Biologie Celulara si Histologie

Curs 5 – Tehnici de biologie moleculara

si inginerie genetica

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cuprins

⇨ The Human Genome project

⇨ Tehnici de genetica moleculara
 Secventierea acizilor nucleici
 PCR
 Clonarea unor gene
 Vectori
 Transfectii
 Animale transgenice; linii knock-out
⇨ Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 The human genome project

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 The human genome project

⇨ Proiect desfasurat pe durata a 13 ani: 1990 – 2003

⇨ Initiat de U.S. Dept. of Energy + National Institute of Health

 Partener major: Wellcome Trust (UK)
 Alte contributii: Japonia, Franta, Germania, China etc

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 The Human Genome Project
Obiective

⇨ Identificarea tuturor genelor din ADN-ul uman (in total 20-

25000)
⇨ Determinarea intregii secvente de nucleotide din ADN-ul
uman (aprox. 3 miliarde)
⇨ Crearea unor baze de date cu aceste informatii
⇨ Perfectionarea de instrumente pentru analiza and
⇨ Transferul tehnologiilor catre sectorul privat
⇨ Identificarea problemelor legale si etice care pot aparea
si propunerea de solutii

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Continutul informational al genomului uman

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Probleme speciale legate de identificarea si localizarea
genelor

⇨ Centromerii – contin secvente cu grad inalt de repetitivitate,

dificil de mapat cu tehnicile actuale
⇨ Telomerele – contin la randul lor secvente repetitive, de multe
ori sunt incomplete / se pierd partial la replicarea ADN-ului
⇨ Existenta multigenelor – locusuri cromozomiale care contin
gene multiple, corelate functional si intricate, dificil de identificat
individual

⇨ Aprox. 93% din ADN a fost efectiv cartografiat in prezent;

studiul telomerelor si centromerilor ramane limitat de tehnologia
actuala

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomul 1

⇨ Cel mai mare dintre

cromozomii umani; contine
aprox. 8% din informatia
genetica
⇨ Boli genetice:
▶ Parkinson
▶ Alzheimer
▶ Charcot-Marie Tooth
(neuropatie ereditara)
⇨ In cancer apar frecvent
modificari ale regiunilor sale
terminale

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomii 2 si 4

⇨ Au cea mai mica rata de recombinare

dintre cromozomii umani

⇨ Cromozomul 2 – unic prin provenienta

(fuziunea a 2 cromozomi ancestrali)

⇨ Cromozomul 4:
▶ Boala Huntington
▶ Boala polichistica

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomii 3, 5, 6
⇨ Cromozomul 3
▶ Cea mai scazuta rata de duplicare segmentala
▶ Zone implicate in diferite cancere

⇨ Cromozomul 5
▶ Redundanta informationala mare, continut genetic
scazut
▶ Implicat in atrofia musculara spinala

⇨ Cromozomul 6
▶ Contine cea mai mare secventa de codificare a ARN-t
(activitate transcriptionala)
▶ Gene implicate in cancer, schizofrenie, autoimunitate

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomii 7, 8, 9
⇨ Cromozomul 7
▶ Gena CFTR - implicata in fibroza chistica

⇨ Cromozomul 8
▶ Contine o gena implicata in cresterea dimensiunii
creierului la primatele mari

⇨ Cromozomul 9
▶ Gene implicate in transsexualitate spontana (reversie
de sex mascul → femela)
▶ Gene tumorale: leucemii, melanoame familiale etc

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomii 10, 11, 12, 13
⇨ Cromozomul 10 ⇨ Cromozomul 11
▶ Tumori, boli ▶ Unul dintre cei mai
neurologice bogati in gene
▶ Numarul cel mai
mare de gene ptr
receptori olfactivi

⇨ Cromozomul 12 ⇨ Cromozomul 13
▶ Leucemii, limfoame, ▶ Contine gena
alte cancere cancerului de san
(de tip II)
▶ 2 gene asociate
diabetului ▶ Contine gena
asociata
▶ Gene implicate in
retinoblastomului
tulburari psihiatrice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomii 14, 15, 16, 17
⇨ Cromozomul 14 ⇨ Cromozomul 15
▶ Gene pentru ARNr ▶ Unul din cromozomii
in bratul scurt cu rata mare de
duplicare
segmentala

⇨ Cromozomul 16 ⇨ Cromozomul 17
▶ Duplicare ▶ Cea mai mare
segmentala mare diferenta de
structura dintre un
▶ Gene implicate in
cromozom uman si
boala polichistica
cromozomi similari
renala, leucemii
mamalieni
acute

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomii 18, 19, 20, 21
⇨ Cromozomul 18 ⇨ Cromozomul 19
▶ Translocarea 14-18 ▶ Gene implicate in
este una din cele hipercolesterolemia
mai comune cauze familiala si diabetul
genetice de cancer insulino-rezistent
la oameni

⇨ Cromozomul 20 ⇨ Cromozomul 21
▶ Contine gene ▶ Cel mai mic
prionice (boala cromozom
Creutzfeld-Jacob) ▶ O copie
▶ Implicat in diabetul suplimentara
zaharat de tip II, (trisomie) determina
obezitate, cataracta, sindromul Down
boala Graves

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomii 22, X, Y
⇨ Cromozomul 22
▶ Implicat in schizofrenie, alte boli psihiatrice

⇨ Cromozomul X
▶ Cromozomul sexual feminin

⇨ Cromozomul Y
▶ Cromozomul sexual masculin

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Exemplu – cromozomul 21

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/posters/chromosome/chooser.shtml

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Baze de date

⇨ NCBI Human Genome Sequencing Progress

▶ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/
⇨ University of California (Santa Cruz)
▶ http://genome.ucsc.edu/
⇨ Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute &
EMBL-European Bioinformatics Institute
▶ http://www.ensembl.org/
⇨ EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's
Nucleotide Sequence Database)
▶ http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Aplicatii, beneficii din urma HGP
⇨ Medicina moleculara:
 Diagnostic timpuriu al bolilor / predispozitiilor la o boala
 Design rational de medicamente
 Terapie genica
 Farmacogenomica

⇨ Aplicatii energetice si de ingineria mediului

 Aplicatii de genomica microbiana pentru a obtine biocombustibili,
sisteme de detectare a poluantilor, tehnici de purificare a mediului

⇨ Bioarheologie si antropologie
⇨ Medicina legala
⇨ Agricultura
 Genetically modified foods (GMF)
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Patentarea genelor, secventelor genetice
⇨ Se poate face atunci cand:
 Este identificata o noua secventa genetica
 Este specificat produsul (proteina) secventei genetice respective
 Este specificata functia produsului respectiv
 Este dezvoltata o metoda de valorificare a produsului genei, care
poate fi utilizata de specialisti din domeniu

⇨ Patentele sunt pe o perioada de 20 de ani

⇨ Patentarea prespune si punerea la dispozitie a intregii informatii
referitoare la produsul patentat
⇨ Informatii suplimentare (argumente pro/contra, situatia legala in
USA etc):
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/patents.shtml

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Tehnici de genetica moleculara

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Secventierea ADN
⇨ Reprezinta succesiunea de proceduri utilizate pentru identificarea
secventei de nucleotide intr-un lant de and
⇨ Metode de baza:
▶ Secventierea chimica (Maxam – Gilbert)
 Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea
lantului la nivelula cestor modificari
 Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADN-
proteine etc)

▶ Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)

 Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer (secventa de
ADN care serveste ca punct de plecare a polimerizarii), ADN-polimeraza si
nucleotide marcate radioactiv sau fluorescent
 Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate prin
electroforeza pe gel si autoradiografie / fotografie UV

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Alte metode de secventiere

Electroforeza capilara

Dye-termination method Clonare in vectori bacterieni

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Secventierea ADN
Metoda shotgun

⇨ Cromozomii sunt taiati in fragmente mai mici

⇨ Fiecare fragment este folosit ca matrita pentru crearea unor fragmente noi, care
difera de original printr-o singura baza (care urmeaza a fi identificata intr-o etapa
ulterioara)
⇨ Fragmentele dintr-un set sunt separate prin electroforeza pe gel
⇨ Markeri fluorescenti de generatie noua permit separarea fragmentelor din cadrul
aceleiasi benzi de migrare in gel
⇨ Se identifica ultima baza azotata din fiecare fragment – se recreaza astfel secventa
originala de A – T – C – G pentru fiecare fragment
⇨ Rezultatele sunt analizate de sisteme de secventiere automate, obtinandu-se o
cromatograma in 4 culori, cu varfuri corespunzatoare celor patru baze azotate
⇨ Dupa “citirea” bazelor, secventele scurte sunt reconstituite pe calculator si este
analizata structura lor din punctul de vedere al tipului de informatie genetica stocata.

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Exemplu (principiu de baza)

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 PCR = polymerase chain reaction
⇨ Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN
⇨ Necesita:
 Fragmentul de ADN-ul care se doreste a fi amplificat
 Primeri = secvente de nucleotide complementare celor doua capete ale
lantului de ADN
 ADN-polimeraza
 Nucleotide
 Buffer, ioni divalenti
⇨ Utilizare:
 Secventializarea ADN-ului (“citirea” informatiei genetice)
 Clonari
 Scopuri diagnostice
 Crearea de plasmide, vectori pentru utilizarea in ingineria genetica
 Scopuri criminalistice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 PCR

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Clonari de gene

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Clonari de gene
⇨ Clonare moleculara = izolarea unei anumite portiuni de ADN si
realizarea de copii multiple ale acesteia

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf
DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Vectori
⇨ Sunt molecule de ADN utilizate pentru transferarea de
material genetic strain intr-o celula

⇨ Tipuri de vectori:
 Plasmide
 Bacteriofagi, alte virusuri
 Cromozomi artificiali

⇨ Transferul de material genetic intr-o celula =

Transfectie

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Plasmide

⇨ Fragmente de ADN dublu

spiralat, de obicei circulare
⇨ Capabile de autoreplicare
⇨ Se pot integra sau nu in
genomul celulei gazda
⇨ Origine bacteriana / sinteza in
vitro
⇨ Utilizare in transfectii, terapie
genica

Wikimedia Commons

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120082/bio35.swf

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Vectori virali
⇨ Bacteriofagi – virusuri care infecteaza bacterii
⇨ Retrovirusuri – se integreaza in genom, se replica o data cu
celula gazda
⇨ Lentivirusuri (subclasa a Retrovirusurilor)
⇨ Adenovirusuri – nu se integreaza in genom, nu se replica o
data cu celula gazda (utilizare limitata; genereaza un raspuns
imun puternic → utilizare in crearea de vaccinuri)

CONDITII DE UTILIZARE:

● Nepatogene pentru oameni / manipulate genetic pentru a nu fi patogene

● Toxicitate redusa pentru celulele pe care le infecteaza

● Stabilitate – sa nu prezinte mutatii frecvente

● Specificitate pentru o anumita linie celulara

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Vectori virali
Bacteriofag

Vector lentiviral

Wikimedia Commons

Wikimedia Commons

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Cromozomi artificiali

⇨ Cromozomi de drojdie (YAC – yeast artificial

chromosome)
⇨ Cromozomi bacterieni (BAC)
⇨ Cromozomi umani (HAC) – functioneaza ca un
cromozom suplimentar (47), sunt multiplicati la
diviziunea celulara; pot fi utilizati pentru introducerea
in celula de gene noi

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Transfectii

⇨ Reprezinta transferul intr-o celula de material genetic strain, cu

ajutorul unui vector
⇨ Metode:
✗ Utilizarea unor plasmide + a unei modalitati de destabilizare temporara a
membranei celulare, pentru a permite intrarea ADN-ului plasmidic in celula
➔ Metoda fosfatului de calciu (istorica; functioneaza!)
➔ Utilizare de lipozomi in care este inclus plasmidul, si care fuzioneaza cu membranele
celulare
➔ Utilizare de polimeri cationici de care se ataseaza ADN-ul, care ulterior sunt introdusi in
celule prin endocitoza
➔ Electroporare, ultrasonoporare, magnetoporare, soc termic etc.
✗ Utilizarea de vectori virali:
➔ Transfer mai simplu; are loc infectia celulelor care vin in contact cu virusul modificat
genetic, infectie care se propaga rapid in toata cultura de celule

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Animale transgenice

⇨ Crearea, in scopuri de
cercetare, a unor linii de
animale de laborator (soareci,
sobolani etc), ce prezinta o
anumita mutatie a unei gene
⇨ Utilitate:
➔ Modele pentru anumite boli
➔ Studierea implicarii anumitor gene
in anumite lanturi de control, in
aparitia anumitor maladii Expert Reviews in Molecular Medicine, Vol. 5; 7 April 2003
Generation of YAC-transgenic mice
Kenneth R. Peterson

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Linii knock-out
⇨ Linii de organisme modificate genetic
(de obicei soareci), la care una sau
mai multe gene au fost blocate de la
expresie
⇨ Utilizate in studiul patogeniei unor boli

Wikimedia Commons Wikimedia Commons

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Aplicatii ale ingineriei genetice

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Aplicatii ale ingineriei genetice

⇨ Screening genetic
⇨ Vaccinuri
⇨ Sinteza de proteine in vitro (ex: insulina!)
⇨ Terapie genica
⇨ GMF/O

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Screening genetic

⇨ Analiza informatiei genetice din ADN-ul unei persoane

⇨ Aplicatii:
 Screening al purtatorilor (identificarea persoanelor care poseda o
gena din doua necesare transmiterii unei boli genetice)
 Diagnostic prenatal
 Teste in perioada presimptomatica la persoanele cu risc pentru boli
genetice (Coree Huntington, Alzheimer, cancer de san, etc)
 Medicina legala

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Terapie genica

⇨ Introducerea in genom a unei gene normale (clonata), care sa

inlocuiasca gena cu defect cauzatoare a unei boli genetice

⇨ Cum se introduce gena?

 Vectori:
 Retrovirusuri
 Adenovirusuri
 Virusuri herpes simplex

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Terapia genica

⇨ Probleme actuale de rezolvat:

 Durata scurta a efectului – in prezent, integrarea genei in genom
este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie
 Controlul raspunsului imun – declansat de prima sedinta de terapie,
accentuat la repetarea sedintei
 Probleme speciale legate de vectorii virali – efecte adverse nedorite
(raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun,
posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul
gazdei)
 Bolile multigenice – dificultati in identificarea tuturor genelor
implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea
tuturor regiunilor de genom implicate

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Terapia genica
⇨ Rezultate semnificative in prezent:
▶ 2008: UCL Institute of Ophthalmology and Moorfields Eye Hospital NIHR Biomedical
Research Centre – ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de
cecitate
▶ 2007: University of Texas M. D. Anderson Cancer Center and the University of Texas
Southwestern Medical Center - un studiu pe soareci, cu o combinatie de terapie genica +
tehnici nanotehnologice de introducere a genelor au indus scaderea semnificativa a
volumului unor tumori pulmonare
▶ 2006: National Cancer Institute (NCI) – au obtinut limfocite modificate genetic care ataca
cu succes celule tumorale de melanom malign
▶ 2006: tratarea cu succes prin terapie genica a unor pacienti suferind de sindroame
mieloide
▶ 2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin
introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare
▶ Alte rezultate promitatoare – deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator
sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei
chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara
 Farmacogenomica
⇨ Studiul felului in care bagajul genetic al unui individ afecteaza
raspunsul organismului la medicamente

http://www.freewebs.com/pharmacogenomics/impactonyou.htm

⇨ Informatii suplimentare: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html

DBB – Masterat Inginerie Medicala si Clinica Biologie Celulara si Histologie – 5. Biologie moleculara