62 .

{ I

Partea intdi. Tehnici da unultzd mlrniltlulu5h'tl

7. Tehnici de evaluare a numdrului de microorganisme

0.1

7.1. NTMARAREA MICROORGANISMT]I,O It PRIN EXAMEN MICROSCOPIC DIRtrC'I.

fetei p5trifel elementar.in cazul citometrului rhoma, suprafafaclc I rrrrrrl _unui este divizatd de citre linii in 400 de pdtri{ele elementare latura de l/20 rrrrrr cu (suprafa{a = unui pdtrilel elemenrar * mmr;1ng.Z.t;. 400 Pentrunumdrarese plaseazd picdturddin suspensia celulede alaliz.rrt o de pc platforma centrald, in dreptul suprafelei delimitate. ireste suspensiesc plascrrztr o lameld care se sprijini pe cele dou6 platforme laterale astretintre lanrcli 9i ;;i citometru se creeazr o peliculi de lichid cu inil{ime egal6 cu dcnivclarca platformei centrale (0,1 mm). Astfel, volumul de lictrid ptasat pe fiecarc pitritlcl elementar cm3.Preparatul o$inut se studiazi la microscop cu obiectiv "o" t{t 10" 4. cu grosisment x40, cand in cdmpul microscopic poate fi vizualiz,atrrn grup rlt: 16 pdtdfele elementare, care se numdri celulelea cdror suprafglitse sllh rrrei din mult dejumltate in interiorul careului de 4x4 pfltr[fele elemcnllic. sti lhc rrurrrArHr i de celule din mai multe cAmpuri microscopice(ln =100) ne cnlerrlee:.| 9i , # Num5.rulde celule prezenteintr-un cm' de suspcrrsie nrratirrr rc rlc de= termini cu formula: numdrul mediu de celule pe un p6tr6lel elementar , = f

direct se aplicdpentruevaluarea tle nrrrnilnrlrri rrrir:rrrExamenulmicroscopic organisme unicelulare (drojdii, eubacterii) gi a stlrii lor fiziologicc in prcpnrnte microscopiceumedesaufixate gi colorate. Pentu numdrarese utilizeazl lame calibrate (citornetre- pcntru dr<rjdii pi sau spori de mucegai) lame normaledin sticli (metodaBreed- pcntru bacterii).tn funcfie de num5rulmediu de celule stabilit pe cAmp microscopicr;i de gradul de dilu{ie al probei analizate, rezultatul se exprim[ in: numir de celule * cm-'(g) produs analizat. Se considerecd sensibilitateaacestortehnici este propor,tionali cu riddcina pdtratAa numirului total de celule numirate. Pentru rezultatecAt mai concludente se recomandi estimareaa 100400 celule gi repetareaoperafiei de numdrare de citeva ori. Metodele ce au la bazi examenul microscopic direct se caracterizeazi prin gi simplitate, rapid^ita1e se preteazd cel mai bine la studiul celulelor clar individualizate. in cazul celulelor care formeazd agregatecelulare inainte de celulelor prin ultrasonare numirare se recomandddispersarea intr-o solu{ie ce conline un agent dispersant(tween, lauril sulfat de sodiu). De asemenea, pentru microorganismelecare prezintd mobilitate se recomanddimobilizarea prealabild a celulelor intr-o solufie2% formaldehidi.

N =n.4.rc6.k
in care:z estenumirul mediu de celulepe un p[tri]el elenrent'r; fr - coeficient de dilufie. in cazul bacteriilor,aceastl metodl este greu de aplicrrl,rrtil riilr r,ert rll mensiunilor reduse celulelor gi a faptuluicd de multecirick: prczrrrtd ale c6t rr1rlllllalr

7.L.1.Numirarea cu citometre
Celulele de drojdii gi sporii de mucegai se pot numira, prin examen (camerelor nurnirat)(fig. 7.1). microscopicdirect,cu ajutorulcitometrelor de Se cunosc mai multe tipuri de citometre: Thoma, Tiirk, Biirker, Rosenthal,Goreaevq.a.,construite pe acelaSiprincipiu. Un citometru este o lami de sticll groasE, prev6zuti cu trei platforme separateintre ele prin rigole in sticli. Platformacentrali este denivelatl fa{a de celelalte doud cu o tfzo rm ?nillime de 0,1- 0,2 mm (inscrisl pe + fiecare camer[). Pe platforma centrald este gravati o re{ea de linii prpendiculare, care delimiteazd o anumitd suprafali divizatl de cdtre linii perpendicularein microcelulede forml pdtraticd (pdtrifele elementare).Diferenfierea dintretipurile de citometre Fig.7.1.Profilulgi rclcaua citometrului Thoma. constdin mirinreavariabil[ a suDra-

_!,; 7.L.2.Metadadirecti de numlrare a bacteriilor

in preparatefixate gi colorate(metodaIJrcr,rll
Celulele bacterii de aflateintr-unvolum cunoscut lichid sc rel)lu de trr(.Arn pF o suprafafdlirnitatd de frotiu, iar dupd fixare gi colorare simplii sc .irnlrrle!re numirul de celule prin examenmicroscopicdirect. Pe o lamd de sticld degresatise contureazrcu markerul o supr'lir(rl,\'; de 2-6 cm2.se inverseazilama-gi,central,cu ajutorul unei micropipctoslcrilc. le plaseazd picdturi din suspensia analizatcu un volum cunoscut o de I/,,.cpnl crr 0,02-0,05cm3. Imediat se adaugapestecelureo picitur[ dintr-o solu{ie slcrili rle 0,03yoagar gi, cu ajutorul firului, se omogenizeaz6, picdturile,realizdlclrr-se g repartizarea amesteculuicat mai uniform, pe intreaga suprafa{i contunrtil. urmeazd uscareain curent.de aer card, fixarea(de preferat cu solu{ie de alcool 96Yo, tinp de 20 min), colorarea simpl6,spilareagi usiarea. Preparatul studiazi ap-oila microscop,cu obiectiv de imersie,avdnd grijd se ca picitura de ulei de cedrusd fie pusdin momentulin carese face numdrarea.

ttt _T_T_T -+-+-+

64 -

Parteatntdi' Tehnici de analizd microbiologicd

7. Tehnici d.eevaluare a ntntdntlui le ntltnnn'ganisme

0l

Se numird celulele de bacterii din mai multe cAmPuri aflate in diferite znne ale frotiului. DuPi (minimum 25; ln=600-1000) ln pe cdmp microscoplc: i =enumarare:se calculeazi numirul mediu de celule

microscoPice

(x = numIrul de cdmpuri cercetate)' L- 4-L-.,-3 prezente intr-un gram sau cmPentru determinareanumirului de celule necesarse se cunoascl: gfadul de dilu{ie, volumul de suspensie produs analizzteste delimitate pe care s-a realizat i.oiorit f" oblinerea frotiului, mdrimea suprafelei microscopic' frotiul 9i suprafalacAmpului ' -'microscopic & se determin6 cu ajutorul micrometrului d"prif"p "an,putui preparatul arfllizat cu lama rnicrometmlui obiectiv 9i' cu olriectiv. Se inlocuiegte diametrul campului d" cu ncclagiobiectiv cu care s-a flcut numirare4 se m[soari ajutorul sclrii gradate(l mm : 100 diviziuni): d":na x 0,01[mm], obiectiv care se unde: r/ este numarul de diviziuni de pe scara micrometrului cuprind exact in cdmpul microscopic: n' d: . S"=? ["*t] ' Num a ru l p o s i b i l d e c d m p u ri mi c ro scopi cey' f" caresecupri ndi nsuprafafade frotiu delimitat5 se calculeazi cu formula:

de par t iculear r lr r ql Num ir ar ea elect r onict ru cclulclor . Num ar lt oar ele intr-Unlichitl aflatein suspensie pentrunumirarea nricroorgnnisnlelor adaptate ' ir principitr:rl+' .,tpararulde tip Coultcr (ng. i.Z; fu.clioneazi dupd unnitorul calibratsuntdispugidoi electlort'le partegi de alta a unu'itub prevezuicu un orificiu ptutinaimersali intr-un electrolit. ale clror bome sunt conectatela tensiunecontittttF Gra{ie unei aspira{iiProvocate

a superioari tubului,cela partea

N- = s ' "

,s,

se Numdrul de bactertt prezente intr-un cm3 sau un g produs analizat determini cu formula:
ftl =-----

n . N-.15 "
V 'p

ln care:t esteun coeficientde dilu{ie.

directl 7.l.3.Tehnici modernede estimare a numirului de microorganisme

ln prezents-au dezvoltat noi tehnici de analizi, derivind din rnetodaclasic6, starea de carepermit ca in paralel cu stabilireaconcegtra{iei celule si se evalueze9i fiziologicl a acestora.

lulele aflate in exteriorul tubului trec pe rind prin orificiu gi deplaseazi o dati cu fiecare pasaj un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoaci o cre$tere trauzie*cno'r torie a rezistenfei circuifului, ceea ce genereazi un impuls electric a c6rui ' amplitudine este proPo$onald cu volumul celulei. Impulsurile fiind sv foarte dvsr, r'rPurDur r'rtu Je rvq t: scurD,, , .2. Principiul de func(ionareal numf irtorttlul 'E Fig,.7 td durat6, aparaful permite numdrarea tipCoulrer. i. celule unui numdr mare de celule, una cate una, ihtr-un tinrp foarte scurt. in plus, este posibil[ gi o clasificare a celulclol In funcfie de dimensiuni gi, respectiv, de volurnul lor' AceastdtehnicS, degi sofisticati, este considerataextrem de interesanttlfi rl suspensiilorde drojdii, realizdnd simultirrr r:u aplici cu succes pentru ar.laliza numdrareagi dimensionareacelulelor. De remarcatsunt urmitoarele aspecte:rezultatelesunt reproductibile cirrrl rc utilizeazdsuspensii diluate de celule; sarcina electrica a celulelor poate inflrrcttp analizaconduiend la oblinerea de rezultate eronate; aceastdtehnici nu se;xrel! alflturi de celulelemicrootpl= aplica in cazul culturilor ce conlin in sgspensie, nismului cultivat, gi particulesolide' i slhtll citometrie in flux. Aceastl tehnic[ permite numararea9i aprecierea enriscrle fluorescenfei fiziologice a celulelor,cAnddetec{iase face prin m[surarea celuleli i' prealabil marcatecu un colorant (fluorocrom). O schemi de prirttripiu in esteprezentatd figura 7.3. printr-unorificiu ingust 9i trec unit cfll5 Dup6 colorari celulelesurrtantrenate emisd de fiecare microorgarrietll una prin iafa unei surselunrinoase.Fluorescen.ta Rezultatelesunt tradusc lle tt estecaptati printr-un fotomultiplicator 9i analizatd. in care dd nurntrrulde evenitnetrte funcfie de intensitatea-fluoresccttlel' histogramd histogramdtraducedeci un profil al popula{iei.Adeseamarkerii colorntt[i Acea-st6 utilizali pot Jferi diferite tipuri cle rispunsuri. Daci colorantul este un markcr dl fiziologici n numflrulde celuleviabile 9i starea viabilitafudin histogramfise clEduce cuprinde net dou[ picuri este posibild numlrnrel popula{iei.DacS liistograrnn ;l clintr.o cultur[ mixtl (de exemplu,streptococi ieiarata a microorganisrnelor Dacd markcrulestc ttlt altticorpsnu o sond[ nucleicdse pot nuttthrl lactobacili). lafiecterogena' isttterlitttr'o poptr microorgntt c specifi anumite

= | f{'pG-l-=-fi,;ff,

I
/. 'l'ehnici de evaluare a numdrului de microttrllttttrtttt

hl

I I

66
Cchle + ffuoromm

pllt r ttttitilt$l+ tl Partea intdi. Tehnici ir rnnilt:,7

N Im i r

( .1 !l t

'n

'
y'u
| | Detedor2

l-l ou,.*,,
,/"
e^i"i"z n
| lDut"a.rl LJ

t
I I I

/ tunira reflecran ,/ '------'---'+ | I Detedor I lumitri Ll

-+
Fscifllls

---'---'-> EmisieI

l l r tl r i . l r r l r 'tl C o m b i n a ti a d i n tr e AR N g i a cr i d i n i r cn r i l c o l l tr ,,tr ='., l i t g i tl l r r i t ( 'cl r r l cl , \'l r i r r rl r r p l l l r l l '{l {l l /'\|l l I c o m b i n a l i a A DN - a cr i d i n d o fl u o r e sce n {5 vcr tl c. \'t'l /l m a r e $ i v o r f i c6 l g r a te i n g a l b e n - Or a n ji,a r ccl r r l cl c l l l ( r i ttl c.tl t;ttl tt't'. "l l l l l t in cazul droidiilorie utllizeazAdiacetat rlc llttott:',t't'itrn. rrit' r",li' lrtrltolirirl r 'el tr l cl c r l d e c e l u l e l ev i i . D u i e o n o u l co l o r a r e cu r o d a n r i n i 'i l ( co l o r ;tttltl e t'r tttl t t:,1 ) ' sc cstc to|tt Nllttt:ltrtltrlt vii au o fluorescenfi galben-verde,iar cAmpul micrttscttpit: = 420 nm). realiznazd in lumini bleu (l' a Aceasta tehnic[ a fost automatizata gralie dezvolt[rii tchnioilor cle analiza
lolrItitrt6 lumlDorsl

trssmise

b)

c)

imaginii. de Existd sisteme comerciale, automatizate, de apreciere directl a numdrului analiza stirii fiziologice celule: sistemul Chemflow (Chemunex) - numlrare 9i coulter a celulelor; sistemul Bactosan - numerarea bacteriilor lactice; sistemul (Bactomatic); sitemul Malthus AT (Tacussel) 9.a. Epics; sisternul BMMS

in al de Fig.73. Principiul functionarecitometrului flux: d'e de b - exemPle sisteme detect;t'#rtl1"#t cepermite a celule celuledrojdiixcrn-'.9i103 prazul de sensibilitate metodeiestede 102 al jur de 2 min la care se mai adaugdtimpul in d" b"#;?;;;;:;;;6tJiot"u "rt" *-- -OlSi necesarpentru marcareaetantionului' o extinderelargi recenti, citom;tria in flux esteo metodAcare a clpltat pentru numdrarea Ea microorganisrnelor. a fost aplicatacu succes Dentrunumerarea din mustul de struguri in fermentafie' ii stuaiut drojdiilor T ehnic ade m i c ro s c o p i e i n fl u o re s c e n fl ' A ceasta.uti l i zeazecol oranti celulelorvii de cele moarte.Astfel, prin suspensionarea specifici pentrudiferenlierea citrat i' preparat drojdie in solulie diluatl de albastru de metilen cu "'"tut"tor'a" se vor puteadiierenliacelulelevii (incolore)de cele moarte(colorate microscopic rnoartedupd i" ;"i similar, pot fi diferenliatebacteriilevii de cele il;];;rirl. colorare cu acridin oranj. tehnici permitedetecin Tehnica de rnicroscopie imunofluorescenfi' AceastE cu ajutorulanticorpilorspecifici. tarbaunei categoriiparticuhrl de microorganisme TehnicaDEFT(DirectEpifluorescentFilterTechnique)'Aceastdtelrnica a celulelor.Ea se aplicd in cupl"uJ filtrarea prin membranecu cotorareavitale (bere, vin, lapte).Numlrarea se ciLd analizermiciobiologice a produselorlichide prin membrani (sau realizeazaprin studiu *i!.os"opi", dupl filtrarea produsului vitald a celulelor' diluareasa) gi colorarea este de este rapid (10-20 min) 9i sensibil' Limita de deteclie Procccleul cm3' l0o rnicroorganir,r,"l"tliuiltizana volumede probede 100 dup6 colorarecu Numdrarca," poui" realizacuun microscopoptic obignuit de fucsini-albastru metilen' nlbnslrudc riletilen,ibastru Loeffler sauamestec cdnd numlrarea se realizeazicu un microscop mai bune se oblin Itcz.uhnte fluorescenti sub lumini uv. in acestcaz se utilizeazdcoloranfi rrrrllrror.escfllllt acridinoranj, galbende acridini, acriflavina)ce auramina, prinrulina" ( llrrilresccirru. vii celulelor 5i a celornloarte' mici grosismente cu evidenfierea r,rlrrrrrrlirrl'ln iu.r

7.2.TEHNICI INDIRECTE (CULTURALE) DE EVALUARE A NUMARULUI DE MICROORGANISME

-.t

t
I I I
I

in prezentsunt cunoscutemai multe metodeculturale de evaluarea numarului gi de microorganisme, attume: metodede cultivarepe medii dense(rnetodaculturaldKoch); ' r metode de cultivare in medii lichide (metodatitrului - lttcttxlrt lttlrttrilot multiple; metodadilu,tiilorlimite). ' D egi de avant ajaie f apt ul cd per m it st abilir eanum lr 'lui 6c:cclr r l'vii. r "'illt ' un acest orm et odepr esupune volum m ar e de nt t t ncii,r illlll t t t 't fOl OS i rea sc rrlr(ttrt'rlttilil analizt:i iar sterilegi medii cleculturi adecvate, rezultatul ustensile " necesardezvolt 6r ii qi r nult iplicir r iiuclt t . lt 'lorlr t r t I un ti mp de t er m ost at ar e ' 3-5 zil('/:)ir" (in gencral: ''ll"t in diferenfiat func{iede naturamicroorganisrnelor pentruiungi; 2 zilel37"C- pentrubacteriiabrobernezofile)'

prin cultivartr Numlrarea microorganismelor 7.2.1. pe rnedii dense

prirl a de Telrnicile nuni[rareindirectd microorganismelor cultivarcpc trlctlii de din unui volum cunoscut suspensia celulepc nlctlii in constau inocularea dense de culturi solidificate, in placi Petri 9i, clup6o perioadade cultivare in conclilii optime,se numdrdcoloniile formate. Rezultatulse exprirnhin: -,untdr de nticroorgarri.s,le [N/cm3 sau g] - in cazul microorganismelor careprezintl celule individuale,neasociate; - unitdli formatoclre de colonii (dc) lufclcm3 sau g] - in cazul uricroorgapseudomiceliu). (lanturi,pachete, asocialii formeazd nismelorla carecelulele

I t
I

-.

68

Partea intdi. Tehnici de analnd mtcrobiologicd

7. Tehnici de evaluare a numdrului de microorganisme

69

Aceste tehnici au avantajul estimlrii numdrului de microorganismevii gi, in acelagitimp, permit gi analizi calitativ[ prin studiul caracterelormorfologice ale coloniilor dezvoltate. Pentru o numlrare eficienti se impune diluarea tlrealabili, prin tehnica dilutiilor decirnale,a probelor de analizi cu incdrclturi microbiand mare, sau concentrarea prin filtrare prin membrane sterilq in cazul probelor cu un numir redusde microorganisme. In figura 7.4 se prezinti schema generali a manipullrilor la aplicarea metodei de numrrare indirecti, prin cultivare pe medii dense,pentru tehnicile de numdraredupl filtrare sauprin diluare.

A* E+9 @

fluidificat gi temperatla 40...45"C. Mediur se omogeniz.eazi suspensia pra.,r cu din prin miqcrri orizontale, circulare ale pldcii. Dupa solidificarea mediului, prirr termostatare conditii optime, se vor forma colonii atat la suprafafa in mediului cir 9i in profunzimeaacestuia.Acest mod de cultjvare este cel mai favorabil pentr.' microorganismele facultativanaerobe, gi microorganismele dar aerobele tolereazj destul de bine' in cazul microorganismelor anaerobese recomandi. cultivarea irr dublu stra! adicl dupd inglobarea celulelor in mediu gi solidificare, primul strar 11. rnediu se acoperEcu incd un strat de mediu steril; rdspdndirea cerurerorpe suprafara mediurui soridifcttr, _o._, :,ino"llare .ryi1 cand u,l cm- probi' diluati se transferd intr-o pracd petri sterild, in caie, iri prealabil, a fost repartizat mediul de culturi cu agar. Suspensia se rispdnde$le uniform pe intreaga suprafafd a mediului de cultur; cu ajutorul unui instrumcrrl special (-deexemplu, spatuld Drigalski). Aceast?itehnic6 prezintn dezavantajurci unele celule pot si rd.mani atagatede instrumentul de etalare, cu efecte negatrvs asupraacumteteirezultatului analizei. Pentru ob,tinerea unor rezultate mai concludentese recomandainocularel e cdte dou[ pl6ci in paralel pentru fiecare dilutie analizatd. bup6 termostatarea condifii optinro, in . .citle7 si interpretarea rez.urtateror. apari(iavizibild a coloniilor va depindede particularitafilefiziologice ale micr,_ organismelorcultivate qi de condifiile de Cultivare,de obicei au"pe +s-zz tr .te cultiva^re (fig.7.5). In funcfie de numirul de colonii evidenfiatein pricile din care s-a fiitrrrl numdrarea se va calculanurndrul de rni /?, icroorganisme gram sau cm3 probi rk, pe analizA,cu formula: u.fclcm3 = n' d (g)

Fig.7.4. Tehnici de cultivare gi numirare a microorganismelor: a - prin filtrare; b - prin diluare (sau inoculare in volume mari).

7.2.l.l.Tehnica clasici de numirare prin cultivare pe medii dense, in plici Petri Metodologia de analizdpresupune adoptareaa dou6 modalitdli de inoculare a celulelorin/pe mediulde culturS. solidificat,in pl6ci Petri,qi anume: - inoculare in masa mediului solidificat, cdnd I cm3 din fiecare dilu{ie se transferi cu cite o pipeti sterill in plici Petri sterile.Peste suspensia fiecareplacd din se repartizraza cite o eprubetd mediu de culturd specific,cu agar{10-15 irn3;, de

in care d este coeficientulde dilu{ie corespunzetor plncii din care s-a realizut numdrarea. In cazulin carepenl^racecagi dilu{ies-auinocurat catedour plici in parirrr.l n reprvintd.media aritrneticii c.krniil.r i' cele douaplaci. ! ' rlc 'umirate In cazul in care trttnritrttl colonii pe placdestemare,in imposibilit;rt,,r i repetirii analizei, pentfu a ?'lesni rrurndrarea se imparte fie praca il;;; ;,;,r,; j sectoare, numdri coloniilc se l)e un sectorgi, in final, se insumeaza coloniilc,e j intreaga placr, fie se clclirnirerizi rcversrirlnediurui suprafatd pe o d; i;;;;,';,J; i con{ineun numdr nredirrde rrricrixrrgnrrisrnc, numdra se coroniiled"-r;^;",,,:;; I ----" "suprafa$gi, in final, se ra;r.rrenzll t'ral suprafafi ln mediuldin placd. -| In cazul rrunti:trilrii c:olortiilor'prrrrctiforrnepot folosi sistemedotatc{* | se su r s5. lum inh, lupr ; r cr r r r rrrnhr i'ca inr aginiigi un dispozit iv de de *ui"or . oi I '- - - "'i nregist r ara coloniilor r r r r r r hr nlc, e " I r Pentru a spori cxircritrrtca Hrrarizoi, prezenr poaterecurgeIa apirrrrte itt se . I speciale nunrirarc,rrrrronrnrieere, de trazale utilizare uateia; po oe turiino, dil;;; I l aser )sau pe analiz. a r r ng, ir r ii, r r r r orut e dupf i denum ir ea ir r ee e I or . "*; ; ; i; . '; ; I anum e: Biot r anC I ll ( New lt r r r r r nr vie, llit ur at ic. ( Foss kf elect r ic)BACC e: O t . if r f l, I , ggloly count er ( t . 'ishcr ) Spir al sr . en, = tC1, ( ^ D o / - - . . ,r l B - - * " ' ( =, " . 500,pr ot o, \ nB'sj, '-\b;s ;afD,(a l ) l 1; Il J ' " ,' ' """'

Bioteh.)g.a.

lrvtv)