Curs 27.

Genul Treponema. Genul Borrelia. Genul Leptospira.

Genul Treponema
Ordinul Spirochaetales cuprinde dou familii importante n patologia uman, familia
Spirochaetaceae (n care se descriu genurile Treponema i Borrelia) i familia Leptospiraceae
cu un singur gen, Leptospira. Genul Treponema include specia Treponema pallidum cu patru
subspecii care produc infecii la om. Treponema pallidum subspecia pallidum este agentul
etiologic al sifilisului.
Sifilisul poate fi congenital sau dobndit. n cazul sifilisului dobndit exist mai multe
stadii, respectiv stadiul primar, stadiul secundar, stadiul latent (recent, tardiv sau de durat
nelimitat) i stadiul teriar. n stadiul teriar, n funcie de organele sau sistemele afectate
putem discuta despre afectarea nervoas (neurosifilis), cardio-vascular etc. n mod particular
se discut sifilisul congenital, sifilisul la gravide i sifilisul aprut la pacienii infectai cu HIV.
Infecia natural cu T. pallidum este limitat la gazda uman. Infecia se transmite de
obicei prin contact sexual, iar leziunile de primoinfecie sunt cantonate la nivelul
tegumentelor i mucoaselor din zona genital. Totui n 10-20% din cazuri, leziunile primare
sunt localizate la nivel rectal, perianal sau oral. Spirochetele se multiplic local la poarta de
intrare, iar unele trec de bariera ganglionilor limfatici i ajung n circulaie. n 2-10 sptmni
de la infecie, la locul inoculrii se dezvolt o papul care se deprim pentru a forma o
ulceraie cu baza curat, indurat (ancru dur) la nivelul creia se gsete un lichid clar, ns
foarte bogat n treponeme. Aceast leziune primar se vindec ntotdeauna spontan, dar
dup circa 2-10 sptmni apar leziunile secundare, care constau n leziuni eritematoase
maculopapulare localizate oriunde pe corp i papule umede, palide (condiloame) n regiunile
anogenital, axilar i n cavitatea bucal. Pot aprea de asemenea meningita, corioretinita,
hepatita, nefrita sau periostita sifilitic. Leziunile secundare se remit i ele spontan. Att
leziunile primare, ct i cele secundare sunt bogate n spirochete i foarte contagioase.
n cele ce urmeaz vom aborda diagnosticul de laborator n cazul sifilisului primar sau
secundar. Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice, dar trebuie
confirmat prin metode de laborator.
Diagnosticul de laborator n sifilis poate fi bacteriologic (direct) sau serologic.
Diagnosticul bacteriologic
Treponema pallidum nu poate fi cultivat pe medii artificiale, n laborator. Din acest
motiv, diagnosticul bacteriologic cuprinde numai primele etape din structura clasic a schemei
diagnosticului direct. Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat att n sifilisul primar ct i
n sifilisul secundar.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute, n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei, avnd o serie de particulariti. Produsul patologic poate fi reprezentat de
lichidul clar (serozitatea) de la nivelul leziunilor primare n funcie de localizare (penian,
cervical, vaginal, perianal etc), de la nivelul leziunilor secundare (condiloma lata, rozeole
sifilitice etc), de la nivelul unor leziuni umede bogate n treponeme n cazul sifilisului
congenital timpuriu sau poate fi prelevat din ganglionii limfatici regionali. n cazul ancrului,
vom recolta p.p. dup ndeprtarea cu grij (fr a produce sngerare) a crustelor care acoper
leziunea. Ar putea fi necesar s comprimm baza leziunii pentru a stimula acumularea de
lichid (clar) din care vom efectua 2-3 preparate microscopice. Prelevm lichidul fie cu
ajutorul ansei bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete Pasteur, fie aplicnd pur i simplu
lama de sticl pe leziunea umed. Acoperim cu o lamel i eliminm prin uoar apsare
eventualele bule de aer. Transportul trebuie s fie realizat foarte rapid, de preferat n maxim
1

20 de minute astfel nct se recomand ca recoltarea s fie realizat ntr-un spaiu

corespunztor, n imediata vecintate a laboratorului. Este o etap esenial.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic se poate realiza fie cu ajutorul
microscopului cu fond ntunecat, fie prin imunofluorescen direct (exist i alte tehnici, care
nu vor fi discutate n acest manual).
Pentru examenul microscopic pe fond ntunecat, pregtim 2 lame (preferabil 3) pentru
fiecare leziune pe care dorim s o examinm. Preparatele nu trebuie s conin hematii,
leucocite, fragmente de esut sau bule de aer. n timp ce examinm primul preparat
microscopic vom introduce celelalte 2 preparate ntr-o cutie Petri n care exist puin vat sau
hrtie de filtru umezit, pentru a pstra atmosfera umed i a preveni uscarea. Preparatul
microscopic trebuie examinat sistematic (minim 10 minute n cazul unui rezultat aparent
negativ), iniial cu obiectivul uscat, ulterior, dup vizualizarea unor microorganisme care par
s aparin genului Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul s aib
experien n acest tip de examinare. Microorganismele caracteristice sunt foarte subiri i
lungi (0,25-0,3 m / 6-14 m), spiralate, prezentnd 8-14 spire (regulate, strnse, adnci i
rigide), mobile (spirele nu se deformeaz), deplasarea n cmpul microscopic nu este foarte
rapid dar seamn cu o micare de nurubare (exist i microorganisme care sunt imobile
dar pstreaz micrile de translaie, rotaie lent, flexie uoar de la un cap la cellalt sau
flexie median cu revenire ca un resort), luminoase pe fondul negru al cmpului microscopic.
n cazul unui rezultat negativ putem repeta recoltarea i examinarea, n anumite situaii se
poate recomanda nceperea tratamentului, iar evoluia va fi monitorizat clinic i serologic
(rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis). Rezultatul pozitiv, atunci cnd poate fi
exclus prezena unor treponeme saprofite, pune diagnosticul de sifilis primar nainte ca
anticorpii s poat fi detectai serologic.
Imunofluorescena direct permite diferenierea T. pallidum de alte treponeme cu
ajutorul anticorpilor marcai fluorescent (reacie Ag-Ac); un alt avantaj este reprezentat de
faptul c nu este necesar ca treponemele s fie mobile. n plus, pentru c reacia este specific,
se poate utiliza cu succes i n cazul unor leziuni foarte probabil contaminate cu treponeme
saprofite (ex. orale, rectale). n cazul n care examinarea nu poate fi realizat imediat secreia
poate fi recoltat ntr-un tub capilar care se nchide la flacr i poate fi transportat la +4C;
alternativ putem realiza frotiul, ateptm s se usuce n vecintatea becului de gaz i putem s
l trimitem ctre laborator. Frotiul poate fi colorat:
- cu Ac anti-T. pallidum obinui de la pacieni cu sifilis sau de la iepuri infectai cu T.
pallidum; serul este tratat pentru creterea specificitii cu tulpina Reiter (o tulpin nepatogen
de T. phagadenis) iar Ac sunt apoi marcai cu izotiocianat de fluorescein sau
- cu Ac monoclonali anti-T. pallidum subspecia pallidum marcai fluorescent.
Subliniem nc odat importana examenului clinic urmat de recoltarea, transportul i
examinarea microscopic a p.p.
n laboratoarele de referin ar mai putea fi utilizate i alte metode n scop diagnostic (mai
rar) sau pentru cercetare.
Inocularea p.p. la animale de laborator reprezint cea mai sensibil metod pentru
detectarea T. pallidum. Pentru meninerea n laborator a unor treponeme viabile sau pentru
determinarea infectivitii au fost utilizate diferite animale (hamsteri, cimpanzei etc.) ns cel
mai util este iepurele. Iepurele poate fi inoculat (intratesticular sau cutanat) cu orice tip de p.p.
cu condiia ca ntre momentul recoltrii i inoculare s nu treac mai mult de 60 minute. n
caz contrar, p.p. trebuie adus rapid la o temperatur de cel puin -78 C (ex. n azot lichid) i
meninut astfel pn n momentul inoculrii. Testul infectivitii la iepure (RIT) rmne
metoda standard; cu ajutorul RIT se apreciaz sensibilitatea i specificitatea oricrei alte
metode care este propus pentru diagnosticul sifilisului.

n centrele de referin au mai fost utilizate i tehnici ale biologiei moleculare (sondele
nucleotidice, PCR). Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostic atunci cnd p.p. este
reprezentat de lichidul amniotic.
Treponema pallidum i pstreaz sensibilitatea la penicilin, medicament care rmne de
elecie pentru tratamentul sifilisului. Exist i o serie de alternative, dar dorim s subliniem c
n vederea tratamentului acestei maladii trebuie respectate recomandrile fcute de ctre
comisia de specialitate a ministerului sntii, pentru fiecare form de sifilis n parte.
Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic se realizeaz folosind antigene nontreponemice i antigene
treponemice. Testele nontreponemice (nespecifice) i treponemice (specifice) sunt
complementare; nu se exclud. Testele nontreponemice sunt utilizate n screening, diagnostic i
monitorizarea pacienilor n cursul tratamentului. n vederea stabilirii diagnosticului vom
utiliza i testele treponemice n corelaie cu cele nontreponemice (nici unul dintre cele dou
tipuri nu pot acoperi din punct de vedere diagnostic toate stadiile sifilisului). Cel mai
frecvent utilizm VDRL sau RPR (din prima categorie) cuplat cu TPHA sau FTA-Abs (din a
doua categorie). De obicei utilizm serul provenit de la pacientul suspect, dar n anumite
situaii testul este realizat folosind plasm sau LCR.
A. Reacii serologice care utilizeaz antigene nontreponemice
Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite esuturi.
Cardiolipina este un difosfatidil-glicerol. Pentru creterea sensibilitii, cardiolipina este
cuplat cu colesterol i lecitin. Anticorpii anti-cardiolipin au fost numii reagine. Sunt
depistai n serul pacienilor la 2-3 sptmni i n LCR la 4-8 sptmni de la debutul
infeciei, n cazurile netratate.
Reacia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) a fost utilizat o lung
perioad de timp, ncepnd cu 1906. Datorit faptului c RFC este o metod laborioas i n
special datorit apariiei unor alte tehnici, RBW este discutat n prezent din punct de vedere
istoric.
Tehnica actual standard este VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de
floculare. Testele de floculare se bazeaz pe faptul c particulele antigenice rmn dispersate
n serul normal, dar formeaz grunji vizibili atunci cnd se combin cu reaginele. Testele se
preteaz la automatizare i la folosirea pentru screening datorit costului redus. O variant
economic i elegant este microreacia VDRLcare se practic n plci cu godeuri.
Ag tip VDRL se prepar conform recomandrilor productorului.
Pregtirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarific prin
centrifugare), inactivarea timp de 30 minute la 56 C i o nou centrifugare (n cazul apariiei
unor particule n suspensie). Nu vor fi testate serurile infectate sau hemolizate. n cazul n care
trec mai mult de 4 ore din momentul inactivrii, serul va fi inactivat din nou timp de 10
minute la 56 C.
Temperatura din camera de lucru trebuie s fie ntre 23-29C. Testul se efectueaz pe ser
nediluat (pentru monitorizarea evoluiei sub tratament se pot face diluii binare). Se pot testa
mai multe seruri concomitent i este necesar o notare clar a godeurilor, pentru fiecare godeu
n parte. Fiecare test va include martori (seruri cu reactivitate cunoscut, martor pentru Ag). n
fiecare godeu punem cte 0,05 ml ser (n godeul pentru martor Ag punem soluie salin
fiziologic). Dup agitarea flaconului cu suspensia antigenic, utiliznd o sering cu ac
calibrat depunem cte o pictur (1/60 ml) n fiecare godeu. Acoperim placa i o aezm pe un
agitator care poate fi reglat la 180 turaii pe minut, pe o durat de 4 minute.
Citim imediat rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe,
ncepnd cu martorii (negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) i continund cu
serurile de testat.

Rezultatul este negativ dac lichidul nu prezint flocoane i este asemntor martorului
negativ i martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de
dimensiuni mici ntr-un lichid uor turbid n timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci cnd
vizualizm flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar. Repetm rezultatele slab
pozitive sau dificil de interpretat. n cazul n care suspicionm existena fenomenului de
prozon (inhibiia total sau parial a floculrii prin exces de Ac), vom repeta testarea se va
repeta pe diluii de ser.
Rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla n perioada de
incubaie sau poate fi cazul unui sifilis latent (evideniabil prin TPHA). n cazul unui pacient
suspect pentru sifilis primar, repetm testul dup 1 sptmn, 1 lun i la 3 luni.
Vom lua n considerare un rezultat pozitiv n corelaie cu rezultatul obinut la testul
treponemic, rezultatul diagnosticului bacteriologic, elementele clinice i epidemiologice. Un
rezultat pozitiv n condiiile n care toate celelalte date sunt negative este de obicei un rezultat
fals pozitiv. Pot aprea rezultate fals pozitive la persoane cu hepatit viral acut, pneumonii
virale, rujeol, malarie, mononucleoz infecioas, alte infecii virale, la persoane care au fost
recent vaccinate, precum i la persoane cu boli ale esutului colagen, persoane care se
drogheaz, la persoanele n vrst etc. Reaciile fals pozitive pot aprea i pe parcursul
sarcinii.
Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util n
urmtoarele situaii: scderea de 4 ori a titrului n sifilisul recent, tratat, semnific de regul
eficacitatea tratamentului; creterea de 4 ori a titrului sugereaz o infecie activ n evoluie, o
reinfecie sau ineficacitatea tratamentului.
Alte teste de floculare utilizate n practic:
Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care
apar mai multe cercuri de 18 mm. Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenic tip
VDRL modificat (pentru a elimina etapa de inactivare prin cldur). Reactivul conine i
particule de crbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat n cercul de pe card.
Daca Ac anti-T. pallidum sunt prezeni, se combin cu particulele lipidice din Ag i produc
aglutinarea lor. Particulele de crbune coaglutineaz cu Ac i duc la apariia unor granule
negre pe fondul alb al cardului. n absena Ac rezult un aspect gri uniform. Testul se poate
realiza calitativ i cantitativ (diluii de ser).
Testul RST (Reagin Screen Test)
Testul USR (Unheated Serum Reagin)
Testul TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test)
A fost pus la punct i o tehnic de tip ELISA cu acest tip de antigene.
Modul de interpretare al testelor nontreponemice depinde i de populaia care este testat
B. Reacii serologice care utilizeaz antigene treponemice
Au fost realizate i tehnici serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din
T. Reiter (specifice de grup) de tipul RFC i CIE.
De utilitate practic sunt reaciile serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase
din tulpina Nichols de T. pallidum, cu o mare specificitate.
Pentru o lung perioad de timp, tehnica standard a fost testul imobilizrii treponemelor
(TPI). Tehnica a fost pus la punct n anul 1949. Serul de cercetat era diluat i amestecat cu
complement i treponeme vii, mobile, obinute din ancrul testicular de la iepure. n prezena
Ac specifici, treponemele erau imobilizate, n timp ce n lipsa acestora, mobilitatea era
pstrat (examinarea se fcea cu microscopul pe fond ntunecat).
Testele de imunofluorescen indirect (Fluorescent Treponemal Antibody, FTA) au
nceput s fie utilizate n 1957, serul de cercetat fiind diluat 1/5. Datorit rezultatelor fals
pozitive, ulterior s-a trecut la diluarea 1/200 a serului (FTA-200). Din 1962 a nceput s fie
utilizat tehnica pe care o avem la dispoziie i astzi, FTA-Abs. Pornind de la tulpina Reiter

s-a obinut prin ultrasonicare un extract antigenic, pentru a ndeprta Ac care nu sunt specifici
pentru T. pallidum. Probele de ser i/sau LCR de la pacieni sunt diluate 1/5 cu un extract care
conine Ag treponemice de grup (Reiter), comune treponemelor patogene i comensale. Astfel
sunt nlturai Ac nespecifici. Exist lame pe care a fost fixat tulpina Nichols de T. pallidum.
Probele de ser i/sau LCR absorbite i martorii corespunztori se depun pe spoturile de pe
lam. Dac n ser/LCR exist Ac specifici, acetia se vor lega de treponemele fixate pe lam
formnd complexe antigen-anticorp. Dup ndeprtarea materialului nelegat prin splri
repetate, Ac legai se detecteaz prin incubare cu un conjugat fluorescent anti Ig umane. Dup
ndeprtarea prin splare a conjugatului nelegat de complexele antigen-anticorp, lamele se
examineaz la microscopul cu fluorescen (UV). n cazul n care serul de cercetat este
pozitiv, treponemele de pe lam apar fluorescente (galben verzui).
Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA) a fost pus
la punct n urm cu 30 de ani. n prezena unor Ac fa de Ag adsorbite pe membrana lor,
hematiile aglutineaz n reele caracteristice formate din complexe imune. Ag treponemic este
extras din tulpina Nichols i adsorbit pe suprafaa hematiilor de oaie sau pasre fixate (hematii
sensibilizate). Drept martor sunt folosite hematii fr Ag treponemice (nesensibilizate). n
cazul n care n serul de cercetat sunt prezeni Ac anti-T. pallidum, hematiile sensibilizate
aglutineaz; hematiile nesensibilizate nu aglutineaz i se depun sub forma unui buton pe
fundul godeului. Pentru creterea specificitii, majoritatea truselor comerciale includ n
diluent un extract de treponeme nepatogene. Testul poate fi realizat calitativ sau semicantitativ (diluii ale serului de cercetat). Exist metode automate, utilizate pentru testarea
sngelui donat.
Tehnica ELISA
Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum; este util pentru
documentarea infecie intra-uterine.
Tehnica Western blot poate detecta att Ac de tip IgM ct i de tip IgG.
Aa cum am mai menionat, interpretarea rezultatelor obinute se face innd cont de
contextul clinic, epidemiologic i de laborator. Lund n considerare numai rezultatele de
laborator pentru testele menionate n acest curs, ar putea rezulta mai multe variante. Spre
exemplu, dac testul VDRL este negativ i testul TPHA este tot negativ, de regul infecia este
exclus. Dac ne gndim c pacientul este la debutul bolii iar anticorpii sunt nc nedectabili,
repetm testele dup 3 sptmni. n cazul n care testul VDRL este pozitiv iar testul TPHA
este negativ, este posibil s ne aflm n situaia de mai sus, la debutul bolii i repetm testele
dup 3 sptmni. Dac rezultatele rmn nemodificate, este vorba de o reacie fals pozitiv.
Pot fi luate n discuie i alte posibiliti.

Genul Borrelia
Genul Borrelia include spirochete de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 m / 8-30 m), cu
spire largi i inegale, mobile (cu micri de rotaie i rsucire), care infecteaz n special
animalele i se transmit la om prin intermediul unor vectori. Produc spre exemplu febra
recurent, boal transmis de artropodele hematofage, borrelioza Lyme etc. Borreliozele
transmise prin cpue sau pduche poart de obicei numele regiunii geografice n care se
gsesc preponderent. Vom discuta n cele ce urmeaz aspecte legate de febra recurent cu
agent etiologic Borrelia recurrentis, care produce infecii i n Europa.
B. recurrentis supravieuiete mai multe luni n sngele contaminat sau n culturi la 4C.
n anumite cpue, bacteriile sunt transferate din generaie n generaie. Tulpinile de B.
recurrentis izolate n diverse pri ale lumii, de la diferite gazde i de la vectori diferii
(cpue sau purici) au primit denumiri variate sau au fost catalogate drept subtipuri ale speciei
principale. n urma infeciei apare un rspuns imun umoral, putnd fi detectai anticorpi

aglutinani i anticorpi fixatori de complement. De remarcat faptul c, inclusiv n decursul

unei singure infecii apar modificri antigenice, care explic recderile. Ultima vindecare
(dup 3-10 recderi) este asociat cu prezena anticorpilor mpotriva mai multor variante
antigenice. Imunitatea consecutiv infeciei este de obicei de scurt durat.
Dup o perioad de incubaie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane i creterea
rapid a temperaturii. Se asociaz cefalee sever, mialgii, artralgii, letargie, fotofobie i tuse
cu sau fr expectoraie. n acest timp, spirochetele se afl n numr mare n snge. Pot aprea
hemoragii (peteii, epistaxis etc) dar de regul fr evoluie fatal. Febra persist 3-6 zile, apoi
scade. Perioada afebril dureaz 4-10 zile i este urmat de un al doilea atac de frisoane,
febr, cefalee intens i stare de ru. Pot aprea succesiv pn la 10 asemenea recderi, a cror
severitate scade n general progresiv. Puseele febrile se asociaz cu bacteriemie.
Diagnosticul de laborator n borrelioza recurent este bacteriologic, direct urmnd etapele
cunoscute. Diagnosticul serologic poate oferi unele date.
Diagnosticul borreliozelor pornete de la elemente clinice, epidemiologice, anumite date
de laborator i este confirmat prin diagnostic bacteriologic.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de
iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de snge dar s-ar
putea recolta i vectori (pduchi, cpue) sau LCR, lichid sinovial etc, n funcie de
manifestarea clinic. Sngele trebuie recoltat n perioadele febrile. n cazul n care produsele
nu se pot examina imediat, recomandm transportul acestora la temperatura frigiderului
(+4C) sau inocularea unor animale receptive (ex. oareci) i transportul acestora ctre
laborator.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat
proaspt ntre lam i lamel utiliznd sngele ca p.p., cu examinare la microscopul cu fond
ntunecat. Borreliile se vd ca spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 m / 830 m), cu spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul
negru al preparatului. Se pot realiza frotiuri subiri sau examenul picturii groase, colorate
Giemsa prelungit, May-Grnwald-Giemsa sau Wright precum i cu acridin-orange sau cu Ac
monoclonali marcai fluorescent i cu examinare la microscopul cu fluorescen. Pe frotiul
colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre
hematii. Examenul microscopic realizat de ctre un medic experimentat permite identificarea
borreliilor n circa 70% dintre cazuri, n condiiile respectrii normelor diagnosticului
bacteriologic.
Preparatele microscopice ar mai putea fi realizate pornind de la hemolimfa vectorilor
infectai (pduche, cpu). De menionat faptul c n cazul acestui p.p. borreliile i menin
pentru o lung durat de timp forma i mobilitatea caracteristice n timp ce n sngele recoltat
de la gazda uman sufer modificri datorit prezenei anticorpilor specifici, iar n timp i
pierd mobilitatea).
n ultima perioad s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian,
pornind de la produsul patologic.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz de regul la nivelul
centrului de referin, existnd mai multe tehnici care ar putea fi utilizate.
Se pot inocula animale de experien sensibile (ex. oareci sau obolani), cu inoculare
intraperitoneal. Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic i prin examinarea microscopic a
sngelui (p.p. se poate recolta de la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (pduchi
sau cpue) sau oul de gin embrionat (la nivel intra alantoidian sau n membrana
chorioalantoidian).
Se pot utiliza i medii de cultur artificiale speciale (cu ageni reductori, Nacetilglucozamin, acizi grai nesaturai cu caten lung, ser de iepure), n condiii de

microaerofilie, cu incubare la 32-37 C. Se recomand i utilizarea mediilor selective care

includ o combinaie de ageni antimicrobieni precum rifampicin, amfotericin B i
fosfomicin. Datorit faptului c mediile de cultur sunt lichide, nu se obin colonii izolate.
Creterea microbian trebuie verificat prin realizare de preparate proaspete examinate la
microscopul cu fond ntunecat la fiecare 3 zile, pentru o durat de 2-6 sptmni.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se poate realiza pe baza:
a) Caracterelor morfotinctoriale: sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5
m / 8-30 m), cu spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe
fondul negru al preparatului. Pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre,
lungi, cu capetele efilate.
b) Caracterelor de cultur:
Dac are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultur acesta rmne limpede, fr
sediment, dar i modific culoarea (ex. vireaz de la rou-portocaliu spre roz-glbui).
c) Caracterelor biochimice:
Borreliile sunt microaerofile, fermenteaz glucoza producnd bioxid de carbon i acid lactic
(dar aceste teste nu sunt utilizate de regul n diagnostic).
d) Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin:
- tehnici ale biologiei moleculare (PCR).
5. Nu a fost pus la punct o metod pentru realizarea antibiogramei (verificarea
sensibilitii la antibiotice i chimioterapice). Febra recurent se trateaz cu tetraciclin,
cloramfenicol, penicilin sau eritromicin. n urma tratamentului poate aprea sindromul
Jarisch-Herxheimer (frison sever, creterea temperaturii, hipotensiune, leucopenie).
Diagnosticul serologic nu este foarte util, datorit variaiilor antigenice (care au loc
inclusiv pe parcursul bolii) i complexitii fenomenului de recuren.
n ser pot fi decelai anticorpi aglutinani, imobilizani i fixatori de complement. Sunt
foarte puine laboratoare care practic aceste reacii, de obicei n scop de cercetare. La
pacienii cu febr recurent epidemic (purttori de pduchi) pot aprea aglutinine fa de
Proteus OXK i o reacie VDRL fals pozitiv.
Se poate nregistra o leucocitoz de pn la 25.000 celule / mm 3i o cretere important a
VSH-ului (de pn la 110 mm / h).

Genul Leptospira
Genul Leptospira include mai multe specii, dintre care mai cunoscute sunt L. interrogans
i L. biflexa. Leptospirele sunt spirochete foarte mobile, descriind micri de burghiu
imprimate de dispoziia particular a flagelilor, cu dimensiuni de 0,1 m / 6-15 m,
prezentnd un crlig la unul sau la ambele capete. n cadrul speciei Leptospira interrogans
exist peste 218 serotipuri (serovaruri n terminologia anglo-saxon, de ex. L.
icterohaemorrhagiae; un serovar include mai multe grupe) care pot determina boala la
animale i accidental la om. Specia Leptospira biflexa reunete peste 63 de serotipuri
saprofite.
L. interrogans este patogen prin multiplicare i invazivitate. Leptospiroza se
caracterizeaz prin polimorfism, pe parcursul evoluiei aspectul clinic putndu-se modifica.
Dup o perioad de incubaie de 1-2 sptmni, debutul bolii poate fi marcat de febr,
perioad n care leptospira este prezent n snge. Microorganismul se cantoneaz apoi n
organele parenchimatoase (ficat i rinichi), n forma cea mai grav (sindromul Weil) putnd
determina apariia de icter, hemoragii, necroz tisular i disfuncii de organ. Boala este
frecvent bifazic (dup o ameliorare iniial urmeaz faza a doua a bolii remarcndu-se
creterea titrului de anticorpi de tip IgM). Infecia leptospirotic poate conduce relativ
frecvent la meningit aseptic (cu lichid clar).

Diagnosticul de laborator n leptospiroz poate fi bacteriologic i / sau serologic.

Diagnosticul bacteriologic este relativ dificil, laborios, respectnd etapele cunoscute i
este cel mai frecvent realizat la nivelul centrului de referin.
Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice. Diagnosticul bacteriologic
al leptospirozei este laborios i costisitor.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile
cunoscute, n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de snge sau LCR (n primele 7-10
zile), urin (dup 9 zile de la debut pn la 2-8 sptmni de boal), dar s-ar putea recolta i
lichid peritoneal, pleural etc. Datorit fragilitii leptospirelor i fenomenului de autoliz,
transportul trebuie s fie realizat rapid, n maxim 1-3 ore, la temperatura camerei.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat
proaspt (fr a folosi ns lamela). Preparatul se examineaz la microscopul cu fond
ntunecat. Exist o serie de proceduri utilizate pentru pregtirea preparatului. n cazul
lichidului peritoneal, LCR etc, produsul de centrifugheaz la x 1.500 rot/min. pentru o durat
de 30 minute, utilizndu-se sedimentul obinut. n cazul sngelui, recoltarea se face pe
anticoagulant (dar nu cu citrat), urmnd o prim centrifugare la x 500 rot/min. pentru o durat
de 5 minute. Prelum supernatantul pe care l centrifugm la x 1.500 rot/min. pentru o durat
de 30 minute i utilizm sedimentul obinut. n aceste condiii, un medic microbiolog cu
experien ar putea stabili diagnosticul prezumtiv. Leptospirele apar ca filamente luminoase,
spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare n
spaiu, pe fondul negru al preparatului.
Unii autori recomand realizarea de frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin
impregnare
argentic
(Fontana-Tribondeau),
mai
ales
pentru
preparatele
histo-patologice; leptospirele apar ca filamente regulat spiralate cu extremitile fin ngroate
sub form de buton, de culoare maro. A fost recomandat i colorarea imunofluorescent
(IF direct) n cazul suspicionrii diagnosticului de leptospiroz. n ultima perioad, pornind
de la p.p. (ser, urin, LCR etc) au fost puse la punct tehnici PCR.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz dificil, cu costuri
ridicate, datorit sensibilitii n mediul extern i particularitilor de multiplicare a
leptospirelor. De regul cultivarea se face la nivelul centrului de referin; utiliznd medii de
cultur lichide nu obinem colonii izolate.
Exist i posibilitatea inoculrii p.p. la cobai sau alt animal de laborator, intraperitoneal.
Starea clinic trebuie monitorizat zilnic. Identificarea infeciei se poate face prin diagnostic
serologic, prin izolarea leptospirelor (hemocultur) sau anatomopatologic i bacteriologic
dup decesul sau sacrificarea animalului respectiv.
n cazul utilizrii mediilor de cultur este recomandat ca toate p.p. s fie nsmnate att
pe medii de cultur selective ct i neselective. Mediul de cultur cel mai cunoscut este
mediul Korthof (cu acizi i alcooli grai, care conine i ser de iepure), pregtind n acest scop
mai multe tuburi n care nsmnm cantiti progresive de p.p. (ex. pornim de la o pictur,
continum cu 2 picturi etc). Mediile selective includ neomicin i / sau 5-fluorouracil.
Realizm incubarea la 28C. Multiplicarea bacterian nu determin o tulburare a mediului
(apariia turbiditii reprezint cel mai frecvent o contaminare cu o alt bacterie). Dup 3 zile,
respectnd cu strictee normele de asepsie, realizm preparate native pe care le examinm la
microscopul cu fondul ntunecat. n cazul n care rezultatul este negativ, repetm aceast
examinare la interval de circa 3 zile pentru o durat total de minim 4 sptmni, sau pn la
obinerea unui rezultat pozitiv. n general creterea bacterian are loc n 3-14 zile de la
momentul nsmnrii.
Costul i durata diagnosticului cresc i datorit faptului c, pentru identificare sunt
necesare cel puin 1-2 repicri pe un alt mediu lichid, dup detectarea microscopic a unor

microorganisme care ar putea fi implicate patogenic. O alternativ (i mai costisitoare,

utilizat mai ales dac presupunem contaminarea culturii cu o alt bacterie) este reprezentat
de inocularea intraperitoneal a culturii respective la cobai. Dup 30-60 minute, avnd n
vedere faptul c leptospirele invadeaz sistemul circulator mai rapid n comparaie cu alte
bacterii, dup anestezierea animalului se recolteaz snge (prin puncie cardiac) i realizm o
hemocultur.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
caractere:
a) Caractere morfotinctoriale: realizm un preparat proaspt (fr a folosi lamela) din
mediul de cultur i l examinm la microscopul cu fond ntunecat. Leptospirele cu
dimensiuni de 0,1 m / 6-15 m, apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu
micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare n spaiu, pe fondul negru al
preparatului. Se pot realiza frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentic
(Fontana-Tribondeau) precum i prin IF direct.
b) Caractere de cultur:
Leptospirele nepatogene se multiplic la 11-13C, n timp ce L. interrogans nu.
c) Caractere biochimice:
Leptospirele nepatogene sunt rezistente la 8-azaguanin, n timp ce L. interrogans este
sensibil.
d) Caractere antigenice:
Se utilizeaz seruri de referin cu anticorpi fa de serogrupurile cunoscute i tulpina de
identificat izolat n cultur pur i concentrat la o densitate standard, prin reacii de
aglutinare microscopic, la nivelul centrului de referin care a elaborat protocolul standard de
operare; n mod similar se poate identifica i serovarul implicat
e) Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin:
- tehnici ale biologiei moleculare (amplificarea prin PCR a fragmentelor obinute prin
restricie endonucleazic etc).
5. Antibiograma nu se realizeaz (nu a fost pus la punct o tehnic n acest scop). Este
cunoscut faptul c leptospirele sunt sensibile la penicilin, amoxicilin, tetraciclin,
doxiciclin etc dar tratamentul se stabilete n funcie de forma i gravitatea bolii.
Diagnosticul serologic
Anticorpii specifici se pot evidenia n serul pacienilor ncepnd cu a 4-6 - a zi de la
debutul bolii, atingnd un nivel maxim ntre sptmna a 3-6 - a de boal, dup care scad
progresiv. Tehnica de referin este reprezentat de reacia de aglutinare microscopic,
realizat pe seruri pereche (primul recoltat la 1-2 sptmni de la debut, al doilea recoltat la 34 sptmni de la debut). O cretere de 4 ori a titrului la a doua determinare semnific un
diagnostic pozitiv. Un titru 1/800 n prezena unor semne clinice este foarte sugestiv. Trebuie
s menionm c pentru unii pacieni seroconversia are loc mai tardiv. O alt problem este
reprezentat de faptul c se utilizeaz leptospire vii n calitate de Ag cunoscut, motiv pentru
care aceast reacie nu se poate practica dect n centrul de referin.
La nivelul altor uniti sanitare se pot practica reacii de tip ELISA, reacia de
hemaglutinare indirect sau reacia de aglutinare pe lam utiliznd Ag preparate din tulpini
saprofite (sensibilitatea i specificitatea acestor reacii este mai sczut). Tehnica ELISA de
identificare a anticorpilor de tip IgM pune diagnosticul infeciei acute dar nu poate permite
determinarea serogrupului implicat aa cum se ntmpl n cazul tehnicii de referin
BIBLIOGRAFIE:Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din
genul Treponema, Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.
1. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Borrelia,
Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.
2. Popa M.I. (coord.), Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Leptospira,
Microbiologie Medical, vol 2 - curs UMF Carol Davila, 2010.