5.

Antibiograma difuzimetrica principiu, interpretare

1. Antibiograma difuzimetric comun Din punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar Mueller-Hinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate reali!a de exemplu prin "inundarea# plcii urmat de aspirarea$ aseptic$ a excesului de inocul sau cu a%utorul unui tampon (exist &i alte variante tehnice). Dup circa '( minute (timp n care placa Petri se las cu capacul ntredeschis n vecintatea )ecului de ga!$ aprins) se aplic microcomprimatele n care sunt ncorporate anti)iotice n concentraie standardi!at. *plicarea microcomprimatelor se poate +ace cu a%utorul unei pense$ n condiii aseptice$ sau cu a%utorul unui aplicator "automat# (la minim ,( mm distan ntre ele &i minim -. mm de marginea plcii/ vom utili!a . anti)iotice di+erite pentru o plac Petri cu diametrul de 0 cm). Microcomprimatele tre)uie s vin n contact per+ect cu mediul$ motiv pentru care$ cu a%utorul unei pense le presm u&or (dup ca!). Dup nc -.-'( minute$ incu)m plcile peste noapte n termostat$ la '1 sau ,.-,234$ n +uncie de temperatura optim de multiplicare a microorganismului testat. *nti)ioticul eli)erat din microcomprimat di+u!ea! n mediu$ reali!nd !one de inhi)iie n care coloniile micro)iene nu se de!volt (5igura nr. ,). 4u ct !ona de inhi)iie este mai larg$ cu att germenul va +i considerat mai sensi)il. Dac n interiorul !onei de inhi)iie (chiar dac diametrul nregistrat este +oarte mare) se de!volt colonii$ "mutani re!isteni#$ germenul va +i considerat re!istent (5igura nr. 6). *ceast metod$ cu toate c este +olosit pe scar larg n la)oratoare$ permite de +apt numai eliminarea anti)ioticelor complet inactive &i eventual selecionarea anti)ioticelor +oarte active$ pentru c tehnica nu este standardi!at.
2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Ba !" 7e e+ectuea! pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de re+erin$ din aceea&i specie (sau o specie asemntoare). 7pre exemplu$ pentru cocii 8ram-po!itivi putem alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. 9ulpina de re+erin are o sensi)ilitate cunoscut la di+eritele anti)iotice pe care le utili!m. Prin aceast metod se nltur o parte din +actorii de eroare ai metodei precedente$ spre ex. calitatea mediului$ calitatea discurilor de anti)iotice$ care vor +i identice pentru microorganismul de re+erin &i pentru microorganismul testat. :e!ultatele se exprim cu termenii; "sensi)il#$ "intermediar#$ "re!istent#$ n +uncie de diametrul !onelor de inhi)iie a multiplicrii celor doi germeni$ +a de acela&i anti)iotic (%umtile de cerc se examinea! comparativ). n ca!ul n care cunoa&tem 4M< (concentraia minim inhi)itorie) a microorganismului de re+erin$ putem +ace aprecieri cu privire la 4M< pentru microorganismul testat. Din punct de vedere tehnic$ pe o plac de +orma unui ptrat ("mprit# n , !one egale marcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculea! n treimea medie microorganismul de re+erin iar n treimile exterioare ' microorganisme di+erite$ pentru care dorim s reali!m testarea. <noculul tre)uie s +ie ast+el reali!at nct s conduc la apariia dup incu)are a unor colonii +oarte apropiate$ dar care s nu +ie con+luente. Plasm microcomprimatele cu anti)iotice pe liniile de demarcaie dintre culturi. <ncu)m peste noapte la ,.-,234 urmnd ca n !iua urmtoare s citim &i s interpretm re!ultatele. (5igura nr. .) #. Antibiograma difuzimetric standardizat ($irb%&Bauer, '(()S" Din punct de vedere tehnic se reali!ea! asemntor cu prima metod pre!entat$ dar este standardi!at$ +iind singura metod di+u!imetric recunoscut pe plan internaional$ care permite o)inerea unor re!ultate reproducti)ile &i corela)ile ntre la)oratoare di+erite (5ilm nr. -). =lementele necesare standardi!rii sunt; > mediul (n ma%oritatea ca!urilor agar Mueller-Hinton$ pentru c are o valoare nutritiv corespun!toare &i nu conine su)stane cu aciune inhi)itoare)

o exist elemente minerale care tre)uie adugate n ca!ul testrii anumitor microorganisme (ex. Mg'? &i 4a'?$ pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa$ atunci cnd este testat sensi)ilitatea la aminoglico!ide)/ o se va veri+ica pH-ul mediului (de o)icei cuprins ntre 2$' &i 2$6)/ o exist suplimente nutritive care tre)uie adugate n ca!ul testrii unor microorganisme pretenioase/ o grosimea mediului tre)uie s +ie de 6 mm ('. ml de mediu@plac de 0 cm)/ > inoculul$ care se o)ine de pre+erat din . colonii i!olate (cultur pur) &i tre)uie s ai) o tur)iditate corespun!toare standardului tur)idimetric ($. Mc5arland (circa -(1 uniti +ormatoare de colonii@ml) n ma%oritatea ca!urilor/ > timpul de incu)are (n ma%oritatea ca!urilor -A--1 ore la ,.-,234$ nu mai mult de '-, plci suprapuse)$ atmos+era de incu)are$ umiditatea atmos+erei de incu)are/ > concentraia su)stanelor antimicro)iene din microcomprimate &i dimensiunea microcomprimatelor (A mm diametru)/ > alegerea su)stanelor antimicro)iene pentru care se +ace testarea/ > pstrarea plcilor cu mediu pn n momentul utili!rii (maxim 2 !ile$ n pungi de polietilen$ la ?634)/ > utili!area tulpinilor de re+erin pentru controlul de calitate/ > interpretarea re!ultatelor (se msoar diametrul !onei de inhi)iie &i se compar re!ultatele cu cele din ta)elele puse la dispo!iie de productori &i@sau centrele de re+erin). Metodele di+u!imetrice au de!avanta%ul c nu permit aprecierea concentraiilor e+icace ale anti)ioticului la nivelul +ocarului in+ecios

*. +eactia As o principiu, interpretare

*ceast reacie poate +i utili!at n diagnosticul retrospectiv al unei in+ecii streptococice sau pentru con+irmarea etiologiei unei )oli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore &i ma%ore de diagnostic). :eacia *7BC determin titrul *c anti streptoli!in C (7BC). Principiu; 9itrarea *c anti-7BC se )a!ea! pe +aptul c 7BC are e+ect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de )er)ec. n ca!ul n care n serul de cercetat exist *c anti-7BC$ aciunea hemolitic a 7BC este neutrali!at. 4om)innd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de 7BC vom putea determina titrul *7BC. Materiale &i reactivi necesari; - ser de cercetat (sau seruri "pereche#$ recoltate la interval de ' sptmni)/ - 7BC lio+ili!at (standardi!at de ctre productor)/ - snge de+i)rinat de iepure @ )er)ec/ - soluie salin i!oton$ soluie de rivanol ($,D/ - epru)ete$ pipete gradate +oarte curate/ - )aie de ap$ centri+ug etc 9ehnica de lucru; 9re)uie urmate toate indicaiile din protocolul de lucru$ respectiv - se omogeni!ea! suspensia de hematii/ - se ndeprtea! inhitorii 7BC din serul de cercetat (utili!m soluie de rivanol &i suspensie de cr)une activ$ reali!m o diluie de -@-( a serului care se va menine ,( minute la .A34)/ - se reali!ea! diluiile de ser &i se reparti!ea! n tu)urile de reacie (ser n diluii succesive) mpreun cu 7BC (n cantitate constant$ cte ($. ml @ tu))/ com)inarea serului de cercetat cu 7BC repre!int prima etap a reaciei/ - se agit tu)urile pentru omogeni!are &i se menin timp de -. minute la ,234/ - urmea! a doua etap a reaciei *7BC$ respectiv adugarea suspensie de hematii (.D)$ cte ($. ml n +iecare tu)/ - se agit pentru omogeni!are &i se incu)ea! timp de 6. minute la ,234/ - se centri+ughea! tu)urile timp de - minut (-..(( rotaii @ minut) &i se menin pn a doua !i la 634 (temperatura +rigiderului). <nterpretare;

Pornind de la o diluie iniial a serului de -@-($ dup adugarea tuturor reactivilor titrul (numrul de uniti *7BC) va +i -'$ .( n tu)ul urmtor$ -(($ -'.$ -AA$ '.($ ,,, etc n tu)urile urmtoare. 9itrul reaciei *7BC este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipse&te complet hemoli!a. Pentru !ona noastr geogra+ic se accept ca normal un titru de '(( (maxim '.() uniti *7BC. =xist teste serologice &i pentru evidenierea pre!enei &i titrului anticorpilor +a de alte structuri antigenice (de exemplu streptodorna!$ hialuronida!$ streptoEina!). 4ontrol de calitate; Fltimele ' tu)uri sunt repre!entate de tu)ul martor pentru hematii$ n care se veri+ic re!istena hematiilor &i respectiv tu)ul martor pentru 7BC n care se pun 7BC &i suspensia de hematii. =xist &i posi)ilitatea de a reali!a o micrometod *7BC$ reacia e+ectundu-se n plci de material plastic cu godeuri.

,. -estu . ek principiu, interpretare

Du)la di+u!ie =leE *ceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini deCorynebacterium diphteriae. n ca!ul n care tulpina este toxigen$ toxina va di+u!a n mediu iar dup unirea cu *c anti-toxin$ complexele *g-*c vor da na&tere unor linii de precipitare. ntr-o cutie Petri turnm mediul =leE &i dup ce mediul s-a ntrit$ decupm un &an pe unul din diametre. n &anul respectiv pipetm ($. ml ser antidi+teric$ ser care conine *c anti-toxin di+teric n concentraie de -.((( F< @ ml. *c anti-toxin di+teric vor di+u!a n mediu. Dup circa ' ore nsmnm perpendicular pe &anul cu *c anti-toxin$ de +iecare parte a &anului$ o tulpin de Corynebacterium diphteriae toxigen (martor po!itiv)$ o tulpin deCorynebacterium diphteriae ne-toxigen (martor negativ) &i tulpini de cercetat$ cte un striu (de +iecare parte a &anului) pentru +iecare tulpin. <ncu)m la ,23 4 pentru 61 ore$ dar urmrim !ilnic apariia culturii &i precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de nsmnare apare cultur )acterian. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen$ toxina (*g) di+u!ea! n mediu. Fnirea dintre *g &i *c duce la +ormarea unor complexe *g-*c care precipit$ iar n mediu vor aprea linii de precipitare n unghiurile dintre cultur &i &anul cu *c anti-toxin. n ca!ul n care apar linii de precipitare n unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat &i &anul cu *c antitoxin$ respectiva tulpin este toxigen. :eacia va +i negativ pentru martorul negativ &i pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.

1/. +eactia Bordet&0asserman principiu, interpretare

n diagnosticul serologic$ cea mai cunoscut metod rmne nc :54 GordetHasserman$ utili!at n diagnosticul serologic al si+ilisului. Principiu: :54 se )a!ea! pe proprietatea sistemului (1 de a se +ixa pe complexul imun *g-*c. n prima +a! a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac acest ser conine *c speci+ici +a de *g cunoscut se va +orma un complex *g-*c$ urmat

de +ixarea (1$ care se va activa pe calea clasic &i nu va mai +i Idisponi)il# pentru a se +ixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii ? *c-antihematie). n ca!ul n care serul de cercetat nu conine *c speci+ici +a de *g cunoscut$ nu va avea loc +ormarea unui complex *g-*c n prima etap a :54. Dup introducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator$ hematiile &i *cantihematie se vor cupla$ vor +orma un complex imun iar (1 Ili)er# se va +ixa pe acesta. Dup +ixare va urma activarea (1&i respectiv li!a hematiilor$ hemoli!a putnd +i examinat cu ochiul li)er. Tehnica de lucru: *&a cum am menionat$ tehnica de lucru este la)orioas &i nu va +i pre!entat n totalitate$ n cele ce urmea!. > serul de cercetat se va menine ,( minute la .A34$ n )aia de ap$ pentru inactivarea (1 propriu > principial$ :54 are loc n ' etape > n prima etap se pun n reacie (1$ serul de cercetat &i *g cunoscut/ exist ' posi)iliti; a. n serul de cercetat e2ist Ac specifici$ re!ultnd un complex *g-*c pe care se va +ixa (1 ).n serul de cercetat nu e2ist Ac specifici$ nu se +ormea! complex *g-*c$ (1rmne li)er > n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii ? *c anti-hematie)/ exist ' posi)iliti; a. (1 nu este li)er$ nu are loc hemoli!a$ ). (1 se +ixea! pe sistemul hemolitic$ li!ea! hematiile &i o)servm apariia hemoli!ei > toi reactivii utili!ai tre)uie standardi!ai$ respectiv se vor reali!a > omogeni!area suspensiei de hematii cu eventual etalonare prin spectro+otometrie > titrarea serului hemolitic > titrarea (1 n pre!ena *g > titrarea )idimensional a *g &i a serului de re+erin > n :54 +inal se va proceda ast+el > se diluea! con+orm indicaiilor din protocolul de lucru reactivii utili!ai (serul hemolitic$ serurile de cercetat$ *g$ serurile de re+erin$ (1) > se reparti!ea! n godeurile corespun!toare serurile de cercetat$ *g &i ( 1 > pe o plac separat se prepar martorii (martor pentru sistemul hemolitic$ martor pentru (1$ martor pentru *g$ ' martori pentru serul de re+erin$ martor sigur negativ) > plcile se introduc pn a doua !i la 634 > a doua !i$ plcile se menin la ,23 4 timp de ,( minute > se adaug n toate godeurile sistem hemolitic > plcile se menin la ,234 timp de ,( minute > se pun plcile la 634$ pn la sedimentarea hematiilor > exist anumite di+erene ntre tehnicile cantitative &i cele calitative$ dar principiile sunt acelea&i <n :54 Bordet&0asserman$ metod calitativ$ reacia se reali!ea! n epru)ete; ' pentru reacia propriu!is (una cu ser diluat -@1$ celalt cu ser diluat -@-A) ' pentru martori sigur po!itiv &i sigur negativ

 cte una pentru +iecare din ceilali martori$ respectiv martor pentru serul de cercetat$ martor pentru *g$ martor pentru (1$ martor pentru serul hemolitic) Interpretare: <niial se veri+ic re!ultatele aprute pentru martori (+ie c este vor)a de o metod cantitativ sau calitativ)/ spre ex. n ca!ul metodei calitative$ n tu)ul martor pentru serul de cercetat tre)uie s +ie hemoli!$ la +el ca &i n tu)urile martor pentru *g$ 4J &i ser sigur negativ. n tu)urile martor sigur po!itiv &i martor pentru sistemul hemolitic$ nu tre)uie s +ie hemoli!. n tu)urile cu serul de cercetat$ dac apare hemoli!a$ nseamn c nu exist *c iar testul este negativ (lichidul din tu) va avea un aspect ro&u$ limpede). 9estul este po!itiv atunci cnd n tu)urile cu ser de cercetat nu apare hemoli!$ hematiile se depun +ormnd un I)uton# n partea in+erioar a tu)ului (n serul de cercetat exist *c). Pentru a sta)ili diagnosticul +inal$ este necesar ca :54GH s +ie con+irmat prin reacii speci+ice (ve!i capitolul 6.).

11. +eactia de ag utinare pe ama principiu, mod de ucru, interpretare

Kom pre!enta att exemple de utili!are a reaciei de aglutinare n diagnosticul direct ct &i n diagnosticul indirect (serologic). :eamintim +aptul c n cadrul diagnosticului de la)orator serologic se va determina pre!ena (sau se va dovedi a)sena) *c necunoscui$ n serul pacientului respectiv$ utili!nd *g cunoscute. n diagnosticul serologic$ de regul$ tre)uie s putem rspunde la minim trei ntre)ri eseniale; exist anticorpi n serul pacientului investigatL care este titrul anticorpilorL cum evoluea! n dinamic (n timp) acest titruL n acest scop vom reali!a minim dou determinri di+erite la un interval de 2--( !ile (pentru ma%oritatea in+eciilor care pot +i diagnosticate ast+el). n acest capitol vom discuta att reacii serologice calitative ct &i reacii serologice cantitative. <n diagnosticul direct: 9ehnica de aglutinare se execut n a patra etap a diagnosticului de la)orator$ respectiv n etapa de identi+icare$ pe )a!a caracerelor antigenice. n momentul aplicrii acestei reacii avem o serie de date pornind de la in+ormaiile clinice$ paraclinice$ epidemiologice$ s-a prelevat un anumit p.p.$ care s-a examinat din punct de vedere microscopic &i a +ost cultivat. *&a cum am menionat anterior$ n vederea identi+icrii este necesar s avem colonii i!olate$ cultur pur. -. *glutinarea pe lam 7pre exemplu$ n cursul identi+icrii unei tulpini entero)acteriene (Shigella spp.$Salmonella spp.$ E. coli etc)$ dup cultivarea p.p. pe medii selectivodi+ereniale se o)in colonii i!olate &i din poriunea superioar ()om)at) a coloniilor i!olate +acem treceri pe medii multitest (ex. 97<$ M<F). n !iua urmtoare$ avem de%a mai multe elemente pentru ncadrarea tulpinii i!olate ntr-o specie$ dar$ +olosind spre exemplu cultura )acterian de!voltat pe mediul 97<$ putem +ace reacia de aglutinare. n nici un ca! nu se vor utili!a pentru identi+icarea pe )a! de caractere antigenice tulpini mai Ivechi# de -1'6 ore. Pentru reali!area reaciei de aglutinare sunt necesare urmtoarele; cultura de identi+icat (colonii de tip 7$ de -1-'6 ore)$ soluie salin +i!iologic$ *c cunoscui +a de *g pe care dorim s le identi+icm (*c polivaleni$ *c monovaleni de

grup$ *c monovaleni de tip$ dup ca!)$ lame de microscop curate$ pahar Ger!elius cu amestec de!in+ectant etc. <niial$ pe o lam de microscop curat &i degresat punem la una dintre extremitile lamei o pictur de soluie salin +i!iologic$ n care suspendm un +ragment din colonia de identi+icat n a&a +el nct s o)inem o suspensie omogen$ opalescent. n ca!ul n care suspensia rmne omogen$ putem trece la etapele urmtoare/ n ca!ul n care pictura Ise limpe!e&te# &i apar grun%i$ tulpina este ne-tipa)il prin aceast metod (apare Iaglutinarea nespeci+ic#)$ ar putea +i vor)a de o tulpin care provine dintr-o colonie de tip :. n urmtoarea etap$ la cealalt extremitate a lamei$ punem o pictur de ser cu *c cunoscui$ de ex. polivaleni &i reali!m o suspensie omogen$ opalescent$ a coloniei de identi+icat. nclinm lama de cteva ori$ u&or$ n toate direciile$ pentru a +avori!a contactul dintre cei ' reactani &i unirea complexelor *g-*c mici$ solu)ile$ pentru a +orma reele de complexe *g-*c. n ca!ul reaciei po!itive (coresponden ntre *c cunoscui &i *g pe care dorim s l identi+icm) pictura Ise limpe!e&te# &i apar grun%i de aglutinare. =ste indicat s citim reacia pe +ond negru. De cele mai multe ori citirea se +ace cu ochiul li)er ns n ca!ul unor aglutinate de dimensiuni +oarte mici poate +i necesar s +olosim o lup$ un microscop sau un aglutinoscop. Pentru identi+icarea di+eritelor microorganisme exist scheme care orientea! etapele de urmat (ta)elele &i schemele respective se livrea! de ctre productori mpreun cu serurile cu *c speci+ici). Bamele pe care se +ac reaciile de aglutinare$ dup terminarea reaciilor se introduc n amestecul de!in+ectant. n cadrul lucrrilor practice vor +i discutate aglutinrile pentru identi+icarea E. coli$ Salmonella spp. pn la nivel de specie (con+orm clasi+icrii Mau++mannHhite) &i respectiv a grupurilor de Shigella spp. 9ot prin aglutinare direct se mai pot identi+ica tulpini de Vibrio cholerae$ Haemophilus influenzae tip )$ tulpini de rucella spp.$ tulpini de E. coli entero-patogen$ iar n ca!ul leptospirelor &i unor ricEettsii apariia aglutinrii tre)uie veri+icat cu a%utorul microscopului. <n diagnosticul indirect (serologic); n diagnosticul serologic$ n mod o)i&nuit$ reaciile utili!ate permit detectarea pre!enei *c n serul de cercetat dar &i sta)ilirea titrului. 9otu&i exist &i cteva exemple de reacii de aglutinare calitative. :eaciile de aglutinare pe lam; -. Huddleson (n diagnosticul )rucelo!ei) '. MudicEs-7teuer (n diagnosticul ti+osului exantematic) Prima dintre reacii o utili!m demonstrativ n cadrul lucrrilor practice$ apariia aglutinatelor +iind clar iar tehnica de lucru +oarte simpl. 7unt necesare urmtoarele materiale; lame de microscop curate *g )rucelos inactivat (colorat n violet) ser de cercetat Pe o lam de microscop depunem o pictur din soluia de *g )rucelos &i n imediata vecintate a acesteia$ o pictur de ser de cercetat. 4u colul unei alte lame amestecm &i omogeni!m cei ' reactani. Prin mi&cri de nclinare a lamei n toate direciile +acilitm +ormarea complexelor *g-*c$ n ca!ul n care n serul de pacient sunt pre!eni *c anti- rucella spp. :eacia este po!itiv n ca!ul n care se remarc pre!ena aglutinatelor. 4hiar &i n perioada n care

aceast se utili!a n diagnostic$ o reacie po!itiv pe lam tre)uia s +ie con+irmat prin aglutinare n tu)uri. 9ehnica de aglutinare indirect poate +i utili!at n diagnosticul serologic al in+eciilor produse de Helicobacter pylori$ Treponema pallidum (hemaglutinare pasiv) etc.

12. .2udatu faringian mod de reco tare, transport

se recoltea! pre+era)il dimineaa nainte ca pacientul s mnnce &i +r s se +i splat pe dini$ +r s +i utili!at gargarisme cu di+erite soluii (iar dac aceste condiii nu au +ost respectate$ recoltarea se va +ace dup minim 6 ore) pacientul st pe scaun$ cu +aa spre sursa de lumin &i gtul n u&oar extensie ne a&e!m puin lateral +a de pacient pentru a evita contaminarea cu picturi eliminate n cursul unui eventual acces de tuse (de pre+erin vom purta masc &i ochelari) deprimm )a!a lim)ii cu a%utorul unui apstor de lim) steril &i n condiii de iluminare adecvat examinm +aringele posterior$ pilierii$ amigdalele pentru a sesi!a care sunt !onele in+lamate (ro&ii$ cu depo!ite$ ulceraii etc) &i eventualele depo!ite purulente utili!m utili!m tampoane cu vat o)i&nuite > un tampon va +i utili!at pentru examen microscopic direct > un tampon va +i utili!at pentru nsmnare pe medii de cultur > n ca!ul suspicionrii di+teriei se vor utili!a , tampoane solicitm pacientului s pronune vocala I*# &i printr-o mi&care de &tergere$ circular$ +erm$ recoltm secreia de la nivel +aringian$ amigdalian insistnd n !onele unde exist ulceraii$ depo!ite (n ca!ul n care se remarc pre!ena unei +alse mem)rane o deta&m cu gri% nspre peri+erie &i recoltm secreia care exist su) aceast structur) tre)uie s evitm atingerea )a!ei lim)ii sau a palatului moale este de pre+erat utili!area imediat a p.p.$ sau n cel mult --, ore/ n ca!ul n care acest lucru nu este posi)il$ tamponul va +i trimis ctre la)orator n mediu de transport

1#. 3rocu tura mod de reco tare, transport, interpretare

9ractul urinar este n mod normal necontaminat$ n schim) uretra distal poate pre!enta o +lor micro)ian +oarte variat$ +iind contaminat cu microorganisme provenind din !ona genital sau de la nivelul colonului. Dintre aceste microorganisme putem i!ola de la nivelul uretrei distale sta+ilococi coagula!o-negativi$ E. coli$ !lebsiella spp.$ Proteus spp.$ )acili di+teromor+i$ enterococi$ streptococi$ neisserii sapro+ite$ "ycoplasma spp.$#replasma spp. sau $usobacterium spp. Ba acela&i nivel ar putea +i identi+icate &i tulpini de Candida spp.$ Clostridium spp.$ di+erii coci gram po!itivi sau gram negativi anaero)i$ lacto)a)ili$ mNco)acterii netu)erculoase$ sta+ilococi aurii etc. 4oloni!area micro)ian a uretrei distale explic motivul pentru care n marea ma%oritate a ca!urilor vom reali!a urocu tura cantitativ. 4u toate c indi+erent de gri%a cu care vom recolta p.p. (urina) acesta va +i contaminat$ prin aprecierea cantitativ a numrului de uniti +ormatoare de colonii n urina proaspt recoltat$ Idin mi%locul %etului#$ putem s preci!m dac pacientul are sau nu in+ecie urinar. Mai multe studii au artat c atunci

cnd se demonstrea! pre!ena a -(. )acterii @ ml$ aceasta indic o in+ecie a tractului urinar (<9F) n aproximativ 1(D dintre ca!uri n timp ce o valoare de -(6 )acterii @ ml indic <9F n mai puin de ,(D dintre ca!uri. Datorit acestor re!ultate$ n practica medical se consider c ne a+lm n situaia unei <9F atunci cnd numrul de )acterii @ ml urin este O -(. @ ml. 4u toate acestea$ dorim s su)liniem c interpretarea re!ultatului nu tre)uie reali!at mecanic &i deci!ia +inal n ceea ce prive&te identi+icarea )acteriei$ e+ectuarea testrii sensi)ilitii la anti)iotice &i respectiv redactarea )uletinului de anali! ar tre)ui s +ie luat avnd n vedere aspectul macroscopic al urinii (ex. purulent)$ re!ultatul examenului microscopic al sedimentului urinar (ex. pre!ena de PMP)$ numrul de uniti +ormatoare de colonii @ ml urin &i elemente clinice (ex. disurie$ miciuni mai +recvente$ +e)r)$ cu alte cuvinte cola)orarea ntre clinic &i la)orator este esenial. 7pre exemplu$ n ca!ul unor elemente sugestive$ chiar dac numrul de )acterii este de -(6 @ ml$ putem lua deci!ia s repetm urocultura iar i!olarea aceleia&i )acterii poate indica pre!ena <9F. Pe de alt parte$ i!olarea a peste -(6 uniti +ormatoare @ ml n ca!ul sta+ilococilor sau levurilor este luat n considerare iar pre!ena n urin a %isteria monocytogenes la +emeile nsrcinate sau pre!ena n urin aSalmonella typhi sunt semni+icative indi+erent de numrul F54 @ ml. Pentru a su)linia nc o dat importana etapei de recoltare &i transport a urinei amintim +aptul c urina repre!int un +oarte )un mediu de cultur pentru ma%oritatea )acteriilor care pot contamina p.p. iar o pro) de urin care are iniial (n momentul recoltrii) -(, )acterii @ ml$ dup ' ore la temperatura camerei va conine -(. )acterii @ ml. 4lasi+icarea <9F se poate +ace dup mai multe criterii. <9F %oase includ cistita dar dup unii autori &i uretrita$ prostatita &i epididimita. <9F nalte includ pielone+rita acut$ necro!a papilar (complicaie a pielone+ritei acute sau care poate aprea n a)sena in+eciei)$ a)cesul renal sau pielone+rita cronic (dup unii autori). <nva!ia tractului urinar poate avea loc pe cale ascendent$lim+atic sau hematogen. =xist o serie de +actori care +avori!ea! apariia <9F$ dintre care amintim; o)struciile care duc la sta! urinar (adenom sau carcinom de prostat$ tumori de vecintate$ stricturi uretrale sau ale colului ve!ical$ compresiune uretral n timpul sarcinii$ corpi strini$ calculi urinari$ cateteri!are urinar etc)$ re+luxul ve!ico-ureteral$ ali +actori +uncionali. Agen4i etio ogici Microorganismele mai +recvent implicate n producerea unei infec4ii a tractu ui urinar sunt n ordine descresctoare E. coli$ !lebsiella pneumoniae$!lebsiella o&ytoca$ Enterobacter cloacae$ Enterobacter aerogenes$ Pseudomonas aeruginosa$ Proteus mirabilis$ Proteus 'ulgaris$ Citrobacter freundii$ Citrobacter di'ersus$ Enterococcus faecalis$ sta+ilococii coagula!-negativi. *denovirusurile pot determina cistite hemoragice la copii. Mai rar$ n ordine descresctoare etiologia <9F poate +i repre!entat de Staphylococcus aureus$ (cinetobacter calcoaceticus$ streptococi )-hemolitici din grupele *$ G$ 4 sau 8$ "organella morgani$ Pro'idencia rettgeri$ P. stuartii$ Serratia li)uefaciens$ Serratia marcescens$ Candida albicans$ Salmonella spp.$ Corynebacterium urealyticum. 4u privire la E. coli$ cel mai +recvent microorganism implicat n <9F$ exist anumite grupuri uropatogene$ spre ex. C-$ C'$ C2 etc. n mod cert$ exist di+erene n ceea ce prive&te etiologia <9F pe grupe de vrst$ n +uncie de sex sau la pacienii spitali!ai n comparaie cu pacienii pentru care se solicit urocultura n am)ulatoriu.

+ea izarea urocu turii +eco tarea !i transportu produsu ui pato ogic n <9F se pot recolta urin$ snge (ex. n pielone+rita acut) sau chiar &i B4:. n continuare vom discuta despre recoltarea &i transportul urinei. n a+ar de recomandrile generale menionate anterio$ tre)uie s su)liniem unele aspecte particulare > n ca!ul n care nu se poate recolta prima urin de diminea$ tre)uie a&teptat pentru recoltare ,-6 ore dup miciune > :ecoltarea se reali!ea! dup splarea cu ap &i spun a organelor genitale &i a perineului/ exist recomandri speci+ice pentru sexul +eminin &i masculin &i respectiv pentru copilul mic > =ste pre+era)il ca recoltarea s ai) loc ntr-un spaiu corespun!tor n apropiere de la)orator iar personalul medical tre)uie s explice &i eventual s asiste recoltarea > =ste contraindicat recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar prelungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea )acteriilor$ a&a cum am menionat mai sus)/ dup recoltare$ n ca!ul n care urina nu este prelucrat imediat (sau n cel mult ,( de minute dup recoltare)$ p.p. tre)uie meninut la temperatura +rigiderului iar transportul tre)uie reali!at la ?63 4 > De regul se recoltea! urina Idin mi%locul %etului#/ dup splarea organelor genitale &i a perineului$ prin miciune se elimin circa -(( ml urin (ndeprtnd ast+el o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale) &i a)ia apoi se recoltea! '(-.( ml (pre+era)il .( ml) urin n recipientul steril$ dup care miciunea continu > =xist &i alte tehnici de recoltare$ neinva!ive sau inva!ive (puncie &i aspiraie suprapu)ian$ cateteri!are uretral$ cu riscurile respective). .2aminarea macroscopic !i microscopic a urinei :eali!m iniial examenul macroscopic/ p.p. poate +i tul)ure$ opalescent$ poate pre!enta un anumit miros etc. n vederea examenului microscopic al urinei omogeni!m urina prin Irsturnare#$ de '-, ori. Punem o pictur de urin pe lam$ acoperim cu o lamel &i examinm cu microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de +a!). n ca!ul n care identi+icm pre!ena a cel puin unei )acterii pe +iecare cmp$ n +iecare dintre . cmpuri succesive$ putem cu o )un aproximaie s considerm c avem o )acteriurie de -(.)acterii @ ml. *lternativ se poate utili!a preparatul colorat 8ram. =ste necesar s apreciem concomitent &i pre!ena piuriei (peste -( leucocite @ mm, de urin). *u +ost imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea piuriei &i )acteriuriei$ spre exemplu testul 8riess (detectarea nitriilor n urin)$ detectarea estera!ei leucocitare$ teste )ioluminiscente etc. Piuria &i )acteriuria tre)uie interpretate n contextul clinic. =xamenul sedimentului urinar permite vi!uali!area de celule epiteliale (malpighiene$ ve!icale$ uretrale etc)$ celule sanguine (leucocite$ hematii)$ cilindrii urinari (hialini$ leucocitari$ eritrocitari$ epiteliali$ granulari etc)$ cristale urinare$ levuri (eventual nmugurite$ cu )lastoconidii)$ Trichomonas 'aginalisetc/ examenul sedimentului urinar este +oarte util &i tre)uie reali!at de +iecare dat. (u tivarea urinei n mod o)i&nuit$ pentru cultivare putem utili!a ,-6 medii di+erite. Din motive de economie am putea nsmna o %umtate de plac cu mediu Mac4onEeN (+r cristal violet)$ o %umtate de plac cu gelo!-snge &i cte un sector de plac cu mediu agar telurit &i respectiv agar cu eo!in &i al)astru de metilen (=MG) n

ca!ul n care examenul microscopic al urinei este po!itiv. Dac examenul microscopic este negativ$ nsmnm doar o %umtate de plac Petri cu mediu Mac4onEeN. C variant de nsmnare pentru mediile Mac4onEeN &i gelo!-snge este utili!area unei anse cali)rate de - Ql cu a%utorul creia prelevm urin prin atingerea supra+eei p.p. dup omogeni!are. nsmnm iniial un striu pe centrul %umtii de plac dup care ntindem p.p. n striuri paralele$ perpendiculare pe primul striu. n +inal +r sterili!m ansa ntindem p.p n striuri paralele n unghi de 6.3 +a de striurile precedente. Dup o incu)are de -1-'6 ore la ,.-,23 4$ nmulind cu -((( numrul de F54 de!voltate$ putem aprecia care este numrul de )acterii @ ml de urin. 5recvent este utili!at nsmnarea urinei dup diluare (ex. -@-(() cu a%utorul pipetei gradate. nsmnm de ex. pe o plac cu mediu Mac4onEeN ($- ml de urin diluat -@-(($ incu)m n condiiile cunoscute &i dup apariia coloniilor calculm numrul de )acterii @ ml prin nmulirea numrului de F54R inversul diluie R inversul volumului nsmnat. 5nterpretarea rezu tate or urocu turii cantitative > <!olarea unei )acterii cu o concentraie de peste -(. @ ml de urin con+irm <9F la )r)at sau la +emeie (cu simptome caracteristice)/ n ca!ul c pacienta este asimtomatic$ certi+icarea <9F este dat de i!olarea acelea&i )acterii n a doua pro) de urin > <!olarea a dou )acterii di+erite$ +iecare cu o concentraie de peste -(.@ ml de urin$ impune repetarea recoltrii &i nsmnrii/ n ca!ul n care re!ultatul este similar &i pentru a doua pro) de urin este posi)il <9F mixt (n ca! contrar este o +oarte pro)a)il contaminare) > <!olarea a trei )acterii di+erite$ chiar &i n ca!ul n care concentraiile pentru +iecare n parte dep&esc -(. @ ml de urin$ impune repetarea anali!ei/ extrem de pro)a)il este vor)a de o contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp n urm &i meninut la temperatura camerei &i nu la +rigider > <!olarea unei )acterii cu o concentraie de -(6 @ ml de urin conduce la recomandarea repetrii anali!ei (exist &i unele excepii$ n care re!ultatul este considerat po!itiv$ spre ex. pentru levuri n concentraie de peste -(6 @ ml de urin$ sta+ilococii coagula!o-negativi n concentraie de peste .R-( 6 @ ml de urin etc) > Bipsa multiplicrii )acteriene sau de!voltarea de F54 n concentraie de , -( @ ml de urin repre!int o urocultur negativ > Dorim s su)liniem din nou c re!ultatul micro)iologic tre)uie s +ie anali!at n contextul clinic &i corelat cu re!ultatul microscopiei iar n ca!ul anumitor )acterii (ex. Salmonella typhi) re!ultatul este po!itiv indi+erent de concentraia F54 @ ml de urin. n ca!ul unei uroculturi po!itive$ )acteria i!olat se identi+ic (pe )a!a caracterelor mor+otinctoriale$ de cultur$ )iochimice$ alte caractere) &i se testea! sensi)ilitatea la anti)iotice &i chimioterapice$ de regul prin metoda di+u!imetric (ve!i capitolul -6). =xist o serie de ncercri pentru optimi!area diagnosticului <9F$ inclusiv a)ordarea unor tehnici miniaturi!ate. Dintre acestea vom aminti metoda imaginat n <nstitutul de )oli in+ecioase IMatei Gal&# (pro+. 5lorin 4runtu)$ metoda IFriline# etc. 7pre exemplu ultima dintre metode utili!ea! o lam de plastic acoperit pe am)ele pri cu mediu de cultur$ prote%at ntr-un tu) de plastic. Principiu;

Mediul 4B=D de pe prima parte a lamei (4Nsteine - Bactose - =lectrolNte De+icient agar) are culoare verde &i permite numrarea coloniilor )acteriene (indirect a numrului de F54 @ ml urin) &i identi+icarea pre!umtiv. 4oncentraia sc!ut de electrolii inhi) inva!ia Proteus spp. Mediul Mac4onEeN +r cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare ro!/ inhi) ma%oritatea )acteriilor gram po!itive. 9ehnica de lucru; De&uru)m capacul &i extragem lama +r s atingem supra+aa agarului. <mersm lama n pro)a de urin recoltat (dac urina nu este su+icient cantitativ$ reparti!m p.p. pe cele ' pri ale lamei cu a%utorul unei pipete Pasteur). ndeprtm excesul de urin pe o hrtie de +iltru curat &i punem la loc n dispo!itiv lama nsmnat. <ncu)m n po!iie dreapt$ timp de -1-'6 ore la ,.-,234. * doua !i citim re!ultatele$ comparnd numrul de colonii aprute pe mediul 4B=D cu modelul productorului. <nterpretare; n ca!ul n care numrul de F54 @ ml este mai mare de -(. reali!m teste suplimentare pentru identi+icare &i respectiv anti)iograma. *lte elemente privind interpretarea au +ost pre!entate anterior. 4ontrol de calitate; > Pregtim o suspensie )acterian n soluie salin +i!iologic steril cu -(.--(A )acterii pe ml din +iecare dintre tulpinile de re+erin > Staphylococcus aureus *944 '.0', > Escherichia coli *944 '.0'' > Proteus mirabilis *944 -'6., > <noculm suspensiile ast+el pregtite pe supra+aa mediilor de cultur Friline$ iar dup -1-'6 ore incu)are citim &i interpretm re!ultatele > Staphylococcus aureus: apar colonii doar pe mediul 4B=D. 5ermentarea lacto!ei este indicat de pre!ena culorii gal)ene n %urul coloniilor de!voltate. > Escherichia coli: apar colonii gal)ene pe 4B=D &i colonii ro! pe Mac4onEeN. > Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea 4B=D este al)astr/ pe Mac 4onEeN apar colonii incolore.