ANATOMIE

PATOLOGICA
 TIPURI DE MICROSCOAPE:
 Microscop cu lumina artificiala
 Microscop cu lumina polarizata
 Microscop binocular in fluorescenta
 Microscop cu contrast de faza
 Microscop cu contrast de faza prin interferenta
 Microscop cu lumina catodica
 Microscop confocal cu laser (confocal laser scanning microscope)
 4pi-microscop
 Microscop de contrast şi reflexie
 Microscop cu imersie
 Microscop-roentgen
 Microscop electronic: microscop cu neutroni
microscop cu unde ultrascurte
 Microscopia cu lumina polarizata este proiectata pentru a observa şi a
fotografia obiecte vizibile în primul rând datorită caracterului lor optic
anizotrop
Microscopia cu fluorescenta analizeaza proprietatile organice sau
anorganice ale substantelor utilizand fenomenul de fluorescenta sau
fosfoflourescenta in aditia fenomenelor de reflexie si absorbtie.
Microscopia in contrast de faza se bazeaza pe tehnica conform careia mici
schimburi de faza ale luminii ce strabate un obiect transparent sunt transformate
in schimbari ale amplitudinii sau contrastului imaginii.
Microscopia cu contrast de faza prin interferenta cunoscuta si ca microscopie
Nomarski este o microscopie prin iluminare optica ce mareste contrastul
probelor transparente necolorate.
Microscopia 4Pi foloseste doua lentile de mare rezolutie pentru iluminarea
specimenului din doua directii opuse.
Microscopia confocala cu laser este o tehnica folosita pentru obtinerea de
imagini de mare rezolutie.
Microscopia de contrast si reflexie (RCM) utilizeaza fenomenul optic realizat prin
epi-iluminarea oblica.
 CITOMETRIE DE FLUX

 Citometria in flux este o tehnica pentru

masurarea rapida, efectuata asupra particulelor
sau celulelor, aflate in suspensie, si trecute, una
cate una, prin dreptul unei sistem de detectie. in
forma sa cea mai simpla un aparat de citometrie
in flux este o combinatie a unui sistem fluidic de
furnizare a probelor, un spectrofluorimetru si un
fotometru de dispersie a luminii. in camera de
masurare celulele sunt aduse, una cate una unui
fascicul laser ce stimuleaza emisia si dispersia
luminii.
 APLICATIILE CITOMETRIEI DE FLUX

 Aplicatiile pentru diagnosticul clinic ale citometriei in flux sunt foarte

numeroase: de la „simpla\" imuno-fenotipare, utilizata pentru testele
de histocompa-tibilitate, sau pentru diagnosticul clinic de laborator in
oncologia hematologica, la (foarte dirse) aplicatii in diagnosticul
oncologic . O alta aplicatie importanta o reprezinta capacitatea unor
tipuri de aparate de a efectua si sortarea celulelor (purtatoare ale
unor seturi de antigene). Astfel se pot obtine populatii celulare de
interes terapeutic (de exemplu celule stem). O astfel de tehnologie
permite, spre exemplu, varianta de autotransplant medular, la
pacienti cu forme diverse de neoplazii ale tesuturilor hemato-
poietice. Citometria permite selectia exclusiva a celulelor ce poarta
setul de antigene corespunzatoare celulelor stem sanatoase
 BIOLOGIE MOLECULARA

 PCR-polymerase chain reaction

 Reactia de polimerizare in lant a acidului dezoxiribonucleic (ADN)
 Aceasta reactie a fost descoperita in 1983 de Kary B. Mullis
 Este o tehnica prin care se genereaza multiple copii identice pornind
de la o singura molecula de ADN deoarece mai multe copii sunt mai
usor de detectat , analizat si prelucrat ulterior
 Practic imita in vitro procesul de replicare al ADN
 Enzima cheie a reactiei este Taq-polimeraza (care la temperaturi
inalte 93 C), in prezenta careia ADN-ul in mod normal dublu catenar
disociaza si astfel fiecare catena poate fi copiata.
 Etapele analizei folosind
tehnica PCR clasic:
 -precultivarea esantionului de proba (5-10 h)
 -extractia ADN-ului
 -verificarea ADN-ului extras (prin spectrofotometrie
sau electoforeza)
 -reactia PCR
 -electroforeza pentru relevarea ampliconilor:
prezent/absent
 -timp total 24-48h
 Real time PCR
 Reactia de polimerizare in lant a acidului dezoxiribonucleic (ADN)
monitorizata in timp real
 In Real time PCR, produsul de amplificat este detectat prin intermediul
colorantilor fluorescenti
 In timpul reactiei sunt folosit „sonde” oligonucleotidice care intr-o anumita
etapa a amplificarii se prind specific fie de produsul amplificarii fie de
fragmentul tinta ce urmeaza a fi copiat
 Fenomenul de fluorescenta creste in intesitate pe masura ce cantitatea
de produs amplificat creste
 Monitorizarea intesitatii fluorescentei chiar in timpul reactiei PCR permite
detectia si cuantificarea produsului acumulat in timp real.
 Diferenta esentiala intre PCR si Real time PCR consta in faptul ca in
cazul PCR, este necesara o etapa post PCR pentru cuantificarea
produsului.
 Etapele analizei calitative
folosind Real time PCR

 -precultivarea esantionului de proba (5-10 h)

 -extractia ADN-ului
 -verificarea ADN-ului extras (prin spectrofotometrie sau
electoforeza)
 -reactia PCR-rezultat: prezent/absent
 (se observa ca nu mai este nevoie de electroforeza )
 Etapele analizei cantitative
folosind Real time PCR

 -extractia ADN-ului
 -verificarea ADN-ului extras (prin
spectrofotometrie sau electoforeza)
 -reactia PCR-rezultat: nr.copii/g(ml)
 -analiza foloseste regula Absolute quantification
: cu ajutorul unei curbe standard, se genereaza
un rezultat=o valoare absoluta.
 Tissue microarrays
(in histopatologie)
 Sunt realizate printr-o metoda de relocare a tesuturilor
din blocuri conventionale de parafina (pana la 1000)
denumite blocuri donor pe un singur bloc denumit
receptor. Aceasta se obtine punctionand blocurile
donoare in zonele prestabilite si de interes si plasand
continutul acului intr-un dispozitiv preformat (care poate
contine pana la 1000 de orificii ) care ulterior va fi inclus
in parafina ca si un bloc standard de parafina. Astfel pe
o singura lama histologica se pot analiza pana la 1000
de probe diferite.
 Avantajele folosirii tehnicii
“TISSUE ARRAY” (1):
 1. Analiza unui număr mare de ţesuturi tumorale cu tehnici convenţionale de patologie
moleculară este lunga si lenta. Autorii au dezvoltat recent tehnologia microarray-tissue
care face posibilă asezarea a unui numar de până la 1.000 de esantioane din tumori pe un
diapozitiv de sticlă, care apoi poate fi analizată prin fluorescenţă în hibridizare in situ, a
ARN-ului în hibridizare in situ, sau imunohistochimie.
 2. Tehnologia ţesutului microarray are potenţialul de a accelera în mod semnificativ studiile
moleculare, ce caută asocierile dintre schimbările moleculare şi caracteristicile
clinicopatologice ale cancerului.
 3. Exemple de aplicaţii potenţiale pentru tehnicile microarray- ţesuturi includ: testarea şi
optimizarea probelor şi anticorpilor, organizarea arhivarii,depozitarii ţesuturilor mari,
precum şi facilitarea studiilor multicentrice. 
 4. Mai mult, tehnicile de microarrays pot fi utilizate în scopuri educaţionale, precum şi de
îmbunătăţire a controlului calităţii şi standardizarea metodelor de colorare şi interpretare.
Microarrays Tissue a devenit unul din instrumentele cele mai promiţătoare pentru patologia
moleculara şi anatomica şi va avea multe aplicaţii în cercetare în domeniul cancerului.
 Avantajele folosirii tehnicii
“TISSUE ARRAY” (2):
5. Tehnica micro array a ADN-ului, a proteinelor si a anticorpilor identifica un număr de solutii în
continuă creştere utile în clasificarea bolilor moleculare, in dezvoltarea medicamentelor, precum şi
in predicţia răspunsului la tratament. Validarea ulterioara cu privire la importanţa clinică a acestor
tipuri gene sau proteine necesită o analiză la scară largă a ţesuturilor umane.  
 6. Tehnologia TMA are potenţialul de a facilita în mare măsură traducerea cercetării de bază în
practica clinică. Aplicaţiile potenţiale includ stabilirea unor asociaţii între schimbările moleculare şi
obiectivele clinice, testarea potenţialelor ţinte terapeutice folosind probe de ţesuturi specifice de la
pacienţii cu cancer, standardizarea detectarii moleculare si translatia rapidă a rezultatelor de la
liniile de celule de pe modelele animale in cancer uman. Din cauza aspectelor sale benefice
economice şi datorita capacitatii de a diferenţia diferenţe etnice în biologia tumorilor, cererile de
TMA pot deveni deosebit de importante în ţările în curs de dezvoltare.
 7. In hibridizarea in situ (ISH) sau coloratiile imunohistochimice (IHC), , ţesutul trebuie să fie
prelucrat nu mai mult de 48 de ore de fixare. Acest pas poate fi crucial pentru mentinerea intacta a
antigenilor mRNA cu ajutorul tissue array-ului.
 Avantajele folosirii tehnicii
“TISSUE ARRAY” (3):
 8. Maximizarea disponibilitatii de ţesuturi – se pot preleva 80 de eşantioane pe o TMA in
comparatie cu 40-60 de esantioane prin metodele conventionale. În acelaşi timp, se păstreza
dimensiunea de bază de la 1,5 mm în diametru pentru a ca ţesutul prelevat pentru tehnica
microarray sa fie reprezentativ. O lama de tissue-arrays poate conţine 200 nuclee, reprezentând
200 de cazuri cu diametru de 1,0 mm. De asemenea este posibil sa avem matrici de ţesuturi cu
600 de nuclee într-o singura lama.
9. Linia de produse enorma – sunt disponibile mai mult de 100 + tipuri de tesut microarray de la
animale (şoarece, şobolan, rhesus, cynomolgus) şi uman (adult sau făt)
 10. Flexibilitate de a achiziţiona – Se pot cumpara 1 sau mai multe diapozitive H & E colorate sau
necolorate, la alegere nefiind obligatorie achiziţionarea de mănunchiuri inutile de lame HE sau
extra lame necolorate parafinate 
 11. Folosirea „bancilor de blocuri de parafina” in departamentele de patologie pentru o evalare
retrospectiva a noilor markeri tumorali pentru fiecare pacient
 12. Detaliind cu cat noile metode vor fi aplicate in practica clinica zilnica mai repede cu atat factorii
de prognostic si tatament vor fi mai relevanti.
 13. Este doar o chestiune de timp in ceea ce priveste rolul TMAs.Majoritatea ramurilor de cercetare
in cancer sunt focalizate pe tehnicile de TMA.
 Tissue microarrays
(in biologie moleculara)

 ADN-array-ul : aranjarea a sute de secvente

reprezentative de ADN - intr-un singur experiment - pe un
suport solid (lame de sticla sau material plastic).
 Metoda foloseste abilitatea ARNm de a hibridiza pana la
secvente ADN cunoscut.
 ARNm este extras din celule normale sau patologice si este
folosit pentru a genera fragmente de ADN complementar
(ADNc) numite probe.
 In final se pun in contact probele ADNc cu secventele ADN-
tinta, acestea legandu-se in cazul compatibilitatii. Cantitatea
de ADN legata este cuantificata apoi prin scanare laser.
 Selectia de gene candidate. Aceasta categorie reprezinta
principala aplicatie a „ADN – array” . Se compara profilul
genic al tesutului neoplazic cu tesut non-neoplazic al
aceluiasi organ, folosind teste statistice simple, pentru a
identifica genele care predomina sau sunt exclusiv exprimate
in respectiva neoplazie.
 Predictia claselor de gene - reprezinta o abordare diferita si
anume a descoperii de patterne complexe ale unor expresii
genice in patologii cunoscute.
 Identificarea claselor de gene- reprezinta descoperirea de
patterne complexe ale unor expresii genice in patologii ce nu
erau cunoscute.
ADN-array poate fi util deasemenea in diferentierea variatelor
subtipuri tumorale cu prognostice si metode terapeutice
diferite.
 IMUNOHISTOCHIMIA
 Imunohistochimia reprezintă o tehnică de
identificare a antigenelor celulare şi tisulare, în
urma unei interacţiuni antigen-anticorp; situsul de
legare a anticorpului se identifică fie prin metode
directe de colorare a anticorpului, fie prin metode
indirecte.
 ANTIGENELE

 Sunt substanţe exo sau endogene capabile să

declanşeze un răspuns autoimun, prezintă unul sau
mai multe situsuri de legare a anticorpilor. În cazul
imunocolorării se recomandă utilizarea anticorpilor
de mare afinitate, deoarece aceştia vor fi rezistenţi
la procedurile de spălare din timpul reacţiei şi nu vor
disocia în soluţiile saline utilizate.
 Grupele de antigene
 antigenele mezenchimale (vimentina);
 antigene epiteliale (citokeratinele, antigenul de membrană epitelial-EMA,
desmoplakina);
 antigene musculare (desmina, mioglobina, actina) ;
 antigene vasculare (antigenul asociat factorului VIII, CD34, CD31-PECAM);
 antigene neurale şi markeri neuroendocrini (proteina S100, enolaza neuronal
specifică – NSE, neurofilamentele – NF, proteina glicofibrilară acidă – GFAP,
proteina bazică a mielinei – PMB, TB-01, cromogranina şi sinaptofizina);
 antigene leucocitare (antigen leucocitar comun – CLA, CD45, RO – limfocite T
cu memorie, CD4- -limfocite T helper, CD8- limfocite T citotoxice, CD20 –
limfocite B, CD68 – macrofage, CD15 şi CD45 – celule Reed Sternberg etc);
 tipuri speciale de antigene (antigene tumorale histotipice, factori de proliferare,
antigene de membrană bazală, receptori hormonali etc.).
 ANTICORPII
 Anticorpii policlonali sunt produşi de celule diferite şi reacţionează cu
epitopi diferiţi ai aceluiaşi antigen sau cu antigene diferite; se obţin din
serul animalelor imunizate cu diferiţi antigeni sau determinanţi antigenici.
Anticorpii policlonali pot da o coloraţie mai mare decît cei monoclonali
deoarece ei pot reacţiona cu întregul spectru de antigene întâlnite la
animalul imunizat.
 Anticorpii monoclonali recunosc în mod specific un singur epitop al
unui antigen.
 Anticorpul policlonal are o sensibilitate mai mare, dar o specificitate mai
mică în identificarea antigenului comparativ cu cel monoclonal. Datorită
tehnicilor de amplificare utilizate, această diferenţă de sensibilitate
devine nesemnificativă, astfel încât se preferă (datorită specificităţii net
superioare) utilizarea anticorpilor monoclonali.
 Enzime, substraturi şi cromogeni
utilizaţi în reacţiile
imunohistochimice
 Din anul 1969 se folosesc sisteme enzimatice în locul fluoresceinei pentru
marcarea anticorpilor; singura dificultate este reprezentată de încercarea
de a lega una de alta două molecule mari, respectiv enzima şi
imunoglobulina, fără ca una din ele să-şi piardă proprietăţile. Această
tehnică, în care anticorpul marcat direct cu enzima se lega de substrat, a
fost prima utilizată în imunohistochimie şi poartă numele de tehnică directă.
 Ulterior s-a dezvoltat tehnica indirectă, în care enzima se leagă de
complexul antigen-anticorp prin intermediul celui de-al doilea anticorp,
antiimunoglobulină.
 Această a doua tehnică permite amplificarea semnalului deoarece se pot
utiliza mai mulţi anticorpi secundari marcaţi enzimatic, care să se lege de
un singur anticorp primar; creşte astfel sensibilitatea metodei, ceea ce
permite chiar utilizarea de diluţii din anticorpii primari.
 CROMOGENII
 AEC (3-Amino-9Ethylcarbazole) reprezinta un cromogen
foarte utilizat pentru coloratii imunohistochimice; acest
reagent producand o colorare clara, uniforma si foarte
intensa eliminand totodata rezidurile nedorite.
 DAB (3,3' Diaminobenzidine) reprezinta un cromogen foarte
utilizat pentru coloratii imunohistochimice; fiind compus din
doua componente: DAB cromogen si DAB substrat,
acestea prezentand toxicitate crescuta fiind ideal pentru
masinile automate de colorat.
VEGF(vascular endothelial growth factor) –
pozitiv in celule tumorale din carcinom
hepatocelular; magnificatie X100,
cromogen folosit AEC
CEA - pozitiv in celule tumorale, X100,
cromogen folosit DAB