Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
MARIA PRISECARU
IONUȚ STOICA
DUMITRA RĂDUCANU
BIOLOGIE CELULARĂ
Metode de laborator
Prof.univ.dr. Costică Misăilă
Ing. CP I dr. Maria Călin
COPRTA executată de Biolog dr. Florian S. Prisecaru
Descrierea CIP a Bibliotecii Naționale a României
PRISECARU, MARIA
Biologie celulară : metode de laborator / Maria Prisecaru, Ionuț Stoica,
Dumitra Răducanu ; referenți: prof. univ. dr. Misăilă Costică ‐ Universitatea "Al. I.
Cuza", Iaşi, CP I dr. ing. Călin Maria ‐ Stațiunea de Cercetare‐Dezvoltare Legumicolă
Bacău. ‐ Bacău : Alma Mater\\Bacău\, 2014
Bibliogr.
ISBN 978‐606‐527‐351‐1
I. Stoica, Ionuţ
II. Răducanu, Dumitru
III. Misăilă, Costică
IV. Călin, Maria
576.3(075.8)
Tipar executat la:
UNIVERSITATEA „Vasile Alexandri” din BACĂU
Calea Mărăşeşti, nr. 157, 600115
Tel.++40‐234‐542411
Tel/fax ++40‐234‐516345
E‐mail: www.ub.ro; stiinte@ub.ro
CUPRINS
INTRODUCERE 7
5
5.1.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi 222
biologie
5.2. Sonde genetice 223
5.3. Clonarea ADN – ului 232
5.4. Reacţia de polimerizare în lanţ (pcr) 235
5.5. Secvenţierea ADN- ului 240
5.6. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 242
BIBLIOGRAFIE 245
6
INTRODUCERE
8
Capitolul 1
9
sedimentează în straturi succesive, în funcţie de densitatea lor, permiţând
astfel separarea şi studierea lor. Când pentru separarea constituenţilor
celularei se utilizează viteze de rotaţie mai mici de 25000 de rotaţii/minut,
se execută o centrifugare. Atât în cazul centrifugării cât şi ultracentrifugării
se obţine un produs numit sediment, care se depune, iar în partea superioară
rămâne un supernatant, ambii produşi putând fi analizaţi.
CENTRIFUGAREA reprezintă un procedeu fizic de separare şi
sedimentare a unor fracţii celulare şi a unor macromolecule.
Diferitele particule celulare se separă prin centrifugare în funcţie de
mărime şi densitate. Asupra particulei aflate în câmpul de centrifugare
acţionează forţa centrifugală, fracţionată şi de plutire (fig. 1). Forţa
centrifugală depinde de: mărimea radiusului particulei, vâscozitatea
mediului de suspendare şi densitate.
A B
10
În linii mari, ultracentrifugarea diferenţială decurge astfel: ţesutul de
studiat, imediat după prelevare, este mărunt sfărâmat, cu ajutorul aparatelor
speciale (omogenizator Potter, etc.), într-o soluţie hipertonică de zaharoză şi
la temperatura de 0 - 40 C.
Omogenatul astfel obţinut este supus centrifugării la viteze din ce în
ce mai mari, culegându-se de fiecare dată sedimentul şi ultracentrifugând
mai departe supernatantul, realizând astfel centrifugări fracţionate ale
supernatantului.
Prin ultracentrifugarea diferenţială a ţesuturilor vegetale, în aceste
condiţii se depun în primul rând compuşii cu greutatea moleculară cea mai
mare (pigmenţii, cristalele, granulele de amidon), apoi membranele şi
nucleul; prin centrifugarea în continuare a supernatantului se sedimentează
cloroplastele; în supernatantul obţinut după recentrifugare se depun
mitocondriile, apoi microzomii (ribozomi + fragmente de reticul
endoplasmatic), iar în supernatantul final se vor găsi compuşii solubili (fig.
1, B).
Deoarece, atât omogenizarea, cât şi ultracentrifugarea se efectuează
la temperaturi joase, analiza biochimică permite să se pună în evidenţă, în
sedimentele succesive precum şi în supernatantul final, atât enzimele,
activitatea lor, cât şi ceilalţi constituenţi chimici citoplasmatici.
În fig. 2 este prezentată o ultracentrifugă performantă.
11
ultracentrifugare într-o anumită bandă a gradientului, adică în zona în care
moleculele din soluţia folosită corespunde densităţii de plutire a substanţei
cercetate (Zarnea, 1970).
Melson şi Stahl (1958) au folosit acest procedeu pentru demonstrarea
caracterului semiconservativ al replicării ADN-ului.
13
• reacţii de precipitare: complexele imune formează precipitat;
• reacţii de aglutinare: complexele imune formează aglutinat;
• RFC – se detectează consumarea complementului (acesta se
leagă de complexele imune);
• reacţii în care elementul cunoscut este marcat – se detectează
elementul marcat din complexul imun format.
1. Reacţii de precipitare. Pot avea loc în medii lichide (metode
folosite în bacteriologie) sau în medii solide.
Antigenele: de natură coloidală (solubile), precipitinogene.
Anticorpii: precipitine.
Complexul imun: precipitat.
2. Reacţii de aglutinare
Antigenele: de natură corpusculară, aglutinogene.
Anticorpii: aglutinine.
Antigenele corespund cu anticorpii şi sunt prezente în cantităţi
echivalente: se formează aglutinatul (reţea tridimensională de complexe
imune), vizibil cu ochiul liber sub forma de grunji.
Reacţia de hemaglutinare, hemaglutino-inhibare (RHA-HAI) se
foloseşte pentru detectarea virusurilor care prezintă pe suprafaţă
hemaglutinine (HA).
Exemplu, metoda Hirst:
- detectarea anticorpilor antihemaglutinină din serul bolnavilor de
gripă convalescenţi.
3. Metode care folosesc un reactant imunologic marcat
Reacţia de imunofluorescenţă (RIF).
Fluorocromii se leagă covalent de proteine (imunoglobuline) =
conjugat; emit fluorescenţă dacă se expun la raze UV. Preparatul se
examinează la microscopul cu fluorescenţă. Puncte fluorescente pe fond
întunecat confirmă rezultat pozitiv.
Metode imunoenzimatice (RIE, ELISA - enzyme-linked
immunosorbent assay)
Permit detectarea antigenelor libere şi a anticorpilor. Este posibilă
determinare cantitativă. Reacţiile au loc în aparate automate, semiautomate.
La reacţii participă:
- un reactant imunologic cunoscut ataşat de un suport solid (plăci cu
godeuri, lame, baghete);
- se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A;
- un reactant imunologic marcat enzimatic – peroxidaza;
- substrat specific (cromogenic) - se produce o modificare de culoare
detectabilă spectrofotometric (determinare cantitativă);
14
- substanţe pentru stoparea reacţiei (baze sau acizi puternici).
Reacţiile citochimice sunt utilizate în localizarea şi chiar
determinarea activităţii a numeroase enzime, care nu-şi pierd activitatea
biologică în timpul fixării ţesuturilor, fie prin congelare, fie cu fixatori
specifici, luând astfel naştere citochimia enzimologică (ex. localizarea
fosfatazelor acidă şi alcalină, evidenţierea peroxidazelor, etc.).
17
identificarea unor compuşi şi chiar izolarea lor dintr-un amestec în stare
pură. În gaz-cromatografie, faza mobilă este un gaz, în mod uzual unul inert,
cum este heliu, sau un gaz nereactiv, cum este azotul. Faza staţionară este
un lichid sau un polimer solid inert, inclusă într-o piesă tubulară de sticlă
sau metal numită columnă. Instrumentul utilizat pentru gaz-cromatografie se
numeşte gaz cromatograf, aerograf sau separator de gaz (fig.5).
Gaz cromatografia este, de asemenea, cunoscută drept vapor-phase
chromatography (VPC) sau gas–liquid partition chromatography (GLPC).
18
Fig. 6. Aparat de electroforeză orizontală
1.4. Autohistoradiografia
1.5. Electronomicroscopia
19
structural – funcţional al biomoleculelor (fig. 7). În afară de înalta putere de
rezoluţie a microscopului electronic şi a contribuţiei celorlalte procedee de
investigaţie biologică asociate, o importanţă deosebită prezintă fixatorii
utilizaţi. Tetraoxidul de osmiu şi permanganatul de potasiu (fixatori
metalici) s-au dovedit a fi cei mai buni fixatori pentru studiul
biomoleculelor, iar aldehidele (glutaraldehida, aldehida formică,
paraformaldehida şi acroleina) pentru cercetarea cromatinei şi punerii în
evidenţă a structurilor fibrilare ale citoplasmei; utilizarea ca fixatori a
carbodiamidei solubilă în apă, urmată de o postfixare osmică, poate asigura
conservarea a numeroase enzime.
21
condiţii sterile, utilizând hota cu flux laminar (fig. 8) şi cameră de creştere
(fig. 9) cu parametrii controlabili (lumină, temperatură, umiditate, etc.).
Metodele de micropropagare (clonare) prin culturi de ţesuturi sunt
de un million de ori mai rapide decât cele tradiţionale. Clonarea in vitro
facilitează deci, înmulţirea în ritm intensiv a explantelor valoroase obţinute
de către amelioratori. Plantele neoformate in vitro deţin toate calităţile
plantei donatoare.
Metodele de multiplicare şi propagare in vitro sunt practicabile la
orice specie vegetală. În horticultură şi silvicultură aceste procedee au
cunoscut o extindere mai mare, întrucât materialul de plantat – săditor –
rezultat prezintă calităţi superioare, în raport cu acela obţinut prin
metodologiile clasice de înmulţire vegetativă.
Plantele generate in vitro sunt juvenilizate (întinerite), lipsite de boli
şi mai viguroase, prezentând calităţi de excepţie, imposibil de păstrat prin
înmulţirea sexuată. Pe de altă parte, tehnicile de cultivare pe medii aseptice
a unor explante vegetale permit şi multiplicarea speciilor care fie nu au
seminţe viabile, fie nu se înmulţesc natural, pe cale vegetativă, sau le lipsesc
polenizatorii, în cazul importului de specii din alte zone ale lumii. Toate
acestea conduc la ridicarea producţiei vegetale şi a calităţii produselor.
Un procedeu care se dovedeşte de un real folos în studiul celulei
vegetale este obţinerea protoplastului. Acest procedeu se bazează pe
degradarea enzimatică a membranei pectocelulozice, fără afectarea
conţinutului celular situat în interiorul acestei membrane, adică protoplastul.
Folosirea protoplaştilor ca material de cercetare a permis în ultimii
ani rezolvarea unora dintre cele mai importante probleme pentru biologia
celulei vegetale, deoarece absenţa peretelui celular pectocelulozic dă
posibilitatea să se utilizeze metode extrem de blânde şi indispensabile pentru
a izola nu numai nucleele intacte, dar şi alte organite celulare. Datorită
folosirii lor au fost obţinute date precise privind proprietăţile fizico-chimice
ale plasmalemei, procesele de pinocitoză, neoformarea peretelui celular şi
biosinteza produşilor chimici care intră în constituţia lui, relaţiile nucleo-
plasmatice, pătrunderea virusurilor, mecanismele hibridării somatice, etc.
Paralel cu punerea la punct a tehnicilor enzimatice de izolat
protoplaştii din diverse organe vegetale au fost elaborate şi o serie de
procedee de cultivare a lor, unele folosind medii lichide, altele medii solide.
Prin aceste tehnici s-a putut stabili că protoplaştii izolaţi posedă trei
caracteristici cu implicaţii teoretice şi practice deosebite:
- totipotenţa, fiind capabili să regenereze plante complete, cu
structuri morfologice normale;
22
- proprietăţi pinotice şi fagocitice, ceea ce fac din ei un excelent
material pentru cercetările de inginerie genetică în scopul
inducerii transformărilor celulare;
- capacitatea de fuziune, care permite obţinerea de hibrizi somatici
parasexuali sau celulari, realizându-se astfel recombinarea
genomurilor unor specii sexual incompatibile.
O importanţă deosebită au biotehnologiile moderne pentru
manipularea genomului celulei vegetale şi animale în vederea creării de
soiuri de plante şi rase de animale pe căi neconvenţionale, mult mai repede
şi mai eficient.
În ultimele două decenii şi jumătate transgeneza la organismele
vegetale şi animale a devenit o metodă tot mai larg folosită pentru transferul
unor gene utile şi obţinerea unor organisme cu rezistenţă sporită la condiţiile
de mediu, cu productivitate superioară, capabile să utilizeze medii
nespecifice, etc. Dacă prin metodele clasice de ameliorare puteau fi
transferate doar gene utile de la rude cultivate sau sălbatice, utilizarea
ingineriei genetice permite transferul oricărei gene la oricare organism viu.
23
Avantaje excepţionale pentru activitatea de creare a unor genotipuri
noi într-un timp mai scurt prezintă aplicarea metodei numită haploidie
experimentală. Haploidia este o stare specifică procariotelor şi mai puţin
întâlnită la eucariote. A fost observată mai frecvent la alge unicelulare,
ciuperci, muşchi. Uneori haploidia a fost depistată şi la unele animale (mai
ales la insecte), dar şi la plantele superioare (mai ales la angiosperme).
Organismele haploide au în celulele lor un număr înjumătăţit de
cromozomi (n), numărul specific gameţilor. Datorită faptului că organismele
haploide posedă un singur set de cromozomi, în fiecare poziţie a unei gene
din cromozom (locus) este prezentă doar o singură alelă. Acest organism
manifestă o stare specială, cea de hemizigoţie.
Această stare permite manifestarea fenotipică a tuturor genelor
prezente în cromozomi (nu există fenomenul de dominanţă şi recesivitate
între gene), existând o concordanţă deplină între genotip şi fenotip.
Frecvenţa haploizilor la plante în natură este foarte scăzută. Rieger
(1963) aprecia la cca. 0,025 – 0,037% la bumbac, cca. 0,018% la laur, cca.
0,05% la porumb, cca. 0025% la grâu, etc. Impactul practic deosebit al
haploizilor şi anume cel al obţinerii într-un timp incomparabil mai scurt al
liniilor izogene (pure din punct de vedere genetic) comparativ cu metoda
clasică de purificare a materialului biologic a determinat o activitate
susţinută pentru identificarea unor tehnici pentru inducerea haploidiei.
Desigur, o serie de tehnici utilizate la început n-au avut eficienţa
aşteptată. În ultimul timp, o atenţie deosebită se acordă obţinerii haploizilor
şi liniilor izogene cu ajutorul culturilor de ţesuturi in vitro, respectiv prin
androgeneză şi ginogeneză experimentală.
Metoda constă în cultura in vitro a anterelor sau microsporilor
uninuleaţi haploizi (androgeneză experimentală), sau a ovarelor sau ovulelor
nefecundate (ginogeneză experimentală). Plantele regenerate au un singur
set de cromozomi (patern prin androgeneză şi respectiv matern prin
ginogeneză).
Plantele haploide (cu ”n” cromozomi) au o talie mică şi sunt mai
puţin viguroase comparativ cu plantele originare diploide (”2n”
cromozomi). La haploizi se manifestă un grad înalt de sterilitate, cauzată de
anomaliile meiozei.
Prezenţa în celulele - mamă ale gameţilor a unui singur set de
cromozomi elimină procesul conjugării şi segregării. Ca urmare, în meioza
haploizilor cromozomii se repartizează neregulat spre cei doi poli,
producând nuclei anormali şi sterilitate totală sau aproape totală.
24
La plantele alogame efectele haploidiei sunt şi mai puternic
exprimate decât la cele autogame, starea haploidă permiţând manifestarea
unor mutaţii recesive cu efect dăunător asupra organismului.
Toate aceste inconveniente pot fi eliminate prin dublarea numărului
de cromozomi cu ajutorul tratamentului cu colchicină (0,01-0,1%) sau cu
alte substanţe antimitotice într-o concentraţie adecvată. De multe ori s-a
observat că dublarea numărului de cromozomi poate avea loc în mod
spontan, prin menţinerea plantulelor cu origine androgenetică sau
ginogenetică în cultura in vitro.
Prin dublarea somatică a cromozomilor hemizigoţi şi prin inducerea
embriogenezei rezultă plante dublu haploide, cu meioză normală,
producătoare de seminţe, cu genotip diploid, perfect homozigot. Haploizii
posedă două atribute de interes major pentru amelioratori:
• scurtează timpul necesar pentru obţinerea liniilor pure,
homozigote;
• reduc dificultatea identificării şi manipulării caracterelor dorite,
deoarece încă din primele faze ale selecţiei pot fi eliminaţi indivizii
necorespunzători, toate genele nefavorabile manifestându-se fenotipic.
Dezvoltarea tehnicilor de cultură a celulelor vegetale a făcut
posibilă, în ultima vreme, cultura celulelor în suspensie, similar
microorganismelor. Ea presupune, deci, cultivarea de mici agregate celulare
sau celule izolate (în culturi monocelulare), submersia materialului putând fi
efectuată în regim staţionar (caz care presupune subcultivări periodice
deoarece creşterea încetează când nutrienţii de bază s-au redus cantitativ sau
chiar s-au epuizat), fie cel mai adesea într-un regim de agitaţie continuă,
realizat cu ajutorul unor aparaturi adecvate. Aceste aparate automate poartă
diferite denumiri (agitatoare rotatorii sau vibratorii, chemostate, fitostate,
bioreactoare, fermentatoare, turbidostate, etc.) urmăresc realizarea unor
condiţii optime de mediu nutritiv, lumină, temperatură, pH, aerisire, etc.
Fermentatoarele sunt utilizate atât pentru cultura continuă, cât şi în cultura
de volum mediu limitat, stabilit iniţial. Chemostatele sunt utilizate pentru
cultura continuă, în timp ce fitostatele pentru reglarea culturii semicontinue,
aparate în care rata de creştere şi densitatea celulară sunt menţinute
constante prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi şi
hormonali. Turbidostatele sunt sisteme deschise de cultură continuă, în care
mediul proaspăt se adaugă în momentul creşterii turbidităţii culturii şi a
eliberării prin spălare şi eliminarea excesului de celule. Rata eliminării
celulare este echilibrată prin formarea de noi celule în vasul de cultură.
Sistemul poate fi de tip continuu închis, caz în care se produce o
reîmprospătare a mediului, dar fără eliberarea de celule, biomasa rămânând
25
să se acumuleze continuu în sistem (acestea sunt limitate în timp).
Suspensiile celulare se pot iniţia fie direct din ţesuturi vegetale inoculate în
mediu lichid, fie din fragmente de calus sau din cultură de protoplaşti.
Agitarea continuă a mediului de cultură lichid facilitează fragmentarea
ţesuturilor şi formarea de mici agregate celulare, fapt ce asigură un bun
contact al celulelor cu componentele mediului de cultură şi în acelaşi timp, o
intensificare a schimbului de gaze. Pentru realizarea unei culturi celulare în
suspensie, eficientă din punct de vedere economic, este necesară cultivarea
unui material biologic de mare productivitate şi stabil genetic. În timpul
perioadei de cultură, procesul de diviziune mitotică începe la o zi-două de la
iniţiere şi se intensifică la maximum la 7 zile, după care frecvenţa mitozelor
scade progresiv, încetând definitiv la sfârşitul celei de-a treia săptămâni de
cultură. Această fază a suspensiei este saturată. Dacă aceasta este diluată
prin subcultură la conţinutul celular iniţial, se repetă acelaşi ciclu de
creştere.
27
diosgenine - producţia este de 26 mg/g masă uscată de celule
în cultura de Dioscorea deltoidea şi de 20 mg/g tuberculi
masă uscată;
saponine de ginseng - producţia este de 0,38% masă
proaspătă de celule în cultura de Panax ginseng şi de 0,3-
3,3% plante masă proaspătă.
Majoritatea tipurilor de celule animale pot supravieţui în condiţii
corespunzătoare într-un vas de cultură in vitro. Prin cultura de celule
animale se obţine o multiplicare a celulelor provenite dintr-un ţesut sau
organ.
Ross Granville Harrison (1907) este primul cercetător care a propus
o tematică de studiu în acest domeniu, fiind considerat părintele şi
fondatorul unei noi ştiinţe, cea a culturii de celule animale. El este cel care a
propus tehnica de cultură în picătură în suspensie (fig.10).
În cultura experimentală se poate studia comportamentul celulelor în
condiţii controlate, strict definite; este posibil să se determine efectele
asupra comportamentului celular prin adăugarea în mediul de cultură a unor
molecule specifice – hormoni sau factori de creştere - şi să se obţină
populaţii celulare omogene care pot fi utilizate în analize biochimice sau
pentru studiul interacţiunilor între un tip celular sau altul.
Observaţiile se verifică în comparaţie cu comportamentul celular in
vivo (mediu natural).
29
Capitolul 2
31
Platina este un dispozitiv pe care se fixează preparatul de examinat. Are
o formă rotundă sau pătrată şi este dispusă perpendicular pe axa optică a
microscopului; în centru are o deschidere rotundă sau dreptunghiulară prin
care trec razele de lumină spre preparatul de examinat. Cu ajutorul a două
vize laterale, platina se poate deplasa în plan orizontal în vederea examinării
preparatului pe toată suprafaţa sa. Pe faţa ei superioară se găsesc două
dispozitive de fixare a portobiectului (valeţi) şi o riglă gradată destinată
reperării unor teritorii de pe suprafaţa preparatului (fig. 12 şi 13).
Tubul are montat la extremităţi sistemul obiectiv – ocular (în partea
inferioară sistemul obiectiv, iar în partea superioară sistemul ocular). Cu
ajutorul a două şuruburi numite vize, tubul se deplasează în sus sau în jos,
mişcări necesare pentru obţinerea unei imagini clare.
Revolverul este dispozitivul pe care se montează elementele sistemului
obiectiv (la microscopul ML4 sunt montate cinci obiective de puteri
măritoare crescânde care pot fi aduse în axa optică a microscopului). Este
format din două discuri: unul mobil pe care se fixează cele cinci obiective
cu puteri măritoare crescânde şi altul fix care se ataşează la extremitatea
inferioară a tubului; acesta din urmă este prevăzut cu un dispozitiv de
stopare care blochează fiecare obiectiv în parte când axa acestuia coincide
cu axa optica a microscopului.
Dispozitivul de punere la punct este necesar pentru obţinerea de imagini
clare şi se realizează prin deplasarea sistemului obiectiv – ocular în sus sau
în jos. Această mişcare se face cu ajutorul a două şuruburi numite vize: viza
macrometrică pentru deplasări grosiere şi rapide şi viza micrometrică pentru
deplasări reduse şi lente, folosită pentru punerea la punct a imaginii.
32
Fig. 12. Microscopul fotonic obişnuit:
1 - talpa microscopului; 2 - coloana; 3 - platina; 4 - dispozitivul
de mişcare a platinei; 5 - idem; 6 - sursa de lumină;
7 - condensatorul; 8 – macro- şi microviza; 9 - tubul microscopului;
10 - revolverul; 11 - obiective; 12 - ocularul
33
obiectivului şi se realizează cu ajutorul unui diafragm iris manipulat cu o
pârghie.
Tehnica de lucru
- se stabileşte legătura între becul microscopului şi transformator care se
conectează apoi la reţeaua de 220V;
- prin rotirea revolverului se aduce în axul optic al microscopului obiectivul
de 10.X;
- privind prin oculare, se coboară condensatorul până când se obţine o
lumină uniformă şi de intensitate mare;
- se aşează lama portobiect cu lamela în sus pe faţa superioară a platinei,
fixând-o cu ajutorul valeţilor;
34
- privind lateral, cu ajutorul vizei macrometrice se coboară tubul până la o
distanţă mai mică decât distanţa focală a obiectivului (pentru obiectivul
10.X distanţa focală este de 16mm);
- se fixează distanţa interpupilară a examinatorului prin apropierea sau
îndepărtarea laterală a celor două tuburi oculare;
- privind prin ocular, se ridică încet tubul cu ajutorul vizei macrometrice
până când apare o imagine în câmpul microscopului; dacă nu apare nici o
imagine înseamnă că: obiectivul nu se află în axul optic, preparatul nu se
află în câmpul microscopului sau am ridicat prea repede sistemul optic. Prin
mişcarea vizei micrometrice în ambele sensuri se obţine o imagine clară şi
luminoasă a preparatului.
35
câmpului deoarece preparatul nu are o grosime uniformă; cu ajutorul celor
două vize montate pe partea laterală a platinei se va mişca lama cu
preparatul în vederea examinării lui în totalitate; se roteşte revolverul
aducând pe rând în axul optic al microscopului obiectivele 20X, 40X şi
imersie, ridicând condensorul pentru a obţine o iluminare puternică.
37
1. Fluorescenţă primară, naturală sau autofluorescenţă produsă de
substanţe care se găsesc în mod natural în celule sau ţesuturi (lipofuscina,
cromolipidele, fenilalanina, tirozina, adrenalina, noradrenalina, etc.);
2. Fluorescenţă secundară sau provocată indusă prin tratarea secţiunilor de
ţesut cu fluorocromi (ex: acridin – orange); prin această metodă se pot
detecta acizii nucleici, fibre de colagen, reticulină şi elastice, mucinele, etc.
Microscopia în lumina fluorescentă foloseşte un microscop obişnuit
cu următoarele particularităţi:
• sursa de lumină este o lampă cu vapori de mercur (H.B.O. – 200W,
3,3 – 3,9 A) care emite radiaţii UV;
• filtre de lumină care opresc radiaţiile vizibile şi calorice; se folosesc
două tipuri de filtre:
- filtre de excitaţie care au rolul de a opri toate radiaţiile în
afara celor UV; se montează în talpa microscopului, între
oglindă şi condensor;
- filtre de protecţie care protejează retina şi se montează între
obiectiv şi ocular.
• condensatorii utilizaţi în microscopia de fluorescenţă sunt de trei
feluri: condensator UV cu apertură numerică 1.20, pentru câmp
întunecat şi cu oglindă, care se montează în locul condensatorului
obişnuit.
Tehnica de lucru
- după montarea dispozitivelor menţionate, se porneşte lampa H.B.O. şi se
aşează pe platina microscopului preparatul de examinat aplicat pe o lamă
portobiect nefluorescentă;
- pentru găsirea câmpului şi punerea la punct a imaginii se procedează la fel
ca în capitolul 2.1.1.;
- după examinare se întrerupe alimentarea de la reţea a lămpii H.B.O.
Aplicaţii practice
Microscopia în lumina fluorescentă reprezintă o metodă cu o largă
aplicabilitate în biologia celulară.
Cu ajutorul fluorescenţei primare pot fi identificaţi:
38
• pigmenţii: portfirinele (fluorescenţa roşie), lipocromii sau pigmenţii
carotenoizi (fluorescenţa verde), cromolipidele (fluorescenţa galben
- verde), lipofuscina (fluorescenţa roşu - brun);
• acizii aminaţi: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescenţa
albastră);
• unele virusuri şi bacilul Koch emit o fluorescenţă verde strălucitor;
• dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se
deosebeşte de cel artificial;
• aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescenţă
verde).
Cu ajutorul fluorocromării cu acridin orange se pot identifica:
• acizii nucleici ARN-ul - fluorescenţa roşie, ADN-ul - fluorescenţă
verde - galben;
• fibrele de colagen, elastice şi de reticulină - fluorescenţa verde;
• nucleii leucocitelor au o fluorescenţă verde iar citoplasma lor şi
eritrocitele rămân opace;
• muricinele - fluorescenţa verde.
Frecvent, coloraţia cu acridin orange se mai utilizează în
citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul acizilor nucleici în condiţiile
unui proces tumoral).
Cea mai importantă aplicaţie este imunofluorescenţa care se bazează
pe cuplarea unui acid cu un fluorocrom; prin fluorescenţa indusă poate fi
identificată localizarea antigenelor în celule.
Microscopia prin fluorescenţă se deosebeşte de microscopia cu raze
ultraviolete al cărui principiu de funcţionare se bazează pe absorbţia luminii
ultraviolete de moleculele preparatului.
Microscopia în ultraviolet este asemănătoare spectrofotometriei, dar
rezultatele sunt înregistrate fotografic. Razele ultraviolete trec prin lentile
speciale şi prin secţiunea preparatului de examinat dând, datorită unui fond
diferit de absorbţie, o imagine invizibilă pentru ochi dar care este
înregistrată pe placa fotografică. Metoda este utilizată pentru detectarea
acizilor nucleici, a bazelor purinice şi pirimidice ale nucleotidelor ca şi la
detectarea proteinelor ce conţin anumiţi aminoacizi.
Grupările -CH, -OCH3, -CH3, -CN, măresc intensitatea fluorescenţei,
altele ca -CO, -COO, -NO2 o slăbesc, ceea ce reduce gama preparatelor care
pot fi vizualizate printr-o astfel de tehnică. Prin metodele de preparare a
secţiunilor se pot elimina astfel de inconveniente, lărgind astfel posibilitatea
de utilizare a microscopiei prin fluorescenţă.
39
2.1.3. Microscopia în contrast de fază
Tehnica de lucru
- se montează condensatorul de contrast de fază în locul
condensatorului obişnuit;
- în locul obiectivelor microscopului propriu-zis, se înşurubează
obiectivele de contrast de fază;
- într-unul din tuburile oculare se introduce microscopul ocular;
- se aduce în axa optică a microscopului obiectivul 10x sau de puterea
de mărire cu care dorim să examinăm; prin rotirea inelului condensorului
facem să coincidă cifra de pe aceasta, care corespunde aperturii lui, cu
apertura obiectivului folosit;
- privind prin pupila de ieşire a ocularului, se reglează microscopul
ocular (apropierea sau îndepărtarea lentilelor care compun ocularul) până în
momentul când în câmpul vizual apar clar conturate două inele (a
diafragmei condensatorului şi a inelului de fază);
- cu ajutorul a două cheiţe se acţionează asupra şuruburilor de reglare
ale condensatorului până în momentul suprapunerii inelului din diafragma
condensorului peste inelul din obiectiv – reglajul se face pentru fiecare
obiectiv în parte;
- se înlocuieşte microscopul ocular cu ocularul propriu-zis;
- se recoltează fragmente din ficat de şobolan care se pun pe o placă
de sticlă; cu o lamă portobiect se fac amprente prin apăsarea ei pe
fragmentele de ficat peste care se pun 2-3 picături dintr-un mediu de cultură;
se acoperă cu o lamelă după care se aşează preparatul pe platina
microscopului;
40
- se pune la punct imaginea după tehnica descrisă la 2.1.1. şi se
examinează preparatul.
Aplicaţii practice
Microscopia în contrast de fază permite:
• studiul celulelor în stare vie (celulele nefixate şi necolorate);
41
• scoate în evidenţă unele detalii de structură care nu se pot observa la
microscopul fotonic obişnuit ca endocitoza, mişcarea cililor şi
flagelilor, diviziunea celulară, etc.;
• studiază reacţiile celulare la diferiţi agenţi fizici sau chimici;
• studiază benzile cromozomilor.
Din microscopia cu contrast de fază au derivat:
- microscopia cu interferenţă care permite aprecierea cantitativă a
masei unor componente tisulare;
- microscopia cu interferenţă diferenţială utilă pentru a evalua
proprietăţile suprafeţei celulare şi a altor structuri biologice.
Principiul unui microscop cu interferenţă este următorul: fasciculul
de lumină incident este divizat în două fascicule de o oglindă
semireflectorizantă; fascicul care traversează oglinda pătrunde într-un
microscop care poartă preparatul; razele de lumină reflectate pătrund în alt
microscop şi iluminează un preparat “martor”; la ieşirea din cele două
microscoape, cele două fascicule se recompun într-un fascicul unic, graţie
unei alte oglinzi semireflectorizante, deasupra căreia se află ocularul; cu
ajutorul unor filtre se poate varia faza şi amplitudinea unei radiaţii şi
provoca interferenţa cu o altă radiaţie.
Metoda interferometrică a dat rezultate interesante asupra
evoluţiei aparatului mitotic (RUSTAD, 1959), a concentraţiei substanţelor
solide în nucleol, nucleu şi citoplasma celulelor nervoase (MERRIAM şi
KOCH, 1960), etc.
42
- birefringenţa de formă sau structură apare atunci când particulele
submicroscopice sunt orientate regulat într-un mediu cu indice de
refracţie diferit;
- birefringenţa de tensiune se observă la structurile izotrope care sunt
supuse unei constrângeri mecanice şi se întâlneşte la nivelul muşchilor şi
în ţesuturile embrionare;
- dicroismul apare în momentul în care absorbţia unei lungimi de undă
dată de lumina polarizată variază în funcţie de orientarea obiectului
examinat. Aceste variaţii apar datorită diferenţelor de intensitate
(amplitudinea luminii transmise de obiect). Unii coloranţi organici ca
roşul de Congo sau thionină, pot induce dicroismul în unele structuri
biologice datorită unei orientări preferenţiale a moleculelor.
Microscopul cu lumina polarizată are două dispozitive speciale
numite: polarizor şi analizor (fig.17); ele sunt constituite dintr-o peliculă
de film polaroid sau dintr-o prismă Nicol în calcită. Polarizorul se găseşte
sub condensator, iar analizatorul se află deasupra obiectivului. Dacă planul
de polarizare al analizatorului este perpendicular pe cel al polarizorului,
lumina nu va fi transmisă. Punând pe platina microscopului un preparat
birefrigent, planul de polarizare va devia datorită întârzierii provocate de
întreruperea probei de examinat. Învârtim preparatul până când în câmpul
microscopului apar puncte cu luminozitate maximă şi minimă.
Tehnica de lucru
- se coboară tubul microscopului apropiind obiectivul de condensor
până la obţinerea unei iluminări maxime şi uniforme a câmpului
microscopic;
- se rotesc cei doi nicoli – analizorul şi polarizorul – până când se
obţine întunecarea maximă în câmpul ocularului;
- pe platina microscopului se aşează o lamă port obiect pe care sunt
lipite secţiuni din rinichi, intestin sau ficat, colorate după metoda topo-
optică Romanyi şi col. 1978 (materialul se fixează în formol, se secţionează
la microtomul de congelare, iar secţiunile se colorează cu o soluţie de
albastru de toluidina la pH. 4,5 urmând o postfixare cu fericianid de potasiu
care are capacitatea de a se lega de lipidele şi glicoproteinele din structura
biomembranelor);
- imaginea se face clară prin tehnica descrisă la 2.1.1.
43
Fig. 17. Schema optică a variaţiilor luminoase de maxim şi
minim ale unui obiect anizotropic când este plasat între
analizor şi polarizor şi rotit cu un unghi de ± 450
Aplicaţii practice
• se pot studia structurile a căror compoziţie chimică macromoleculară
au un aspect liniar ca de exemplu fibrele de colagen, mielina, fibrele
musculare striate etc.;
• se utilizează pentru studiul structurilor: membrane biologice, etc.;
• se evidenţiază structurile cu simetrie radială – granule proteice,
lipide, colesterol.
44
2.2. Microscopia electronică
h
λ=
m⋅v
45
Lungimea de undă a fasciculului de electroni este aleasă în funcţie
de tensiunea de accelerare, de la 0,0859 A la 20 kV, la 0,0028 A la 400kV,
permiţând explorări în microcosmosul celular până la nivel molecular. Cele
mai perfecţionate microscoape electronice aflate în exploatare în diferite
laboratoare au rezoluţii garantate de 2-3 A (în condiţii speciale 1,2 A şi
putere maximă de mărire pe placa fotografică de 800.000x).
Microscoapele electronice existente se împart după tipul de
construcţie şi destinaţia lor în câteva grupe:
1. Microscoape electronice de transmisie, sau prescurtat TEM
(Transmission Electron Microscope), utilizate pentru cercetări
ultrastructurale.
2. Microscoape electronice de baleiaj, sau de tip SEM (Scanning
Electron Microscope), folosite la studiul ultramorfologiei suprafeţelor cu
ajutorul electronilor secundari sau reflectaţi.
Tipul de imagine
46
7. Microscoape electronice – EPI (Electron Probe Instrument) –
utilizate în analize elementare şi în studiul suprafeţelor.
8. Microscoape ionice cu emisie de câmp, FIM (Field Ion
Microscope) – cu ajutorul cărora se poate vizualiza direct orientarea
atomilor într-un material.
47
Obţinerea unor preparate microscopice permanente necesită
efectuarea unor timpi operatori succesivi, fiecare din ei având o influenţă
hotărâtoare asupra reuşitei finale. În ordinea executării lor, aceştia sunt:
recoltarea, fixarea, spălarea, includerea, secţionarea, aplicarea secţiunilor pe
portobiect, colorarea, montarea şi etichetarea. În funcţie de tehnica aleasă,
succesiunea acestor timpi poate fi modificată, unii dintre ei putând fi omişi
(fig. 19).
2.3.1.1. Recoltarea
Recoltarea reprezintă unul din timpii cei mai dificili din tehnica de
biopsie celulară deoarece după sacrificarea animalului de experienţă sau
obţinerea unui fragment de ţesut sau organ prin biopsie sau alt operator, cu
maximum de operativitate trebuie să confecţionăm o piesă de material
biologic care să conţină populaţia de celule necesară studiului propus.
48
Recoltarea materialului biologic din organismele vii se poate efectua
prin:
a. Biopsie – se prelevă prin secţionare un fragment mic de ţesut (ex.
biopsie ganglionară, cutanată, musculară).
b. Puncţie biopsică – se obţin fragmente dintr-un ţesut cu ajutorul unui
tub ascuţit – trocar – ex. puncţie sternală pentru obţinerea unor fragmente
din măduva hematopoietică, puncţie hepatică, renală, ganglionară.
c. Aspiraţie endoscopică – pentru recoltarea cu ajutorul unui endoscop a
produselor biologice existente în cavităţile naturale (ex. endoscopie
gastrică).
d. Puncţia cavităţilor – pentru obţinere secreţilor normale sau patologice
ca: lichide pleurale, peritoneale, otice, lichid cefalorahidian.
e. Raclarea mucoaselor – (superficială sau profundă) pentru recoltarea
materialului din cavitatea uterină, vaginală, faringe, cavitatea bucală, etc.
f. Prelevarea intraoperatorie – se efectuează în timpul unei intervenţii
chirurgicale pentru stabilirea unui diagnostic imediat.
g. Recoltarea de material biologic de la cadavrele umane – secţionarea
unor fragmente de organ pentru examinarea lor.
h. Recoltarea de la animalele de experienţă sacrificate în acest scop.
2.3.1.2. Fixarea
50
Fixarea se realizează prin:
1) agenţi fizici
2) agenţi chimici
51
Congelarea – desicarea sau criodesicarea nu este o fixare în sensul
propriu al termenului pentru că ea nu determină denaturarea proteinelor
tisulare. Principiul ei este foarte simplu, bazându-se pe eliminarea prin
sublimare a apei conţinute în piese, răcire la o temperatură inferioară de 0°
şi plasarea într-o incintă unde presiunea este inferioară valorii de 4,6 mm Hg
(coloană de mercur). Numeroasele aplicaţii industriale ale metodei justifică
numărul mare de lucrări consacrate principiilor fizice şi realizării tehnice a
acestei metode. Metoda a fost pusă la punct în 1958 de către Neumann iar
lucrările lui Lison şi Pearse (1960) trec în revistă datele esenţiale în ceea ce
priveşte locul criodesicării în tehnica citologică.
Din punct de vedere tehnic metoda fixării prin criodesicare are trei
etape:
1. congelarea piesei care are drept scop principal oprirea rapidă a
tuturor reacţiilor vitale, ceea ce se poate obţine prin folosirea unei
temperaturi de -50° - -70°; la această temperatură se obţine oprirea reală a
tuturor reacţiilor enzimatice ce s-ar putea derula în interiorul ţesuturilor.
Congelarea reprezintă etapa crucială a acestei metode - defecţiunile acestei
etape pot duce la artefacte grosiere reticularea ţesuturilor ce ar face piesa
recoltată inutilizabilă;
2. desicarea sub zid – sublimarea apei ce are drept scop eliminarea
apei, prezentă în mare parte sub formă de cristale de gheaţă conţinute în
interstiţiile ţesutului.
3. tratamentul ulterior al piesei – piesa odată deshidratată nu
prezintă la examenul microscopic nici o retracţie comparativ cu starea
proaspătă, proteinele tisulare sunt seci, dar nu denaturate. Urmează apoi
impregnarea şi includerea în parafină.
52
se conservă satisfăcător; conservarea devine necorespunzătoare în cazul
testiculului, ţesutului nervos, măduvei spinării, osoase şi ganglionilor
limfatici.
Deşi din punct de vedere morfologic rezultatele criodesicării pot
rivaliza uneori cu cele obţinute folosind fixarea prin agenţi chimici,
exigenţele sale materiale sunt mult prea mari, preţul său de cost mult mai
ridicat decât cel al fixării pe cale chimică.
Fără a-i contesta avantajele, în prezent se consideră că această
metodă de fixare trebuie rezervată numai unor cazuri bine definite, în afara
cărora ea nu prezintă nici o superioritate raportată la alte procedee mult mai
rapide, mai puţin minuţioase şi mai ieftine.
53
Printre criteriile de clasificare a fixatorilor chimici se iau în
consideraţie în primul rând acţiunile lor asupra proteinelor, deoarece
denaturarea proteinelor reprezintă piatra de temelie a fixării. În afara
denaturării proteinelor, fenomen ce merge în paralel cu o serie de modificări
din care cea mai vizibilă este o schimbare a caracterelor solubilităţii,
lanţurile care reprezintă proteinele de structură sunt depliate; apar legături
intermoleculare noi ce conferă ansamblului o anumită rigiditate; o serie de
grupări pot deveni active în timp ce altele care puteau reacţiona înaintea
denaturării sunt mascate acum. Cum de altfel a şi fost remarcat, denaturarea
nu este un fenomen uniform, totdeauna acelaşi; fixatori diferiţi pot fi cauza
unor denaturări diferite, ce vor modifica o anumită proprietate a proteinelor
asupra cărora acţionează.
În funcţie de tipul de acţiune asupra ovalbuminei (floculare sau
coagulare) se poate face o clasificare a agenţilor chimici fixatori în:
1. coagulanţi (metanol, etanol, acetonă, acid nitric, acid clorhidric,
trioxidul de crom, etc.)
2. necoagulanţi (acid acetic, tetraoxid de osmiu, bicromat de potasiu,
formaldehida).
De asemenea, trebuie avute în vedere acţiunile agenţilor chimici
fixatori şi asupra glucidelor şi lipidelor tisulare, gradul de penetrare în
interiorul pieselor, retracţia ţesuturilor sub acţiunea lor, modificările
morfologice ale organitelor, etc. Numărul fixatorilor chimici simpli este
relativ mic în comparaţie cu varietatea amestecurilor fixatoare. Vom trece în
revistă în continuare câţiva dintre fixatorii simpli şi amestecurile fixatoare
cel mai frecvent utilizate.
Fixatori simpli
a. Etanolul – lichid incolor, uşor miscibil cu apa, uneori utilizat ca
fixator la concentraţii variind între 70% - 100%. Este utilizat în special în
scopul fixării glicogenului şi conservării elementelor minerale insolubile în
alcool; în marea majoritate a cazurilor este folosit în amestecuri (alcool-
formol, amestecul Carnoy, etc.). Utilizat singur este un fixator mediocru
prezentând o serie de inconveniente (ex. retracţia ţesuturilor după un anumit
timp de acţiune).
b. Formaldehida – este un gaz ce este utilizat sub formă de soluţie în
apă cu o concentraţie de 36% - 40% fiind în mod obişnuit numită formol.
Soluţiile formaldehidei constituie fixatorii cei mai folosiţi, fiind
utilizaţi frecvent singuri şi nu în amestecuri. Aceste soluţii trebuie însă
neutralizate adăugând carbonat de calciu sau de sodiu sau tamponate până la
neutralitate.
54
În caz contrar, se formează progresiv acid formic prin oxidare, ceea
ce reprezintă un inconvenient important pentru fixare. Formolul face parte
totodată din numeroase amestecuri fixatoare.
c. Acizi organici şi minerali – nu sunt utilizaţi singuri, ci ca
adjuvanţi în amestecurile fixatoare.
Exemple:
1) acidul acetic - unul din cei mai vechi fixatori cunoscuţi, este utilizat în
diferite amestecuri: Bouin, Hollande, Carnory, etc.; este un bun fixator al
nucleului.
2) acidul tricloracetic – în soluţii apoase de 5-10% are proprietăţi
asemănătoare, prezentând şi o capacitate decalcifiantă; intră în alcătuirea
amestecului Bouin tricloracetic şi a fixatorului Heidenhain denumit “Susa”.
3) acidul picric – este un excelent fixator al proteinelor şi adăugarea lui în
soluţiile fixatoare favorizează anumite coloraţii cum ar fi cele ale
colagenului sau cele folosite pentru studiul glandelor endocrine.
4) acidul cromic – în soluţie apoasă 1% este utilizat exclusiv ca adjuvant în
anumite amestecuri (ex: Flemming, Benda, etc.).
d. Tetraoxidul de osmiu – este cel mai bun fixator citologic cunoscut,
rămânând încă fixatorul de bază pentru studiile de microscopie electronică,
deoarece păstrează cel mai bine structurile tisulare şi relaţiile dintre acestea.
Prezintă dezavantajul de a fi puţin penetrat şi de a face ţesuturile foarte
friabile, făcând dificilă confecţionarea secţiunilor. Pentru aceste motive şi
datorită preţului ridicat şi toxicităţii sale (conjuctivite), este puţin utilizat ca
fixator în microscopia fotonică.
Este folosit doar pentru conservarea mitocondriilor sau a aparatului
Golgi sau în stare de vapori pentru fixarea frotiurilor. Alte substanţe folosite
ca fixatori chimici simpli sau intrând în compoziţia unor amestecuri
fixatoare sunt: sărurile de metale grele (bicromat de potasiu), clorura
mercurică, acetonă, dioxanul, etc.
Amestecuri fixatoare
Sunt amestecuri de doi sau mai mulţi fixatori simpli la care se pot
adăuga substanţe destinate realizării unui anumit pH al soluţiei.
Principalele amestecuri fixatoare utilizate în biologia celulară se pot
sistematiza în patru grupe:
1. Amestecuri cromo-osmice (Flemming, Benda, Champy, Benoit
Nassonov) conservă foarte bine structurile nucleare, centriolii, aparatul
fusorial, diferenţieri ale plasmalemei ca marginea în perie, platoul striat şi
cilii. Restricţiile sunt mici şi piesele se pot include în parafină. Timpul
optim de fixare este de 12-24 ore.
55
2. Amestecurile cromice fără OsO4 şi acid acetic (Orth, Kopsch,
Regaud, Helly, Maximov) sunt utilizate pentru studiul mitocondriilor şi
permit impregnarea argentică a complexului Golgi; conservă granulele de
secreţie, iar gama de coloranţii şi reacţii citochimice după aceste fixări este
foarte largă.
3. Amestecuri de bază de metale grele în afară de crom şi OsO4
(Ramony Cajal, Da Fano, Aoyama) conservă mitocondriile şi permit
impregnarea argentică a complexului Golgi. Timp optim de fixare 3-25 ore.
4. Amestecurile cromo-acetice (Telliensniczky, Zenker, Kolmer,
Sanfelice) se folosesc în studiul granulelor de secreţie, a ergastoplasmei,
cililor precum şi în cariologie. Timp optim de fixare 12-24 ore.
Alţi fixatori: în afara celor patru grupe descrise mai sus, se pot
utiliza cu rezultate asemănătoare şi alţi fixatori.
1. Amestecul formol-calciu (Baker) reprezintă un excelent fixator
pentru mitocondrii şi complexul Golgi.
2. Fixatorii Clarke şi Carnoy conservă foarte bine reticulul
endoplasmatic granular.
3. Fixatorii Bouin, Susa, Heidenhein sunt utilizaţi în studiul
produşilor de secreţie, iar amestecurile pe bază de sublimat şi formol sau
acid acetic pot servi pentru conservarea centrozomului, aparatului fusorial şi
cililor.
Practica fixării
Arta fixării constă în utilizarea corectă a fixatorilor ce corespunde
fiecărui caz în parte, adică de a şti ce fixator trebuie folosit în funcţie de
obiectivele lucrării, cunoscut fiind faptul că nu există un fixator universal.
Un fixator simplu e greu să întrunească toate calităţile necesare unei
bune fixări, motiv pentru care se recurge la amestecuri fixatoare în care
diverşi constituenţi îşi modifică reciproc acţiunea.
La alegerea fixatorului se ţine cont de: natura ţesutului sau
organului; detaliile de structură care trebuie evidenţiate; coloraţia pe care o
vrem să o facem.
56
fiziologică, umectând lamele de ras şi celelalte instrumente cu
aceeaşi soluţie).
d. Tăierea unor fragmente suficient de mici
e. Facilitarea la maximum a penetrării fixatorului – în organe şi
ţesuturi; pentru aceasta se vor utiliza flacoane mari cu fundul plat şi
dop rodat; nu se va lăsa sânge sau mucus la suprafaţa piesei; se evită
ca acestea să se lipească de pereţii recipientului în care se face
fixarea, agitând din timp în timp flaconul.
f. Utilizarea unui volum suficient de fixator În afara unor cazuri
particulare, volumul fixatorului trebuie să fie de aproximativ 40-50
ori mai mare decât a fragmentului fixat.
g. Piesele se introduc în amestecul fixator ambalate în tifon şi purtând
un număr de ordine pentru identificare.
h. Durata fixării variază în funcţie de compoziţia amestecului fixator,
structura şi dimensiunea pieselor, temperatură – existând o durată
optimă pentru fiecare fixare.
i. Un fixator utilizat odată nu poate fi folosit pentru fixarea altei piese.
Nici un fixator citologic nu este universal şi de aceea arta fixării constă
în alegerea corectă a amestecului în raport de ceea ce trebuie studiat.
În tabelul 1 sunt prezentaţi principalii fixatori citologici şi utilizarea
lor:
Tabel 1. Principalii fixatori citologici şi utilizarea acestora
Nr.
ORGANIT FIXATORI UTILIZAŢI
crt.
1. Nucleul Clarke, Carnoy, Bouin + CrO3
2. Cromatină sexuală Amestecuri cromo-osmice
3. Nucleolul Sanfelice şi fixatori pe bază de CrO3
4. Complex Golgi Champy, Nassonov, R.Y.Cajal, Da Fano
5. Mitocondrii Orth, Kopsch, Regaud, Altman, Benoît
6. R.E.G. Bouin, Susa, Heidenhaim, Clarke, Carnoy
7. Tonofibrile Canoy
8. Microvili Canoy, Flemming, Benda, Campy, Benoît
9. Cili Sanfelice, Kolmer, Champy, Benda
10. Granule de secreţie Bouin, Zenker, Susa, Clarke, Caroy
A. Amestecuri cromo-osmice
1. Fixatorul Flemming
57
- tetraoxid de osmiu 2% 4 ml
- trioxid de crom 1% 15 ml
- acid acetic 1 ml
2. Fixatorul Benda
- tetraoxid de osmiu 2% 4 ml
- trioxid de crom 1% 15 ml
- acid acetic 3 pic.
3. Fixatorul Altman
- tetraoxid de osmiu 2% 10 ml
- bicromat de K 5% 10 ml
4. Fixatorul Champy
- tetraoxid de osmiu 2 % 4 ml
- trioxid de crom 1% 7 ml
- bicromat de K 7 ml
5. Fixatorul Benoît
- tetraoxid de osmiu 2% 5 ml
- bicromat de K 5% 6 ml
- clorură mercuriană 5% 5 ml
- nitrat de uranil 4% 4 ml
B. Amestecuri cromice
1. Fixatorul Kopsch
- bicromat de K 3,5 % 4 ml
- formol 40% 1 ml
2. Fixatorul Orth
- lichid Müller 9 ml
- apă distilată 100 ml
- bicromat de K 2,5 g
- sulfat de Na 1g
- formol 40% 1 ml
3. Fixatorul Regaud
- bicromat de K 3 % 4 ml
- formol 40 % 1 ml
4. Fixatorul Helly
- lichid Zenker 9,5 ml
- clorură mercurică 5g
- apă ditilată 100 ml
- formol 40% 0,5 ml
D. Alţi fixatori
1. Fixatorul Bouin
58
- soluţie apoasă saturată de acid picric 75 ml
- acid acetic cristalizat 5 ml
- formol 40 % 25 ml
2. Fixatorul Carnoy
- alcool etilic 100% 60 ml
- cloroform 30 ml
- acid acetic 10 ml
59
Fig. 20. Bateria de includere în parafină
2.3.1.4. Deshidratarea
60
Este preferabilă utilizarea mai multor băi de scurtă durată o singură
baie abundentă şi prelungită. Durata deshidratării este în funcţie de volumul
fragmentelor tisulare. Pentru cele de talie mijlocie deshidratarea se
efectuează în 2-3 ore. Deshidratarea trebuie să se încheie întotdeauna, în
cazul în care se face în etanol, cu o baie de alcool absolut nou, ce nu a fost
folosit.
2.3.1.5. Clarificarea
61
Fig. 21. Barele Leuckart
Parafina este mediul de includere cel mai frecvent utilizat dar, există
şi alte medii şi tehnici de includere: în paraplast, în celoidină, dublă
includere în celoidină şi parafină, în dietilen sau polietilenglicol sau în
gelatină, unele dintre ele fiind introduse destul de recent în practica
citologică şi vor căpăta probabil o mare dezvoltare în viitor.
1. Includerea în paraplast
Paraplastul este un amestec de parafină purificată şi polimeri plastici
care prezintă o mare rezistenţă şi elasticitate. Includerea pieselor în acest
amestec permite confecţionarea de secţiuni deosebit de fine de ţesuturi dure
sau de consistenţă diferită cu rezultate foarte bune; în acest domeniu, această
metodă tinde să înlocuiască tot mai mult procedeele clasice de includere în
celoidină sau de dublă includere. Anumite laboratoare utilizează în mod
curent paraplastul în locul parafinei. Tehnica de includere este aceeaşi ca şi
în cazul includerii în parafină.
2. Includerea în celoidină
Celoidina, utilizată în soluţie cu un amestec de eter şi etanol, este un
mediu de includere care are avantajul de a realiza impregnarea ţesuturilor la
rece. Ea este o formă purificată de nitroceluloză.
Includerea pieselor este foarte simplă: după fixare ele sunt
deshidratate apoi impregnate cu soluţii de celoidină în concentraţie
crescătoare, la temperatura laboratorului; când este gata impregnarea se lasă
să se întărească ultima soluţie prin evaporarea solventului şi blocului astfel
obţinut este gata pentru secţionat. Acest procedeu de includere prezintă faţă
de includerea în parafină avantaje şi dezavantaje.
Dintre avantaje amintim faptul că:
- tehnica este simplă şi principiul său nu necesită încălzirea;
- mediul de includere conservă bine structurile şi raporturile între
ţesuturi de consistenţă diferită;
- consistenţa sa fermă şi elastică este un excelent suport pentru
ţesuturile dure;
62
Aceste proprietăţi fac din celoidină mediul de includere ideal pentru
organele formate din ţesuturi de consistenţă diferită, pentru formaţiuni
chistice, ţesuturi fibroase sau musculare din care adesea este dificil de
obţinut secţiuni regulate şi omogene după includerea în parafină.
Consistenţa sa permite secţiuni de dimensiuni mai mari; acest
procedeu este folosit pentru includerea organelor cum ar fi: uterul, glanda
mamară, etc. şi mai ales encefalul, includerea în celoidină reprezentând
metoda de bază în tehnica neurologică.
Dintre inconveniente amintim:
- metoda este lentă şi unele etape mai dificile;
- mediul de includere nu permite confecţionarea unor secţiuni foarte
fine (sub 10 microni);
- blocurile nu pot fi conservate ca atare: este necesară păstrarea lor
în etanol 70% sau 80%.
3. Dubla includere în celoidină şi parafină
Această metodă combină unele dintre avantajele metodei includerii în
celoidină cu cele ale includerii în parafină (rapiditate, obţinerea de secţiuni
fine, etc.).
Există mai multe moduri de realizare a acestei metode, cele mai
simple constând în: deshidratarea şi impregnarea în soluţii de celoidină în
concentraţie crescătoare şi apoi printr-o soluţie (ex: benzen) de clarificare,
luând impregnarea piesei cu parafină ca în procedeul uzual al includerii în
parafină.
4. Includerea în dietilen şi polietilen glicol
a. Dietilen-glicolul “Ester Waxes” – mediu mult mai dur decât
parafina, prezintă unele avantaje faţă de parafină şi celoidină; blocurile
rezultate sunt mai dure decât cele de parafină şi este necesară utilizarea unui
cuţit foarte rezistent şi a unui microtom foarte stabil.
b. Polietilen-glicolii “Poliester Waxes” – sunt medii de includere
care prezintă un mare interes teoretic pentru faptul că sunt hidrosolubili,
nefiind necesară deshidratarea pieselor şi folosirea unui agent clarifiant, în
felul acesta economisindu-se timp (o includere se poate face în 4-5 ore) şi
realizându-se o diminuare a retracţiei ţesuturilor.
Piesele nefiind trecute prin alcooli sau solvenţi organici, lipidele sunt
conservate în secţiunile care sunt mai fine şi mai regulate decât cele obţinute
prin congelare.
Din păcate, în ciuda optimismului numeroşilor cercetători, secţiunile
sunt destul de dificil de realizat şi de etalat pe lamă din cauza higroscopiei
polietilen glicolului. Astfel, această metodă de includere este folosită doar
pentru anumite cercetări cum ar fi studiul lipidelor sau punerea în evidenţă a
lipidelor şi a mucopolizaharidelor.
63
5. Includerea în gelatină
Este utilizată în cazul unor ţesuturi fragile sau de volum mic.
Fragmentele fixate sunt trecute prin soluţii de gelatină de concentraţie
crescătoare, aşezate apoi în gelatină turnată într-o formă, blocul de gelatină
se solidifică şi este gata de a fi secţionat.
Procedeul prezintă un inconvenient: gelatina solidifică prin acţiunea
formolului nu poate fi prea mult îndepărtată ceea ce creează dezavantaje la
colorarea secţiunilor
6. Includerile automate
Intreprinderi specializate furnizează de câţiva ani aparate ce permit
trecerea automată a pieselor prin diferiţi agenţi chimici utilizaţi pentru
includere. Aceste aparate au cunoscut un mare succes şi echipează în
prezent multe laboratoare. Ele prezintă un avantaj: economisirea timpului
deoarece aparatele funcţionează continuu, zi şi noapte şi sunt înzestrate cu
sisteme de agitare a pieselor în diferiţi solvenţi, ceea ce creşte viteza de
impregnare. Dau rezultate bune când sunt folosite la includerea fragmentelor
de volum asemănător, timpii de trecere a pieselor prin diferite băi fiind în
funcţie de acest volum.
2.3.1.8. Secţionarea
64
A B
Piesele esenţiale ale unui microtom tip rotativ sunt: cuţitul, suportul
cuţitului care-l menţine în poziţie şi permite orientarea lui, port-obiect şi
dispozitivul lui de fixare, şurubul micrometric cu ajutorul căruia se fixează
grosimea secţiunii, dispozitivul pentru avansarea piesei şi roata motrice.
Pentru secţiuni vegetale se poate folosi şi un microtom de mână (fig. 22, B).
Înaintea secţionării propriu-zise, blocul de parafină ce conţine
preparatul se va modela în formă de trunchi de piramidă patru unghiulară
astfel încât în jurul piesei să rămână o bandă de parafină de 1-2 mm
grosime. Astfel finisat el se fixează, indiferent de mediul de includere
folosit, cu baza mare pe un port-obiect care se montează la microtom ( fig.
23).
Pentru blocurile de parafină această operaţie este foarte simplă: se
încălzeşte port-obiectul metalic apoi se aplică blocul de parafină, se introduc
apoi în apă rece, menţinând în contact cele două piese până când blocul
aderă solid la port-obiect.
Montarea blocurilor de paraplast, Ester Wax, sau a celor obţinute
prin dublă includere se realizează la fel ca şi în cazul blocului de parafină.
Blocurile de celoidină şi Necol sunt montate pe port-obiecte din
lemn sau plastic pe care se pune un strat dintr-o soluţie de celoidină 2% în
alcool-eter; blocul este menţinut apoi apăsat pe port-obiect timp de o oră şi
ansamblul este apoi introdus în alcool 70% timp de o jumătate de oră,
înainte de a fi fixat la microtom.
65
Fig. 23. Banda de secţiuni seriate
A-secţiunile la parafină; B-etalate pe lama port-obiect
67
higroscopiei polietilen-glicolilor folosiţi, dar utilizarea mediului Reid şi
Sarantakos îndepărtează acest inconvenient.
68
Fig. 25. Diferitele etape ale realizării frotiului de sânge
69
- soluţii fixatoare – frotiu umed; alcoolul etilic absolut timp de 15 min.,
alcool etilic absolut şi eter în părţi egale timp de 5-15 min., alcool metilic
timp de 2 min. sau prin vapori de OsO4 (soluţie 2%)
După fixare se execută colorarea preparatului.
d. Colorarea frotiului de sânge
Frotiul trebuie colorat cât mai curând după realizarea lui (imediat
după întinderea lui sau în primele 24 ore) întrucât pe lamele necolorate
celulele se alterează pierzându-şi afinitatea tinctorială.
Actualmente se foloseşte colorarea dublă cu soluţie May-Grümwald-
Giemsa ce dă indicaţii asupra compoziţiei chimice a substanţei vii celulare.
May-Grünwald-Giemsa aparţine coloranţilor neutri şi este o coloraţie
panoptică (metoda permite identificarea în mod selectiv a componenţilor
celulari în funcţie de pH-ul specific). Este colorantul de elecţie al frotiurilor
sangvine.
Compoziţia colorantului utilizat:
a. soluţia May-Grümwakd
- eozinat de albastru de metilen 1 g.
- glicerina neutră p.a. 50 ml.
- alcool metilic p.a. 100 ml.
b. soluţie Giemsa
- eozinat de azur metilen 3 g.
- azur de metilen 0,8 g.
- glicerină neutră 250 ml.
- alcool metilic p.a. 200 ml.
Tehnica colorării
Reactivi şi materiale necesare:
- soluţie May-Grümwald;
- soluţie Giemsa;
- apă distilată neutră;
- pipete Pasteur, pipete gradate.
PH-ul apei distilate trebuie să fie 7 sau 7,2. Apa distilată este de
obicei acidă. Neutralizarea ei se obţine adăugând câteva picături dintr-o
soluţie slab alcalină de carbonat de sodiu 1% la 500 ml apă distilată,
încercându-se pH-ul cu un indicator universal de hârtie; pH-ul apei se mai
controlează şi prin adaos de câteva cristale de hematoxilină (colorarea apei
în roz este indicaţia de neutralitate – hematoxilina este violet-albastră în
mediu alcalin şi galbenă în mediu acid);
70
- se acoperă frotiul cu soluţie May-Grümwald şi se lasă 2-3 min.
(timp în care soluţia realizează o fixare a frotiului);
- se adaugă apoi peste soluţia May-Grümwald un număr egal de
picături de apă tamponată, se omogenizează şi se lasă 2 min.
(diluată, soluţia May-Grümwald acţionează ca un colorant);
- se îndepărtează colorantul fără spălare şi se acoperă cu soluţie
Giemsa diluată cu apă distilată tamponată în proporţie 1/1 (1
picătură soluţie Giemsa pentru un mililitru apă); se lasă 15-20 min;
- se spală lama sub jet de apă;
- sugativare uşoară;
- se aşează în stativ pentru uscare.
Colorarea pentru trombocite se face la fel, prelungind doar timpul de
colorare cu Giemsa la 45 min., iar spălarea lamei nu se face sub jet puternic
de apă fiindcă apa antrenează trombocitele.
Clasa unui element sau gradul lui de maturare se stabileşte pe baza
unor criterii ce privesc bazofilia citoplasmei elementelor tinere, afinitatea
tinctorială a granulaţiilor granulocitelor şi acidofilia eritrocitelor mature.
Această metodă de colorare dă indicaţii asupra pH-ului
componentelor celulare. Astfel, coloranţii acizi sunt fixaţi de porţiunile
alcaline ale celulei, care sunt acidofile, iar coloranţii bazici sunt fixaţi de
părţile acide, care sunt bazofile. De exemplu eozina, colorant acid, este
fixată de granulaţiile eozinofile ce sunt alcaline (pH = 11); albastrul de
metilen, colorant bazic, este fixat de acidul ribonucleic din citoplasma
eritroblastului bazofil colorând-l în albastru; azurul de metilen fixează
acidul dezoxiribonucleic din nucleul eritroblastului bazofil. Nucleolul
fixează albastru de metilen deoarece conţine acid ribonucleic de tip
citoplasmatic.
Cu cât o celulă este mai tânără cu atât citoplasma ei este bazofilă, dat
fiind concentraţia mare de acid ribonucleic. Pe măsura măturării celula
devine tot mai acidofilă deoarece scade concentraţia în acid ribonucleic (ex:
evoluţia eritroblaştilor).
Termenii de eozinofil, bazofil, acidofil, indică afinitatea faţă de
coloranţii acizi.
72
Variaţii fiziologice ale numărului elementelor sângelui periferic
HEMOGRAMA
Eritrocite - variaţii după sex:
- bărbat adult 4500000-5500000/mm3
- femeie adultă 400000-5000000/mm3
- variaţii după vârstă:
- la naştere 4500000-7000000/mm3
- până la 12 ani 4000000-5000000/mm3.
Leucocite
- adulţi 4000-9000/mm3
- la naştere 15000-25000/mm3
Trombocite
- valori normale 130000-300000/mm3.
Aceste elemente variază nu numai în funcţie de vârstă după cum se
observă şi din tabelul de mai sus ci şi după sex. La aceste variaţii se adaugă
cele care survin în cursul unei activităţi musculare mai intense, în timpul
digestiei, în funcţie de anotimp, de altitudine (poliglobulie).
Examinarea frotiului de sânge
În examinarea frotiului de sânge colorat se recomandă ordinea
arătată anterior (studiul atent al morfologiei eritrocitelor, a trombocitelor şi
apoi a leucocitelor), deoarece, începând cu studiul leucocitelor, atrăgătoare
prin variaţiile lor de formă, structură şi culoare, riscăm neglijarea unor
detalii, uneori foarte importante ale aspectului hematiilor sau trombocitelor
(fig.26; 27).
73
Fig. 27. Interpretarea unui frotiu de sânge
75
Capitolul 3
76
3.2. Clasificarea coloranţilor
77
anumite substanţe) şi în fenomenele de mordansare, atât de importante în
anumite tehnici citologice;
3. absorbţia legată de structura fizică a constituenţilor tisulari.
4. Starea materialului
- coloraţia vitală se face pe celule în stare vie prin utilizarea unor
coloranţi vitali şi care persistă numai atât timp cât supravieţuieşte celula; se
utilizează pentru evidenţierea unor organite celulare (mitocondrii - verde
Janus B sau complexul Golgi - roşu neutru) şi a unor activităţi fiziologice
celulare;
78
- coloraţia permanentă se face prin colorarea unor preparate
permanente.
79
reprezintă un inconvenient deoarece este vorba de secţiuni colorate; de
asemenea un număr mare de coloraţii nu se conservă bine în aceste medii.
b. mediile de montare miscibile cu alcoolul – necesită o deshidratare
a preparatelor mergând până la alcool 80° sau chiar 85°. Folosirea lor este
indicată atunci când se dovedeşte evitarea folosirii alcoolului absolut şi a
hidrocarburilor benzenice necesare când se foloseşte balsamul de Canada
sau alte rămăşiţe sintetice. Cel mai utilizat dintre aceste medii miscibile cu
alcoolul este euparolul (Gilson 1906). După mulţi autori, conservarea
majorităţii coloranţilor şi reacţiilor histochimice este foarte bună. Avantajul
principal al utilizării pentru montare a euparolului este evitarea deshidratării
prin alcool absolut a secţiunilor în celoidină nelipite (este indicaţia
principală a acestui procedeu).
Montarea propriu-zisă se realizează punând 1-2 picături din mediul
de montare pe lama cu secţiunea lipită şi colorată pe care se aplică apoi o
lamelă de sticlă.
În această etapă, esenţială este manipularea lentă a lamelei pentru a
se evita formarea bulelor de aer între lamă şi lamelă.
Scoaterea bulelor de aer se face prin apăsarea uşoară pe lamelă cu un
ac de disociat. Preparatele astfel montate se pun la termostat la 37°C, 10-12
ore sau la temperatura camerei dar ferite de praf 1-2 zile, în vederea
uniformizării grosimii stratului şi uscării mediului de montare.
c. anhidre, răşinoase (miscibile cu hidrocarburi benzenice) (ex:
balsam de Canada) ce necesită nu numai deshidratarea completă a
secţiunilor dar şi impregnarea cu un solvent al materialului de montare, deci
cu o hidrocarbură benzenică. Alături de balsamul de Canada se pot folosi şi
alte răşini sintetice.
5. Etichetarea preparatului este ultima etapă în obţinerea unui
preparat microscopic permanent: constă în lipirea unei etichete pe port-
obiect, pe faţa cu secţiunea colorată, pe care se trec datele înregistrate în
condica de lucru şi coloraţia făcută. Preparatele microscopice se păstrează în
cutii sau histoteci, ferite de lumină şi praf.
80
Hematoxilina este un compus natural, de origine vegetală (extrasă
din Haematoxylon campechianum) a cărui utilizare pentru colorarea
ţesuturilor vegetale sau animale era cunoscută de indigenii din America
Centrală înainte de cucerirea spaniolă. Introdusă apoi în Europa, a fost
utilizată în industria textilă.
Formula ei stabilită încă din 1810 de către Chevreul este: C16H14O6.
Se ştie de asemenea că hematoxilina însăşi nu este un colorant şi că ea
capătă această proprietate după oxidarea în hemateină (C16H12O6 – pierderea
celor doi atomi de hidrogen făcându-se fără intrarea oxigenului în
moleculă).
Oxidarea hematoxilinei, denumită curent maturare, se face:
- prin maturare naturală – expunere prelungită la aer;
- prin maturare artificială – tratare cu agenţi oxidanţi;
Se preferă însă procesul de maturare lentă, naturală. Hemateina
utilizată în tehnica citologică sub formă de lacuri, prin mordansare cu un
alaun (alaun de K), se numeşte hemalaun.
Ea permite obţinerea unei coloraţii nucleare bune în albastru violet.
Numărul formulelor de hemalaun folosite este mare (ex: hemalaunul
Hansen, Mason, etc.).
Eozina. Există în realitate mai mulţi coloranţi care poartă numele de
eozină. Toţi sunt derivaţi de xantină şi mai precis din fluoresceină. Printre ei
este şi eozina Y (sau eozina galbenă) care dă cele mai bune rezultate în
asociere cu hemalaunul.
Acest colorant este sarea de sodiu a derivatului tetrabromat al
fluoresceinei. Mai este numit şi eozină hidrosolubilă. Derivaţii săi metilaţi şi
etilaţi sunt mult mai puţin folosiţi (eozina etilată sau eozina S, solubilă în
alcool este utilizată pentru punerea în evidenţă a corpusculilor Negri ai
turbării).
Eozina B sau albastră, derivatul dibromat al dinitrofluoresceinei, este
utilizată mai rar ca eozina Y în asociere cu hemalaunul, dovedindu-se utilă
atunci când este combinată cu azur A sau albastru de toluidină.
Timpii acestei metode sunt:
1. operaţiunile etapei de precolorare: deparafinare, hidratare.
2. colorarea propriu-zisă ce cuprinde:
a) introducerea secţiunilor hidratate într-o baie care conţine hemalaun,
timp de 5-10 min;
b) spălarea în apă curgătoare 5-10 min;
c) diferenţierea în alcool clorhidric (alcool 96° - 100 ml. Soluţie acid
clorhidric – 0,5 ml.) când nucleii sunt supra coloraţi. Pentru virare,
secţiunile se trec în soluţia saturată de carbonat de litiu;
81
d) introducerea secţiunilor spălate într-o baie cu soluţie apoasă de
eozină 1% timp de 1-2 min;
e) spălarea secţiunilor timp de câteva secunde în apă distilată pentru
eliminarea excesului de colorant;
h) sugativare uşoară.
3. operaţiunile etapei de postcolorare: deshidratare, clarificare,
montarea lamelei, etichetare.
Rezultate:
- nucleii apar coloraţi în albastru violet cu hemalaun. Hemalaunul este
un colorant bazic deci, conţinutul nuclear este bazofil (principalii
constituenţi chimici ai nucleului, ADN şi ARN, posedă radicali fosfat acizi
ce reprezintă locuri de ataşare pentru colorantul bazic-hemalaunul).
- citoplasma se colorează în roz cu eozina. Eozina este un colorant
acid, deci citoplasma este acidofilă (cele mai multe proteine citoplasmatice
se comportă la pH-ul respectiv ca baze, expunând grupările NH3+ care,
reprezintă locul de ataşare pentru colorantul acid-eozină).
În cazul în care se folosesc secţiuni de ficat uman pentru colorare cu
HE se observă: hepatocitele dispuse în cordoane celulare, separate prin
spaţii în care sunt capilarele sanguine; în citoplasma acidofilă a
hepatocitelor pot fi observate uneori formaţiuni granulare bazofile, colorate
în albastru-violet - corpii Berg – ce reprezintă ergastoplasma, cantitatea
mare de ARN, datorată ribozomilor ataşaţi membranei RE, reprezintă
substratul acestei bazofilii.
Pe o secţiune efectuată la nivelul pielii se identifică cele trei straturi
(epiderm, derm şi hipoderm), foliculi pilari, glande sebacee, etc. În
hipoderm se găsesc grupuri de celule adipoase, încărcate cu lipide care
ocupă aproape toată citoplasma. Celulele au formă sferică, citoplasma
necolorată (lipidele nu se colorează). Lipidele intracitoplasmatice împing
nucleul la periferie, turtindu-l, adipocitul căpătând astfel aspectul de " inel
cu pecete".
Glande exocrine cu mecanism de secreţie de tip merocin - celula îşi
menţine integritatea între cicluri secretorii succesive. În coloraţia HE,
citoplasma acinilor mucoşi nu este colorată, datorită prezenţei produşilor de
secreţie (mucopolizaharide acide şi neutre).
În coloraţia HE o insulă Langerhans apare ca o structură mai puţin
colorată printre acini, care sunt intens coloraţi. Este formată din câteva zeci,
până la câteva mii de celule endocrine, de dimensiuni mici, rotunde sau
poligonale, cu citoplasma eozinofilă, palidă, cu nuclei rotunzi, albastru-
violet. Celulele sunt aşezate în cordoane care se anastomozează şi printre
care se găsesc numeroase capilare sangvine. Celulele din centrul insulei
82
(mai numeroase - 70%) denumite celule B sau β, secretă insulina, iar
celulele din exteriorul insulei (mai puţine 20%) denumite celule A sau α,
secretă glucagonul. Cei 2 hormoni (insulina şi glucagonul) intervin în mod
decisiv în metabolismul glucidic.
- spaţiile goale, necolorate în citoplasma hepatocitelor; aceste spaţii
goale reprezintă locurile ocupate de: incluziuni granulare de glicogen (ce nu
se colorează cu HE), spaţiile ocupate de granulele de glicogen apar
neregulate şi cu un contur neclar; incluziuni granulare lipidice – locurile
ocupate de acestea, apar sub formă sferică.
84
Datorită componenţei cromozomiale situată la exteriorul nucleolului,
metoda lui Estable şi Sotelo pune în evidenţă această structură periferică
numită nucleololemă.
a. Fixarea în formol, amestec Sanfelice sau alţi fixatori pe bază de
trioxid de crom.
b. Secţiuni deparafinate şi hidratate.
c. Imersia secţiunilor într-o soluţie apoasă de alaun de fier 3%.... 1-2
min.
d. Spălarea rapidă în apă distilată.
e. Imersia secţiunilor într-o soluţie apoasă de fericianură de K 1% în
care, după 30 sec. se adaugă 7-10 picături din soluţia apoasă de pirogalol
2%; coloraţia este aproape instantanee.
f. Spălarea în apă curgătoare.
g. Deshidratarea, clarificare, montare în balsam de Canada.
86
3. Punerea în evidenţă a R.E.G.
Toate tehnicile se bazează pe bazofilia acidului ribonucleic,
constituentul caracteristic al acestui organit. Cele mai bune rezultate se obţin
prin detectarea histochimică.
a. Fixare fragmente scoarţă cerebrală în formol 10%......24 ore.
b. Spălare apă curgătoare……………………………..12-24 ore.
c. Deshidratare, clarificare, includere la parafină.
d. Secţiuni de 4-5 microni, deparafinate şi hidratate.
e. Colorare cu soluţie apoasă de albastru de toluidină 10%..... 10
min.
f. Spălare în apă distilată + 1 picătură dintr-o soluţie suprasaturată de
carbonat de litiu….5-10 sec.
g. Spălare în apă distilată…..2 min.
h. Diferenţiere pe stativ cu alcool etilic absolut 100ml + 1 ml acid
acetic + 1 pic. Amoniac (până la obţinerea unei tente bleu-albastru).
i. Oprirea diferenţierii cu alcool etilic absolut, evitându-se
decolorarea preparatului.
j. Clarificare, montare în balsam Canada.
Consideraţii generale
Coloraţia vitală reprezintă o metodă a cărei semnificaţie teoretică şi
practică depăşeşte simpla punere în evidenţă a unor detalii de structură la
nivelul ţesuturilor sau celulelor. Importanţa acestei metode de studiu s-a
impus încă de la primele încercări sistematice şi un număr mare de
discipline biologice beneficiază astăzi de rezultatele ei.
Punctul de plecare al acestei metode a fost punerea în evidenţă a
anumitor ţesuturi, celule sau anumitor organite, evidenţiere obţinută prin
administrarea la un animal viu, a unor coloranţi bine aleşi. Acest stadiu este
depăşit însă de mult. În prezent, anumite coloraţii vitale sunt utilizate în
scop pur morfologic dar interesul principal al metodei rezidă în explorarea
permeabilităţii tisulare şi celulare, în analiza fenomenelor ce se derulează în
timpul absorbţiei, transportului de substanţe în organism, a acumulării şi
eliminării substanţelor introduse în mediul intern în scop experimental.
O coloraţie vitală este în realitate o experienţă de fiziologie celulară
iar fiecare timp trebuie să fie atent supravegheat. Coloraţiile vitale nu sunt
metode de rutină, ele reprezintă metode de cercetare şi un procedeu de
diagnostic.
În ceea ce priveşte definiţia acestei metode, deşi un număr mare de
publicaţii şi cercetări au început să dea o definiţie satisfăcătoare coloraţiei
vitale, nu s-a ajuns încă la un acord în acest sens.
Astfel Fischel (1910) propune de asemenea cu numele de coloraţii
vitale, metodele ce permit obţinerea unei coloraţii a anumitor elemente
citologice fără a sacrifica în prealabil animalul folosit ca material biologic
de studiu.
Pentru Mollendorff (1920, 1926) acest termen de coloraţie vitală este
rezervat coloraţiilor obţinute în timpul vieţii animalului; în spiritul acestei
88
definiţii, coloraţiile vitale sunt opusul coloraţiilor supravitale sau post-vitale,
executate pe ţesuturile unui organism ce tocmai a fost sacrificat ca şi în
cazul coloraţiilor ţesuturilor fixate.
Vonwiller şi apoi Gicklhorn încearcă definirea acestei metode,
insistând asupra imposibilităţii trasării unei limite rigide între coloraţiile
vitale şi postmortem printr-o definiţie riguroasă şi absolută.
În general deci, se foloseşte termenul de coloraţie vitală pentru toate
coloraţiile executate pe elemente vii, obţinute administrând colorantul la
animalul de experienţă în întregime, iar cel de coloraţie post-vitală pentru
coloraţia aplicată ţesuturilor sau celulelor extrase din organismul viu deşi, se
pare că această separare nu este justificată, cunoscut fiind faptul că viaţa
celulelor nu încetează obligatoriu şi imediat ce sunt extrase din organism şi
că ea poate continua un timp în condiţii de mediu favorabile, iar colorarea
anumitor structuri obţinute în condiţii “vitale” pot reprezenta, la nivel
celular, un fenomen post-mortem.
Numărul coloranţilor este mare, tehnica variind în funcţie de
colorant şi animalul de experienţă. De exemplu, pentru studiul celulei în
general se folosesc coloraţiile vitale cu roşu neutru, verde Janus, albastru de
metilen. Interpretarea coloranţilor vitali şi explicarea mecanismelor de
acţiune ale acestora sunt probleme cu grad sporit de dificultate. Problemele
de ordin fizico-chimic pe care le pune coloraţia vitală a celulelor şi
organitelor sunt departe de a fi soluţionate. Ar fi iluzoriu să considerăm, în
momentul de faţă, având în vedere stadiul actual al cunoştinţelor din acest
domeniu, că se poate forma o teorie unică ce ar permite interpretarea
coloraţiei tuturor structurilor de către toţi coloranţii vitali.
Este sigur însă că mecanismele ce intervin în fenomenul global al
colorării in vitro, al diverselor structuri, sunt numeroase şi variate.
89
2. coloranţi bazici: albastru de metilen, albastru de toluidină şi
azurul de metilen - ce sunt tiozine, roşu neutru şi verde Janus ce sunt azine,
violetul de cresil, albastru de Nil, - oxazine, etc.
91
Acest lucru este uşor de realizat pentru unele ţesuturi şi organe
(mezenter, plămân, cornee), posibil în alte situaţii (ex: rinichi de şoarece) şi
imposibil de realizat în majoritatea cazurilor, astfel încât realizarea
secţiunilor la congelare şi de material proaspăt este de maximă importanţă
pentru examinarea rezultatelor coloranţilor vitali.
Alegerea fixatorului, prelucrarea ulterioară a pieselor şi alegerea
coloraţiilor de fond depinde de colorantul vital şi de ţesut.
2. Folosirea coloranţilor bazici. Condiţiile de aplicare şi mai ales
tehnica examinării sunt particulare în cazul coloranţilor vitali bazici.
Conservarea prin fixatori chimici este imposibilă în majoritatea
cazurilor şi de aceea este necesară urmărirea in vivo a tuturor fazelor
coloraţiei.
Anumiţi coloranţi, ex: verdele Janus, nu sunt utilizaţi decât pentru
aplicări locale; ca roşu neutru sau albastru de metilen pot fi aplicaţi local sau
injectaţi în mediul intern al animalului de experienţă. Modalităţile şi
precauţiile de preparare semnalată pentru coloranţii vitali acizi sunt valabile
şi în cazul coloranţilor bazici.
92
Coloraţia cu hematoxilina ferica (Hf) Heidenheim
Oferă detalii structurale nucleare preţioase, incluziuni celulare, fibre
musculare striate.
Etape de lucru:
A) Pregătirea colorantului
- Hematoxilina 10%+ alcool etilic 96%, maturare 2-3 săptămâni
- Soluţia coloranta: 10ml sol. Hematoxilina 10% + apa distilata 90ml.
- Mordansare= pregătire selectivităţii pentru colorant
B) Tehnica de lucru
- Mordansare pentru nucleu 30 min. - 24h
- Colorare cu HF 30 min - 24h
- Spălare rapidă cu apă distilată
- Diferenţiere la microscop
- Spălare
- Colorare
- Deshidratare, clarificare, montare în balsam de Canada.
C) Rezultate
Cromatina apare colorată în negru-albăstrui,
Citoplasma incoloră
Centrozomii şi granulele de secreţie pot fi evidente
93
Capitolul 4
LABORATOR 1
Materiale necesare:
- NaCl 9% 0 (ser fiziologic);
- apă distilată;
- detergent;
- eprubete;
- pipete gradate de 5 şi 10 ml;
- pahare Berzelius de 150 ml;
- hârtie de filtru;
- tifon;
- aparat de centrifugă;
- sânge recoltat pe anticoagulant.
94
Modul de lucru:
Sângele recoltate pe anticoagulant se lasă în eprubetă pentru
sedimentara hematiilor; cu o pipetă se îndepărtează plasma şi elementele
albe (fig. 28). Se fac două spălări repetate a hematiilor cu ser fiziologic
pentru îndepărtarea proteinelor de pe suprafaţa membranelor eritrocitare.
Se pun apoi hematiile într-un vas cu apă distilată timp de 10 minute,
pentru producerea şocului osmotic (ruperea membranelor) şi eliberarea
hemoglobinei. Se face apoi o centrifugare la 3000 g/min., timp de 20 de
minute, pentru sedimentarea membranelor; se îndepărtează supernatantul.
Se mai fac două sau mai multe spălări cu apă distilată, urmate de o
centrifugare uşoară – la 1000 g/min., timp de 10 minute până când
membranele plasmatice se deschid la culoare.
Rezultate:
Sedimentul obţinut reprezintă membranele plasmatice eritrocitare.
Cu un detergent se poate face solubilizarea lor, dovedind că natura lor
chimică este lipoproteică.
95
LABORATOR 2
Materiale necesare:
- soluţie de acid citric 1,5%;
- soluţie de acid citric 2,5%;
- soluţie de sucroză 0,88M;
- soluţie de sucroză 0.25M sau alcool etilic absolut;
- alcool metilic 960 sau alcool etilic absolut;
- eprubete, omogenizator;
- lame, lamele, tifon, baghetă de sticlă;
- pâlnie de sticlă, tifon, cutii Petri, pahare Berzelius de 150 ml;
- bisturiu, foarfece;
- baloane Erlenmayer de 100-200 ml;
- centrifugă;
- material biologic (ficat).
Modul de lucru:
Ficatul animal (cobai, şobolan, pui etc.), recoltat proaspăt, se
plasează într-un vas şi se mărunţeşte cu un bisturiu sau foarfece. Ficatul
mărunţit se spală cu o soluţie de acid citric 2,5% la temperatură scăzută
(40C). Operaţia de spălare se repetă de 3 ori, facilitând îndepărtarea
hematiilor.
Ţesutul hepatic se introduce apoi într-un omogenizator Potter 2-3
minute, peste care se adaugă soluţie de acid citric 2,5% la pH= 2,3. Volumul
mediului de suspendare variază în funcţie de cantitatea ţesutului de cercetat.
Ţesutul se omogenizează 2-3- minute la rece, după care se ajustează
volumul final al mediului. Omogenatul se filtrează apoi printr-un tifon.
Pentru a uşura trecerea prin tifon se amestecă uşor omogenatul cu o baghetă.
96
Dacă tifonul se îmbibă puternic cu material, se înlocuieşte.
Omogenatul celular se centrifughează la o turaţie de 3000 g/min, timp de 10
minute. Supernatantul se aruncă, iar sedimentul se resuspendă în 25 ml
soluţie de sucroză 0,24 M în acid citric 1,5% la rece (40C). Se
centrifughează din nou la 3000 g/minut timp de 10 minute, nucleii
acumulându-se în sediment. Ei se suspendă într-o soluţie de sucroză-acid
citric (5 ml soluţie).
Rezultate:
Nucleii izolaţi prin acest procedeu au o puritate de 80%.
În vederea purificării ulterioare se utilizează eprubete de centrifugă
cu o capacitate de 25 ml, în care se toarnă 15 ml soluţie de sucroză 0,88 M
în acid citric 1,5%. Peste soluţia de sucroză se stratifică 3 ml suspensie de
nuclei. Turnarea se face cu o pipetă al cărui vârf se plasează pe peretele
eprubetei, la nivelul sucrozei. Se centrifughează la 9000 g/minut, timp de 10
minute. Pe o lamă de microscop se pune o picătură de suspensie nucleară,
către una dintre extremităţi şi se execută un frotiu (se prinde picătura la
unghiul format de lamă şi lamelă şi se deplasează lamela către celălalt capăt
al lamei). Frotiul se usucă la aer 10 minute. Se examinează la microscop.
Nucleii apar sferici sau ovalari, înconjuraţi de anvelopa nucleară, cu unul
sau doi nucleoli mai refringenţi decât nucleoplasma (fig. 29). Pe acest frotiu
se pot executa coloraţii specifice ( Feulgen, May-Grünwald Giemsa, Benoit
etc.).
97
LABORATOR 3
Materiale necesare:
- NaCl 0,9%, NaCl cristalizată, dodecilsulfat de sodiu 5%;
- alcool etilic de 450, 900, 950, acetonă, agitator magnetic, baghetă
de sticlă;
- cilindru gradat de 25 ml, eprubete, pahare Berzelius de 100-150
ml;
- hârtie de filtru, tifon, pipete de 5 sau 10 ml, material biologic.
Modul de lucru:
Suspensia nucleară obţinută prin tehnica descrisă anterior, se
suspendă în 100 ml NaCl 0,9%, la care se adaugă 9 ml dintr-o soluţie de
dodecilsulfat de sodiu 5% în alcool etilic 450. Soluţia se agită pe un agitator
magnetic timp de 1-2 ore, timp în care ADN-ul trece în soluţie.
Dodecilsulfatul de sodiu (DDSA) are rolul de a sparge membranele nucleare
eliberând ADN-ul din complexul cu proteinele. Proteinele se alterează şi
precipită. Se adaugă NaCl cristalizată până când concentraţia salină a
soluţiei devine 1M (4,04g). Concentraţia crescută de sare facilitează
disocierea acizilor nucleici de proteine. După adăugarea suplimentară de
sare se continuă agitarea încă 30 de minute. Soluţia nucleară, vâscoasă, se
centrifughează la 3000 g/minut timp de 20 de minute. Supernatantul obţinut
se precipită cu un volum egal de etanol 950, într-un cilindru gradat. Alcoolul
se toarnă peste supernatant cu multă atenţie, astfel încât să plutească peste
faza apoasă. Cu o baghetă de sticlă foarte curată se amestecă cele două faze.
Rezultate:
ADN-ul precipită sub forma unor fire, care se răsucesc pe baghetă.
Agitarea continuă până când cele două faze sunt complet amestecate şi tot
ADN-ul este prins pe baghetă. Deoarece ADN-ul conţine încă destule
proteine, operaţia de dizolvare în NaCl-DDSA şi precipitare cu alcool se
repetă de două ori. ADN-ul prins pe baghetă se usucă în alcool de 700,
alcool de 900 şi acetonă. După extracţie, raportul extincţiilor citite la
spectrofotometru 230/260=0,37 indică o izolare bună a ADN-ului (fig.30).
98
Pentru o purificare completă se fac tratamente ulterioare cu pronază şi
ARN-ază.
99
LABORATOR 4
A B
100
Materiale necesare:
- acid citric 2,5%;
- soluţie de sucroză conc. 1-2 M;
- tampon TRIS-HCI 0,01 M, pH=7,2;
- omogenizator Potter;
- foarfecă (bisturiu), pensă, cutie Petri;
- pahar Berzelius de 150 ml, pipetă de 5 ml.
Modul de lucru:
Ficatul de animal proaspăt se plasează la rece (40C), apoi se
mărunţeşte cu o foarfecă sau un bisturiu foarte bine. Ţesutul se spală cu o
soluţie rece (40C) de acid citric 2,5% după care se introduce într-un
omogenizator Potter, de asemenea, răcit. Ficatul se omogenizează timp de 1-
2 minute la rece (40C), într-un volum mic (2 ml) de soluţie de acid citric
2,5% după care se diluează la un raport de 1/10g/v.
Nucleii şi resturile de membrane sunt îndepărtate prin centrifugare la
rece, la o viteză de 4000g/min. timp de 30 de minute. Sedimentul care
conţine nuclei, resturi de membrane, se aruncă, iar supernatantul se
păstrează.
Mitocondriile din suparnatant sunt colectate printr-o centrifugare la
7000g/min timp de 30 de minute. Pentru o bună spălare a mitocondriilor,
sedimentul mitocondrial se resuspendă în 5 ml soluţie acid citric 2,5% şi se
centrifughează din nou la 7000 g/min. timp de 30 de minute. Operaţia se
repetă de două ori.
Mitocondriile obţinute prin acest procedeu reprezintă o fracţie
mitocondrială brută, care conţine pe lângă mitocondrii, lizozomi şi
peroxizomi.
Purificarea ulterioară a acestei fracţii se face prin ultracentrifugare la
100.000 g/min. timp de 3 ore, în gradient de sucroză. Astfel, într-o eprubetă
de centrifugare se obţine un gradient de densitate discontinuu. În acest scop,
se pipetează cu multă atenţie 3 ml de sucroză, din soluţii cu concentraţii
molare între 1-2 M, în ordine descrescătoare.
Suspensia brută de mitocondrii se plasează deasupra gradientului de
sucroză, suspendată într-un volum mic din soluţia de acid citric 2,5%. Prin
centrifugare la viteză mare (100.000 g/min.) timp de 3 ore, cele trei fracţii
celulare se separă.
Fracţiile sunt colectate din eprubete cu o seringă, sunt diluate cu o
soluţie tampon TRIS-HCI 0,01 M, pH=7,2, până când concentraţia în
sucroză scade la o valoare de 0,25 M.
101
Rezultate:
Mitocondriile (fig.31) sunt depuse în sediment, prin centrifugare la
10.000 g/min. timp de 10 minute. Ele sunt suspendate într-un volum final
adecvat (2 ml) cu soluţia de acid citric 2,5%.
Pe frotiul executat din sedimentul mitocondrial, uscat la aer şi fixat
cu fixatori mitocondriali (aldehidă formică neutralizată de bicromat de
potasiu, acid osmic, biclorură de mercur, etc.), se pot face coloraţii specifice
cu hematoxilină, fucsină Altmann, verde Janus B., etc.
102
LABORATOR 5
Materiale necesare:
- fucsină bazică, verde lumină, acid clorhidric normal;
- metabisulfit de sodiu (sau potasiu), cărbune activ;
- alcool metilic, termometru de laborator de 0-1000C;
- baloane de 200 şi 500 ml, pipete gradate de 5 şi 10 ml;
- cilindri gradaţi de 25 şi 100 ml, pahare Borrel;
- pahare Berzelius, pâlnie de sticlă, hârtie de filtru;
- hârtie neagră, sticlă cu dop rodat de 250 ml, mojar cu pistil.
Pregătirea reactivilor:
Reactivul Schiff
Se mojorează 1 g fucsină bazică; pulberea se trece într-un balon de
sticlă rezistentă la foc. În balon se toarnă peste fucsină 200 ml apă distilată
clocotită. Se continuă fierberea la flacără mică, încă 5 minute. Se lasă
soluţia să se răcească la 500C se filtrează. În filtrat se adaugă 30 ml acid
clorhidric normal.
Se lasă soluţia să se răcească la 250C, după care se dizolvă 3 g
metabisulfit de potasiu sau sodiu. Soluţia se păstrează timp de 24 de ore la
rece, într-o sticlă bine închisă, de culoare brună sau învelită într-o pungă
neagră de material plastic. În soluţie se adaugă 0,5 g cărbune activ, se agită
puternic şi se filtrează printr-o hârtie de filtru rapidă. Atât pâlnia cât şi sticla
în care se filtrează reactivul Schiff vor fi foarte curate.
Reactivul Schiff, care se prezintă ca un lichid perfect incolor, va fi
păstrat tot timpul în frigider, într-o sticlă brună închisă ermetic. Acest
103
reactiv va fi folosit şi pentru evidenţierea histochimică a glucidelor prin
reacţia PAS.
Apa sulfuroasă
Se dizolvă 0,5 g metabisulfit de sodiu în 4,5 ml apă distilată. Soluţia
de metabisulfit de sodiu 10% se toarnă în 100 ml apă distilată, peste care se
adaugă 6 ml acid clorhidric normal. Soluţia se prepară în momentul folosirii.
Modul de lucru:
Frotiurile sau amprentele se usucă la aer, apoi se fixează timp de 30
secunde în alcool metilic şi se usucă la aer.
Se pun la încălzit la termostat, la 56-60 0C, pahare Borrel cu acid
clorhidric închise ermetic. Se aşteaptă circa o oră, până când baia de acid
clorhidric normal a atins temperatura termostatului.
Preparatele se hidrolizează timp de 12 minute la 56 0C sau 5 minute
0
la 60 C. În baia de acid clorhidric normal; sunt clătite apoi în acid
clorhidric normal la temperatura camerei.
Preparatele se colorează timp de o oră cu reactivul Schiff la
temperatura camerei.
Pentru a atinge această temperatură reactivul Schiff este scos din
frigider cu o oră înainte. Preparatele colorate se spală un minut cu apă
sulfuroasă.
Se colorează citoplasma cu verde lumină 1/5000 timp de 10 secunde,
apoi preparatele se spală şi se usucă la aer.
Rezultate:
Cromatina nucleară (ADN) se colorează în roşu de nuanţe diferite, în
funcţie de concentraţia ADN din nucleii celulelor. Nucleolii nu se colorează.
Citoplasma este verzuie (fig.32).
104
Fig. 32. Nuclei interfazici şi în diviziune coloraţi cu reactivul Schiff
105
LABORATOR 6
Materiale necesare:
- verde de metil, pironină, acid acetic glacial;
- acetat de sodiu cu trei molecule de apă cristalizare;
- cloroform, alcool absolut, alcool etilic de 960C;
- alcool butilic, xilen, balsam de Canada;
- balanţă, cutie cu greutăţi, pipete gradate de 1,5 şi 10 ml;
- cilindri gradaţi de 25, 50 şi 100 ml;
- balon de sticlă de 200 ml rezistent la flacără;
- pâlnie de separare de 200 ml;
- hârtie indicatoare de pH pentru domeniul acid;
- pahare Borrel, pensă mare, tifon.
Pregătirea reactivilor:
106
este apoi trecută printr-o pâlnie de separare. Se adaugă peste soluţie 30 ml
cloroform şi se agită puternic pâlnia de separare, având grijă să se susţină
fiecare dop cu câte o mână. Se aşteaptă separarea cloroformului colorat în
violet de soluţia de verde de metil. Se lasă să se scurgă cloroformul, care
fiind mai greu decât apa, ocupă partea de jos a pâlniei de separare. Se
adaugă încă 30 ml cloroform. Operaţia se repetă până când cloroformul nu
se mai colorează. După ultima decantare, soluţia conţine circa 0,5% verde
de metil purificat.
Soluţia de colorare
În soluţia de verde de metil purifiat se adaugă 0,2 g pironină Y şi se
obţine soluţia de verde de metil-pironină.
Fixatorul Carnoy
Se obţine prin amestecul a 6 părţi alcool absolut cu 2 părţi cloroform
şi 1 parte acid acetic glacial; fixatorul se prepară în momentul folosirii.
Modul de lucru:
Frotiurile şi amprentele sunt fixate după uscare, cu fixatorul Carnoy,
timp de 10 minute. Fixarea se realizează prin cufundarea preparatelor în
pahare Borrel, în care s-a turnat fixator proaspăt. Se spală lamele timp de 2
secunde în alcool etilic absolut. Se spală lamele câteva secunde în apă
distilată apoi se lasă să se usuce.
Lamele uscate sunt colorate timp de 30 secunde cu verde de metil-
pironină; lamele colorate se spală câteva secunde în apă distilată, după care
sunt puse la uscat în poziţie verticală. Imediat după uscare se face
diferenţierea în alcool butilic câteva secunde.
Se clarifică în xilen şi se montează în balsam de Canada.
Rezultate:
ADN-ul nuclear apare colorat în verde sau în albastru-verzui.
Nucleolii şi citoplasma bazofilă se colorează în roz (fig. 33).
107
Fig. 33. Coloraţia cu verde-metil şi pironină: nucleul (ADN-ul nuclear)
apare colorat în albastru-verzui, nucleolul şi citoplasma în roz
108
LABORATOR 7
Materiale necesare:
- fixator Carnoy, albastru de bromfenol mercuric 0,1%;
- alcool etilic 95%, clorură mercurică 0,1%, roşu neutru;
- soluţie-tampon fosfat 0,1 M cu pH=7,0;
- lame, pipete de 5-10 ml, hârtie de filtru, sticlă picătoare.
Modul de lucru:
Fronturile celulare sunt uscate la aer şi fixate în fixator Carnoy, apoi
sunt incubate într-un amestec format din albastru de bromfenol mercuric
0,1% preparat în alcool etilic de 95% şi clorură mercurică 0,1% (v/v), timp
de 10 minute. Excesul de colorant se îndepărtează prin spălări cu alcool de
95% din sticlă picătoare. Se execută apoi o coloraţie cu roşu nuclear timp de
10 minute pentru coloraţia nucleilor.
Colorantul virează spre albastru prin spălarea lamelor cu apă sau
soluţie-tampon fosfat 0,1 M cu pH=7,0.
Rezultate:
Proteinele din celule, în funcţie de cantitatea lor şi afinitatea pentru
colorant, apar colorate în albastru deschis sau închis. Uneori se pot observa
tente violacee cu nuanţe închise. În figura 34 este prezentată structura
spaţială cuatenară a unei proteine (hemoglobina).
109
Fig. 34. Structura cuaternară a unei proteine (hemoglobina)
110
LABORATOR 8
Materiale necesare:
- acid periodic, reactivul Schiff, acid clorhidric normal;
- metabisulfit de sodiu, hematoxilină, oxid roşu de mercur;
- alaun de potasiu (sulfat de potasiu şi aluminiu), acid acetic glacial;
- pipete gradate de 5 şi 10 ml, cilindri gradaţi de 25 şi 100 ml;
- baloane Erlenmayer de 200 şi 500 ml, pahare Borrel, vas Laveran;
- alcool etilic absolut, alcool metilic.
Pregătirea reactivilor:
Apa sulfuroasă
Această soluţie este necesar să fie proaspătă. Este nevoie de circa
300 ml soluţie. Pentru această se dizolvă 1,5 g metabisulfit de sodiu în 13,5
ml apă distilată şi se obţine o soluţie 10%. Această soluţie se diluează în 300
ml apă distilată.
Peste amestec se adaugă 18 ml acid clorhidric normal. Balonul în
care s-a preparat această soluţie se acoperă până în momentul folosirii cu un
dop uşor de vată.
111
Hermalaunul Harris
Se dizolvă 1 g hematoxilină în 100 ml alcool etilic absolut. Separat,
se dizolvă 20 g alaun de potasiu în 200 ml apă distilată şi se încălzeşte. Se
amestecă cele două soluţii şi se fierb. Se scoate din flacără şi se adaugă cu
multă atenţie 0,5 g oxid roşu de mercur. Se mai lasă să fiarbă timp de 5
minute. Se pune balonul în apă rece şi se răceşte repede; se filtrează şi se
adaugă 2 ml acid acetic glacial. Se poate folosi imediat. Soluţia de hemalaun
Harris se păstrează timp de 1-2 luni, însă trebuie filtrată înainte de fiecare
întrebuinţare.
Modul de lucru:
Frotiurile sau amprentele uscate la aer se fixează timp de 15 minute
în alcool metilic, în pahare Borrel. După fixare, preparatele se hidratează
timp de 3 minute în apă distilată.
Se realizează o oxidare a preparatelor timp de 7 minute în acid
periodic 1%. Preparatele se spală apoi în 2-3 băi de apă distilată.
Se face o baie în apă sulfuroasă, timp de 1 minut. Preparatele sunt
trecute apoi într-o baie scurtă de 20-30 secunde în reactivul Schiff. Baia se
realizează la temperatura camerei, însă la întuneric, într-un pahar Borrel
acoperit cu hârtie neagră.
Preparatele se trec în trei băi de apă sulfuroasă, a câte 5 minute
fiecare baie. Este de preferat ca lamele să rămână într-un pahar Borrel şi la 5
minute să se reînnoiască apa sulfuroasă.
Se face o clătire cu apă distilată, urmată de o spălare în apă
curgătoare timp de 10 minute.
Se colorează nucleii cu hemalaun Harris timp de 3 minute; se spală
preparatele în apă curgătoare timp de 3 minute şi apoi se usucă la aer, la
temperatura camerei.
Rezultate:
Nucleii sunt coloraţi în albastru-negru. Glicogenul se colorează
intens în roşu (fig. 35).
112
Fig.35. Coloraţia PAS pentru glicogen şi glicoproteine pe ţesut glandular
(parotidă)
113
LABORATOR 9
Materiale necesare:
- sudan negru B, fenol, fosfat disodic;
- alcool absolut, alcool de 700, formol;
- pahare Borrel, cilindri gradaţi de 50 şi 100 ml;
- pipetă gradată de 10 ml, flacoane Erlenmayer de 200 ml;
- placă (cutie) Petri, hârtie de filtru;
- colorantul concentrat Giemsa.
Pregătirea reactivilor:
Soluţia-tampon
Se dizolvă 16 g fenol în 30 ml alcool absolut. Separat se dizolvă 0,3
g fosfat disodic în 100 ml apă distilată. După completa dizolvare se
amestecă cele două soluţii.
Soluţia de lucru
Se amestecă 40 ml soluţie-tampon cu 60 ml soluţie-stoc de Sudan
negru B. Se omogenizează. Această soluţie de colorare îşi păstrează
proprietăţile 3-4 săptămâni.
114
robinet. La 90 ml apă neutră se pun, picătură cu picătură, 10 ml soluţie
concentrată Giemsa. Soluţia de colorare se prepară strict înaintea folosirii.
Modul de lucru:
Amprente de măduvă roşie osoasă sau amprente de ficat se usucă la
aer şi se fixează în vapori de formol la temperatura camerei, timp de 10
minute într-o cutie Petri care are fixată în capac o hârtie de filtru îmbibată în
formol concentrat. Se evită contactul direct al preparatelor cu formolul.
Coloraţia se realizează prin imersionarea preparatelor timp de o oră
în soluţie de Sudan negru B. Preparatele se spală în alcool 700 până nu se
mai văd ,,nori“ de colorant. Preparatele se spală apoi cu apă, se colorează cu
soluţie Giemsa 10% timp de 30 minute, se spală cu apă şi se usucă la aer.
Rezultate:
Granulele sudanofile (lipidele) se colorează în albastru (fig.36).
A B
115
LABORATOR 10
Materiale necesare:
- alcool metilic, ferocianură de potasiu;
- acid clorhidric concentrat;
- coloranţii May Grunwald şi Giemsa;
- pahare Berzelius sau Borrel, cilindri gradaţi de 100 ml;
- pipete gradate de 2 şi 10 ml, baie Laveran.
Pregătirea reactivilor:
Soluţia de lucru
Se amestecă cele două soluţii preparate mai înainte exact în
cantităţile realizate. Se obţine o soluţie clorhidrică de ferocianură de potasiu
care se filtrează şi se foloseşte imediat.
116
Soluţia de colorare May Grunwald 1/1 în apă neutră
Se prepară strict înaintea folosirii prin diluarea unui volum de soluţie
concentrată cu un volum de apă neutră. Se prepară circa 10 ml soluţie de
colorare pentru 5 lame.
Apă neutră se prepară prin amestecarea a 9 volume de apă distilată
cu 1 volum de apă de robinet.
Modul de lucru:
Frotiurile şi amprentele uscate la aer se fixează în alcool metilic timp
de 1 minut, apoi se usucă la aer.
Se scufundă lamele în soluţie clorhidrică de ferocianură de potasiu
timp de 15 minute, după care se spală în apă curentă de robinet timp de 10
minute.
Se colorează timp de 5 minute în soluţie de colorare May Grunwald
1/1.
Se colorează timp de 30 minute în soluţie de colorare Giemsa 10%.
Se spală în curent de apă de robinet apoi se usucă la aer.
Rezultate:
Granulele sau aglomeraţiile de fier feric (Fe+++) sunt colorate în
verde. Nucleii sunt coloraţi în albastru; citoplasma apare în nuanţe de
albastru-palid sau roz (fig. 37).
117
LABORATOR 11
Evidenţierea peroxidazelor
Materiale necesare:
- alcool metilic, alcool etilic 96%, benzidină;
- perhidrol 30%, soluţie concentrată Giemsa;
- balanţă, cutie cu greutăţi;
- pipete gradate de 10 ml, cilindri gradaţi de 100 ml;
- baloane Erlenmayer de 200 ml, sticle brune cu dop rodat de 100 ml;
- pipete gradate de 2 şi 5 ml, sticluţă de penicilină foarte curată;
- pipete Pasteur, pahare Borrel sau baie Laveran, stativ de colorare.
Pregătirea reactivilor:
118
Modul de lucru:
Se fixează frotiurile sau amprentele uscate la aer în alcool metilic
timp de 1 minut. Peste preparatele aşezate orizontal pe un stativ de colorare
se picură cu o pipetă Pasteur curată amestecul alcoolic de benzidină şi
perhidrol preparat. Coloraţia durează 3 minute.
Preparatele se scurg rapid şi sunt spălate într-un vas Laveran la apă
curgătoare timp de 5 minute. Se controlează coloraţia la microscop. Dacă s-
au format precipitate aciculare, lamele sunt ţinute 10 minute într-o baie de
alcool metilic. Se colorează în baia Laveran timp de 30-45 minute în soluţia
Giemsa 10%. Se spală preparatul colorat în flux moderat de apă de robinet
apoi se usucă la aer.
Rezultate:
Eritrocitele şi zonele de activitate peroxidazică din leucocite se
colorează în nuanţe de gălbui sau brun-gălbui. Eritroblaştii se colorează în
verde din cauza amestecului culorii gălbui a hemoglobinei cu nuanţele de
albastru care rezultă din colorarea ribozomilor citoplasmatici cu colorantul
Giemsa. Nucleii se colorează în albastru (fig. 38).
119
LABORATOR 12
Materiale necesare:
- beta-glicerofosfat de sodiu, azotat de plumb, soluţie Giemsa
concentrată;
- sulfură de amoniu proaspătă (preparată în laborator), formol;
- acid acetic glacial, acetat de sodiu cu trei molecule de apă de
cristalizare;
- balanţă, cutie cu greutăţi, pipete gradate de 2 ml şi 10 ml, cilindri
gradaţi de 100 ml;
- baie Laveran, pahare Borrel, cutie Peri, hârtie de filtru, pâlnie de
sticlă;
- baloane Erlenmayer şi sticle de diferite capacităţi pentru soluţii.
Pregătirea reactivilor:
120
- soluţia B: se dizolvă 2,7 g acetat de sodiu cu trei molecule de apă de
cristalizare în 100 ml apă distilată;
Pentru obţinerea unei soluţii-tampon cu pH=4 se amestecă: 80 ml
din soluţia A cu 20 ml din soluţia B.
Soluţia de incubare
Se amestecă 30 ml soluţie-tampon acetat cu pH=4, cu 10 ml soluţie
beta-glicerofosfat de sodiu 2%, cu 10 ml soluţie azotat de plumb 2% şi cu
50 ml apă distilată. După preparare, soluţia de incubare se ţine timp de 24
ore la 370C şi se filtrează înainte de folosire.
Modul de lucru:
Amprentele sau frotiurile sunt uscate la aer şi apoi fixate cu vapori
de formol concentrat timp de 3 minute, la temperatura camerei, iar apoi se
continuă fixarea în vapori de formol calzi la 370C încă 6 minute. Pentru
aceasta, lamele de fixat se pun într-o cutie Petri mare, al cărei capac este
tapetat cu hârtie de filtru îmbibată în formol concentrat.
Se spală preparatele timp de 5 minute în curent de apă de robinet.
Se incubează preparatele în soluţie de incubare, într-un vas Laveran
cu capac, timp de 6-8 ore la 370C, apoi se spală lamele 2 minute la curent de
apă de robinet.
Se virează 2 minute în soluţie diluată de sulfură de amoniu şi apoi se
spală din nou lamele în două băi de apă distilată a câte două minute fiecare.
Se colorează preparatele cu soluţia Giemsa 10% în apă neutră timp
de 30 minute.
Se spală în curent de apă de robinet şi se usucă la aer.
121
Rezultate:
Punctele de activitate acidfosfatazică sunt marcate printr-un
precipitat brun-negru. Nucleii apar coloraţi în albastru, iar citoplasma
diverselor tipuri de celule, în albastru palid sau roz.
122
LABORATOR 13
A. Metoda cu beta-glicerolfosfat
Principiu:
Constă în clivarea substratului glicerofosforic în prezenţa enzimei,
eliberând ioni fosforici care, cu nitratul de calciu formează fosfatul de
calciu. Fosfatul de calciu trece în fosfat de cobalt care, la rândul lui este
transformat în sulfură de cobalt de culoare neagră.
Materiale necesare:
- alcool metilic absolut (1/9), soluţie substrat tamponată;
- soluţie apoasă de safranină 2%;
- nitrat de calciu 2%, nitrat de cobalt 2%, sulfură de amoniu;
- cilindri gradaţi de 100 ml, baie Laveran, pahare Borrel;
- cutii Petri, pâlnie de sticlă, baloane Erlenmayer;
- pipete gradate, lame, lamele, sticle de diferite capacităţi pentru
soluţii;
- tifon, hârtie de filtru;
- materialul biologic.
Modul de lucru:
Fixarea frotiului de sânge sau măduvă se face, timp de 3 secunde,
într-un amestec format din 10 ml formol şi 90 ml alcool metilic absolut,
123
după care se spală câteva secunde. Se incubează timp de 2 ore la 370C într-o
soluţie de substrat tamponată, proaspăt preparată, care conţine:
- veronal sodic 10%.....................30,0 ml
- beta glicerofosfat de Na 3%......30,0 ml
- sulfat de magneziu M/10...........30,0 ml
- nitrat de calciu 2%.....................45,0 ml
- apă distilată .............................165,0 ml
După incubare urmează o spălare cu apă distilată în care s-au pus
câteva picături de nitrat de calciu 2%, timp de câteva secunde.
Se introduce lama într-o soluţie de 2% nitrat de cobalt şi se lasă 5
minute, apoi se spală temeinic cu apă, după care se acoperă frotiul cu o
soluţie slabă de sulfură de amoniu (circa 1 ml sulfură de amoniu la 80 ml
apă) lăsându-se în contract 10 secunde.
Se spală bine şi se colorează cu o soluţie apoasă de 2% safranină,
timp de 10 secunde. Se spală bine şi se usucă la aer.
Principiu
În această metodă este folosit ca substrat naftilfosfatul. Grupele de
naftol libere se unesc cu o sare de diazonium (Fast blue) formând un
precipitat insolubil, colorat bine, vizibil la locul acţiunii enzimei.
Materiale necesare:
- amestec metanol/formol (9-1), mediu de incubaţie;
- hidroxid de sodiu 1N, soluţie Hemalaun Mayer;
- cilindri gradaţi de 100 ml, baie Laveran, pahare Borrel;
- cutii Petri, hârtie de filtru, pâlnie de sticlă, baloane Erlenmayer;
- pipete gradate, lame, lamele, sticle de diferite capacităţi pentru
soluţii.
Modul de lucru:
Frotiurile proaspete sau amprentele ce urmează a fi studiate se
fixează 45 de secunde în metanol-formol (9/1=metanol 9 părţi şi formol 1
parte).
Fixatorul se păstrează la 40C. După fixare, preparatele se spală la apă
curentă timp de 45 de secunde.
Preparatele astfel fixate se ţin 2 ore la temperatura camerei în
următorul mediu de incubaţie, preparat:
124
- 0,2 M 2amino-2metil-1,3-propandiol …8,3 ml
- acid clorhidric M/10 …………………..1,7 ml
-apă distilată …………………………….33 ml
- natriu alfa metol acid fosfat ……………35 ml
- Fast blue RR ………………………… 35 ml
- pH-ul final al soluţiei de mai sus trebuie să fie peste 9. El se poate
ajusta cu câteva picături dintr-o soluţie de hidroxid de sodiu 1N.
După cele 2 ore de incubare preparatele trebuiesc spălate cu apă. Se
colorează apoi preparatele cu Hemalaun Mayer timp de 5 minute.
Pe scurt dăm câteva explicaţii şi indicaţii cu privire la prepararea a
două dintre soluţiile de mai sus.
Hemalaunul Mayer
Se dizolvă într-un 1 litru de apă distilată caldă 50 g alaun de potasiu
şi 0,2 g de natriu iodat. Se agită. După răcire se adaugă 1 g hematoxilină.
Soluţia se lasă la temperatura camerei până apare o culoare violet-albastră.
Se adaugă 50 g clorat hidrat şi 1 g acid citric. Se agită din nou şi apoi se
fierbe timp de 5 minute. Se filtrează soluţia şi se păstrează la temperatura
camerei.
Rezultate:
În citoplasmă, zonele de activitate fosfatazică apar colorate în brun
mai mult sau mai puţin intens. Nucleul se colorează în albastru. Reacţia
fosftazei alcaline este negativă pentru limfocite, monocite, eozinofile,
plasmocite şi celule tinere blastice. În funcţie de numărul şi mărimea
granulelor, reacţia fosfatazică se notează: absentă, slab pozitivă, intens
pozitivă.
Se examinează 400 de granulocite neutrofile segmentate şi se
notează procentajul celulelor cu reacţia intens pozitivă, procentul celulelor
cu reacţie slab pozitivă şi al celulelor cu activitate fosfatazică absentă.
Interpretare:
În mod normal granulocitele segmentate neutrofile prezintă o slabă
activitate fosfatazică alcalină. În leucoza mieloidă activitatea fosfatazică
este mică sau absentă (fig. 40). Activitatea fosfatazică este mult crescută în
125
reacţiile leucemoidale privind seria granulocitară ca: infecţii tuberculoasă,
carcinomatoza, policitemia adevărată (fig. 41).
Pentru o exprimare cifrică a unei asemenea activităţi se foloseşte
metoda scorului, care se calculează după cum urmează: se adună cifra
procentuală a elementelor celulare aflate în activitate medie cu dublu
procentului de granulocite cu activitate crescută scorului.
La leucemia mieloidă cronică, fosfataza alcalină granulocitară se
apropie de 0, în timp ce în policitemia vera, de cele mai multe ori depăşeşte
100.
Scorul amintit este util în mod deosebit pentru identificarea
leucemiei nucleoide cronice şi a stărilor leucemoide, la aceasta din urmă
fiind normal sau crescut.
Exploatarea fosfatazei alcaline se mai practică în o serie de boli
infecţioase, hepatobiliare, obstetricale şi ginecologice, limfoproliferative, în
plasmocitemii, anemii, etc.
126
Fig. 41. Policitemia vera – granulocite cu activitate fosfatazică
alcalină intens pozitivă
127
LABORATOR 14
Materiale necesare:
- seruri hemostat: 0 (anti-A, B), A (anti-B), B (anti-A);
- lame, pipetă, ac steril, vată, alcool;
- sânge de cercetat.
128
Determinarea aglutinogenelor (Proba Beth-Vincent)
Metoda pe lamă
Pe o lamă se pun succesiv, cu pipete diferite, câte o picătură de ser
hemostat în ordinea următoare: 0 la stânga, A la mijloc, B la dreapta.
Cu colţul unei lame se adaugă o mică cantitate de sânge pe fiecare
picătură de ser, schimbând colţul lamei pentru fiecare picătură de ser
hemostat, amestecându-se pentru omogenizarea, iar picătura de sânge să fie
de circa 10 ori mai mică decât cea de ser; sângele se recoltează steril prin
înţeparea pulpei degetului.
Lama se ia în mână şi i se imprimă o mişcare lentă, rotativă (fig. 43).
Citirea se face în primele 2-3 minute, cu ochiul liber (fig. 44).
129
Fig. 44. Determinarea aglutinogenelor (Proba Beth-Vincent) –
interpretarea rezultatelor
Interpretarea rezultatelor
Dacă în toate trei picăturile nu apare nici o aglutinare, amestecurile
rămân uniforme, colorate în roz, sângele de cercetat aparţine grupei 0. Dacă
apare aglutinare cu serurile 0 şi B şi lipsă de aglutinare cu serul A, sângele
de cercetat aparţine grupei A. Dacă apare aglutinare cu serurile 0 şi A şi
lipsă de aglutinare cu serul B, sângele cercetat aparţine grupei B. Dacă apare
aglutinare cu toate cele trei seruri, atunci sângele cercetat aparţine grupei
AB (fig. 44 46, A).
130
Fig. 45. Compatibilitatea grupelor de sânge
Metoda pe lamă
Pe o lamă se pun trei picături din serul de cercetat.
Pe prima picătură de la marginea stângă se adaugă eritrocite 0, pe
picătura din mijloc se adaugă eritrocite A şi pe picătura din dreapta eritrocite
B. Adaosul şi amestecul pentru fiecare picătură se face cu colţul unei lame,
aceasta schimbându-se la fiecare picătură.
Raportul între eritrocite şi ser trebuie să fie aproximativ 1/10.
Citirea se face prin rotirea lentă a lamei în primele 2-3 minute, cu
ochiul liber.
Interpretarea rezultatelor
Reacţia trebuie să fie negativă cu eritrocite 0 pentru toate cele trei
posibilităţi. Aglutinarea cu eritrocite A şi B arată că serul conţine aglutinine
anti-A şi anti-B, iar sângele cercetat aparţine grupei 0. Lipsa de aglutinare
131
cu eritrocite A şi eritrocite B arată că serul conţine aglutinine anti-B, iar
sângele cercetat aparţine grupei A. Aglutinarea cu eritrocitele A şi lipsa
aglutinării cu eritrocitele B arată că serul conţine aglutinine anti-A, iar
sângele cercetat aparţine grupei B. Când nu apare aglutinare nici cu
eritrocitele A şi nici cu eritrocitele B, serul este lipsit de aglutinine anti-A şi
anti-B, iar sângele cercetat aparţine grupei AB (fig. 46, B).
Determinarea Rh-ului
132
Modul de lucru:
O picătură de ser anti Rh cu o picătură de sânge de cercetat se
amestecă pe o lamă şi se lasă o oră la 370C. Pentru accelerarea reacţiei se
poate adăuga 1 picătură de papaină (reacţia se produce în 10 minute).
Rezultate:
Dacă picătura aglutinează, sângele este Rh+ (85% din cazuri).
Dacă picătura nu aglutinează, sângele este Rh- (15% din cazuri).
133
LABORATOR 15
Materiale necesare:
- soluţie de acridin-orange 0,02% la pH=1,5-3,5;
- alcool metilic, soluţie Ringer-Krebs;
- lame, lamele, pahare Berzelius de 150 ml;
- cilindru gradat de 500 ml;
- pipetă de 5 ml, pipetă gradată de 10 ml, material biologic.
Pregătirea reactivilor:
Soluţia de acrin-orange
Se dizolvă 0,1 g acridin-oranj în 500 ml apă de robinet, înainte de
folosire.
Modul de lucru:
Frotiul de nuclei sau celule se usucă la aer şi apoi se fixează în alcool
metilic timp de 15 minute.
Se colorează cu soluţia de acridin-orange 0,02% la pH=1,5-3,5 timp
de 10-20 minute. Excesul de colorant se îndepărtează prin spălare cu o
soluţie Ringer-Krebs. Examinarea preparatelor la microscop în flourescenţă.
Rezultate:
ADN-ul prezintă o fluorescenţă verde, ARN-ul prezintă o
fluorescenţă roşie.
134
LABORATOR 16
Materiale necesare:
- acid percloric 0,5 N;
- balanţa de torsiune;
- mojar cu pistil, sticlă pisată;
- bec de gaz;
- pahar Berzelius de 250 ml;
- centrifugă, eprubete de centrifugă;
- spectofotometru Beckman;
- material biologic.
Modul de lucru:
Ţesutul animal proaspăt recoltat (între 5-20 g) se cântăreşte precis la
balanţa de torsiune şi se notează greutatea, apoi ţesutul se majarează cu
sticla pisată şi se trece în eprubete de centrifugă, adăugând 5 ml acid
percloric 0,5 N (spălând mojarul de mai multe ori cu acid percloric, dar fără
a depăşi volumul de 5 ml acid percloric).
Eprubetele cu ţesut şi acid percloric se fierb pe baie de apă, timp de
30 minute. După fiecare fierbere eprubetele se răcesc şi se centrifughează 10
minute la 5000 rotaţii/min.; supernatantul se trece în cuve de 10 mm şi se
citeşte extincţia în UV, la două lungimi de undă diferite la spectofotometru
Beckman: λ=270 nm şi λ=290 nm, notându-se valorile pentru fiecare citire
faţă de acid percloric (martor).
135
Rezultate:
Calculul rezultatelor
Se face diferenţa între valoarea extincţiei la λ=270 nm şi la λ=290
nm, pentru aceeaşi probă, iar rezultatul se împarte la factorul 0,19 şi se află
concentraţia fosfatului din acizii nucleici într-un ml de extract în acid
percloric.
a) Calculul fosfatului se face după formula:
unde:
Conc. P(A.N.)= concentraţia fosfatului de acizii nucleici exprimat în mg/ml
extract.
E270 şi E290 = extracţia hidrolizatului total la λ=270 nm şi la λ=290 nm.
0,19 = indicele extincţiei specifice pentru A.N.
unde:
10,3 = coeficientul mediu de transformare a concentraţiei de fosfat în
concentraţie de acizi nucleici (A.N.)
136
d) Calculul concentraţiei de acizi nucleici dintr-un gram de ţesut
proaspăt.
Exemplu:
137
LABORATOR 17
Materiale necesare:
- aparat de electroforeză;
- hârtie de filtru specială pentru electroforeză (Whatman nr.1,
4, 100, Schleicher Schull nr.2043 B, 2024).
Pregătirea reactivilor:
139
a) tampon veronal pH=8,6 f.i 0,075
Se obţine din 3 vol. soluţie de bază + 1 vol. apă distilată
b) tampon veronal pH=8,6 f.i. 0,05
Se obţine din 1 vol. soluţie de bază + 1 vol. apă distilată
c) tampon veronal pH=8,6 f.i. 0,035
Se obţine din 1 vol. soluţie de bază + 2 vol. apă distilată
d) tampon veronal pH=8,6 f.i. 0,025
Se obţine din 1 vol. soluţie de bază + 3 vol. apă distilată
Soluţii de coloranţi:
- Albastru de bromfenol – 0,1 g sau 1 g
Se prepară din sulfat de zinc (50 g), acid acetic glacial (50 ml) şi apă
distilată până la 1000 ml.
- Azocarmin B – 1 g
Se obţine din acid acetic glacial (28,2 ml), acetat de sodiu (3,96 g), glicerină
(100 ml) şi apă distilată până la 1000 ml.
- Amidoschwartz 10 B – 1 g
Rezultă din amestecul alcool metilic (900 ml) şi acid acetic glacial (100 ml).
- Naftalen negru 12 B 200 – 1 g
Conţine: acid acetic 10% - 1000 ml
- Verde Geigy – 1 g
Conţine: acid acetic 10% - 1000 ml
Soluţia de spălare
Conţine: acid acetic – 2 ml; apă distilată – 100 ml
Soluţia de viraj
Conţine: acid acetic – 10 ml; acetat de sodiu – 5 g; apă distilată –
100 ml.
Soluţia de eluare
Conţine:
- carbonat de sodiu – 4 g;
- metanol – 50 ml;
- NaOH – 4 g;
- apă distilată – 1000 ml.
Modul de lucru:
Se montează camera de electroforeză pe o masă perfect orizontală
(control cu bula de nivel). Cele două bacuri se încarcă cu soluţie tampon,
140
fiind aduse la acelaşi nivel cu ajutorul sifonului. Hârtia de filtru specială,
tăiată fâşii cu dimensiunile cerute de aparat (25cm/2cm) se numerotează, se
impregnează una câte una în soluţie tampon şi se aşează în aparat unde sunt
fixate orizontal prin adeziune de ramele bacurilor; capetele benzilor trebuie
introduse cel puţin 1 cm în soluţia tampon din cele două bacuri. Se
corectează cuvele la redresor; se reglează amperajul (0,2 mA/cm lăţime) şi
aparatul este lăsat să funcţioneze 30 minute pentru echilibrarea sistemului.
Se închide aparatul, se aplică serul de cercetat (0,005-0,01 ml) care trebuie
să fie clar şi nehemolizat. Aplicarea probei se face la capătul catodic (-) pe
banda de hârtie cu o micropipetă.
Se redeschide aparatul pentru controlul migrării, apoi se colorează
serul amestecând în el câteva cristale de albastru de bromfenol. Colorantul
migrează cu frontul aluneinelor. Durata de migrare variază între 4-5 ore
(migrare rapidă) sau între 16-18 ore (migrare lentă). Viteza de migrare
variază după pH-ul soluţiei tampon şi tensiunea la borne, amperaj, lăţimea
benzilor de hârtie, cantitatea de ser.
Când se constată că desfăşurarea migrării s-a terminat, se deschide
aparatul, se scot benzile de hârtie şi se usucă. După uscare benzile sunt
introduse într-o soluţie de colorant (30 minute – 12 ore) – soluţie de albastru
de bromfenol 0,1g – 1%; timpul de colorare variază după concentraţia
colorantului. Excesul de colorant se înlătură trecând proteinograma (benzile
de hârtie) prin trei băi de spălare (2 ml acid acetic + 100 ml apă distilată),
timp de 10 minute primele 2 băi şi 5 minute ultima baie. Se trec benzile 2
minute în soluţie de viraj (acid acetic + acetat de sodiu + apă distilată) şi
apoi se usucă benzile la etuvă (10-20 minute la 800C). După uscare se trece
la măsurarea densităţii optice a colorantului fixat pe fracţiunile desfăşurate
electroforetic prin fotometrare directă (aparat special) sau prin eluţia
colorantului din fiecare zonă şi măsurarea densităţii optice a soluţiei
obţinute cu fotometrul obişnuit. Pentru eluarea spoturilor se pregătesc 5
eprubete, prima eprubetă din serie purtând numărul probei corespunzătoare.
Luându-se benzile în ordinea numerotării, se taie cu foarfeca fiecare zonă
colorată şi se introduce în eprubeta corespunzătoare din seria de 5, în
ordinea migrării: în prima eprubetă albuminele apoi alfa-1, alfa-2, beta şi
gammaglobulinele. Tăierea se face pe zona cea mai puţin colorată dintre
fracţiuni. Se pipetează pe fiecare eprubetă câte 5 ml soluţie de eluare
(carbonat de sodiu + metanol + apă distilată), peste fragmentele de hârtie, se
pune dopul şi se agită puternic. Pentru o bună eluare se lasă 30 minute.
Extincţia eluentului fiecărei fracţiuni se citeşte la λ=590 nm, în cuve
de 1 cm, faţă de apa distilată. Se face suma extincţiilor celor 5 fracţiuni ale
unei probe şi se egalează cu 100. Prin regula de trei simplă se calculează
procentajul fiecărei fracţiuni faţă de această sumă.
141
Rezultate:
La serul normal prin electroforeza pe hârtie se disting 5 fracţiuni:
albumină, afla 1, alfa 2, beta şi gamma, care cu excepţia gammaglobulinelor
migrează spre anod, fracţiunea gamma care este electiv neutră migrează spre
catod datorită electroendosmozei (fig. 48).
142
LABORATOR 18
Metoda disc-electroforezei
Materiale necesare:
- redresor
- două blocuri din material plastic în care sunt inserate tuburile care
conţin gel
- tuburi de sticlă de capacitate egală
- parafină sau plastilină
Pregătirea reactivilor:
- Tampon TRIS pH=8,9
Conţine: TRIS=4,5 g, HCl 1 N=6 ml, apă=100 ml.
- Tampon TRIS pH=8,3
Conţine: TRIS=0,6 g, glicocol=2,8 g, apă=1000 ml
- Acrilamidă, Bisacrilamidă
- TEMED
- Persulfat de sodiu
- Soluţie de albastru de bromfenol
Conţine: albastru de bromfenol=1 mg, apă=100 ml
- Soluţie de sucroză 20%
Conţine: sucroză=20 g, apă=100 ml, sau o picătură de glicerină ca atare
- Soluţie de colorare
Conţine: amidoschwartz=1 g sau 0,1-0,2%, acid acetic 7%=100 ml
- Acid acetic 7%
Conţine: acid acetic=7 ml, apă=100 ml
- Soluţii de decolorare
Conţine: acid acetic 7%
- Gel de acrilamidă
143
Gelurile de acrilamidă se obţin prin polimerizarea acrilamidei sub
acţiunea activatorului metilen bisacrilamidă. Formarea polimerului poate fi
indusă pe cale fotochimică sau chimică. Fotopolimerizarea se face în lumină
flourescentă în prezenţa de N, N, N', N', tetrametilendiamidă (TEMED), iar
polimerizarea chimică cu amestec de catalizatori persulfat de amoniu şi
TEMED (0,2 g%).
Reacţia nu are loc în prezenţa oxigenului atmosferic. Polimerizarea
este completă după 3 ore. Concentraţia de monomer poate varia de la 3 la
30%.
În tabelul de mai jos se dau grame substanţe % ml amestec acrilamidă:
Metoda II
Se prepară soluţiile 1, 2, 3 şi 4 care sunt păstrate la frigider timp
îndelungat, iar în momentul folosirii se face amestecul după formula de mai
jos:
Soluţia 1
Conţine: acrilamidă – 28 g, bisacrilamidă – 0,75 g, apă distilată adus
la 100 ml.
Soluţia 2
Conţine: NaCl 1N – 48 ml; TRIS – 36,6 g; TEMED – 0,23 µl.
Soluţia 3
Conţine: persuflat de amoniu – 0,28 g; apă distilată adus la 100 ml.
Soluţia 4
Conţine: apă distilată
Amestec:
2 vol. soluţia 1 + 1 vol. soluţia 2 + 4 vol. soluţia 3 + 1 vol. soluţia 4.
Se agită şi apoi tuburile sunt umplute ca în cazul metodei I.
Se recomandă ca înălţimea stratului de poliacrilamidă să fie aceeaşi
în toate tuburile.
Cu ajutorul unei pipete Pasteur bine efilată să se umple spaţiul rămas
liber din tub cu apă distilată şi se lasă până a doua zi.
Cantităţile de mai sus au fost date pentru un aparat în care se pun 6
tubuleţe de 8 cm lungime şi cu un diametru de 0,5 cm. În cazul altor
dimensiuni de tuburi se vor mări cantităţile păstrându-se însă proporţiile.
Modul de lucru:
Punerea probei: 0,01 ml probă 600-1000 µg (proteine extrase din
membrana eritrocitară) la care se adaugă sucroză pentru a forma o soluţie
145
10% (deci 0,01 g) sau glicerină. Sucroza măreşte densitatea soluţiei proteice
şi nu permite amestecarea ei cu tamponul.
Tubuleţele sunt fixate în partea de sus a aparatelor (după ce în
prealabil s-a scos parafilmul sau plastilina şi apa de deasupra) şi apoi sunt
scufundate în cuva inferioară 1-2 cm intrând în tampon.
În cele 2 cuve (de sus şi de jos) se pun câte 200 ml tampon TRIS
pH=8,3 sau cantitatea necesară în funcţie de dimensiunile cuvelor cu care se
lucrează.
Se lasă sistemul de echilibrare 1-2 ore.
Se reglează amperajul la 4 mA/tub şi se lasă gelul pentru echilibrare.
Se opreşte apoi aparatul şi se pune proba direct în fiecare tub, fără a-l scoate
din cuvă.
Timpul de migrare este de aproximativ 4 ore, migrarea probei se
observă după nivelul colorantului. După migrare se opreşte aparatul şi se
scoate cu grijă gelul din tub cu ajutorul unei seringi. Se lasă gelul în colorant
de la 10 minute la 30 minute, apoi urmează decolorarea. Astfel, gelurile se
spală cu soluţia apoasă de acid acetic 7% schimbându-se soluţia pe măsură
ce se colorează.
Spălarea se continuă până când tot colorantul nelegat de proteine
este eliminat din gel.
Rezultate:
După o bună spălare fracţiunile proteice apar colorate în albastru
intens sau negru, iar gelul devine incolor şi transparent.
Gelurile pot fi păstrate timp îndelungat în eprubetele cu acid acetic
3%.
Pentru interpretarea rezultatelor, benzile se desenează la scara 1/1 pe
hârtie milimetrică şi se măsoară cu precizie poziţia fiecărei benzi în gel şi
lăţimea benzilor.
Metoda pe plăci
Gelul poate fi turnat şi într-o cuvă de plastic iar după solidificare
(gelificare) se poate tăia exact după dimensiunile aparatului de
electroforeză. Gelul este pus pe un suport şi lăsat să migreze în aparatul de
electroforeză, legătura cu bacurile făcându-se cu hârtie de filtru obişnuită.
Pentru o placă de sticlă cu dimensiunile de 6,5×30×0,3 sunt necesare
aproximativ 6 ore de migrare atunci când se aplică o diferenţă de potenţial
de 500V.
Etapele de lucru, colorarea şi decolorarea sunt identice cu cele
descrise la metoda Disc-electroforezei.
146
LABORATOR 19
Consideraţii generale
Metoda cromatografiei descendente se realizează într-o cameră
cromatografică cu pereţi de sticlă prevăzută cu două jgheaburi fixate în
partea de sus, care conţine solvenţi neapoşi. Camera cromatografică este
acoperită ermetic cu o placă de sticlă.
În tehnica cromatografică solvenţii organici nemiscibili cu apa sunt
cei mai folosiţi. Înainte de utilizare ei sunt saturaţi cu apă. Saturarea se
efectuează prin agitarea anumitor cantităţi de solvent cu apă într-o pâlnie de
separare.
Amestecul se lasă în pâlnia de separare în repaus 1-2 ore, timp în
care se formează două straturi net diferite:
1- stratul care conţine solventul saturat cu apă
2- stratul apos, utilizat la saturarea cu vapori a camerei cromatografice.
Solvenţilor utilizaţi în cromatografie li se impun următoarele condiţii:
- nu trebuie să denatureze substanţa de cercetat;
- nu trebuie să reacţioneze cu substanţele de identificare, trebuie însă
să separe două sau mai multe substanţe cu structuri asemănătoare.
Diferenţa între Rf trebuie să fie cel puţin 0,05 cm.
Revelatorii
Sunt reactivi care dau în general reacţia de culoare şi sunt specifici
substanţelor de analizat.
Revelatorii pentru aminoacizi
Soluţia de 1% ninhidrină este revelatorul cel mai folosit şi este
comun pentru aminoacizi, peptide şi amine primare. Coloraţia variază de la
albastru la portocaliu în funcţie de natura aminoacizilor. Soluţia de
pulverizat se face de obicei 0,1-0,3% ninhidrină în butanol, alcool 96% sau
acetonă. La soluţia 0,3% ninhidrină în alcool 960 se poate adăuga 2%
cloroform, pentru obţinerea de nuanţe diferite ale spoturilor cromatografice.
Revelatori pentru glucide:
a) Metoda cu nitrat de argint amonical constă în pulverizarea
cromatogramei cu un amestec preparat extemporaneu din
AgNO3 N/10 + NH4OH 5N (volume egale).Spoturile obţinute
sunt de culoare neagră. Reactivul nu este specific deoarece dă
reacţii similare şi cu fenolii;
147
b) Soluţia de monoanilină a acidului ftalic este reactivul specific
glucidelor. Reactivul se prepară prin dizolvarea a 3,3 g acid ftalic
+ 2 ml anilină + 95 ml acetonă + 5 ml apă distilată;
c) Reactivul specific aldozelor: oxalatul de anilină, preparat din
acid axalic-anilină; acidul oxalic este dizolvat în acetonă sau
butanol. Uscarea cromatogramei pulberizate se efectuează la
temperaturi până la 800C;
d) Revelatori specifici cetozelor: naftorezorcinolul în mediul acid.
Se prepară prin amestecul în volume egale al unei soluţii 0,2%
naftolrezorcinol în alcool 96% cu o soluţie de 2% acid
tricloracetic.
În determinările cantitative ale zaharurilor se foloseşte ca reactiv 2%
clorură de trifeniltetrazoliu în soluţie de NaOH 0,5% în alcool metilic. Cu
acest reactiv cromatograma se umectează în întregime şi se lasă timp de 60
minute la 650C. Apoi petele sunt decupate şi evaluate într-o soluţie de 20%
acid acetic în alcool metilic. În aceste condiţii coloraţia soluţiei se menţine
timp de 14 zile. Extincţia se măsoară la fotocolorimetru sau spectofotometru
la λ=482 µm.
Metoda de lucru:
Constă din următoarele etape:
148
extractelor tricloracetice se formează cloroformul, produs care se poate
elimina foarte repede prin încălzire la 250C.
149
uscarea şi identificarea spoturilor; puritatea şi concentraţia substanţei de
analizat; distanţa între frontul solventului şi linia de start se impune să fie de
cel puţin 20-25 cm; durata de irigare de minimum 24 ore.
Pentru determinarea spoturilor cromatografice, în afara de metoda
identificării directe se pot folosi metode chimice şi fizico-chimice.
Studierea cromatogramelor în lumină ultravioletă constituie deseori
un bun mijloc de identificare.
Aparatul cromagrafic poate fi aşezat într-un loc fără mari variaţii de
temperatură, chiar în laborator, însă pentru executarea cromatogramelor în
serie este necesară o cameră specială, pentru a evita atât variaţiile de
temperatură, cât şi atmosfera toxică provocată de solvenţii utilizaţi în
cromatografie.
Identificarea aminoacizilor sau a zaharurilor din sânge prin
cromatografie descendentă.
Aplicarea acestei metode se face atât la sânge cât şi la urină.
Pentru identificarea aminoacizilor sau a zaharurilor în aceste probe
se recurge la operaţiile de defectare şi concentrare. În cazul sângelui total
sau al elementelor figurate din sânge, izolate prin anumite metode, se
impune în prealabil o liză totală apoi se prelucrează lizatul în acelaşi fel ca şi
serul.
Materiale necesare:
La 1 ml ser sau sânge se adaugă 1 ml apă, iar diluţia obţinută se
precipită cu 18 ml alcool etilic. Precipitatul se separă prin centrifugare.
Supernatantul se tratează cu 25 ml cloroform. Prin agitare intensă se
separă două straturi. Stratul apos se evaporă până la uscare. Reziduul se reia
într-o cantitate foarte mică cu alcool izopropilic 10%. Cu serul astfel tratat
se pun în evidenţă aminoacizii liberi.
Pentru evidenţierea aminoacizilor totali, serul este supus hidrolizei
acide (HCl6N) timp de 24 ore. Urina fiind săracă în unii aminoacizi se
impune a se lucra cu o cantitate mai mare de soluţie. Pentru îndepărtarea
sărurilor se folosesc răşini schimbătoare de ioni; astfel se evidenţiază doar
aminoacizii liberi.
Modul de lucru:
Pe fâşia de hârtia de filtru, cu lăţime de 4 cm şi lungime de 2-50 cm
se aplică, la distanţa de 6 cm de la capătul hârtiei, câte 0,01 ml din substanţa
de analizat, cu ajutorul unei micropipete. Pentru a obţine rezultate bune se
recomandă să se depună cantitatea de 0,01 ml soluţie într-o pată circulară
mică. După uscarea spoturilor hârtia de filtru se introduce cu capătul
150
superior în jgheabul de sticlă ce conţine lichidul de irigare (soluţie saturată
butanol-acid acetic-apă 5:10:40 sau fenol-apă 1:1).
Se fixează hârtia cu bagheta de sticlă pentru ca să nu cadă. Se lasă să
irige un timp determinat, menţinând temperatura constantă şi o atmosferă
saturată cu vaporii lichidului de irigare, în timpul irigării lichidului
antrenează în direcţie descendentă aminoacizii din soluţia depusă la punctul
de plecare.
După 15 ore fâşiile de hârtie sunt scoase din aparatul de
cromatografie, uscate în etuvă (105-1100C) şi pulverizate pentru identificare
cu lichidul de developare adecvat, de exemplu, soluţie de ninhidrină 0,1% în
butanol, pentru aminoacizi.
În cursul uscării la etuvă, etapa care urmează developării, apar petele
colorate caracteristice pe fondul alb al hârtiei, pete roz-violet la aminoacizi.
Rezultate:
Identificarea spoturile apărute se face comparativ cu cromatograma,
pe care s-au aplicat aminoacizii cunoscuţi. Modul de lucru este identic ca
pentru probă.
Prin acest procedeu de comparaţie se pot identifica componentele
soluţiilor de cercetat.
Pentru a avea 10-15 aminoacizi martori, determinaţi în acelaşi
condiţii, cromatograma se poate efectua pe coli late de hârtie de filtru (20-40
cm).
În acest caz se pot pune atât soluţiile de cercetat cât şi soluţiile etalon
pe o singură hârtie. Operaţiile sunt aceleaşi de la cromatograma efectuată pe
o hârtie de filtru lată de 4 cm.
Cromatografia de tipul celei descrise, efectuată într-o singură
direcţie numită cromatografia ,,unidimensională“ este completă de
cromatografia ,,bidimensională“, în acest caz se utilizează două lichide de
migrare şi o cantitate dublă de analizat faţă de cromatografia
unidimensională.
151
LABORATOR 20
Consideraţii generale
Schimbătorii de ioni de tip Sephadex au la bază dextranul,
polizaharid al glucozei.
Aceşti schimbători de ioni sunt insolubili în soluţiile slab alcaline şi
acide. În soluţii puternic acide şi mai ales la cald are loc hidroliza legăturilor
glucozidice. Printre cei mai folosiţi schimbători de ioni tip Sephadex se
numără DEAE Sephadex, QAE ca anioni şi, CM Sephadex, SP Sephadex şi
SE sunt cationii.
Alegerea corectă a schimbătorilor de ioni care să posede anumite
grupări active, depinde de sarcina substanţelor de cromatografiat.
Substanţele sunt legate de schimbător, când sarcinile lor sunt de semn
contrar-legarea este electrostatică şi reversibilă. De asemenea, alegerea
acestora este în funcţie de greutatea moleculară a proteinelor, aşa cum se
arată în tabelul de mai jos:
152
Tipul de Sephadex Timpul minim de îmbinare
La temperatura camerei Pe baie de apă
G=10, G=15, G=25 3 ore 1 oră
G=50, G=75 24 ore 3 ore
G=100, G=150, G=200 3 zile 5 ore
LH=20 3 ore -
Colectarea fracţiunilor
Fracţiunile sunt colectate în tuburi la volum constant, manual sau
automat. Viteza de scurgere a eluentului depinde în mare măsură de
dimensiunile particulelor schimbătorilor.
Dimensiunile de 40-20 mesh sunt folosite pentru scurgeri rapide.
Dimensiunile de 200-400 mesh sunt folosite pentru scurgerile lente.
Debitul de scurgere a eluentului în afară de dimensiunile
schimbătorului depinde de mai mulţi factori ca: diametrul şi lungimea
153
coloanei încărcată cu schimbător, compoziţia tamponului şi presiunea
aplicată.
Regenerarea schimbătorului de ioni tip Sephadex se face prin spălare
cu soluţie salină de concentraţii crescânde. După spălare şi regenerare,
schimbătorul se reechlibrează cu tamponul de pornire şi poate în aceste
condiţii să fie conservat timp îndelungat, în prezenţa unui agent
antimicrobian: azida de sodiu 0,1% sau methiolat 1%.
Materiale necesare:
- coloană cromatografică;
- schimbător de ioni tip DEAE Sephadex A50;
- soluţie tampon fosfat pH=6,6 u/0,02, NaCl;
- soluţie 1% acid sulfosalicilic (sau acid azotic concentrat);
- spectofotometru, tuburi (volum 5 ml);
- pipete, eprubete.
Modul de lucru:
Pe coloana cromatografică de 10/1 cm încărcată cu 0,1 g – 1 g
DEAE Sephadex A50 se pot fracţiona 2 ml ser uman. Serul în prealabil
trebuie să fie dializat faţă de soluţia tampon folosită la echilibrarea coloanei
(tampon fosfat pH=6,6 u/0,02).
Eluarea se face cu acelaşi tampon fosfat pH=6,6 cu concentraţii
crescânde de NaCl, conform figurii de mai jos. Colectarea fracţiunii poate fi
făcută manual sau automat, în tuburi cu volum de 5 ml.
Prezenţa sau absenţa proteinei se controlează cu o soluţie de 1% acid
sulfosalicilic sau cu acid azotic concentrat.
Rezultate:
Determinarea cantitativă a fracţiunii proteice se face prin absorbţie
specifică în ultraviolete (λ=280 um). Pentru obţinerea celor mai bune
154
separări de proteine este folosită proporţia 1 g schimbători de ioni Sephadex
la 0,1 g proteine.
155
LABORATOR 21
Materiale necesare:
- alcool etilic 960, benzină, acetonă, alcool metilic;
- balon Erlenmayer de 250 ml, pipetă, bec de gaz (lampă de spirt);
- sticlă de ceas, hârtie de filtru, cilindru sau borcan de sticlă;
- dop de cauciuc (care să acopere perfect cilindru sau borcanul de
sticlă) străbătut de o baghetă de sticlă îndoită sub forma unui cârlig.
Modul de lucru:
156
Hârtia de filtru se fixează la acest cârlig cu capătul opus dungii
colorate. Pe fundul cilindrului se găseşte un amestec compus din benzină 30
părţi, acetonă 1 parte şi alcool metilic 0,3 părţi.
Hârtia de filtru se ţine suspendată deasupra amestecului timp de 30
minute pentru ca în cilindru să se formeze o atmosferă saturată în vaporii
celor trei substanţe din amestec (fig. 50).
Rezultate:
După trecerea celor 30 minute, se apasă bagheta pentru a introduce
capătul inferior al hârtie de filtru, pe o distanţă de 0,5 cm în solvent. Acesta
(solventul) se ridică de-a lungul hârtiei şi antrenează cu sine pigmenţii, care
datorită gradului diferit de absorbţie se repartizează astfel (fig. 51):
- la partea superioară – carotina – marcată printr-o dungă
portocalie; urmează apoi – xantofila – de culoare galbenă;
- pigmenţii verzi, fiind absorbiţi mai puternic, se găsesc la partea
inferioară şi anume: clorofila a – de culoare verde-albăstruie şi
sub aceasta clorofila b de culoare verde-gălbuie.
157
Fig. 51. Ordinea de separare a pigmenţilor clorofilieni
158
LABORATORUL 22
160
Fiecăreia dintre hemoglobine i se poate descrie o ,,formulă“, care
cuprinde simbolul lanţurilor, numărul lor şi tipul hemoglobinei. De exemplu
principala hemoglobină normală a adultului (A) cuprinde două lanţuri alfa şi
două lanţuri beta. Structura sa este notată: α2A, β2A.
Hemoglobinele umane normale sunt:
- embrionare: Grower 1 (ξ2, ε2), Gower (α2A, ε2), Pertland (ξ2, γ2)
- fetală: (α2A, γ2F)
- adulte: majoră, A (α2A, β2A) şi minoră, A2 (α2A, β2A).
Materiale necesare:
- ser fiziologic, apă distilată, pipetă de 5 sau 10 ml;
- balon Erlenmayer de 150 ml, eprubete de centrifugă, centrifugă.
Modul de lucru:
Sângele recoltat pe un anticoagulat este lăsat câteva ore pentru
sedimentarea hematiilor. Plasma supernatantă şi stratul subţire de globule
care se depune deasupra hematiilor se îndepărtează cu ajutorul unei pipete.
Se adaugă o soluţie izotonică (ser fiziologic – NaCl 0,15 M); se face
o centrifugare la 3000 rot./min. timp de 10 minute. Se repetă operaţiunea de
spălare şi centrifugare de două ori, de fiecare dată se îndepărtează
supernatantul şi se păstrează sedimentul.
După cele două spălări se obţine un sediment de celule eliberat de
plasma cu care erau amestecate. Se îndepărtează supernatantul şi se adaugă
apa distilată. Se lasă hematiile 10 minute în apă distilată, timp în care
acestea (hematiile) se umflă datorită osmozei, plesnesc, eliberând conţinutul
lor (hemoglobinei) în lichidul înconjurător.
Învelişurile hematiilor (,,fantomele“) şi resturile celulare se separă
printr-o centrifugare la 3000 rot./min. timp de 20 minute.
Rezultate:
Deoarece conţinutul globulelor roşii este reprezentat în cea mai mare
parte de hemoglobină, supernatantul constă practic dintr-o soluţie de
hemoglobină.
Această soluţie de Hb se titrează fotometric pentru a afla
concentraţia se citeşte extracţia la lungimea de undă 540 nm faţă de etalonul
de hemoglobină.
Pentru separarea diferitelor tipuri de hemoglobină se utilizează
cromatografia prin schimbători de ioni (CM Sephadex C50).
161
Fig. 53. Comparaţie între molecula de hemoglobină şi cea de clorofilă
162
LABORATOR 23
Materiale necesare:
- fixator Bouin, serie de alcool (50, 70, 90, 95, 100), benzol, (toluen),
- parafină (lichidă la 58-60), acid tricloracetic 5%,
- soluţie verde intens FCF 0,1%, NaOH 1 N, apă distilată,
- balsam de Canada, xilen, baie Laveran,
- pahare Borrel, cilindru gradat de 100 ml, pipete de 2,5 şi 10 ml,
- pahare Berzelius de 150 ml, lame, lamele, baghetă de sticlă, tifon,
- hârtie de filtru, bisturiu, foarfece, bec de gaz.
Prepararea reactivilor:
Modul de lucru
Se utilizează fragmente de organe sau ţesuturi proaspete, foarte mici.
Fixarea materialului biologic în formol neutru timp de 24 de ore.
Deshidratarea şi clarificarea se fac pentru scoaterea apei din ţesuturi
(apa este miscibilă cu parafina sau cu solvenţi ai parafinei). Deshidratarea se
face prin trecerea pieselor în băi succesive de alcooluri, din ce în ce mai
concentrate, până la alcoolul absolut (500, 700, 900, 950, 1000); clarificarea
se face prin spălarea pieselor în câteva băi de benzol sau toluen, pentru a
îndepărta alcoolul din ţesuturi şi a-l înlocui cu substanţe în care parafina este
solubilă; în cursul acestei operaţii piesele devin semitransparente (se
clarifică).
163
Incluziunea în parafină se realizează prin introducerea pieselor în 2-3
băi de parafină lichidă, la termostat la 580C, timp de 12-24 ore după mărirea
pieselor, pe o placă de sticlă încălzită se aşează două bare metalice, formând
un cadru în care se toarnă parafină lichidă. Rapid în parafina lichidă se
introduc piesele dându-le orientarea necesară în vederea secţionării lor după
un anumit plan. După solidificarea parafinei se fac blocuşoare mici,
îndepărtând restul de parafină. Impregnarea cu parafină a conferit piesei
consistenţa necesară în vederea secţionării.
Secţionarea la microtom se realizează prin plasarea pieselor pe
portobiectul microtomului, căruia i se imprimă o mişcare de înaintare spre
briciul care va secţiona piesa; se execută secţiuni de 8-10 microni; secţiunile
se aranjează pe un suport (hârtie, cutie etc.) în ordinea succesiunii lor.
Întinderea şi uscarea secţiunilor se face pe lame de sticlă pe care în
prealabil se întinde un strat subţire de albumină glicerinată; lamele se
încălzesc uşor având grijă să nu se topească parafina. În acest timp parafina
se ,,descreţeşte“ putând fi bine întinsă pe lamă; excesul de lichid se scurge
iar preparatele se pun la uscat în etuvă la 370C.
Deparafinarea şi hidratarea secţiunilor se realizează prin trecerea
preparatelor prin 2-3 băi de benzol sau xilon care dizolvă parafina din
secţiuni; prin băi succesive de alcooluri din ce în ce mai diluate, secţiunile
se hidratează deoarece coloranţii, în majoritatea lor, sunt soluţii alcoolice
sau apoase. Pentru a putea face colorarea cu verde intens FCF se trec
preparatele prin băi succesive de alcooluri (1 min/baie) 1000, 950, 700, etc.
până la apă distilată.
Tratarea cu acid tricloracetic 5% se realizează prin introducerea
pieselor pentru 15 minute în soluţie de acid tricloracetic 5% la fierbere. Prin
acest tratament acizii nucleici (ADN, ARN) sunt scindaţi şi trecuţi în soluţie
sub formă de nucleotide. Lamele se scot din acid tricloracetic şi se clătesc în
trei băi de apă distilată (2min/baie).
Colorarea. Piesele se plasează în colorant – soluţie verde intens FCF
0,1% la care s-au făcut corecţia de pH=8,6 cu NaOH 1 N. Colorarea pieselor
se face timp de o oră. După colorare piesele se clătesc în 2 băi de apă
distilată;
Deshidratarea şi clarificarea secţiunilor colorate se realizează
pentru obţinerea preparatelor de durată. Deoarece pentru includere se
utilizează balsamul de Canada, care nu este solubil în alcool sau apă
(pătrunse în ţesuturi) este necesară hidratarea cu băi de alcooluri de 95 şi
100 şi clarificarea în băi de xilon în care balsamul de Canada este solubil.
Montarea. Pe secţiunile scoase din ultima baie de xilon se pune o picătură de
balsam şi se acoperă cu lamela.
164
Fig. 54. Reprezentarea tridimensională a moleculelor de histone care intră în
structura nucleosomului – unitatea de structură a cromatinei
Rezultate:
Cromatina apare colorată în verde; zonele de citoplasmă care conţin
proteine bazine (ribozomi) apar colorate în verde.
165
LABORATOR 24
Materiale necesare:
- fixator alcool-formol, tampon fosfat 0,2M, pH=7,0;
- trusa necesară tehnicii de secţionare şi impregnare în parafină;
- soluţie de roşu de alizarină S 0,2%, soluţie de amoniac diluată;
- pahare Borrel, baie Laveran, pipete de 2,5 ml;
- cilindru gradat de 100 ml;
- lame, lamele, microtom, etuvă (termostat).
Modul de lucru:
Ţesuturi sau celule libere sunt fixate în alcool-formol (alcool 70%,
formol 10%) sau formol tamponat (formol 10% în soluţie tampon fosfat
166
0,2M, pH=7,0). Piesele sunt incluse în parafină şi apoi secţionate la
microtom (secţiuni de 8-10 micromi).
Secţiunile sunt montate pe lamă, după care sunt deparafinate şi aduse
la apă.
Preparatele biologice se incubează într-o soluţie de roşu de alizarină
S în concentraţie de 0,2%, tamponată cu o soluţie diluată de amoniac, la un
pH=4,2. Incubaţia se face la temperatura camerei, timp de 30 minute.
Secţiunile se clătesc cu apă distilată, două băi a câte 2 minute/baie.
Deshidratarea, clarificarea şi montarea secţiunilor în balsam de
Canada.
Rezultate:
În structurile subcelulare, ionii de calciu apar sub formă de alizarinat
de calciu de culoare roşie-orange. Uneori membrana nucleară şi cromatina
apar colorate cu o tentă uşor roză.
167
LABORATOR 25
Materiale necesare:
- tampon TRIS pH=7,5=0,2M, glucozo-6-fosfat (sare de sodiu sau
potasiu) 0,1M, clorură de Mg 2%, NADP 150 ml, extract tisular de
intestin.
Prepararea reactivilor:
NADP 3 mg/ml:
NADP – 3 mg; apă – 1 ml.
Modul de lucru:
Reacţia are loc în cuva spectrofotometrului. Cu o pipetă se pune în
cuva spectrofotometrului: tampon TRIS pH=7,5 – 1,4 ml, glucozo-6-fosfat
de Na-0,2 ml, clorură de Mg 2% - 0,4 ml, NADP – 0,4 ml, extract tisular –
0,4 ml.
Se măsoară densitatea optică la 30 secunde şi la 3 minute de la
adăugarea extractului tisular.
Rezultate:
- (extincţie la 3 minute – extincţie la 30 secunde) X 1000 =
unităţi/minut/ ml ext.
168
LABORATOR 26
Materiale necesare:
- tapon fosfat de Na pH=8,8 0,1 M;
- lactat de Na 0,16 M, NAD 3 mg/ml;
- pipetă de 2 ml, baloane Erlenmayer de 150 ml.
Modul de lucru:
În cuva spectrofotometrului se pipetează: tampon fosfat de Na – 1
ml, lactat de Na – 0,5 ml, NAD – 1 ml, extract tisular – 0,2 ml.
Se determină densitatea optică a probelor la 30 secunde şi 3 minute
după adăugarea extractului tisular.
Rezultate:
Extincţia la 3 minute – extincţia la 30 secunde X 2000=
unităţi/min/ml extract tisular.
169
LABORATOR 27
170
Prin fuzionări de protoplaşti ai unor celule somatice, se poate realiza
combinarea genotipurilor unor specii incompatibile sexual, deschizându-se
calea hibridării interspecifice îndepărtate.
În acelaşi timp, protoplaştii reprezintă un sistem ideal pentru
introducerea de material genetic străin în genomul unei specii premize
pentru transformarea dirijată a speciilor, deci de intervenţie a omului în
însuşi procesul evoluţiei.
Materiale necesare:
Culturile de celule şi ţesuturi se prepară într-un spaţiu de lucru steril,
amenajat special, ce include instalaţie de apă curentă, gaze, electricitate.
Modul de lucru:
La baza cercetărilor care folosesc ca model experimental culturile
celulare stă capacitatea de diferenţiere, rediferenţiere şi totipotenţă proprie
celulei vegetale, ceea ce conferă posibilitatea regenerării unui organism în
condiţii controlate, pornind de la celule somatice de diverse origini.
În biologia vegetală, tehnicile de culturi de celule şi ţesuturi se
bazează în esenţă pe obţinerea de calusuri (mase de celule nediferenţiate)
pornind de la explante (fragmente de ţesut) din diferite organe ale plantei
(rădăcini, tulpină, frunze, antere, ovare, muguri etc.) inoculate aseptic pe
medii nutritive standard şi inoculate la temperatură şi lumină controlate.
Una din cele mai importante etape ale acestei tehnologii constă în
alegerea şi prepararea mediului de cultură. Mediul de cultură conţine
componente esenţiale: apă, săruri organice, o sursă de carbon (zaharoză sau
glucoză), vitamine, fitohormoni şi componente opţionale: azot organic, acizi
organici, extracte de diferite origini.
Fitohormonii sunt fie substanţe naturale, produse de plante – caz în
care sunt clasificaţi ca endogeni – fie substanţe de sinteză cu efect similar.
Principalii regulatori de creştere (fitohormoni) utilizaţi pentru culturile ,,in
vitro“ sunt auxinele, citochininele şi giberelinele. Toate aceste categorii de
fitohormoni au următoarele caracteristici comune: acţionează în doze mici,
172
reacţionează în mod specific la nivel celular - ţintă prin intermediul unor
receptori, acţionează în echilibru unii cu ceilalţi, induc efecte variabile în
funcţie de concentraţiile utilizate iar în doze mari se pot dovedi inhibitori
sau chiar toxici.
Auxinele. În afară de auxina naturală – acidul indolil acetat (AIA)
sunt utilizate şi auxine sintetice: acidul 2-4 diclorfenoxiacetic(2,4D), acidul
naftic acetic (ANA), acidul indolil butiric (AIB), acidul naftoxiacetic
(ANO). Auxinele induc formarea calusului, organogeneza şi embriogeneza.
Citochininele. Sunt, de asemenea, fie compuşi endogeni – zeatina,
isopentoniladenina sunt, fie substanţe de sinteză – benziladeina (BA) sau
benzil aminopurina (BAP), kinetina (6-furfuriladeina sau 6-
furfurilaminopurina). Adăugate în mediul de cultură stimulează
metabolismul şi diviziunea celulară, favorizând diferenţierea mugurilor
(efect caulogen).
Giberelinele. Au acţiune similară şi sinergetică cu a auxinelor.
Dintre gibereline acidul giberelic (GA3) inhibă rizogeneza la lumină în timp
de la întuneric, în asociaţie cu auxina, o stimulează; influenţează, de
asemenea, alungirea zonei aplicate axiale a materialului caulinar. La multe
specii evoluţia in vitro a culturii nu necesită prezenţa GA3.
De regulă, concentraţii mai mari de auxină faţă de citochinină
favorizează creşterea rădăcinilor (rizogeneza), un raport invers stimulează
formarea de tulpini (caulogeneza), iar raportul 1:1 favorizează creşterea
calusului (calusogeneza). De multe ori, concentraţii crescute de auxină şi
scăzute de citochinină determină, de asemenea, formarea calusului.
Frecvent, pentru introducerea calusului se utilizează 2,4D în cantitate de 1-
2mg/l.
Cel mai utilizat mediu de cultură pentru cultura celulelor vegetale
este mediul Murashige-Skoog (MS, 1962). Acest mediu se caracterizează
printr-o concentraţie ridicată de săruri. Prin manipularea balanţei hormonale
se pot realiza diferite variante de mediu.
Tabelul de mai jos prezintă compoziţia mediului de cultură
Murshige-Skoog, 1962:
173
7 CaCl2 X 2H2O 440
8 MgSO4 X 7H2O 370
9 Na2SO4 -
Microelemente
1 Fe2(SO4)3 -
2 FeSO4 X 7H2O 27,8
3 Na2EDTA 37,3
4 MnSO4 X 4H2O 22,3
5 H3BO3 6,2
6 ZnSO4 X 4H2O 8,6
7 KI 0,83
8 Na2MaO4 X 4H2O 0,25
9 CuSO4 X 5H2O 0,025
10 CaCl2 X 6H2O 0,025
Compuşi organici
1 Biotonă -
2 Glicerină 2,0
3 Inozitol 100
4 Acid micotireic 0,5
5 Piridoxină - HCl 0,5
6 Tiamină – HCl 0,1
7 Acid falic -
8 Zaharoză 30.000
175
LABORATOR 28
Materiale necesare:
- rădăcini de morcov, mediu de cultură MS cu 2,4D 2 mg/l, apă
distilată;
- clorură mercurică 1% cu adaus de Tween 20 2-3 picături/l;
- hotă cu flux laminar (cu aer steril);
- baloane Erlenmayer de 250, 100 şi 700 ml;
- baloane cotate de 1000 şi 500 ml;
- pipete gradate de 1 ml şi 2 ml, pâlnii;
- cutii Petri cu diametrul de 10-20 cm;
- hârtie de filtru, pense, bisturie, lampă de spirt;
- alcool , tifon, creion pentru scris pe sticlă, folie staniol;
- etuvă, balanţă analitică şi tehnică;
- autoclav, pH-metru de laborator.
Modul de lucru:
Se execută mediul de cultură MS, 1962, conform reţetei, la care se
adaugă 2mg/l 2,4D; se pregătesc baloane cu apă distilată şi se sterilizează
totul la autoclav, la 1200C timp de 30 minute; sticlăria destinată manipulării
materialului biologic la hotă se sterilizează la etuvă, la 1200C timp de o oră,
176
după ce în prealabil a fost perfect spălată şi uscată; se sterilizează şi câteva
cutii Petri cu hârtie de filtru (în straturi suprapuse).
Fig. 56. Cultura de calus (stânga) şi regenerarea de plante din calus (dreapta)
Rezultate:
Se observă periodic procesele de formare şi creştere a calusului.
Periodic (la cca. 4-6 săptămâni) calusul se repică (fragmentează) şi se
pasează (transferă) pe medii proaspete; se va ţine o evidenţă strictă a
numărului de repicaje suportate de către fiecare unitate de ţesut calusal.
Când se urmăreşte regenerarea de plante din calus, se recurge la mediul de
diferenţiere, cu alte concentraţii de hormoni (fig. 56).
178
LABORATOR 29
Celulele ţesutului calusal pot fi legate între ele sau mai laxe, formând
un calus friabil, grunjos (separabil în fragmente sau mai greu dezagreabile)
ori scuamos (care se separă în fragmente tisulare fine), acesta fiind mai
adecvat pentru iniţierea unei culturi de celule. Consistenţa şi friabilitatea
calusului depind de specie, natura organelor, vârsta acestora, hormonii
utilizaţi şi uneori şi de condiţiile de cultură.
Capacitatea organogenă sau embrionară a ţesutului calusal este
dependentă de factori endogeni sau exogeni, cât şi de numărul replicajelor
făcute. Un rol important îl are şi vârsta calusului. Unele calusuri vor
regenera plantule şi după 5 ani (la tutun), alte plante, cum sunt cerealele, au
o capacitate organogenă mult mai scăzută.
Materiale necesare:
- tulpini de tutun de la plante neînflorite sau tulpini de la plante tinere,
fragmente de peţiol;
- mediu de cultură MS, 1962, cu adaos de Tween 20, hotă sterilă;
- balanţă analitică şi tehnică, etuvă, autoclav, baloane Erlennmayer de
100, 250, 750 ml, baloane cotate de 1000 şi 500 ml, cutii Petri de 10-
20 cm3, pipete gradate de 1 şi 2 ml, pâlnie, hârtie de filtru, pense,
bisturie, lampă de spirt, alcool, tifon, creion pentru scris pe sticlă.
Modul de lucru:
Se prepară mediul de cultură conform reţetei; se pregătesc baloanele
cu apă distilată şi se sterilizează totul la autoclav la 1200C timp de 30
minute; se sterilizează sticlăria – baloane Erlennmayer de 100, 250 ml, cutii
Petri – destinate manipulării materialului biologic la hotă, la etuvă la 1200C
timp de 1 oră; se sterilizează şi câteva cutii Petri cu hârtiile de filtru (în
straturi suprapuse). Dacă materialul biologic folosit pentru inducerea
calusului este reprezentat de ţesut medular, se procedează astfel:
- treimea mijlocie a tulpinii (de la plante neînflorite, de aproximativ 1
m înălţime) se taie în segmente de 3-5 cm;
- segmentele de tulpină se sterilizează cu clorură mercurică timp de 10
minute după care se spală repetat cu apă distilată sterilă;
- se extrage măduva şi se taie în segmente de 3 mm lungime;
179
- segmentele de măduvă se pun pe mediul de cultură (în prealabil
turnat şi răcit în vase Erlennmayer de 100 ml).
După sterilizare materialul biologic se manipulează la hotă cu
instrumentar steril inserat în alcool, flambat şi răcit; dacă nu sunt disponibile
tulpini mari, bogate în conţinutul medular, se utilizează tulpini de la plante
tinere sau fragmente de peţioluri. Pentru sterilizare se folosesc procedee
anterioare. Segmentele se secţionează longitudinal pe diametru în bucăţi de
3-4 mm şi se plasează cu partea plană în jos pe mediul de cultură. Incubarea
vaselor de cultură cu explantele se face în camera de creştere, la întuneric şi
temperatură 26-28 0C.
Rezultate:
La 3-4 săptămâni după izolarea iniţială a ţesuturilor apar, în mod
normal, creşteri considerabile ale explantelor de măduvă. Creşterea este mai
redusă, iar calusul friabil, atunci când explantele iniţiale au fost constituite
din segmente de tulpini mici. În general, de pe ţesutul iniţial pot fi desprinse
fragmente de calus de 20-50 mg, care, trecute pe un mediu identic, dau
naştere unor linii de calus uniforme. Pentru regenerarea de plante sunt
necesare alte variante hormonale şi condiţii de creştere (fig. 57).
180
LABORATOR 30
181
Materiale necesare:
- calus de morcov, mediul de cultură Murashige Skoog (MS) 1962 cu
adaos de 2,4 D x 10-8 g/ml, dispozitiv de mişcare rotativă în plan
orizontal, condiţii sterile de lucru (hotă cu flux laminar);
- cilindru gradat de 50 sau 100 ml, pipete de 10 ml, baloane
Erlennmayer de 250 ml.
Modul de lucru:
Se ia 1 g de calus şi se introduce într-un vas Erlennmayer de 250 ml
conţinând 60 ml mediu MS cu adaos de 2,4 D. Flaconul se asamblează pe
un dispozitiv cu mişcare rotativă în plan orizontal (şeicăr) cu 80-100
rotaţii/minut, la întuneric sau la lumină slabă şi temperatură de 250C. După
7 zile, în condiţii sterile se introduc 100 ml de mediu proaspăt aseptic. Se
lasă cultura să se sedimenteze timp de 10 minute, apoi se îndepărtează
supernatantul şi reziduul se trece într-un flacon de 250 ml cu 60 ml mediu
proaspăt. Flaconul se reaşează pe platforma rotativă.
Rezultate:
Menţinerea culturii se realizează prin transferuri repetate la interval
de 7 zile, pe mediu de cultură proaspăt, în condiţii sterile. Densitatea optimă
este de 105 – 3 x 105 celule/ml sau100 – 300 mg (greutate proaspătă) de
inocul în 60 ml mediu proaspăt. După 3-4 subculturi, reinoculările se pot
face transferând 10 ml din suspensia celulară (cu cilindru sau pipetă largă)
în 50 ml mediu proaspăt (după Reinert şi Yeoman, 1982).
182
LABORATOR 31
Materiale necesare:
- cultură de celule de Nicotiana tabacum; soluţie de enzime (0,2%
macerozină R-10; 1% celulază Onozuka R-10; 0,5 manitol), cu
pH=5,7; HCl 1N; manitol 0,7 M; baloane Delong de 50 ml;
centrifugă; agitator (shaker); condiţii de lucru sterile (hota cu flux
laminar).
183
Modul de lucru:
- centrifugarea suspensiei celulare la 300 rpm, 10 minute;
- resuspendarea a 500 mg celule în soluţie de enzime ajustat cu 0,1
HCl 1N sau NaOH în baloane Delong de 50 ml;
- agitarea soluţiei pe un agitator (50-100 rpm, 3-4 ore la 270C;
- centrifugarea la 100 rpm, 2 minute şi resuspendarea protoplaştilor în
manitol 0,7M;
- spălarea protoplaştilor de 3 ori cu manitol 0,7M (după Uchimya şi
Murashige, 1974).
Rezultate:
Colorarea protoplaştilor cu coloranţi vitali.
Capacitatea de a fixa asemenea coloranţi cum este, de exemplu, roşul
neutru, poate constitui un indiciu clar al viabilităţii protoplaştilor.
184
LABORATOR 32
Materiale necesare:
- suspensie celulară;
- mediu de cultură (soluţie nutritivă);
- hemocitometru;
185
- pipetă Pasteur (sau cu vârf ascuţit);
- hârtie de filtru.
Modul de lucru:
Se prepară o suspensie celulară în mediu de cultură sau soluţie
nutritivă, conţinând aproximativ 2-5 x 105 celule/ml;
Se aplică lamela pe lama camerei de numărat, fie prin simplă
adeziune, fie cu ajutorul cavalerilor. Dacă camera nu are cavaleri, lama se
va umezi uşor pe margini, aburindu-se şi astfel aderă bine;
Cu o pipetă Pasteur (sau o pipetă cu vârf ascuţit) se va transfera o
mică cantitate de suspensie celulară în ambele camere ale hemocitometrului,
astfel: se agită pipeta timp de 2-3 minute, apoi primele picături sunt lăsate să
cadă pe o hârtie de filtru. Vârful pipetei se apropie de marginea camerei şi
se lasă să intre prin capilaritate în ambele camere ale hemocitometrului o
cantitate de lichid, în spaţiul format între lamă şi lamelă (fig. 60); este de
dorit să se introducă dintr-o dată atâta lichid încât spaţiul dintre lamă şi
lamelă să fie umplut în întregime, fără ca lichidul să treacă în şanţurile
laterale, fără ca lamela să se deplaseze, fără să intre bule de aer în cameră; în
caz contrar, operaţia se repetă după ştergerea camerei. Se aşteaptă câteva
minute sedimentarea celulelor pe grilaj;
Se examinează hemocitometrul la microscop; se începe
numărătoarea cu prima cameră a hemocitometrului şi se numără toate
celulele din pătratul din centrul camerei de 1 mm (figurile 61, 62, 65) şi din
pătratele de 1 mm din colţurile camerei (figurile 63, 64).
Notă: se numără celulele de sus şi stânga care ating mijlocul liniei
perimetrului fiecărui pătrat; nu se numără celulele care ating mijlocul
perimetrului din partea de jos şi dreapta, conform fig. 63. Se numără cele 4
pătrate din colţuri şi pătratul din mijloc în ambele camere; dacă mai mult de
10% dintre celule apar agregate, se repetă întreaga procedură, asigurându-se
o bună dispersare a celulelor prin agitarea suspensiei de origine şi printr-o
pipetare viguroasă. Dacă mai puţin de 200 sau mai mult de 500 de celule
(aprox. 20-50/pătrat) sunt observate în 10 pătrate, se repetă întreaga
procedură ajustând factorul de diluţie la unul potrivit. În fig. 61 – diagrama
unei camere standard – cercul indică suprafaţa aproximativ vizibilă la
microscop, mărire 100 x (10 x ocular şi 10 x obiectiv).
Rezultate:
Determinarea numărului de celule
Fiecare pătrat de 1 mm al hemocitometrului, acoperit cu
lamela, reprezintă un volum total de 0,1 mm3 sau 10-4 cm3. Dacă
186
1 cm3 este echivalentul la 1 ml, concentraţia celulelor/ml ( şi deci numărul
total de celule) va fi determinat astfel:
Exemplu:
Dacă numărul total de celule/pătrat este de 45 celule x 104 = 4,5 x 105
celule/ ml.
Exemplu:
4,5 x 105 (celule/ml) x 10 ml (volum iniţial al suspensiei celulare)= 4,5 x
105 celule.
Pentru siguranţa acurateţii numărului, întreaga operaţiune se repetă
încă o dată.
187
Fig. 60. Hemocitometru cu cele două camere goale şi pline cu suspensie
(sus); modul de umplere a camerei (la mijloc); umplerea unei camere de
numărat (jos).
188
Fig. 61. Diagrama unei camere standard a hemocitometrului
189
Fig. 63. Aspectul mărit al unui pătrat din colţul camerei
190
Fig. 65. Imaginea plasării celulelor dintr-o suspensie în perimetrul
unui pătrat la microscopul optic
191
LABORATOR 33
Materiale necesare:
- mediu pentru cultura protoplaştilor;
- mediu pentru diferenţiere (inducerea lăstarilor sau embrionilor);
- mediu pentru înrădăcinarea lăstarilor; zaharoză 0,3M;
- baloane DeLong de 50 ml; tuburi de centrifugă de 25x150 ml;
- vase Petri de 10x55mm; pământ sterilizat, ghivece; pipete de 10 şi
25 ml;
- condiţii sterile de lucru (hotă cu flux laminar);
- cameră de cultură cu parametrii controlabili (lumină, temperatură,
umiditate etc.);
- etuvă, autoclav, pH-metru;
- tifon, hârtie de filtru, pense, pipete de 2 şi 5 ml,
- balanţă analitică şi tehnică, alcool etilic de 700.
Modul de lucru:
Uchimiya şi Murashige (1974) au regenerat plante de tutun pornind
de la protoplaşti izolaţi din suspensie celulară folosind o metodă ce
comportă următoarele operaţiuni (fig. 66):
- transferul protoplaştlor în baloane Delong de 50 ml, care conţin 5 ml
mediu de cultură pentru protoplaşti (tabelul); fiecare balon trebuie să conţină
192
aproximativ 5 x 105 protoplaşti; incubarea, fără agitare, la 270C, la 1000 lx,
timp de 16 ore;
193
calusuri cu un diametru de 2-3 mm; transferul calusurilor în tuburi de
cultură de 25 x 150 mm care conţin 25 ml mediu de diferenţiere (tabelul);
- incubarea la 10.000 lx timp de 2-4 săptămâni;
- transferul plantelor înrădăcinate în pământ steril şi creşterea lor în
seră.
Mediul pentru cultura protoplaştilor
Săruri minerale din mediul Murashige-Skoog
Mediul de înrădăcinare
Săruri minerale din mediul Murashige-Skoog
194
LABORATOR 34
Materiale necesare:
- inflorescenţe recoltate la începutul perioadei de înflorire, soluţie de
clorură mercurică 0,1%, hotă cu flux laminar (aer steril), alcool etilic;
- mediu de cultură Murashige – Skoog (MS, 1962), modificat pentru
inducerea dezvoltării androgenetice (MS cu BAP 2 mg/l şi NAA 0,5
mg/l), mediu de cultură pentru regenerarea rădăcinilor (MS cu NAA 0,1
mg/l), mediu de creştere (MS lipsit de fitohormoni), apă distilată;
- etuvă, termostat, autoclav, pH-metru, balanţă analitică şi tehnică, vase
Petri, cu diametrul 0,5 cm, alcool etilic, vase Erlemmazer de 1 litru şi
750 ml, baloane cotate de 500 ml, 1 litru, pipete gradate de 1 şi 5 ml,
soluţii stok de BAP şi NAA, pense, bisturie, cameră de creştere cu
parametrii controlabili, refrigerator.
Modul de lucru:
- inflorescenţele se păstrează la 40 C timp de 24 de ore;
- se pregăteşte şi se sterilizează nişa cu aer steril;
- se sterilizează mediile de cultură preparate, apa distilată, sticlăria pentru
cultură, instrumentarul; înainte de autoclavarea mediilor, pH-ul trebuie
ajustat la 5,5, apoi se adaugă agarul;
195
- se răcesc mediile şi se toarnă în vasele de cultură la hotă, se acoperă
vasele cu staniol steril;
- se sterilizează inflorescenţele ăn HgCl2 0,1% timp de 10 minute şi se
spală de trei ori cu apă distilată sterilă şi răcită;
- se verifică stadiul de dezvoltare al microsporului din antere prin colorare
cu aceto-carmin şi vizionare la microscopul optic;
- se scot cu grijă anterele din butonii florali, se îndepărtează filamentul şi
se plasează pe mediul de inducere (tabel) în vase Petri (câte 50/vas; se
aleg antere de 2,5 mm, care conţin microspori uninucleaţi);
- vasele de cultură cu antere se plasează la întuneric pentru 6 zile, la
temperatura de 350C, după care vasele de cultură care conţin antere cu
embrioizi se trec la lumină (fotoperioadă 16 ore la 3000 lx.), la o
temperatură de 230C.
Rezultate:
Plantulele obţinute din embrioizi de trec pe mediu cu 0,5 mg/l NAA
pentru formarea completă a rădăcinilor şi apoi pe un mediu fără fitohormoni
pentru dezvoltarea şi creşterea plantelor; se acomodează la condiţii septice,
apoi se trec la ghiveci, în seră şi câmp experimental (fig. 67).
Pentru studiul citogenetic al plantelor obţinute şi certificarea
gradului de ploidie, la trecerea la ghiveci se recoltează vârfuri radiculare
care se prelucrează şi se colorează conform unei metode standard (de
exemplu, metoda Feulgen). Pentru diploidizarea plantele haploide se
tratează cu colchicină 0,5% timp de 24- 48 de ore sau se trec printr-o nouă
cultură „in vitro” iniţiată din diferite explante (peţiol, frunză, rădăcini, vârf
vegetativ); în acest caz, diploidizarea este spontană.
Componente Cantitatea
Macroelemente MS
Microelemente MS
Vitamine B5 (Gamborg)
BAP 2 mg/l
NAA 0,5 mg/l
Zaharoză 30 g/l
Agar 8 g/l
pH 5,5
196
Fig. 67. Androgeneza experimentală la varză (Brassica oleracea L. ):
stânga sus - calus cu centre meristematice; drapta sus - plantule regenerate
din antere (dreapta) la varză; stânga jos – plantule de varză obţinute din
antere; dreapta jos - plante androgenetice complet formate la varză, în vase
de cultură şi ghiveci (Prisecaru, 1998)
197
LABORATOR 35
Materiale necesare:
- inflorescenţe recoltate cu 6 zile înainte de înflorire;
- medii de cultură MS (1962), pentru iniţiere (cu BAP 0,3 mg/l, NAA
0,1 mg/l şi 2,4 D 0,05 mg/l) şi pentru regenerare (cu BAP 0,1 mg/l şi
NAA 0,1 mg/l);
- soluţie de clorură mercurică =,1%, apă distilată sterilă;
- hotă cu flux laminar, etuvă, termostat, autoclav, pH-metru, balanţă
analitică şi tehnică;
- vase Petri, cu diametrul 0,5 cm, alcool etilic, vase Erlemmazer de 1
litru şi 750 ml;
- baloane cotate de 500 ml, 1 litru, pipete gradate de 1 şi 5 ml;
- soluţii stoc de BAP, NAA şi 2,4-D;
- pense, bisturie;
- cameră de creştere cu parametrii controlabili, refrigerator.
Modul de lucru:
- se pregăteşte şi se sterilizează nişa cu aer steril;
- se sterilizează mediile de cultură preparate, apa distilată, sticlăria
pentru cultură, instrumentarul;
- înainte de autoclavarea mediilor, pH-ul trebuie ajustat la 5,5, apoi se
adaugă agarul;
- se răcesc mediile şi se toarnă în vasele de cultură la hotă, se acoperă
vasele cu staniol steril;
- se sterilizează inflorescenţele în HgCl2 0,1% timp de 10 minute şi se
spală de trei ori cu apă distilată sterilă şi răcită;
- se scot cu grijă ovarele pentru a nu fi rănite şi se plasează pe mediul
de inducere;
198
- culturile se trec în camera de creştere, la 250C şi 16 ore fotoperioadă.
Rezultate:
După 3-8 săptămâni se scot ovulele mărite şi se trec în aceleaşi
condiţii de sterilşitate, pe mediul de creştere.
După 1-2 luni, plantele obţinute se acomodează la condiţii septice
(fig. 68).
Fig. 68. Ginogeneza la grâu (Triticum aestivum L.) : stânga sus - ovare de
grâu mult mărite, după o săptămână de cultură ; stânga jos – calus
ginogenetic provenit din ţesuturile ovulului ; dreapa sus – calus ginogenetic
cu numeroşi embrioizi vizibili la suprafaţă ; dreapta jos – plante de grâu
regenerate din calus ginogenetic
(Prisecaru, 1998).
199
Se păstrează apexuri meristematice pentru studiul citogenetic al
gradului de ploidie.
Se execută preparate histologice, conform procedurii obişnuite,
pentru studiul dezvoltării embrionare (ontogenia embrionilor ginogenetici).
Pentru diploidizarea plantele haploide se tratează cu colchicină 0,5%
timp de 24- 48 de ore sau se parcurge un ciclu de cultură in vitro iniţiată din
diferite explante.
200
LABORATOR 36
Materiale necesare:
- suspensie de protoplaşti proveniţi din două surse, preparaţi simultan;
- site de oţel inoxidabil cu ochiuri de 80 microni diametrul;
- filtru cu pori de 0,22 microni;
- centrifugă de laborator;
- pipete Pasteur, lame de microscop, cutii Petri de 50 mm diametrul,
baloane Kitasato;
- pH-metru;
201
- soluţie de PEG, soluţie de eludare, mediu pentru cultura
protoplaştilor (PCM), NaOH 0,1N, HCl 0,1N;
- hotă cu aer steril;
- cameră de incubare, autoclav, etuvă, trompă de vid.
Modul de lucru:
- protoplaştii proveniţi din cele două surse se filtrează împreună prin
sita de oţel inoxidabil cu ochiuri de 80µ;
- centrifugarea protoplaştilor în tub de centrifugă steril, la 100 rpm,
pentru 3 minute;
- resuspendarea protoplaştilor în soluţie apoasă şi repetarea operaţiei de
centrifugare pentru o bună spălare a protoplaştilor;
- se ia cu o pipetă pasteur 0,1-0,2 ml din supernatant şi se depune pe o
lamă protejată de un vas Petri; se lasă 5 minute pentru a permite
protoplaştilor să se aşeze la suprafaţa sticlei;
- în timpul examinării la microscop, se adaugă încet, cu picătura, câte
0,2 ml/picătură soluţie PEG, care acoperă suspensia de protoplaşti,
determinând aglutinarea lor;
- protoplaştii se spală cu soluţie PEG prin următorul procedeu:
• se adaugă 0,3 ml din mediul de cultură (PCM= protoplast culture
medium) în suspensia de protoplaşti, se aşteaptă 5 minute, după
care se înlătură 0,3 ml din lichid cuo pipetă Pasteur;
• se repetă operaţia de 5 ori, astfel ca de fiecare dată să rămână o parte
din mediu care să acopere protoplaştii în timpul spălării.
- se cultivă protoplaştii în 0,2-0,4 ml mediu de cultură pe lame sau vase
de sticlă; pentru păstrarea vaselor umede se adaugă câteva picături din
mediu în jurul lamelei;
- vasele Petri se închid ermetic cu parafilm sau leucoplast şi se
incubează în lumină slabă (50 lx);
- Diviziunile încep după 4-6 zile, iar în 2-4 săptămâni calusul devine
vizibil;
- Se adaugă în cultură volume din ce în ce mai mari de mediu de
cultură, a cărei concentraţie osmotică descreşte treptat.
Rezultate:
Când calusul ajunge la 2-3 mm se transferă pe mediul de
diferenţiere. Mediul pentru cultura protoplaştilor PCM se foloseşte pentru
diviziunea celulară şi formarea de calus din protoplaşti de Nicotiana
tabacum, N. glauca, N. rustica, N. langsdorfii, N. longiflora, N. debneyi.
202
Fig.69. Obţinerea unui hibrid somatic prin fuziunea protoplaştilor obţinuţi
din două specii le genului Nicotiana (N. langsdorfii şi N. glauca)
Soluţie de spălare:
Glucoză – 0,5M; CaCl2 x 2H2O – 3,5mM; KH2PO4 x H2O-0,7 mM; pH=5,7
Soluţie PEG:
PEG 1,540 sau 0,09MPEg 6000 – 0,33 M; CaCl2 x 2H2O – 10,5mM;
KH2PO4 x H2O-0,7 mM; glucoză-0,1M; pH=5,5.
Se prepară înainte de folosire.
Soluţie de eluare:
1) CaCl2 x 2H2O-100 mM; glucoză-0,4M;
2) NaOH-glicină, tampon pH=10,5- 100 mM; glucoză-0,4M.
3) Se prepară soluţiile 1 şi 2 separat şi se amestecă (1:1) înainte de
folosire.
203
Mediul pentru cultura protoplaştilor (PCM)
204
heterocarionii devin celule mononucleate, adică sincarioni. Aceştia se pot
menţine şi prolifera pe medii adecvate timp îndelungat, formând clone
celulare hibride (animale) sau calusuri din care pot regenera organisme
întregi (hibrizii vegetali).
205
LABORATOR 37
206
C). După tipul de material biologic:
- culturi de organe (organocultură) - reprezintă scoaterea unui fragment de
organ din organism (intestin, trahee, rinichi, etc.) şi cultivarea lui pe un
mediu nutritiv; această cultură se menţine in vitro un timp limitat;
- cultura de embrioni de diferite stadii;
- culturi de celule obţinute prin multiplicarea celulară in vitro: cultura de
celule în suspensie; cultura de fragmente de ţesuturi.
Materiale de lucru:
Culturile de celule in vitro se prepară într-un spaţiu de lucru steril,
amenajat special, ce include instalaţie de apă curentă, gaze, electricitate.
Nevoile de bază într-un laborator de culturi de celule sunt:
a. arie de lucru sterilă;
b. sticlărie, instrumente fine;
c. dispozitive de curăţat şi sterilizat;
d. recipiente de stocare pentru medii, ser, soluţii, sticlărie şi altele;
e. incubator şi hotă cu flux laminar;
f. sursă de apă curentă şi distilată;
g. microscop, agitator, balanţă tehnică şi analitică;
h. substanţe chimice.
Tehnicile aseptice
Tehnicile aseptice presupun următoarele reguli:
- accesul limitat în zona de culturi in vitro;
- suprafeţele se decontaminează cu etanol înainte de utilizare;
- nu se pipetează cu gura, nu se mănâncă, nu se fumează în zona de lucru;
- hainele de protecţie se folosesc numai în cadrul incintei;
- se spală mâinile înainte şi după operaţii, iar părul se leagă;
- se controlează emisiile de aer, se sterilizează incinta cu lămpi UV;
- vasele de cultură, mediile,instrumentarul, se sterilizează.
Mediile de cultură
Mediile de cultură trebuie să asigure:
- echilibru ionic obţinut cu soluţii izotone - pentru menţinerea constantă a
presiunii osmotice;
- pH optim (7.2 – 7,4), menţinut cu substanţe tampon (tampon fosfat,
tampon bicarbonat de sodiu – CO2);
- temperatura optimă;
- conţinutul de oxigen şi CO2 favorabil;
207
- elemente nutritive indispensabile metabolismului (microelemente şi
macroelemente, vitamine, hidraţi de carbon, aminoacizi esenţiali,
proteine, factori de creştere, hormoni;
- extracte embrionare pentru stimularea multiplicării şi creşterii celulare;
- evitarea contaminării cu germeni patogeni prin adăugarea de antibiotice
şi/sau antifungice.
208
Protocol pentru iniţierea unei culturi de
ţesuturi embrionare umane
Materiale necesare:
- hotă cu aer steril, arie de lucru sterilă, medii de cultură nutritive (de
creştere şi de menţinere);
- etuvă, termostat (incubator), autoclav, recipiente de cultură,
centrifugă, cameră de numărat (hemocitometru);
- pipete Pasteur, soluţie salină, tripsină;
- pense, foarfeci, cutii Petri, alcool iodat.
Modul de lucru:
Tegumentul embrionului trebuie considerat contaminat. Sterilizarea
lui se face cu alcool iodat, având grijă ca antisepticul să nu pătrundă în
cavităţile embrionului după incizarea lui. Cu pense sterile, se aleg fragmente
de ţesut embrionar, îndepărtând cu atenţie cheagurile de sânge; fragmentele
curate se trec în altă cutie Petri sterilă cu soluţie salină. Transvazarea
fragmentelor se repetă de 2-3 ori şi de fiecare dată se folosesc alte
instrumente sterile; prin transvazarea succesivă se elimină cheagurile de
sânge şi porţiunile de ţesut strivite (neutilizabile).
După ultima spălare, fragmentele se pun într-o eprubetă de
centrifugă sterilă şi cu ajutorul unui omogenizator se obţine o masă cu
aspect omogen. Dacă dispersarea mecanică nu dă rezultate, celulele se
separă sub acţiunea tripsinei şi agitării. Acţiunea tripsinei se opreşte prin
răcirea soluţiei şi apoi se separă celulele de soluţia de tripsină prin
centrifugare; celulele se resuspendă în mediul nutritiv şi se efectuează
numărarea lor cu o cameră de numărat. În final celulele se introduc într-o
cameră de cultură. Cu o pipetă Pasteur sau cu o ansă sterilă se ia o cantitate
din suspensia de celule embrionare şi se întinde pe una din suprafeţele unui
recipient de cultură steril, făcându-se o repartizare cât mai uniformă a
suspensiei. Recipientul, cu faţa pe care este întinsă suspensia în jos, se lasă
la temperatura camerei sau la termostat la 370C, timp de 30-60 minute. După
trecerea acestui timp se introduce mediu nutritiv, având grijă ca el să nu
209
antreneze fragmentele de pe sticlă. Recipientele se astupă cu dop de cauciuc
şi se incubă la termostat la 370C. În timpul incubării recipientele nu trebuie
mişcate din loc cel puţin 3-4 zile. Metoda este analogă şi la recoltarea de
placentă umană, de ţesuturi embrionare animale şi ţesuturi embrionare de
pui (fig. 70).
210
salină cu antibiotice, unde se lasă 2-3 ore şi apoi se efectuează etapele de
prelucrare preliminară identice cu ale embrionului.
Controlul culturii
Înaintea oricărui experiment se realizează controlul culturii prin:
211
Capitolul 5
5.1. Hibridarea
212
separate, pe baza complementarităţii bazelor azotate. Împerecherea de baze
complementare se poate face intre:
¾ ADN – ADN; ADN–ARN; ARN-ARN
Totdeauna hibridizarea are loc între două lanţuri unice de acid nucleic.
Hibridizarea se foloseşte ori de câte ori se urmăreşte identificarea
secvenţelor nucleotidice pe un acid nucleic (secvenţa ţintă).
5. 1. 1. Principiu
5. 1. 2. Denaturarea
213
hidrogen;
- concentraţia în NaCl a soluţiei; o concentraţie scăzută de NaCl
determină destabilizarea moleculei de acid nucleic, aceasta necesită
ADN o temperatură de topire mai scăzută;
- concentraţia cationilor.
b) Denaturarea chimică
Se face prin adaos de substanţe denaturante (formamida, uree) care
determină scăderea punctului de topire.
214
5.1.5. Tipuri de hibridări
a. Hibridare Blotting:
a.1. Southern Blotting (ADN Blotting)
a.2. Norhern Blotting (ARN Blotting)
a.3. Western Blotting (Protein blotting)
a.4. Dot Blotting
a.5. Slot Blotting
b. Hibridare in situ;
c. Hibridare colonială.
a. Hibridizare Blotting
Este o tehnică specială prin care acidul nucleic ţintă (de cercetat)
este extras din materialul de cercetat prin încălzire la 1000C şi răcire la
gheaţă şi apoi depus pe o membrană (de nitroceluloză sau filtru de nylon) şi
fixat. Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu
ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut şi marcat).
Noţiunea de "Blot" reprezintă filtrul + acidul nucleic fixat
(imobilizat). Acţiunea de "Blotting" reprezintă trecerea acidului nucleic pe
filtru. Există mai multe variante de hibridare Blotting şi anume:
216
sunt omologate în proporţie de 97% (diferenţa constă în cromozomul X).
Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om decât alte specii de
maimuţă.
218
În acest caz de Western Blotting, substratul de cercetat nu este
reprezentat de un acid nucleic ci de o proteină.
Reacţia foloseşte la evidenţierea unor cantităţi foarte mici de
proteine prezente în lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea
acestora cu anticorpi specifici corespunzători (marcaţi).
Etapele reacţiei sunt următoarele:
- proteina este supusă electroforezei în gel SDS -
policrilamidă;
- transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de
nitroceluloză;
- adaos de anticorpi specifici marcaţi (cu enzime sau
radionuclizi);
- spălarea anticorpilor rămaşi nefixaţi;
- aplicarea deasupra membranei de nitroceluloză a unui film
fotografic;
- expunere şi developare;
- citirea prin autoradiografie a benzilor de proteină cu ajutorul
anticorpilor specifici marcaţi şi fixaţi.
Avantajul metodei este acela de a pune în evidenţa prezenţa unei
anumite proteine, dintr-o mixtură complexă. Această metodă este folosită
pentru clonarea genelor.
219
Fig.72. Tehnica Dot Bloptting
220
determinări calitative şi semicantitative.
Se folosesc fragmente de ţesuturi, amprente de celule, culturi
celulare (prelucrate, aplicative şi fixate pe lame obiective). Fixarea se face
cu xilol, etanol (100% şi apoi 70%). Lama obiectiv cu celule fixate
corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting.
Reacţia de denaturare şi hibridizare se face pe lama obiectiv şi
anume: după depunerea probei pe lama obiectiv, pentru denaturarea probei
se foloseşte o încălzire puternică sau tratarea cu proteaze şi digitonină,
ultima slăbind şi desfăcând citoscheletul şi rezultând molecula ţintă de acid
nucleic unic. Lama cu probă pentru denaturare se acoperă cu o placă,
realizându-se o cameră umedă. După denaturare, lama se spală (pentru
îndepărtarea particulelor nelegate) şi abia apoi urmează hibridizarea cu
sonda (ADN sau ARN) marcată; în cazul reuşitei hibridizării, secvenţele
ţintă din acidul nucleic de cercetat (din ţesuturi) sunt evidenţiate la
autoradiografie (prin cuplare cu secvenţele de acid nucleic complementare
din probele marcate cu biotină).
Biotina din sondă a fost fixată de un necleotid cu uracil; acest uracil
se va împerechea în lanţul de acid nucleic ţintă cu o adenină; după ce se
produce această reacţie de hibridizare, se face o spălare cu o soluţie tampon,
care îndepărtează moleculele nelegate de acid nucleic din probă. Marcarea
cu biotină este evidenţiată ulterior prin diferite variante de lucru (vezi
"Sonde genetice. Marcarea").
Aplicaţiile practice in situ sunt:
- evidenţierea şi localizarea diferiţilor agenţi infecţioşi în diferite
celule şi ţesuturi ale organismului: virusul hepatitei virale tip B,
HIV, virusul Epstein-Barr, virusul cito-megaliei, virusul herpes
simplex, virusul papiloma;
- cercetarea relaţiilor virus-procese oncogene (de exemplu, relaţia
virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic);
- diagnosticul pre- şi postnatal în boli genetice;
- localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu, în fibroza
chistică, distrofia musculară Duchenne);
- identificarea anormalităţilor cromozomiale (de exemplu: trisomia
21, sindromul Langdon Down, sindromul Turner);
- stabilirea sexului la embrion;
- cercetarea tiparelor de expresie genetică (stabilirea momentului
activării anumitor gene);
- stabilirea hărţii genetice cromozomiale (stabilirea relativă a
locus-ului fiecărei gene pe cromozom);
- hibridarea colonială.
Pe plăci cu medii de cultură se însămânţează colonii bacteriene
221
din două tipuri de clone:
- o clonă bacteriană de origine (cu plasmid);
- o clonă bacteriană cu ADN ţintă (cu plasmid + fragmente de
ADN ţintă).
Prin replica plating se obţine copii ale acestor colonii din cele două
clone pe un filtru de nitroceluloză. Aceste copii de clone bacteriene (de pe
filtru) sunt supuse lizei pentru a se obţine ADN.
ADN este supus denaturării pentru obţinerea lanţurilor unice de
ADN.
Lanţul unic ADN este supus hibridizării cu probele ADN cunoscut şi
marcat radioactiv. După fixarea probelor ADN radioactive (fixarea
complementară) pe lanţul unic de ADN ţintă (de cercetat) se procedează la
evidenţierea autoradiografică a marcării pe un film Roentgen.
Prin compararea imaginii radiografice se identifică şi se diferenţiază
clonele bacteriene care conţin fragmente de ADN ţintă faţă de clonele
bacteriene de origine. Clonele bacteriene care poartă ADN ţintă recombinant
(plasmid + ADN ţintă) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor
multiplica şi fragmentele de ADN straniu).
222
posibilitate de diagnostic rapid şi precoce, în vederea instituirii a unei
terapii de urgenţă în special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele
imunosupresate (terapeutic) în urma unor transplante de organe.În
aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor
deoarece pozitivarea serului în cazul infecţiei cu HIV se produce abia
după câteva săptămâni de infecţie, iar în cazul imunosupresaţilor după
câteva luni sau chiar deloc;
- evidenţierea prezenţei virale în tumori de origine virală;
- studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor
secvenţe ADN celulare glucogene nevirale a ajutat la completarea şi
aprofundarea diagnosticului de tumoră. Astfel o reacţie de tip
imunohistochimic a putut pune în evidenţă un produs de transcriere
(ARNm) specific de ţesut (de exemplu, prezenţa unui anumit ARNm
corespunzător unei imunoglobuline prezente în caz de limfoame
maligne sau prezenţa unui anumit ARNm hormonal în anumite tumori
neuroendocrine. Această metodă reprezintă o unealtă foarte eficientă
pentru cercetarea activităţii genelor oncogene prin evidenţierea
indirectă imunohistochimică a produselor lor de translaţie (ARNm
corespunzător);
- diagnosticul pre- şi postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc
copii sau la care se pune problema întreruperii sarcinii);
- determinarea defectelor metabolice;
- utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea
infecţiilor virale ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic
pentru o cantitate de antigen de 2x10 nanograme);
- aplicaţii în epidemiologia moleculară în vederea depistării unor noi
markeri genetici (de exemplu, robotip, pulsotip);
- se precizează ca în viitor metoda hibridizării să ofere posibilităţi
pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activităţii genelor.
226
hibridare, ca sonde genetice.
B. Marcarea
Se face pe un singur nucleotid, cu o substanţă care îl face vizibil din
punct de vedere biochimic sau imunohistochimic.
a. Marcarea radioactivă
Se face cu radioizotopi 3H,35S, 125I, 32P. La alegerea izotopului trebuie
ţinut cont de timpul de înjumătăţire (timp necesar pentru ca substanţă
radioactivă să se descompună în proporţie de 50%). Astfel, timpul de
înjumătăţire pentru :
3
H este de 12,35 ani;
35
S este de 87,4 ani;
125
I este de 60 de zile;
32
P este de 14,3 zile.
Atomul radioactiv introdus în probă prin dezintegrare va emite radiaţii
β care vor fi evidenţiate la autoradiografie (impresionarea plăcii Roentgen la
iluminarea cu radiaţii UV).
Timpul de expunere a filmului la UV va fi diferit în funcţie de izotopul
folosit:
- pentru hibridarea Blotting se foloseşte proba marcată cu 32P;
- pentru hibridarea in situ se foloseşte proba marcată cu 3H.
În ultima vreme există tendinţa ca substanţele radioactive să fie
abandonate din cauza efectului lor nociv asupra organismului şi înlocuirea
lor cu substanţe neradioactive.
b. Marcarea neradioactivă
Se face în două etape:
• Etapa I – marcarea probelor cu biotină (cel mai frecvent),
bromdeoxiuridină, digoxigenină.
• Etapa II – probele marcate sunt evidenţiate prin intermediul legării
markerului de avidină (glicoproteină din ou), streptovidină
(sintetizată din ciuperca Streptomyces avidinii) şi anticorpi
antimarker (de exemplu, antibiotina) marcaţi cu fluorocrom.
Etapa I
Markerul (biotina) se leagă printr-un lanţ de legare numit spacer de
baza uracil din nucleotid. Acest braţ de legare va uşura şi legarea ulterioară
a biotinei de proteinele avidină/streptovidină, în etapa II. În mod normal
uracilul se înglobează numai în ARN, nu şi în ADN, dar în condiţii de
227
laborator, prin intermediul spacer-ului de la biotină se pot realiza două tipuri
de legături:
- legătura cu nucleozidul natural;
- legătura cu nucleozidul artificial.
De exemplu: Bio – UTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat
Bio – dUTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat.
Pentru aceste structuri se folosesc în laborator trifosfaţii
nucleozidelor. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie
pentru metabolismul celular. Atât Bio – UTP, cât şi Bio – dUTP sunt
derivate biotinate ale dezoxiuridin – trifosftului şi, respectiv ribouridin –
trifosfatului şi vor fi înglobate în locul dezoxitimidin – trifosfatului şi,
respectiv în ARN, în locul ribouridin – trifosfatului. În momentul hibridării
cu segmente ADN ţintă, nucleotidele cu uracil se împerechează, pe lanţul
complementar de ADN ca şi pe lanţul ARN, tot cu un nucleotid cu adenină.
Etapa a II-a
Probele de mai sus biotinate se evidenţiază prin legarea biotinei de
avidină/streptovidină sau anticorpi antibiotină marcaţi cu fluorocrom.
Biotina prezintă o mare afinitate pentru avidină. Legătura biotină + avidină
este foarte puternică şi aproape ireversibilă. Din cauza unor reacţii
nespecifice se preferă streptovividina în locul avidinei. În final, pentru a se
evidenţia prezenţa complexului molecular hibrid biotină –
avidină/streptovidină, acesta este marcat prin diferite metode.
I. Metode enzimatice
Înglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu
ajutorul unei reacţii enzimatice, în prezenţa ionilor de Mg++.
a. Nick - translaţia
Cea mai folosită metodă pentru marcarea sondelor este Nick-
translaţia (translaţia prin tăiere). În această metodă se folosesc două enzime:
ADN-aza I şi ADN – polimeraza I.
ADN- aza I este o enzimă de restricţie extrasă din pancreas de bou; ea
taie legăturile fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lanţ; nu atacă ARN şi
acţionează în prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ (fig. 74).
228
Fig. 74. Acţiunea ADN- azei I pe dublul lanţ ADN în prezenţa ionilor de
Mg++ şi Mn++
229
b. Oligomarcare
(RADNom Priming, RADNom Priming Oligolabelling,Feinberg-
Vogelstein Technik)
Spre diferenţa de “nick-translatie”, în oligomarcare se folosesc drept
matriţe lanţuri unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabilă a unui
lanţ ADN. Se foloseşte enzima Klenow Polimeraza care reprezintă un
fragment de ADN-polimeraza. Klenow Polimeraza posedă activitate 5’ – 3’,
şi 3’- 5’ exonucleazică (dar nu prezintă activitate 5’- 3’ exonucleazică).
230
Se mai utilizează un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide
sintetizate cu ajutorul unei maşini de gene); ele sunt structuri formate fiecare
din câte şase nucleoide care conţin practic toate combinaţiile de secvenţe
nucleotidice posibile, reprezentate de nucleotide ADN marcate (.), cât şi
nemarcate (o), aflate de obicei în proporţie de la 1 la 3.
Numele metodei de RADNom Priming derivă de la utilizarea drept
primeri a hexanucleotidelor cu secvenţe întâmplătoare (randomized primer).
231
II. Metode chimice
Reprezintă o marcare directa a acidului nucleic.
1. Marcarea cu fotobiotină.
Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un
braţ de legare chimică, de acidul nucleic, pe o grupare chimică activate în
prezenţa luminii (iluminare foarte scurtă). Se formează o legătură stabilă
între biotină şi acidul nucleic (lanţ unic sau dublu).
232
a) pentru a împiedica circularizarea vectorului ADN străin, trebuie
îndepărtate grupările fosfat de la extremităţile 5’ ale moleculei
deschise de ADN a vectorului, cu ajutorul fosfatzei alcaline. În acest
fel, vectorul nu se va mai circulariza. Fosfataza alcalină se obţine din
celule de E.coli sau celule de intestine de oaie;
b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul
plasmid vector, celula bacteriană trebuie tratată cu soluţie CaCl2
pentru a deveni competentă;
c) având în vedere faptul ca celulele bacteriene posedă sisteme care
protejează celula de pătrunderea unui ADN străin, se folosesc pentru
clonări celule bacteriene mutante (celule cu system de apărare mult
diminuat).
233
4.Selectarea celulelor bacteriene purtătoare de vector recombinant.
Selectarea acestor celule purtătoare de plasmid cu ADN străin
încorporate şi diferenţierea lor de celule (clone) fără ADN străin se face prin
însămânţare, prin replica plating, a coloniilor bacteriene pe un mediu cu
tetraciclina; pe acest mediu vor supravieţui doar clonele care nu conţin nici
un fragment de ADN străin (celule rezistente la tetraciclina).
Tip sticky = enzime care taie cele două lanţuri ale helixului ADN în
mod franjurat datorită faptului ca şi-au păstrat gena purtătoare de această
rezistenţă (este vorba de plasmidul “gol” fără ADN străin ataşat), în timp ce
clonele care au pierdut gena de rezistenţa la tetra (în momentul legării
plasmidului de ADN străin), prin formarea unui plasmid recombinant, nu
cresc pe acest mediu.
Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care
conţine fragmentul ADN dorit, printr-o tehnică de hibridizare specială, şi
anume prin hidibridizare colonială.
234
C. Biblioteca ADNc (ADN copie după matriţa de ARNm matur)
Reprezintă doar o informaţie pură formată numai din secvenţe de
exoni. Spre diferenţa de biblioteca genomică ADN, care rezultă din clonarea
de fragmente ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o molecula de
ARNm matur, drept copie complementară (în prezenţa enzimei
reverstranscriptaza).
Produsul acţiunii acestei enzime va fi o moleculă mixtă (hibrid):
ARNm-ADNc. Din acest hibrid, lanţul dublu ADNc se va forma din acest
lanţ unic ADNc, prin două posibilităţi:
- în prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasă din
celula de E.coli);
- în vectori; vectorii recombinaţi (vector + lanţ unic ADNc) vor
determina ulterior formarea de clone bacteriene ADNc.
În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate
celulele aceluiaşi organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele
tipuri de celule ale aceluiaşi organism. În fiecare tip de celule, aceluiaşi tip
de ADN genomic îi corespund alte gene active (exoni), ceea ce înseamnă că
în fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur, astfel încât,
aceluiaşi organism, biblioteca ADNc rezultată variază de la un tip celular la
altul.
Clonele din biblioteca ADNc se folosesc în special în scopul analizei
directe a secvenţelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau
produsul proteic final (codificat de respectivul fragment ADNc). Secvenţa
clonelor ADNc este studiată în special prin experimentele de hibridizare.
Astăzi, în terapia bolilor tumorale se întrevede posibilitatea
identificării şi distrugerii ţintite a anumitor molecule ARNm, care induc
translaţia informaţiei pentru sinteza unor substanţe oncogene.
Cu ajutorul experienţelor de clonare s-a reuşit citirea de secvenţe de
ADN de pe lanţul ADN al genomului unui organism. Pasul următor îl
reprezintă obţinerea unor modificări ale acestor secvenţe ADN, cu ajutorul
unor tehnici de inginerie genetică (procese artificiale de recombinare ADN),
cât şi introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN în celule sau
organisme, unde aceste modificări urmează a se exprima.
A. Principiul reacţiei.
Se foloseşte drept matriţă un ADN monocatenar. În condiţii de
laborator in vitro, pe acest lanţ unic de ADN se poate sintetiza un lanţ
complementar cu ajutorul ADN-polimerazei şi în prezenţa unui
oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Pentru a porni sinteza
noului lanţ ADN pe un lanţ ADN matriţă, ADN-polimeraza necesită
prezenţa pe matriţa a unui oligonucleotid primer cu capătul 3’-OH liber; la
acest capăt urmează a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lanţ.
B. Efectuarea reacţiei
PCR poate porni de la punctul a sau b.
a. ADN genomic dublu lanţ (de cercetat) izolat din celule şi
tăiat în fragmente cu ajutorul enzimelor de restricţie;
b. Lanţ unic de ADNc, sintetizat în prealabil prin transcriere
inversă a ARNm.
La capatul 3’ al lanţului ADNc se ataşează o coadă de nucleotide -
guanina cu ajutorul enzimei trasferaza terminală.Urmează desfăşurarea PCR
cu doi primeri diferiţi utilizaţi simultan, câte unul corespunzător pentru
fiecare lanţ ADN (rezultat din ADN-ul dublu lanţ denaturant). Dintre cei doi
primeri, primul primer este nucleotide - timina, al doilea primer este
nucleotide - citozina.
236
Etapele reacţiei:
denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lanţ sau ADNc
(sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la temperatură înaltă (95
grade C). Acest ADN conţine secvenţe care urmează a fi multiplicate
(amplificate);
după scăderea temperaturii se adaugă primerul în exces. În aceste condiţii
fixarea primerului pe ADN-ul unic lanţ reprezintă un proces de hibridizare
ce are loc la temperatură scăzută (36-65 grade C). Primerul delimitează
capătul iniţial al fiecărei din cele două secvenţe ADN unic lanţ (rezultate
din denaturarea ADN-ului dublu lanţ) de multiplicat. Adaosul de primer se
face în exces, pentru a se obţine o hibridizare primer lanţ unic de ADN şi
nu o hibridizare între lanţurile unice de ADN rezultate din denaturare.
reacţia de sinteză a noului lanţ ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, în
prezenţa celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timine/guanine/citidin
deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. ADN-
polimeraza se leagă de capatul 3’ al primerului şi sintetizează noul lanţ în
direcţia 5’->3’, folosind drept matriţă segmentul ADN lanţ unic de
amplificat. Primerul va fi încorporat în noul lanţ de ADN format. În acest
fel lanţul de ADN este dublat şi, odata cu acesta, un ciclu de PCR este
terminat.
începe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dată a ADN-ului dublu lanţ
nou sintetizat (în treapta anterioară); mai departe, acest nou ciclu şi acest
ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocită de ADN-polimeraza);
cu fiecare nou ciclu (de denaturare/sinteză a ADN-ului) va fi dublată
cantitatea de ADN rezultată din ciclul anterior.
Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reacţiei PCR,
se recomandă;
- repetarea de mai multe ori a respectivei reacţii pentru aceeaşi probă;
- reacţia PCR sa fie însoţită, de fiecare dată, de controale negative.
237
Dacă pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 950 C, noul adaus
de Taq-polimeraza declanşează de fiecare dată ciclu următor de sinteza
ADN. În acest fel, se poate efectua reacţia în care toţi reactivii se pun de la
început în recipient până la sfârşitul reacţiei nu mai trebuie adăugate noi
cantităţi.
Utilizarea Taq-polimeraza a făcut posibilă automatizarea totală a
acestei produceri în maşinile Thermal Cyclers. În condiţii normale, cu
ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR,
obţinându-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7.
Dacă se urmăreşte o amplificare ADN mai mare decât cea corespunzătoare
la 40 de cicluri PCR, trebuie începută o nouă serie de cicluri, cu ajutorul
ADN-ului amplificat, obţinut şi diluat de 1000-10000 de ori.
În acest fel, cu ajutorul a două serii câte 40 de cicluri PCR, se poate
obţine o amplificare de 109 a cantităţii de ADN. Pentru o multiplicare
suficientă de secvenţe ADN sunt necesare 25-30 de cicluri de reacţii
automatizate, care se efectuează, după cum am mai arătat, în aproximativ 4
ore.
239
c. În studii ecologice
Cu ajutorul PCR s-a reuşit evidenţierea unui număr de
microorganisme în probe de pământ şi apă; au fost analizate
microorganisme care până astăzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultură,
cât şi microorganisme de sol care au suferit în timp modificări genetice.
d. În arheologie
PCR a fost utilizată până în prezent şi pentru analiza ADN provenit
din mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani.
B. Metode
Pentru secvenţiere se folosesc două metode:
I. Metoda enzimatică; tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique).
II. Metoda chimică; tehnica Maxam - Gilbert (de obicei combinată cu
metoda Sanger).
I. Metoda enzimatică
Tehnica Sanger
Principiu: se determină secvenţele de baze nucleotidice pe copia de
acid nucleic şi prin complementaritate se deduce secvenţa de baze de pe
lanţul de acid nucleic de origine.
Etapele reacţiei:
- lanţul dublu de acid nucleic (AN) este adus la forma de ADN unic lanţ;
- pe lanţul unic AAN se fixează un primer (moleculă starter sau amorsă).
Acest primer este un oligonucleotid scurt, preparat semiautomat prin
tăiere, cu ajutorul enzimelor de restricţie, a unui fragment ARN.
Primerul este astfel selectat încât capătul 3' să se potrivească prin
complementaritate, într-un punct, pe lanţul ADN de cercetat. Acest
primer este înglobat într-un vector sau secvenţă cunoscută;
- are loc sinteza lanţului ADN complementar (după modelul matriţei
ADN) în prezenţa celor patru dezoxinucleotid trifosfaţi (dATP, dTTP,
dGTP, dCTP), dintre care unul este marcat, a unui didezoxinucleotid
trifosfat (ddNTP) şi a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei;
- sinteza lanţului ADN se va opri acolo unde în locul unui dNTP se va
îngloba un ddNTP corespunzător. În acest punct se va opri reacţia
241
polimerazei. Această reacţie de sinteză a ADN-ului se va desfăşura în
patru variante, în fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru
dNTP-uri;
- cele patru molecule de ADN dublu lanţ obţinute sunt denaturate prin
căldură;
- lanţul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat
prin gel elecroforeză;
- în locul marcării radioactive, fiecare bază este colorată cu altă
substanţă fluorescentă. Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul
de electroforeză prin autoradiografie.
a. Principiu
Pe baza analizelor de secvenţiere a ADN-ului, s-a demonstrat că
fiecare individ este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern
individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic, şi anume de pe
zona ADN- urilor minisatelizate).
Genomul uman conţine trei miliarde de perechi de nucleotide, dintre
care:
70 % reprezintă secvenţe unice identice la toţi indivizii;
30 % reprezintă secvenţe repetitive, şi anume:
- înalt repetitive 7 – 10 %; aceeaşi secvenţă de 300 perechi de
nucleotide se repetă de 30 000 – 1 milion de ori dispersat, pe
toată lungimea genomului;
- gene structurale pentru sinteza de ARNt, ARNr şi histone;
- zona spacer ce conţine gene criptice (silenţioase);
242
- ADN-uri satelite înalt repetitive, netranscriptibile,
necodificatoare de proteine.
20 – 30 % moderat repetitive, fiecare secvenţă cu câteva sute până la
6 000 de perechi de nucleotide se repetă în 20 – 30 000 de copii.
b. Tehnica RFLP
Cu ajutorul acestei tehnici se pun în evidenţă zonele de ADN
variabil de la individ la individ. Aceste tipare de fragmente de ADN
individual sunt reprezentate de o amprentă RFLP specifică (polimorfismul
de lungime al fragmentelor de restricţie).
Pentru determinarea acestor tipare individuale, se izolează ADN-ul
genomic din celulele unui organism (diferite ţesuturi, rădăcini ale firului de
păr, sânge, salivă, spermă).
Tehnica RFLP cuprinde următoarele etape:
- ADN-ul extras este supus acţiunii enzimelor de restricţie;
- fagmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrării bidimensionale
într-un gel denaturat (conţinând un agent chimic denaturat ca ureea,
concentraţie 5 %);
- benzile de ADN unic lanţ obţinute în gel sunt supuse colorării cu
etidiumbromid;
- benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la UV.
Această tehnică evidenţiază atât prezenţa/absenţa fragmentelor de
restricţie, cât şi polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente.
Determinarea RFLP pentru organismele eucariote, inclusiv omul, are
semnificaţie, în mod deosebit, în cazul urmăririi transmiterii la descendenţi,
a informaţiei genetice parentale (prin compararea fringerprint - urilor între
generaţii). În cazul examinării singulare (a informaţiei genetice per individ),
se preferă metoda Southern Blotting a cărei capacitate discriminatorie este
considerată mai bună.
c. Tehnica AFLP
Această tehnică ce combină principiul analizei RFLP cu cel al
reacţiei PCR înalt specifică, detectează numai prezenţa sau absenţa
fragmentelor de restricţie, dar nu face şi analiza polimorfismului de lungime
a fragmentelor. Tehnica este considerată astăzi metoda universală pentru
determinarea prezenţei/absenţei unei anumite amprente de ADN în orice
sursă de origine bacteriană, vegetală, animală sau umană.
243
d. Aplicaţii ale metodei amprentelor ADN
În medicina judiciară:
- în criminalistică; urmărirea criminalului poate fi condusă în funcţie de
urmele găsite: amprente individuale prezente în resturi de piele, păr,
sânge, spermă. Dacă materialul genetic se află în cantitate foarte mică, se
recurge la PCR pentru amplificarea cantităţii de ADN;
- diagnosticul paternităţii; având în vedere că variaţiile de ADN- urile
minisatelite se moştenesc după legile mendeliene, metoda amprentelor
ADN este utilă pentru dovedirea unei înrudiri (amprenta genetică diferă de
la individ la individ, se potriveşte în mare parte la rude şi este identică la
gemenii univitelini);
În medicina clinică
- în boli genetice; în analiza de likage şi determinarea instabilităţii genetice;
- în oncologie; pentru diagnosticul modificărilor genetice din celulele
tumorale de la persoane cu carcinom mamar (se prepară şi se compară
amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu
condiţia ca în proba de sânge să nu existe celule modificate oncogen;
- urmărirea epidimiologică a circulaţiei agenţilor infecţioşi pentru
determinarea pattern-urilor RFLP la virusuri şi tulpini bacteriene;
- stabilirea interrelaţilor virale şi bacteriene pe bază de amprente ADN, în
vederea încadrării taxonomice a unor noi agenţi infecţioşi;
- prin introducerea tehnicii de fracţionare a segmentelor de restricţie şi
separării acestora în gel cu gradient denaturat, se va putea, în viitor,
măsura frecvenţa mutaţiilor în genomul uman, se va putea analiza
instabilitatea genomului şi a relaţiei acestuia cu senescenţa şi neoplazia, se
vor putea realiza analize de linkage şi cartare de noi gene implicate în boli
genetice;
În biologie
- stabilirea paternităţii unor păsări de pradă ale căror ouă au fost clocite de
părinţi adoptivi;
- stabilirea de relaţii genetice între diferite specii pe baza structurii ADN-
ului, acest criteriu fiind superior celui al sistematizării de până în prezent,
efectuat pe bază simplelor caractere morfologice;
- stabilirea polimorfismului genetic în interiorul aceleiaşi specii (de
exemplu, heterozigoţii);
- pe baza existenţei RFLP-urilor au fost amplificate şi analizate secvenţe
nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii dispărute;
În arheologie
- s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de
2400 de ani (prin clonare şi secvenţierea unor fragmente ADN de circa
3400 de baze).
244
BIBLIOGRAFIE
245
19. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, RĂDUCANU
DUMITRA, TINA OANA CRISTEA; PRISECARU FLORIAN,
2008 - Ecotoxicologie – Curs universitar, Ed. „Alma Mater”,
Bacău, 300p.;
20. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, RĂDUCANU
DUMITRA, PRISECARU FLORIAN, 2008 - Ecotoxicologie –
Metode de laborator, Ed. „Alma Mater”, Bacău, 100p.;
21. PRISECARU MARIA, STOICA IONUŢ, CRISTEA TINA OANA,
2011, Citologie vegetală, curs universitar,Editura „Alma Mater”,
Bacău, ISBN: 978-606-527-114-2;
22. PRISECARU MARIA, CRISTEA TINA OANA, STOICA IONUŢ,
2011, Histologie animală, curs universitar, Editura „Alma Mater”,
Bacău, ISBN: 978-606-527-115-9;
23. PRISECARU MARIA, CRISTEA TINA OANA, VOICU
ROXANA, 2011, Biologie celulară şi moleculară, curs universitar
Editura „Alma Mater”, Bacău, ISBN: 978-606-527-116-6;
24. PRISECARU MARIA, MORĂRAŞU NADIA, 2012 - Lumea
plantelor în viaţa omului, Ed. Alma Mater, Bacău
25. PRISECARU MARIA, STOICA IONUŢ, CRISTEA OANA TINA,
2012, Biologie vegetală – curs universitar, Ed, Alma Mater Bacău,
384 p.;
26. PRISECARU MARIA, STOICA IONUŢ, 2012 - Biologie vegetală
- Lucrări practice, Ed, Alma Mater Bacău, 133 p.;
27. RAICU P., 1984 - Informaţia genetică şi viaţa, Ed. Ştiinţifică şi
enciclopedică, Bucureşti;
28. RAICU P., 1974 - Genetica, Ed. Did. şi Ped., Bucureşti;
29. RAICU P., IONESCU-VARO M., GENEVICI G., MOISESCU G.,
1972 - Celula – structură, ultrastructură şi funcţii. Ed. Ac. RSR;
30. RAICU P., IONESCU-VARO M., STOIAN V., 1978 - Celula vie,
Ed. Şt., Bucureşti;
31. RAICU P., NACHTIAL M., 1969 - Citogenetica, principii şi
metode, Ed. Acad., Bucureşti;
32. STEOPOE I., 1967 - Citologie, histologie, embriologie, Ed. Did. Şi
Ped., Bucureşti;
33. TARNAVSCHI I. T., şi colab., 1974 - Practicum de morfologie şi
anatomie vegetală, Tipografia Universităţii Bucureşti;
34. TEODORESCU M., UNTU C., 1974 - Lucrări practice de
citologie, histologie, centrul de multiplicare, Univ. Bucureşti.
246