au fost corelate cu
sănătatea.Deși bacteriile Gram-negative ar putea juca rol la începutul bolii, prezența acestor specii nu presupune că
boala va apărea. S-a demonstrat că țesuturile parodontale sănătoase adăpostesc aceste microorganisme patogene,
deși în număr scăzut (Marsh 2003). Prin urmare, alte microorganisme ar putea fi, de asemenea, implicate în boală.
Aceste observații au condus la idei noi privind etiologia infecțiilor parodontale. Teorii noi consideră cavitatea
bucală ca un anumit ecosistem, în care gazda, și mediu, și microorganisme, contribuie la apariția bolii (Marsh 2003,
Darveau 2010). Conform acestei ipoteze a plăcii ecologice, există un echilibru simbiotic între gazdă și toate
microorganismele în circumstanțe sănătoase. Cu toate acestea, modificarea numărului de bacterii patogene sau
benefice și echilibrului acestora, sau o modificare/activare a gazdei ar putea duce la apariția periodontitei. Pentru
această interacțiune bidirecțională nu este clar dacă este vorba de disbioza microbiană, care duce la distrugerea
inflamatorie a țesuturilor parodontale, sau dacă este răspunsul inflamator, care duce la o disbioză. Tehnicile
moleculare moderne permit focusare la acest concept ecologic prin abordări avansate de secvențiere a ADN-ului.
Aceste tehnici de profilare comunitară încearcă să captureze/analizeze întreagă comunitate în loc să se concentreze
pe taxoni specifici. Ei pot descoperi microorganisme noi, care sunt implicate în periodontită, deoarece ecosistemul
bucal nu este format doar de câțiva membri. Griffen et al. (2012) au folosit pirosecvențarea genelor 16S rRNA
pentru a cartografia diferențele comunitare microbiene dintre periodontită și sănătate. Datele confirmate de
asociația de specii Gram-negative specifice cu parodontită, așa ca P. gingivalis, T. denticola și T. forsythia. Cu
toate acestea, un număr mare de specii suplimentare de asemenea au arătat asocieri semnificative cu boală. Mai ales
Filifactors alocis, o bacterie Gram-pozitivă, și alte specii încă necultivate păreau să fie asociate cu boala
parodontală. Mai multe microorganisme au fost corelate cu sănătatea, între care sunt speciile Streptococcal,
Acinetobacter, Actinomyces și Moraxella au fost cele mai importante.
Deși complexitatea ecologiei bucale și diferențele ecologice dintre sănătate și boală sunt bine acceptate, un
punct de vedere clar asupra dinamicii în raport cu severitatea bolii sau progresia lipsește. Modificările ecologice în
ceea, ce privește evoluția bolii, sunt dificil de studiat longitudinal, deoarece este imposibil să se determine în
prealabil, care din subiecte vor dezvolta boli, și odată, ce boală începe să se dezvolte, este lipsit de etică să nu se
intervină. În ciuda acestor probleme, câteva studii au încercat să urmeze modificările microbiologice, care au avut
loc în timpul tranziției de la sănătate la boală (MacFarlane et al. 1988, Machtei et al. 1997, Papapanou et al. 1997,
Tanner et al. 1998). Machtei et al. (1997) a stabilit că prezența T. forsythia, P. intermedia și P. gingivalis a fost un
factor prognostic pentru o defalcare parodontală suplimentară. Întrucât datele de la Tanner et al. (1998) au sugerat
că T. forsythia, Campylobacter rectus și Selenomonas noxia au fost speciile principale, care caracterizează zonele,
prin care se tranzitează de la sănătatea spre boală parodontală. Cu toate acestea, din cauza motivelor menționate
mai sus, majoritatea datelor privind modificările ecologice în legătură cu progresia bolii provin din studii
transversale (Socransky et al. 1998, Haffajee et al. 2008). În aceste studii, pentru a descrie dinamica microbiană de
la sănătate la boală, se folosesc diferențe microbiologice între pacienții sănătoși, pacienți cu gingivită, pacienți cu
parodontită moderată sau severă.
Pentru a înțelege dinamica ecologică din pungile parodontale în legătură cu progresia bolii, este necesar să
studiem modificările microbiene în relație cu creșterea adâncimi pungilor parodontale. Deoarece studiile
longitudinale sunt considerate lipsite de etică și văzând gama largă de posibile sondări ale adâncimilor pungilor,
studiile transversale trebuie să includă un număr mare de pacienți pentru a furniza suficientă putere. Costurile
aferente cu analizele microbiene adesea împiedică analiza unui număr mare de pacienți.
Numărul limitat de pacienți, care pot fi analizați, de asemenea împiedică posibilitatea de-a studia efectul
creșterii unui membru al ecologiei asupra celorlalți membri ai acestei ecologii. O astfel de analiză ar putea oferi
informații valoroase cu privire la interacțiunile intre specii și asociațiile din cadrul ecologiei microbiene dinamice.
Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a analiza modificări microbiene în ecologia microbiană subgingivală în
raport cu sondarea adâncimei a pungii, și în ceea, ce privește numărul de speciile individuale, bazate pe un set de
6308 probe subgingivale unice, care au fost analizate cu un cip de ADN pentru 20 de specii bucale reprezentantive.
Materiale și metode-Eșantionul de populație
O bază oarbă de date microbiologice pentru anii 2007-2009, furnizată de Advanced Dental Diagnostics B. V.
(ADD) (Malden, Olanda), a fost verificată și analizată în acest studiu retrospectiv și transversal. Studiul a primit
aprobarea de la Comitetului Etic al Spitalului Universitar al Universității Catolice din Leuven (ML 9333). Baza de
date a fost construită pe baza analizelor microbiologice ale probelor de pacienți furnizate de personalul medical
bucal din Olanda, Belgia și Germania. Pe lângă eșantionul combinat, au fost furnizate datele referitoare la
eșantioane despre pacienți și probele pe baza formularelor standard. Aceste formulare conțineau informații privind
verificarea adâncimii a pungii, sexul, data nașterii, atitudinea către fumat, igiena cavității bucale și stadiul al
tratamentului. Populația eșantionului era formată din pacienți din Europa de Vest, în principal din Olandă și
Germania. În cazul, în care chestionarul nu a furnizat informațiile necesare, în primul rând despre pacient/probă,
pacientul/proba a fost exclus(ă) din analiza ulterioară. Pe baza informațiilor furnizate, s-au calculat adâncimea
medie a pungilor, valoarea maximă a adâncimii pungilor, numărul de locații grupate și vârsta pacientului la
momentul prelevării probelor. De când probe în această bază de date au fost derivate din probele grupate,
adâncimea pungilor și corelarea deviației standard a fiecărui participant individual a fost determinat că o
intraindividuală medie de peste unu până la cinci au înregistrat adâncimea a pungilor de la prelevare. Pacienții cu
valori ale adâncimii pungilor de peste 12 mm au fost excluși din analiză. Ca atare, populația a fost de 12.884
pacienți. Pentru analize suplimentare, populația eșantionului a fost împărțită în două grupuri principale:
pacienți/probele înainte de tratamentul inițial (abreviat BIT; n = 6308) și pacienți/probele după tratamentul inițial,
dar înainte de intervenție (abreviat AIT; n = 6576). În acest studiu, s-au luat în considerare numai grupul de
pacienți/probele anteriore față de tratamentului inițial (biți; n = 6308). Populația a fost împărțită în mod arbitrar în 8
categorii de adâncimile a pungilor: <3 (egal sau mai mic de 3); >3 (mai mare de 3); >4; >5; >6; >7; >8; >9.
Evaluare microbiologică
Probele de plăci subgigivale au fost prelevate de stomatologi clinicieni cu acces la istoricul cazurilor,
radiografii și date clinice. Clinicienii au avut posibilitatea de a alege între 1 și 5 probe, folosind știfturile de hârtie
sterile. Aceste știfturile de hârtie au fost depozitate în tuburi eppendorf marcate și trimise societății la temperatura
camerei pentru evaluarea microbiologică moleculară. ADN-ul a fost obținut folosind extracția Quickextract DNA
(Epicentre Biotehnologies, Madison, WI, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Reacția în lanț a
polimerazei a fost efectuată într-un volum total de 20 limita lichid, utilizând tuburi de reacția în lanț a polimerazei
de 0, 2 ml (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germania), astfel cum este descris în Viena et al. (2005). Pe scurt,
amestec din reacția în lanț a polimerazei, care conținea 18.8 limita lichid al reacției în lanț a polimerazei MasterMix
(trusa Parocheck 20 Greiner, Frickenhausen, Germania), de 1,25 unități de Taqpolymerase (Promega, Madison, WI,
SUA) și 1 limita lichid a ADN-ului bacterian (2-10 ng/l). Controlul negativ conținea apă ultrapură în loc de ADN
bacterian. Amplificare era făcută pe GeneAmp 9700 (Perkin Elmer, Fremont, CA, USA). Condițiile de testare au
constat în primul minut 94°C, urmat de 45 de cicluri de 95°C pentru 20 secunde, 60°C pentru 20 secunde și o etapă
de elongație la 72°C timp de 1 minut. Ulterior, probele au fost păstrate aparte la 22°C. Rampa de încălzire a fost
fixată la 1°C/secundă, iar temperatura capacului a fost de 105°C. Acest test a permis amplificarea unor părți ale
genei specifice 16S rRNA în prezența grundurilor etichetate cu fluorescență. Hibridizarea s-a efectuat în
conformitate cu instrucțiunile producătorului cipului ParoCheck DNA (Greiner Bio-One) (Vienna et al. 2005).
Acest cip conținea probe specifice pentru 20 de taxoni parodontali diferiți conform tabelului 1. Cipurile au fost
analizate pe un scaner Axon Genepix4000 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA). Amplificare ale tuburilor
fotomultiplicatoare a fost ajustat la 600 (Cy3) și 700 respectiv (Cy5). Rezoluția inițială a fost stabilită la 10 lm.
Analiza a fost posibilă dacă au fost aprobate controalele (controlul hibridizării, controlul reacției în lanț a
polimerazei și controlul orientării). Valorile au fost stabilite în raportul „semnal-zgomot”. Media de 5 puncte a
reprezentat un microb. Aceste valori medii ale raportului “semnal-zgomot” au fost traduse apoi în cantități
bacteriene cu ajutorul unei curbe standard. Astfel de curbe (valori ale raportului “semnal-zgomot” versus cantități
bacteriene) au fost disponibile pentru toate cele 20 de tulpini. Limita de detecție a cipului ParoCheck DNA a fost
determinată de analiza multiplă a diluțiilor în serie ale ADN-ului bacterian în prezența matricei probelor. Limita de
detecție pentru fiecare bacterie a fost calculată pentru o valoare limită a raportului “semnal-zgomot” egală cu 12.
Analiza statistică
Din setul de date au fost create mai multe tabele pentru a autoriza ordonarea și corelațiile constrânse Datele
microbiene au fost disponibile în ceea ce privește numărul celor 20 de specii testate. Adâncimile ale pungilor au
fost considerate ca un factor variabil discontinuu și toate adâncimile ale pungilor mai mare de 10 mm au fost
stabilite ca 11 mm. Numerele de bacterii au fost transformate. Înainte de evaluarea a corelației, datele au fost
afișate prin utilizarea histogramelor cumulative. Relația dintre numărul de microorganisme și adâncimile a pungilor
a fost evaluată cu coeficientul de corelare spearman. Semnificația corelației a fost evaluată prin testul Chi-square și
s-au efectuat corecții pentru comparații multiple. Relația dintre adâncimile a pungilor și absența sau prezența unei
anumite bacterii a fost evaluată prin intermediul unui model liniar generalizat, din care s-a calculat un coeficient. În
ambele cazuri, o valoare pozitivă a coeficientului de corelație reprezintă o relație pozitivă, o valoare negativă
reprezentând o relație negativă. Ulterior, a fost evaluată relația dintre diferitele microorganisme. S-au calculat
corelațiile de rang Spearman și s-a evaluat semnificația corelației cu testul Chi-square și corecția pentru comparații
multiple. Toate evaluările au fost efectuate pe baza întregului set de date și pe baza datelor fără valori zero (adică
datele nu sunt indicate). În cele din urmă, s-a făcut o evaluare pe baza gradului, în care microorganismele apar
împreună. Phi a fost calculată ca o măsură de asociere a prezenței (0: fără asociere; 1: asociere puternică). Valoarea
P a fost calculată cu testul Chi-square.
 Rezultate
Corelație între speciile bacteriene și adâncimea de pungă
Figura 1 a arătat că pentru P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia, P. micra și Eubacterium
nodatum prevalența crește împreună cu creșterea adâncimii de pungă, întrucât opusul a fost drept pentru A.
actinomycetcomitans, Prevotella nigrescens, Campylobacter gracilis, Eikenella corrodens, specii de
Capnocytophaga, Campylobacter concisus, grupul Streptococcus mitis, grupul Streptococcus gordonii, grupul
Streptococcus constellatus, Actinomyces odontolyticus și Actinomyces oris. Aceste microorganisme au prezentat o
prevalență mai mare în zonele puțin adânci (<3 mm) și în pungi intermediare (3-6 mm). Prevalența F. nucleatum,
C. rectus și Veillonella parvula a rămas relativ stabilă între diferitele adâncimile ale pungilor.
În loc de a privi pe parte de calitatea (Fig. 1), datele de asemenea au fost abordate cantitativ (Fig. 2). P. gingivalis,
T. forsythia, T. denticola, E. nodatum, P. micra și P. intermedia au arătat o creștere clară în abundență cu creșterea
adâncimilor a pungilor (Fig. 2). Cu toate acestea, majoritatea microorganismelor investigate (A.
actinomycetemcomitans, P. nigrescens, E. corrodens, Capnocytophaga specii, C. gracilis, C. concisus, grupul S.
mitis, grupul S. constellatus, grupul S. gordonii, A. odontolyticus, A. oris și V. parvula) au arătat o scădere în
abundență cu creșterea adâncimilor ale pungilor. Pentru două microorganisme, F. nucleatum și C. rectus, abundența
a rămas stabilă, atunci când trece de la un pungă sănătoasă la una bolnavă.
Tabelul 2 demonstrează coeficientul de corelație între speciile bacteriene și adâncimile ale pungilor pe baza
abundenței a microorganismelor, precum și a prevalenței microorganismelor în raport cu adâncimile ale pungilor.
Valorile cu litere aldine reprezintă toate corelațiile semnificative (p < 0, 05). Corelațiile au fost separate în categorii
pe baza puterii lor. Între 0 și 0.1: nimic până la foarte slabă corelație; 0.1-0.3: corelație slabă; 0.4-0.6: corelație
moderată; 0.7-1: corelație puternică (Dancey & Reidy 2004). Cea mai puternică corelație a fost observată pentru T.
forsythia și T. denticola. Uitându-se la prevalența lor, aceste microorganisme au arătat o puternică corelație pozitivă
cu adâncimile ale pungilorși o corelație pozitivă slabă pentru abundență. Acest lucru indică clar că prevalența
acestor două microorganisme, precum și abundența lor într-o mai mică măsură, crește împreună cu creșterea
adâncimii pungii. A. oris, pe de altă parte, a prezentat o corelație negativă moderată cu adâncimile ale pungilor atât
pentru prevalență, cât și pentru abundență. V. parvula arătând, de asemenea, o asociere moderat negativ cu
adâncimile a pungilor, dacă ne uităm la prevalența; totodată, acest lucru a fost doar o asociere slab negativă atunci
când analizăm abundență. Pentru majoritatea din celorlalte microorganisme au fost observate corelații slabe atât
pentru abundență, cât și pentru prevalență. Pentru A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, C. rectus, P. micra și
P. nigrescens au fost demonstrate doar corelații foarte slabe.
Relații interbacteriale între microorganismele bucale testate pe baza datelor privind abundența
Figura 3 indică diferitele corelații pozitive sau negative între diferitele microorganisme. Au putut fi observate
mai multe corelații, iar cele mai multe corelații au fost semnificative (p < 0, 05). Există corelații pozitive puternice
între T. forsythia și T. densicola, totodată și între toate cele trei grupuri streptococice. Pe lângă acesta, A. oris a
arătat o corelație pozitivă puternică cu grupul S. mitis și grupul S. gordonii. Toate corelațiile importante (p < 0, 05)
slabe, moderate sau puternice au fost selectate și afișate în figurile S1–S5 și în tabelul S1. Aceste grafice prezintă o
subanaliză a setului de date, în care modificările microbiologice nu au fost exprimate în raport cu adâncimile ale
pungilor parodontale, ci în raport cu concentrația speciilor de bacterii, care au avut o corelație semnificativă între
ele. Histogramele a arătat că T. forsythia și T. denticola a scăzut atunci, când concentrația de A. oris, grup S.
constellatus, grup S. gordonii, grup S. mitis, specii Capnocytophaga sau E. corrodens a crescut și vice-versa. Mai
mult, o creștere a A. oris de asemenea a condus la o scădere a C. rectus, în timp ce o creștere a grupului S. mitis a
fost însoțită de o scădere a P. gingivalis. Concentrații mai mari de F. nucleatum, A. odontolyticus și C. concisus au
condus la concentrații mai mari de toate microorganismele, care sunt prezentate în histograma. P. nigrescens a fost
corelat pozitiv cu P. intermedia, dar creșterea sa a dus și la scăderea de E. nodatum. C. gracilis și C. concisus au
fost corelate pozitiv cu toate Streptocci și A. oris alături de altele. Cu toate acestea, ele de asemenea au arătat o
corelație pozitivă cu C. rectus.
Relații interbacteriene între microorganismele bucale testate pe baza prevalenței
 Tabelul 3 oferă un rezumat asupra corelațiilor semnificative dintre microorganisme pe baza prevalenței. S-a
observat că mai multe microorganisme au crescut în prevalență atunci când a fost prezentă o altă bacterie. P.
gingivalis au arătat o creștere în prevalența în timp, ce T. forsythia și T. denticola au fost prezenți, întrucât nici un
efect de prezența a P. gingivalis pe procente de detectare a T. forsythia și T. denticola nu a fost observat. De
asemenea, era clar că T. forsythia și T. denticola erau dependenți unul de celălalt, procentajele lor creșteau când
erau prezenți împreună. Dependența de alte microorganisme a fost puțin mai declarată pentru T. forsythia. Prezența
T. denticola a determinat, de asemenea, o creștere în detectarea ale P. micra, P. intermedia și C. rectus, viceversa nu
a fost evidențiat nici un efect. Astfel, într-o singură influență de asemenea a fost văzută de la grupul S. constellatus
și A. odontolyticus, ca și grupul S. constellatus și V. parvula. Prevalența acestui grup de Streptococcus a crescut cu
siguranță atunci, când au fost prezenți A. odontolyticus și V. parvula. În afară de asta, A. oris părea să depindă de
prezența lui V. parvula. Pentru restul corelațiilor din tabelul 3, dependența a fost observată în două direcții.
Detectarea grupului S. mitis, de exemplu, a crescut atunci, când au fost prezente microorganisme din grupul S.
constellatus și, în mod similar, ultimul grup a crescut atunci, când au fost prezente microorganisme din grupul S.
mitis.
Discuții
Deoarece microbiota bucală poate conține peste 700 de organisme, diferite microorganisme ar putea juca
roluri importante. Este posibil ca întreaga microbiota bucală afișează o sinergie polimicrobiană, cum a sugerat în
ipoteze etiologice actuale (Marsh 2003, Darveau 2010). Atunci parodontită poate fi cauzată de o modificare
disbiotică a microbiotei bucale complexe, de exemplu, o schimbare a abundenței relative a anumitor membri in
raport cu abundența lor în starea sănătoasă. O astfel de schimbare ar putea perturba relația "gazdă-microb", care
duce la inflamație. În acest studiu, prevalența și abundența a 20 de bacterii bucale reprezentative au fost evaluate în
stare de sănătate și boală și, mai important, s-a acordat o privire mai atentă relațiilor interbacteriene. În primul rând,
prevalența și abundența relativă a microorganismelor au fost examinate la 6308 pacienți, prezentând diferite
gradități de parodontită de la pacienți sănătoși la pacienți cu parodontită severă. În plus la asta, a fost evaluată
corelația dintre prevalența și abundența speciilor bacteriene și adâncimii a pungii. Când comparăm rezultatele
noastre cu complexele codate pe culori după Socransky et al. (1998), s-a demonstrat că bacteriile complexe roșii de
asemenea au prezentat o asociere clară cu boala în studiul nostru. T. forsythia, T. denticola și P. gingivalis au arătat
o creștere clară a prevalenței și abundenței cu pungă în creștere și au arătat o corelație pozitivă aparentă cu
adâncimea a pungii. Toate aceste bacterii sunt bacterii strict anaerobe, ce, în parte, explică frecvența mai mare și
numărul lor în pungile adânci, și un mediu anaerob adăugător. Corelația lor cu boala a fost, de asemenea,
demonstrată în alte studii (Socransky et al. 1998, Ximenez-Fyvie et al. 2000, Haffajee et al. 2008, Griffen et al.
2012). În plus, studiul nostru de asemenea a ilustrat o asociere cu boală pentru P. intermedia, P. micra și E.
nodatum, pe baza numărului și prevalenței lor în pungile cele adânci. Cu excepția lui P. micra, ei de asemenea au
arătat o corelație pozitivă cu adâncimile ale pungilor, deși aceasta a fost doar o corelație slabă. Aceste bacterii au
fost membre ale bacteriei complexe portocalii din studiu de către Socransky et al. (1998), acest complex s-a dovedit
a fi puternic corelat cu complexul roșu și cu boala din acest studiu. Diferite bacterii au afișat o scădere a
prevalenței, abundență cu o creștere în adâncimile ale pungilor și o clară corelație negativă cu adâncimile ale
pungilor în studiul nostru, dintre care sunt specii Streptococice, Capnocytophaga și Actinomyces, V. parvula, E.
corrodens și C. concisus. Aceste grupuri de specii au fost deja asociate cu un periodonțiu sănătos în studiile
anterioare (Griffen et al. 2012, Bik et al. 2010, Roberts & Darveau, 2002). În studiul lui Socransky et al. (1998), de
asemenea acestea au fost definite ca non-bolile asociate, situate în complexele verde, galben sau violet. Cu toate
acestea, unele discrepanțe au fost de asemenea afișate între studiul nostru și analiza lui Socransky et al. (1998). În
studiul nostru, au fost observate o scădere a prevalenței și abundență atât pentru P. nigrescens, C. gracilis și o
corelație negativă cu adâncimile ale pungilor, întrucât acestea au fost poziționate în asociat cu bolile complex
portocaliu de Socransky et al. (1998). În plus, F. nucleatum și C. rectus, ambele definite ca bacterii cu complexe
portocalii, au prezentat o scădere a numărului, frecvența de detecție cu boală și o corelație foarte slabă cu AP.
Rezultatele noastre au arătat că F. nucleatum a avut o prevalență ridicată și abundență în toate categoriile de AP.
Acest lucru ar putea fi explicat de capacitățile de coagulare ale acestei bacterii, care este capabilă să formeze punți
între primii și ulteriori colonizatori (Kolenbrander et al. 2002). A. actinomycetemcomitans, adesea menționat în alte
studii ca un membru important în perioada agresivă a parodontitei, de asemenea a arătat o corelație foarte slabă și
negativă cu AP. Această bacterie a fost, de asemenea, poziționată într-un complex distinct în studiu de către
Socransky et al. (1998).
 După ce s-a stabilit, care microorganisme au fost asociate cu boala sau sănătatea, au fost evaluate relațiile
interbacteriene. Matricele de corelație au ilustrat faptul că aproape toate microorganismele au fost într-un fel
corelate cu alte specii, iar cele mai multe dintre aceste corelații au fost semnificative. Histogramele au prezentat
corelațiile slabe, puternice și moderate, și au arătat schimbări microbiene clare. La observarea corelației dintre
grupurile streptococice și alte bacterii, trebuie să se țină cont de faptul că aceste grupuri sunt formate din mai multe
specii streptococice. În special, Grupul S. gordonii este unul din cele importante, deoarece este format din specii
benefice definite anterior, cum ar fi S. salivarius, precum și bacteria cariogenică S. mutans. Negativ cel mai evident
s-au observat corelații între bacterii, asociate de boală (T. forsythia și T. denticola) și bacterii, asociate de sănătate
(grupuri Streptococ , A. oris, V. parvula, E. corrodens și specii Capnocytophaga ). Studii privind T. forsythenis și
T. denticola sunt limitate fiincă aceste bacterii sunt dificil de cultivat.
Cu toate acestea, se știe că streptococii produc adesea bacteriocine, inhibarea bacteriilor patogene
(Santagati et al. 2012). Hillman et al. (1985) au descris deja o corelație negativă între Viridians streptococi (S.
sanguinis, S. uberis) și T. forsythia. Un studiu, realizat de Apolonio et al. (2007), a demonstrat, de asemenea, că E.
corrodens a fost capabil să producă substanțe antagoniste eficiente împotriva mai multor bacterii bucale, cum ar fi
P. gingivalis. Cele mai multe corelații în matricele au fost pozitive și mai multe dintre interacțiunile bacteriene,
afișate în histograme, au fost deja descrise în studiile anterioare. A fost descrisă o relație simbiotică reciprocă între
T. denticola și P. gingivalis, acid succinic, produs de T. denticola, fiind un factor de creștere, care pare să fie
încorporat în învelișul celular al lui P. gingivalis (Grenier 1992). Corelația puternică între T. forsythia și T.
denticola a fost deja descrisă în mai multe studii (Bolstad et al. 1996, Ikegami et al. 2004). Deoarece F. nucleatum
este considerat o specie de punte, acesta prezintă o corelație pozitivă cu mai multe specii de bacterii a cavității
bucale. Grupările între F. nucleatum și P. gingivalis au fost deja descrise (Kolenbrander & Londra, 1993,
Kolenbrander et al. 2002, Periasamy & Kolenbrander 2009), specii Gram-pozitive (Kolenbrander et al. 1989, Kang
et al. 2005), specii Prevotella (Okuda et al. 2012a), E. nodatum (George & Falkler 1992), P. micra (Kremer & Van
Steenbergen 2000), T. forsythia (Sharma et al. 2005), T. densicola (Kolenbrander et al. 1995) și specii de
Capnocytophaga (Okuda et al. 2012b) între alții. Cele mai puternice corelații pozitive au fost descrise între
speciile streptococice, V. parvula, A. oris și E. corrodens. Specii de Streptococcus și specii de Veillonella au fost
deja găsite că adesea apar în același loc în cavitatea bucală, cel mai probabil deoarece Veillonella utilizează acizi cu
lanț scurt, cum ar fi lactatul secretat de Streptocci (Kreth et al. 2008). Ebisu et al. (1988) au demonstrat regrupările
între E. corrodens, A. oris și S. sanguinis prin intermediul unei substanțe bacteriene, care seamănă cu lectină. Cu
toate acestea, de asemenea a fost observat că trei bacterii, a căror creștere a condus la creșterea concentrației a
bacteriilor, asociate cu sănătate, cum ar fi specii de tip Streptococ, și de la care concentrația și prevalența a scăzut
cu creșterea AP, a avut de asemenea o corelație puternică cu una sau mai multe boli asociate cu bacterii. P.
nigrescens a arătat o corelație pozitivă cu P. intermedia și C. gracilis, care a fost legată strâns de C. rectus, care pot,
de asemenea, explica de ce aceste bacterii au fost anterior definite ca un membru al complexului portocaliu, asociat
cu bolile. În plus, A. odontolyticus a prezentat o corelație pozitivă atât cu P. gingivalis, cât și cu P. intermedia.
Corelația dintre A. odontolyticus și P. intermedia a fost deja descrisă de Nesbitt et al. (1993). În afară de corelații
bazate pe abundență, de asemenea au fost prezentate corelațiile, care erau bazate pe detectarea frecvențelor, care a
ilustrat faptul că multe bacterii sunt dependente de prezența altora bacterii, cum a fost prezentat de P. gingivalis, a
căror procent de detectare a crescut de când T. forsythenis sau T. denticola au fost prezente, relația dintre P.
gingivalis și T. denticola a fost deja menționată mai înainte (Grenier 1992).
Acest studiu retrospectiv pe scară largă a fost capabil de-a corela mai multe bacterii cu boală și a ilustra mai
multe interacțiuni bacteriene. Cu toate acestea, este necesară o opinie critică cu privire la metodologia utilizată.
Trebuie să ținem cont de faptul că metoda de colectare a datelor a dus la o variabilitea datorită participării unui
număr necunoscut de medici stomatologi-practici necalibrați. Cu toate acestea, extinderea a populației eșantionului
ar trebui să compenseze această variabilitate suspectată. În plus, dezavantajul al studiului este că un număr variabil
de situri au fost prelevate din fiecare subiect și că aceste situri ar putea avea o adâncime de pungă diferită. Așadar,
analiza s-a bazat pe adâncimea medie de pungă a siturilor de probe. Prin aceasta, unele efecte ar fi putut fi trecute
cu vederea. Cu toate acestea, media DS a acestor adâncimilor a pungii a fost limitată la 0,95 mm. Adesea, datele
clinice și microbiologice sunt grupate pentru analiză în spații puțin adânci (≤3 mm), moderate (4-6 mm) și în pungi
adânci (≥7 mm). Această abordare grupează datele cu o variație de 2 sau 3 mm și mai mult. Diferența dintre cea
mai mare și cea mai mică pungă eșantionată pentru 69,5% din probe a fost ≤2 mm, pentru 87,2% din probe această
diferență a fost ≤3 mm. Cu toate acestea, din acest punct de vedere, luând în considerare faptul că a fost utilizată
AP medie și văzând posibilitățile limitate, pe care trebuie să le analizăm la aceste evenimente, utilizând eșantioane
mari pe bază de populație, autorii consideră că eroarea indusă de această abordare este limitată. O altă limitare a
studiului este că doar 20 de bacterii bucale erau examinate. Deoarece cavitatea bucală poate găzdui peste 700 de
microorganisme, alte bacterii de asemenea pot juca un rol crucial. Cu toate acestea, cele 20 de bacterii investigate
în studiul actual sunt toate bacterii-cheie în mediul bucal și era dovedit că toate ele joacă un rol crucial în cavitatea
bucală (Socransky et al. 1998).
În concluzie, s-au observat multe corelații interbacteriene semnificative. În general, se pare că bacteriile
benefice au o rețea mai mare, corelând puternic cu alte bacterii benefice. Mai departe trebuie investigat, dacă o
combinație a mai multor bacterii benefice poate duce la un efect mai mare, apoi doar la o singură bacterie benefică.
În plus, trebuie să se țină cont de faptul că, deși o specie pare să nu aibă nicio corelație cu factorii clinici, creșterea
acesteia ar putea duce indirect la boală. Rezultatele acestui studiu sugerează un profil microbian corelat cu boala
parodontală sau cu sănătatea. Întrucât mai mare prevalență și abundența de T. forsythia, T. denticola, P. gingivalis,
P. intermedia, P. micra și E. nodatum sunt corelate cu boala, mai multe bacterii Gram-pozitive și grupuri de bacterii
(Streptococ specii, V. parvula, A. oris, E. corrodens) sunt corelate cu sănătate parodontală. De asemenea, poate și
mai important, a fost oferit un context pentru interacțiunile microbiene bazate pe corelații între 20 de specii. Acest
lucru ar putea ajuta la înțelegerea și oferirea unei baze pentru investigarea a modificărilor comunitare și
interacțiunile intermicrobiene în continuare.
În acest studiu a fost testată doar o serie mică, dar relevantă de bacterii bucale, în analiza viitoare ar putea fi
efectuată lucrând asupra identificării a microbilor umani cu ajutorul sistemului micro-array. Un studiu, realizat de
Ahn et al. (2011) deja a comparat hibridizare, bazat pe identificărea a microbilor umani cu ajutorul sistemului
micro-array, împreună cu pirosecvențare, și a demonstrat că ambele tehnici au fost corelate destul de puternic pe
niveluri de phylum (încrengătură) și de gen. Cu toate acestea, cunoștințele actuale privind corelațiile bacteriene și
relațiile deja deschide calea pentru posibile noi opțiuni de tratament fără concentrarea asupra eliminării întregii
microbiotei bucale, dar concentrându-se pe aceste interacțiuni bacteriene, restabilind astfel echilibrul mutat.

Informații justificative
Informații suplimentare justificative pot fi găsite în versiunea online al acestui articol:
Figura S1. Relații interbacteriene: Efectul creșterii categorice a speciilor A. actinomicetemcomitans, E.
corrodens, Capnocytphaga și F. nucleatum asupra altor bacterii. Barele indică gradul de corelație: corelație slabă,
corelație moderată. Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei (n = 6308).
Figura S2. Relații interbacteriale: Efectul categoric creștere categorică a P. nigrescens, V. parvula, P.
gingivalis și T. forsythensis asupră altor bacterii. Barele indică gradul de corelație: corelație slabă, corelație
moderată, corelație puternică. Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei (n = 6308).
Figura S3. Relații interbacteriene: Efectul creșterii categorice a T. denticola, P. intermedia, C. gracilis și C.
rectus asupra altor bacterii. Barele indică gradul de corelație: corelație slabă, corelație moderată, corelație
puternică. Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei (n = 6308).
Figura S4. Relații interbacteriene: Efectul creșterii categorice a C. concisus, P. micros, E. nodatum și A. oris
asupra altor bacterii. Barele indică gradul de corelație: corelație slabă, corelație moderată, corelație puternică.
Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei (n = 6308). Figura S5. Relații interbacteriene: Efectul
creșterii categorice a grupului S. mitis, S. gordonii, S. constellatus și A. odontolyticus asupra altor bacterii. Barele
indică gradul de corelație: corelație slabă, corelație moderată, corelație puternică. Barele de eroare reprezintă
eroarea standard a mediei (n = 6308).
Tabelul S1. Tabel de corelare interbacteriană bazat pe corelație spearman: sunt afișate corelații între 20 de
bacterii bucale.

Relevanță clinică
 Justificarea științifică a studiului: Scopul acestui studiu a fost de a analiza modificările microbiene în cadrul
ecologiei microbiene subgingivale în ceea, ce privește verificarea adâncimii pungilor și numărul de specii
individuale.
Constatări principalele: Acest studiu retrospectiv pe scară largă a fost capabil de-a corela mai multe bacterii
cu boală și a ilustra mai multe interacțiuni bacteriene.
Implicații practice: Implicațiile practice rămân dificile pentru acest moment. Cu toate acestea, cunoștințele
actuale privind corelațiile bacteriene și relațiile deja deschid calea pentru noi opțiuni de tratament posibile, care nu
se concentrează pe eliminarea întregii microbiotei bucale, ci restabilirea echilibrului mutat.
Bibliografie:
Ahn, J., Yang, L., Paster, B. J., Ganly, I., Morris, L., Pei, Z. & Hayes, R. B. (2011) Oral microbiome profiles: 16S rRNA pyrosequenc- ing
and microarray assay comparison. PLoS ONE 6, e22788.

Apolo^nio, A. C. M., Carvalho, M. A. R., Ribas, R. N. R., Sousa-Gaia, L. G., Santos, K. V., Lana, M. A., Nicoli, J. R. & Farias, L. M. (2007)
Production of antagonistic substance by Eikenella corrodens isolated from the oral cavity of human beings with and without peri- odontal
disease. Journal of Applied Microbiol- ogy 103, 245–251.

Bik, E. M., Long, C. D., Armitage, G. C., Loo- mer, P. M., Emerson, J., Mongodin, E. F., Nelson, K. E., Gill, S. R., Fraser-Liggett, C. M. &
Relman, D. A. (2010) Bacterial diversity in the oral cavity of 10 healthy individuals. The ISME Journal 4, 962–974.

Bolstad, A. I., Jensen, H. B. & Bakken, V. (1996) Taxonomy, biology, and periodontal aspects of Fusobacterium nucleatum. Clinical
Microbiology Reviews 9, 55–71.

Dancey, C. & Reidy, J. (2004) Statistics without maths for psychology: using SPSS for windows. London: Prentice Hall.

Darveau, R. P. (2010) Periodontitis: a polymicro- bial disruption of host homeostasis. Nature Reviews Microbiology 8, 481–490.

Ebisu, S., Nakae, H. & Okada, H. (1988) Coag- gregation of Eikenella corrodens with oral

bacteria mediated by bacterial lectin-like sub- stance. Advances in Dental Research 2, 323– 327.

George, K. S. & Falkler, W. A., Jr (1992) Coag- gregation studies of the Eubacterium species. Oral Microbiology and Immunology 7, 285–
290.

Grenier, D. (1992) Nutritional interactions between two suspected periodontopathogens, Treponema denticola and Porphyromonas gingi-
valis. Infection and Immunity 60, 5298–5301.

Griffen, A. L., Beall, C. J., Campbell, J. H., Fire- stone, N. D., Kumar, P. S., Yang, Z. K., Podar, M. & Leys, E. J. (2012) Distinct and
complex bacterial profiles in human periodonti- tis and health revealed by 16S pyrosequencing. The ISME Journal 6, 1176–1185.

Haffajee, A. D., Socransky, S. S., Patel, M. R. & Song, X. (2008) Microbial complexes in supra- gingival plaque. Oral Microbiology and
Immu- nology 23, 196–205.

Henssge, U., Do, T., Radford, D. R., Gilbert, S. C., Clark, D. & Beighton, D. (2009) Emended description of Actinomyces naeslundii and
descriptions of Actinomyces oris sp. Nov. and Actinomyces johnsonii sp. nov., previously identi- fied as Actinomyces naeslundii
genospecies 1, 2 and WVA 963. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology 59, 509–516.

Hillman, J. D., Socransky, S. S. & Shivers, M. (1985) The relationships between Streptococcal species and periodontopathic bacteria in
human dental plaque. Archives of Oral Biology 30, 791–795.

Ikegami, A., Honma, K., Sharma, A. & Kurami- tsu, H. K. (2004) Multiple functions of the leu- cine-rich repeat protein LrrA of Treponema
denticola. Infection and Immunity 72, 4619– 4627.

Kang, M. S., Na, H. S. & Oh, J. S. (2005) Coag- gregation ability of Weissella cibaria isolates with Fusobacterium nucleatum and their adhe-
siveness to epithelial cells. FEMS Microbiology Letters 253, 323–329.

Kolenbrander, P. E., Andersen, R. N., Blehert, D. S., Egland, P. G., Foster, J. S. & Palmer, R. J., Jr (2002) Communication among oral
bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 66, 486–505.

Kolenbrander, P. E., Andersen, R. N. & Moore, L. V. (1989) Coaggregation of Fusobacterium nucleatum, Selenomonas flueggei,
Selenomonas infelix, Selenomonas noxia, and Selenomonas sputigena with strains from 11 genera of oral bacteria. Infection and Immunity
57, 3194– 3203.
Kolenbrander, P. E. & London, J. (1993) Adhere today, here tomorrow: oral bacterial adherence. Journal of Bacteriology 175, 3247–3252.

Kolenbrander, P. E., Parrish, K. D., Andersen, R. N. & Greenberg, E. P. (1995) Intergeneric coaggregation of oral Treponema spp. with
Fusobacterium spp. and intrageneric coaggrega- tion among Fusobacterium spp. Infection and Immunity 63, 4584–4588.

Kremer, B. H. & Van Steenbergen, T. J. (2000) Peptostreptococcus micros coaggregates with Fusobacterium nucleatum and non-
encapsulated Porphyromonas gingivalis. FEMS Microbiology Letters 182, 57–62.

Kreth, J., Zhang, Y. & Herzberg, M. C. (2008) Streptococcal antagonism in oral biofilms: Streptococcus sanguinis and Streptococcus
gordonii interference with Streptococcus mutans. Journal of Bacteriology 190, 4632–4640.

MacFarlane, T. W., Jenkins, W. M., Gilmour, W. H., McCourtie, J. & McKenzie, D. (1988) Lon- gitudinal study of untreated periodontitis
(II).

Microbiological findings. Journal of Clinical

Periodontology 15, 331–337.Machtei, E. E., Dunford, R., Hausmann, E.,

Grossi, S. G., Powell, J., Cummins, D., Zam- bon, J. J. & Genco, R. J. (1997) Longitudinal study of prognostic factors in established peri-
odontitis patients. Journal of Clinical of Peri- odontology 24, 102–109.

Marsh, P.D. (2003) Are dental diseases examples of ecological catastrophes? Microbiology 149, 279–294.

Nesbitt, W. E., Fukushima, H., Leung, K. P. & Clark, W. B. (1993) Coaggregation of Prevotella intermedia with oral Actinomyces species.
Infec- tion and Immunity 61, 2011–2014.

Okuda, T., Kokubu, E., Kawana, T., Saito, A., Ok- uda, K. & Ishihara, K. (2012a) Synergy in biofilm formation between Fusobacterium
nucleatum and Prevotella species. Anaerobe 18, 110–116.

Okuda, T., Okuda, K., Kokubu, E., Kawana, T., Saito, A. & Ishihara, K. (2012b) Synergistic effect on biofilm formation between Fusobacte-
rium nucleatum and Capnocytophaga ochracea. Anaerobe 18, 157–161.

Papapanou, P. N., Baelum, V., Luan, W. M., Madianos, P. N., Chen, X., Fejerskov, O. & Dahl_en, G. (1997) Subgingival microbiota in adult
Chinese: prevalence and relation to peri- odontal disease progression. Journal of Peri- odontology 68, 651–666.

Paster, B. J., Boches, S. K., Galvin, J. L., Ericson, R. E., Lau, C. N., Levanos, V. A., Saha- srabudhe, A. & Dewhirst, F. E. (2001) Bacte- rial
diversity in human subgingival plaque. Journal of Bacteriology 183, 3770–3783.

Periasamy, S. & Kolenbrander, P. E. (2009) Mutualistic biofilm communities develop with Porphyromonas gingivalis and initial, early, and
late colonizers of enamel. Journal of Bacteriol- ogy 191, 6804–6811.

Roberts, F. A. & Darveau, R. P. (2002) Beneficial bacteria of the periodontium. Periodontology 2000 30, 40–50.

Santagati, M., Scillato, M., Patan_e, F., Aiello, C. & Stefani, S. (2012) Bacteriocin-producing oral Streptococci and inhibition of respiratory
pathogens. FEMS Immunology & Medical Microbiology 65, 23–31.

Sharma, A., Inagaki, S., Sigurdson, W. & Kuram- itsu, H. K. (2005) Synergy between Tannerella forsythia and Fusobacterium nucleatum in
bio- film formation. Oral Microbiology and Immu- nology 20, 39–42.

Slots, J. (1977) Microflora in the healthy gingival sulcus in man. Scandinavian Journal of Dental Research 85, 247–254.

Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C. & Kent, R. L., Jr (1998) Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of
Clinical Periodontology 25, 134–144.

Tanner, A., Maiden, M. F., Macuch, P. J., Mur- ray, L. L. & Kent, R. L., Jr (1998) Microbiota of health, gingivitis, and initial periodontitis.
Journal of Clinical Periodontology 25, 85–98.

Vienna, M. E., Horz, B. G. & Conrads, G. (2005) Microarrays complement culture methods for identification of bacteria in endodontic
infections. Oral Microbiology and Immunology 20, 1–6.

Xim_enez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D. & Socran- sky, S. S. (2000) Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health
and periodontitis. Journal of Clinical Periodontology 27, 648–657.