Sunteți pe pagina 1din 246

 

 
MARIA PRISECARU                 
  IONUȚ STOICA 
 DUMITRA RĂDUCANU                                    

BIOLOGIE CELULARĂ 
Metode de laborator 

Editura „Alma Mater” Bacău


2014
Referenți ştiințifici: 

ƒ Prof.univ.dr. Costică Misăilă  

ƒ Ing. CP I dr. Maria Călin 

COPRTA executată de Biolog dr. Florian S. Prisecaru 

Descrierea CIP a Bibliotecii Naționale a României 
PRISECARU, MARIA 
        Biologie celulară : metode de laborator / Maria Prisecaru, Ionuț Stoica, 
Dumitra Răducanu ; referenți: prof. univ. dr. Misăilă Costică ‐ Universitatea "Al. I. 
Cuza", Iaşi, CP I dr. ing. Călin Maria ‐ Stațiunea de Cercetare‐Dezvoltare Legumicolă 
Bacău. ‐ Bacău : Alma Mater\\Bacău\, 2014 
        Bibliogr. 
        ISBN 978‐606‐527‐351‐1 

I. Stoica, Ionuţ
II. Răducanu, Dumitru
III. Misăilă, Costică
IV. Călin, Maria

576.3(075.8) 

         

Tipar executat la: 

UNIVERSITATEA „Vasile Alexandri” din BACĂU 
Calea Mărăşeşti, nr. 157, 600115 
Tel.++40‐234‐542411 
Tel/fax ++40‐234‐516345 
E‐mail: www.ub.ro; stiinte@ub.ro 
 
CUPRINS

INTRODUCERE 7

Capitolul 1. Metode uzuale de investigaţie utilizate în biologia 9


celulară
1.1. Ultracentrifugarea diferenţială 9
1.2. Metode citochimice (histochimice) 12
1.3. Metode citofizice 15
1.4. Autohistoradiografia 19
1.5. Electronomicroscopia 19
1.6. Culturile de celule şi ţesuturi 21

Capitolul 2. Tehnica microscopică. Preparate microscopice 30


2.1. Microscopul fotonic 31
2.1.1.Microscopul fotonic obişnuit 31
2.1.2. Microscopia prin fluorescenţă 36
2.1.3. Microscopia în contrast de fază 40
2.1.4. Microscopia în lumina polarizată 42
2.2. Microscopia electronică 45
2.3. Metode pentru examenul citologic în microscopia fotonică 47
2.3.1 Metoda efectuării secţiunilor fine 48
2.3.1.1. Recoltarea 48
2.3.1.2. Fixarea 49
2.3.1.3. Includerea în parafină 59
2.3.1.4. Deshidratarea 60
2.3.1.5. Clarificarea 61
2.3.1.6. Impregnarea cu parafină 61
2.3.1.7. Includerea propriu-zisă 61
2.3.1.8. Secţionarea 64
2.3.1.9. Etalarea şi lipirea secţiunilor pe lamă 66
2.3.2. Metoda etalării materialului biologic în monostrat 68

Capitolul 3. Coloranţii şi mecanismele colorării 76


3.1. Coloranţii. Generalităţi. 76
3.2. Clasificarea coloranţilor 77
3.3. Mecanismele colorării 77
  3
3.4. Principalele metode de colorare 78
3.4.1. Colorarea secţiunilor la parafină 79
3.4.2. Tehnica colorării cu hemalaun-eozină (HE) 80
3.4.3. Coloraţii nucleare 83
3.4.4. Coloraţii citoplasmatice 85
3.4.5. Coloraţiile vitale 88

Capitolul 4. Lucrări practice de laborator 94


LABORATOR 1 Izolarea membranelor plasmatice eritrocitare 94
prin centrifugare
LABORATOR 2 Izolarea şi purificarea nucleilor hepatici într- 96
un mediu de suspendare cu acid citric
LABORATOR 3 Izolarea şi purificarea ADN-ului nuclear 98
LABORATOR 4 Izolarea mitocondriilor din ficat 100
LABORATOR 5 Coloraţia Feulgen cu hidroliză acidă pentru 103
evidenţierea ADN
LABORATOR 6 Coloraţia cu verde-metil şi pironină pentru 106
evidenţierea selectivă a acizilor nucleici
LABORATOR 7 Colorarea proteinelor cu albastru de 109
bromfenol mercuric
LABORATOR 8 Evidenţierea glicogenului prin reacţia PAS 111
LABORATOR 9 Evidenţierea histochimică a lipidelor 114
LABORATOR 10 Evidenţierea fierului feric (Fe3+) 116
LABORATOR 11 Evidenţierea peroxidazelor 118
LABORATOR 12 Evidenţierea fosfatazei acide 120
LABORATOR 13 Evidenţierea fosfatazei alcaline 123
LABORATOR 14 Determinarea grupelor sanguine ABO 128
LABORATOR 15 Identificarea acizilor nucleici cu acridin- 134
orange
LABORATOR 16 Dozarea acizilor nucleici prin metoda Spirin 135
LABORATOR 17 Separarea electroforetică a proteinelor 138
LABORATOR 18 Separarea electroforetică a proteinelor din 143
membrana plasmatică eritrocitară
LABORATOR 19 Cromatografia de partiţie (descendentă) 147
LABORATOR 20 Cromatografia de absorbţie (prin schimbători 152
de ioni) pe bază de dextran (Sephadex)
LABORATOR 21 Separarea pigmenţilor clorofilieni prin 156
cromatografie pe hârtie
LABORATOR 22 Izolarea hemoglobinei prin centrifugare 159
LABORATOR 23 Evidenţierea histologică a histonelor şi în 163
  4
general a proteinelor bazice prin tehnica de
colorare cu verde intens FCF
LABORATOR 24 Localizarea intracelulară a calciului (tehnica 166
de colorare cu roşu de alizarină S)
LABORATOR 25 Determinarea activităţii glucozo-6-fosfat 168
dehidrogenazei (G-6PDH)
LABORATOR 26 Determinarea activităţii lactat-dehidrogenazei 169
(LDH)
LABORATOR 27 Culturile celulare – modele experimentale 170
moderne
LABORATOR 28 Protocol pentru inducerea şi creşterea 176
calusului la Daucus carota L.
LABORATOR 29 Protocol pentru inducerea şi creşterea 179
calusului la Nicotiana tabacum L.
LABORATOR 30 Protocol pentru obţinerea unei suspensii 181
celulare din calus de Daucus carota L.
LABORATOR 31 Protocol pentru izolarea protoplaştilor din 183
suspensii derivate din culturi de Nicotiana
tabacum var. bright yellow
LABORATOR 32 Determinarea numărului de celule dintr-o 185
suspensie utilizând hemocitometrul
LABORATOR 33 Protocol pentru cultura şi regenerarea 192
protoplaştilor la plante
LABORATOR 34 Protocol pentru obţinerea de plante haploide la 195
Brassica oleracea var. capitata prin
androgeneză experimentală
LABORATOR 35 Protocol pentru obţinerea plantelor haploide 198
prin ginogeneză experimentală la Triticum
aestivum L.
LABORATOR 36 Metode de hibridare celulară 201
LABORATOR 37 Tehnica culturilor de celule şi ţesuturi 206
animale
Capitolul 5. Metode moderne de investigaţie şi aplicaţiile lor 212
5.1. Hibridarea 212
5.1.1. Principiu 213
5.1.2. Denaturarea 213
5.1.3. Renaturarea (annealing/reannealing) 214
5.1.4. Factorul stringent 214
5.1.5. Tipuri de hibridări 215
5.1.6. Hibridizare in situ 220

  5
5.1.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi 222
biologie
5.2. Sonde genetice 223
5.3. Clonarea ADN – ului 232
5.4. Reacţia de polimerizare în lanţ (pcr) 235
5.5. Secvenţierea ADN- ului 240
5.6. Fingerprinting genomic (amprente de ADN) 242

BIBLIOGRAFIE 245

  6
INTRODUCERE

Evoluţia cunoştinţelor referitoare la celule reflectă progresele care s-


au realizat în tehnicile de studiu. Perfecţionările aduse de microscopia
fotonică la sfârşitul secolului al XIX-lea, au condus la descoperirea
plastidelor (SCHIMPER, 1883; MEYER, 1883), a vacuolelor (SACHS,
1883), a proceselor osmotice (De VRIES, 1885), a mitocondriilor
(ALTMANN, 1890; BENDA, 1897), a aparatului Golgi (GOLGI, 1898).
Punerea la punct a microscopiei electronice şi a tehnicilor asociate
acesteia, începând cu anul 1954, a adus brusc numeroase noţiuni noi.
Multiple structuri, ale căror dimensiuni sunt cuprinse între 10 şi 2000 Å au
fost evidenţiate, unele în organitele deja cunoscute (cristele membranelor
interne mitocondriale, discurile granare ale cloroplastelor, saculii şi tubulii
dictiozomilor, fibrele cromozomilor, etc.). Aceste formaţiuni care au fost
evidenţiate la o scară aşa de fină, comparativ cu cea a microscopului optic,
reprezintă ultrastructuri (sau infrastructuri) celulare. Microscopia electronică
a dat, de asemenea, imaginea virusurilor şi a macromoleculelor.
Alături de microscopia electronică, care a făcut posibilă cunoaşterea
– mai ales a structurilor celulare – alte tehnici au permis determinarea
naturii chimice a organitelor celulare.
Coloraţia Feulgen a permis evidenţierea distribuţiei ADN-ului; cea
a lui BRACHET evidenţiază prezenţa ARN-ului. Alte reacţii specifice sunt
aplicabile în histochimie şi citochimie pentru decelarea glucidelor (amidon,
glicogen), proteinelor, lipidelor. Unele dintre aceste metode au fost adaptate
microscopiei electronice; repartiţia activităţii enzimatice (fosfataza,
dehidrogenaza) poate fi pusă în evidenţă prin apariţia precipitatului opac la
electroni, la scară ultrastructurală.
În 1934 BENSKLEY şi HOERR au ideea să macereze fragmente de
ficat şi apoi să separe diverse organite celulare prin centrifugare.
Fracţiunile obţinute au fost suficiente pentru a face posibilă analiza lor
biochimică. Această metodă a fost ulterior perfecţionată în sensul
ameliorării purităţii extractelor celulare. Astfel au putut fi localizate
procesele fundamentale ale respiraţiei celulare şi au fost evidenţiate
enzimele oxidoreducătoare ale mitocondriilor (HOGEBOOM şi col., 1946).
  7
Analizele biochimice au devenit foarte precise şi extrem de sensibile
odată cu descoperirea (TSWETT, 1943) şi perfecţionarea metodei
cromatografice (MARTIN şi SYNGE, 1944).
Tehnicile combinate au condus treptat la posibilitatea asocierii
studiului structurilor cu cele ale funcţiilor. Mecanismele fundamentale cum
sunt absorbţia, metabolismul, reproducerea, etc., sunt astăzi abordate la
scară celulară şi moleculară.
Disciplina care le înglobează – BIOLOGIA CELULARĂ – cunoaşte
în ultimii 10 ani o dezvoltare rapidă datorită progreselor remarcabile
realizate în posibilităţile de investigare a celulei, astfel, tehnicile avansate de
microscopie electronică, fracţionarea celulelor prin ultracentrifugare
diferenţială, folosirea culturilor celulare, fuzionarea celulară, realizarea
anticorpilor monoclonali, tehnologia ADR-recombinat, manipularea
genetică, utilizarea biosenzorilor şi ştiinţa computerelor sunt numai câteva
din aceste tehnici care şi-au dovedit puterea analitică şi au permis unificarea
experimentului biologic, a substratului molecular şi a tehnologiei în biologia
celulară care s-a conturat sub numele de BIOLOGIE MOLECULARĂ.
Această succintă trecere în revistă a principalelor metode de
investigaţie a celulelor şi progresele acestora, departe de a fi complete,
ilustrează totuşi dinamismul acestei ramuri a biologiei contemporane.
Dezvoltarea ulterioară a biologiei celulare şi moleculare este nelimitată şi
putem afirma cu toată convingerea că ne aflăm la începutul unui drum a
cărui finalitate nu o vedem încă şi din care vom explora, cu siguranţă, din ce
în ce mai mult în scopul îmbunătăţirii condiţiei umane pe Terra.
Cartea de faţă – BIOLOGIE CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ –
metode de laborator - în forma în care a fost concepută şi realizată, este
destinată în principal activităţilor practice de laborator a studenţilor
facultăţii de biologie sau profil cu biologic (medicină, agronomie,
silvicultură, farmacie, etc.), dar prin complexitatea şi actualitatea lucrărilor
abordate, ea poate fi utilă specialiştilor din domeniul biologic şi medical,
cadrelor didactice de profil precum şi tuturor celor interesaţi să cunoască
manifestările vieţii la nivel celular.

  8
Capitolul 1

METODE UZUALE DE INVESTIGAŢIE UTILIZATE


ÎN BIOLOGIA CELULARĂ

Biologia celulară ocupă, începând din anul 1950, o poziţie din ce în


ce mai importantă în vastul domeniu al biologiei generale. Folosind
tehnicile de investigaţie cele mai noi, volumul uriaş de informaţii furnizat de
microscopia electronică şi remarcabilele rezultate obţinute de biochimie,
biofizică, genetică şi biologie moleculară, biologia celulară demonstrează
din ce în ce mai convingător inexistenţa unor graniţe stricte între căile:
morfologică, biochimică şi genetică de cercetare a celulei vii. Totodată, ea
dă posibilitatea să se înţeleagă mai bine atât diversitatea şi unitatea
proceselor moleculare ce se desfăşoară în celula vie, cât şi măsura în care
structura şi infrastructura organitelor condiţionează aceste procese. Spre
deosebire de tehnicile clasice ale biologiei celulare, care, în majoritate,
abordează probleme axate pe studiul celulei animale, în lucrarea de faţă
prezentăm şi unele metode cu aplicabilitate în studiul celulei vegetale.
Toate achiziţiile spectaculare, la început ale citologiei clasice, în
prezent ale biologiei celulare şi moleculare, au fost şi sunt dependente atât
de perfecţionarea instrumentelor de investigaţie (observaţie şi analiză), cât şi
de folosirea celor mai subtile tehnici puse la dispoziţie de diferite ramuri ale
biologiei, în special biochimia şi biofizica.
Dintre metodele de investigaţie utilizate în biologia celulară fac
parte următoarele:
- ultracentrifugarea diferenţială;
- metode citochimice (histochimice);
- metode citofizice;
- autohistoradiografia;
- electronomicroscopia;
- culturile de celule şi ţesuturi.

1.1. Ultracentrifugarea diferenţială

Watson (1974) a afirmat că punerea la punct a ultracentrifugării de


către Swedberg constituie una dintre contribuţiile cele mai importante ale
chimiei fizice în cercetările de biologie celulară.
Ultracentrifugarea diferenţială se bazează pe folosirea unor aparate
speciale cu program (ultracentrifugă), care dezvoltă mai mult de 25000
rotaţii/minut. Unii constituenţi celulari supuşi unei acceleraţii progresive,

  9
sedimentează în straturi succesive, în funcţie de densitatea lor, permiţând
astfel separarea şi studierea lor. Când pentru separarea constituenţilor
celularei se utilizează viteze de rotaţie mai mici de 25000 de rotaţii/minut,
se execută o centrifugare. Atât în cazul centrifugării cât şi ultracentrifugării
se obţine un produs numit sediment, care se depune, iar în partea superioară
rămâne un supernatant, ambii produşi putând fi analizaţi.
CENTRIFUGAREA reprezintă un procedeu fizic de separare şi
sedimentare a unor fracţii celulare şi a unor macromolecule.
Diferitele particule celulare se separă prin centrifugare în funcţie de
mărime şi densitate. Asupra particulei aflate în câmpul de centrifugare
acţionează forţa centrifugală, fracţionată şi de plutire (fig. 1). Forţa
centrifugală depinde de: mărimea radiusului particulei, vâscozitatea
mediului de suspendare şi densitate.

A B

Fig. 1. A – reprezentarea schematică a aparatului de centrifugare;


B – Repartizarea constituenţilor celulari în urma centrifugării
diferenţiale

Sedimentul este proporţional cu diferenţa între densitatea particulei


şi densitatea mediului, astfel, dacă densitatea particulei este mai mare decât
densitatea mediului, el se deplasează în sensul forţei centrifuge şi se depune;
dacă cele două densităţi sunt egale, sedimentul rămâne pe loc; când
densitatea particulei este mai mică decât densitatea mediului, particulele se
deplasează în sensul contrar forţei centrifuge, formând supernatantul.

  10
În linii mari, ultracentrifugarea diferenţială decurge astfel: ţesutul de
studiat, imediat după prelevare, este mărunt sfărâmat, cu ajutorul aparatelor
speciale (omogenizator Potter, etc.), într-o soluţie hipertonică de zaharoză şi
la temperatura de 0 - 40 C.
Omogenatul astfel obţinut este supus centrifugării la viteze din ce în
ce mai mari, culegându-se de fiecare dată sedimentul şi ultracentrifugând
mai departe supernatantul, realizând astfel centrifugări fracţionate ale
supernatantului.
Prin ultracentrifugarea diferenţială a ţesuturilor vegetale, în aceste
condiţii se depun în primul rând compuşii cu greutatea moleculară cea mai
mare (pigmenţii, cristalele, granulele de amidon), apoi membranele şi
nucleul; prin centrifugarea în continuare a supernatantului se sedimentează
cloroplastele; în supernatantul obţinut după recentrifugare se depun
mitocondriile, apoi microzomii (ribozomi + fragmente de reticul
endoplasmatic), iar în supernatantul final se vor găsi compuşii solubili (fig.
1, B).
Deoarece, atât omogenizarea, cât şi ultracentrifugarea se efectuează
la temperaturi joase, analiza biochimică permite să se pună în evidenţă, în
sedimentele succesive precum şi în supernatantul final, atât enzimele,
activitatea lor, cât şi ceilalţi constituenţi chimici citoplasmatici.
În fig. 2 este prezentată o ultracentrifugă performantă.

Centrifugarea în gradient de densitate (centrifugarea izopicnică)

Dacă ultracentrifugarea celulelor intacte şi a omogenatelor de


ţesuturi a dat posibilitatea biochimiştilor să obţină în stare necontaminată
organitele celulare, în schimb, centrifugarea în gradient de densitate s-a
dovedit o tehnică foarte preţioasă pentru obţinerea de informaţii în legătură
cu masa moleculară a proteinelor, acizilor nucleici, precum şi cu
posibilitatea de a separa aceşti componenţi în funcţie de densitatea lor. De
asemenea, prin acelaşi procedeu este posibilă şi obţinerea în stare de
purificare înaintată a membranelor intracelulare.
Acest procedeu a avut ca punct de plecare constatarea că dacă o
soluţie concentrată de săruri ale metalelor grele şi, în special, cele de clorură
de cesiu (CsCl) sau de zaharoză, este supusă unei centrifugări la viteze
foarte mari un timp îndelungat, moleculele individuale ale acestor substanţe
se dispun în câmpul centrifugal, potrivit unui gradient de densitate foarte
uniform; densitatea soluţiei este foarte mare la fundul tubului şi scade treptat
spre suprafaţa lichidului. Când într-o astfel de soluţie se adaugă o substanţă
de densitate necunoscută, moleculele acestei substanţe se dispun prin

  11
ultracentrifugare într-o anumită bandă a gradientului, adică în zona în care
moleculele din soluţia folosită corespunde densităţii de plutire a substanţei
cercetate (Zarnea, 1970).
Melson şi Stahl (1958) au folosit acest procedeu pentru demonstrarea
caracterului semiconservativ al replicării ADN-ului.

Fig. 2. Ultracentrifuga Beckman

1.2. Metode citochimice (histochimice)

Aceste tehnici se bazează pe proprietatea unor compuşi chimici din


celulă de a forma cu reactivi specifici combinaţii caracteristice, decelabile la
microscopul fotonic. În acest scop se utilizează reactivi chimici care dau fie
reacţii de culoare, fie reacţii de fluorescenţă sau care pot să conducă la
obţinerea directă sau indirectă a unor precipitate colorate.
Dintre metodele citochimice bazate pe reacţii de culoare cea
utilizată pentru localizarea amidonului şi glicogenului cu ajutorul soluţiei de
iod iodurat (soluţia Lugol) este considerată printre cele dintâi procedee
citochimice, care nu şi-au pierdut nici astăzi importanţa.
Atât chimia animală cât şi cea vegetală dispun de reacţii de culoare
de identificare a proteinelor (reacţia biuretului, xantoproteică), a glucidelor
(reacţia Fehling), a lipidelor (reacţia cu Sudan negru B). Pentru localizarea
polizaharidelor, reacţia PAS (engl. Periodic Acid Schiff), se bazează pe
  12
proprietatea acidului periodic de a oxida grupările glicol din molecula
polizaharidelor în grupări aldehidice, iar produşii rezultaţi se colorează în
roşu-violaceu cu reactivul Schiff.
Coloraţia Feulgen reprezintă una dintre cele mai precise reacţii
pentru identificarea ADN-ului. Această metodă a fost elaborată de Feulgen
şi Rossenbeck (1924) şi modificată de De Tomasi (1936).
Reacţiile de fluorescenţă se bazează pe existenţa grupărilor
electronegative. În unele biomolecule, cum ar fi cele de acizi nucleici,
lipidele şi mucopolizaharidele, aceste grupări chimice le dau capacitatea de
a contracta cu unii coloranţi fluorescenţi, combinaţii fluorescente, ceea ce
permite localizarea intracelulară a acestor biomolecule.
Astfel, oranjul de acridină i-a permis lui Strugger (1940) să
localizeze acizii nucleici atât în celulele animale, cât şi în cele vegetale şi să
constate că nuanţa fluorescenţei protoplasmei diferă de la celula vie la cea
moartă.
Reacţiile de precipitare şi de reducere a unor ioni metalici, se
bazează pe faptul că unele structuri celulare, datorită unor compuşi chimici
ce intră în constituţia lor au proprietatea de a forma precipitate; uneori
aceste precipitate sunt colorate permiţând vizualizarea directă a acestor
structuri, alteori sunt supuse unor tratamente ulterioare, trecând ionii
metalici în combinaţii colorate sau chiar reducându-i sub forma metalică,
cum se întâmplă în special în cazul precipitatelor argentice. Proprietatea
aceasta a constituenţilor celulari de a contracta combinaţii insolubile, în
special cu ionii metalelor grele (argint, uraniu, plumb), este larg folosită în
cercetările electronomicroscopice, datorită însuşirii lor de a-şi intensifica
densitatea optică la fluxul de electroni.
Modelele imunochimice sunt metode bazate pe reacţia de
precipitate a antigenului cu anticorpul în mediu lichid sau solid (ex.
determinarea grupelor sanguine).  Componentele structurale ale
microorganismelor joacă rol de antigen, provoacă răspuns imun din partea
organismului infectat, ceea ce rezultă în producere de anticorpi.
Reacţia antigen – anticorp este specifică, antigenul poate fi legat
numai de anticorpul ce s-a produs ca răspuns la stimulul antigenic respectiv.
Aceste reacţii pot fi folosite pentru detectarea unui antigen necunoscut cu
ajutorul unui anticorp cunoscut (metode de diagnostic directe) sau
detectarea anticorpilor din serul bolnavilor cu antigene cunoscute
(serodiagnostic, metode de diagnostic indirecte). În cazul în care antigenul
corespunde anticorpului, se formează complexul imun antigen-anticorp.
În funcţie de cum se vizualizează / detectează formarea complexului
imun există mai multe metode bazate pe reacţii antigen - anticorp:

  13
• reacţii de precipitare: complexele imune formează precipitat;
• reacţii de aglutinare: complexele imune formează aglutinat;
• RFC – se detectează consumarea complementului (acesta se
leagă de complexele imune);
• reacţii în care elementul cunoscut este marcat – se detectează
elementul marcat din complexul imun format.
1. Reacţii de precipitare. Pot avea loc în medii lichide (metode
folosite în bacteriologie) sau în medii solide.
Antigenele: de natură coloidală (solubile), precipitinogene.
Anticorpii: precipitine.
Complexul imun: precipitat.
2. Reacţii de aglutinare
Antigenele: de natură corpusculară, aglutinogene.
Anticorpii: aglutinine.
Antigenele corespund cu anticorpii şi sunt prezente în cantităţi
echivalente: se formează aglutinatul (reţea tridimensională de complexe
imune), vizibil cu ochiul liber sub forma de grunji.
Reacţia de hemaglutinare, hemaglutino-inhibare (RHA-HAI) se
foloseşte pentru detectarea virusurilor care prezintă pe suprafaţă
hemaglutinine (HA).
Exemplu, metoda Hirst:
- detectarea anticorpilor antihemaglutinină din serul bolnavilor de
gripă convalescenţi.
3. Metode care folosesc un reactant imunologic marcat
ƒ Reacţia de imunofluorescenţă (RIF).
Fluorocromii se leagă covalent de proteine (imunoglobuline) =
conjugat; emit fluorescenţă dacă se expun la raze UV. Preparatul se
examinează la microscopul cu fluorescenţă. Puncte fluorescente pe fond
întunecat confirmă rezultat pozitiv.
ƒ Metode imunoenzimatice (RIE, ELISA - enzyme-linked
immunosorbent assay)
Permit detectarea antigenelor libere şi a anticorpilor. Este posibilă
determinare cantitativă. Reacţiile au loc în aparate automate, semiautomate.
La reacţii participă:
- un reactant imunologic cunoscut ataşat de un suport solid (plăci cu
godeuri, lame, baghete);
- se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A;
- un reactant imunologic marcat enzimatic – peroxidaza;
- substrat specific (cromogenic) - se produce o modificare de culoare
detectabilă spectrofotometric (determinare cantitativă);
  14
- substanţe pentru stoparea reacţiei (baze sau acizi puternici).
Reacţiile citochimice sunt utilizate în localizarea şi chiar
determinarea activităţii a numeroase enzime, care nu-şi pierd activitatea
biologică în timpul fixării ţesuturilor, fie prin congelare, fie cu fixatori
specifici, luând astfel naştere citochimia enzimologică (ex. localizarea
fosfatazelor acidă şi alcalină, evidenţierea peroxidazelor, etc.).

1.3. Metode citofizice

Dintre acestea fac parte: spectrofotometria, cromatografia şi


electroforeza.
Spectrofotometria – reprezintă un procedeu fizic de localizare (şi
chiar dozare) cu ajutorul luminii, a componenţilor unui amestec, în funcţie
de lungimea de undă absorbită (fig. 3).

Fig. 3. Spectrofotometru UV/VIS T60

Spectrofotometria poate fi considerată ca unul dintre cele dintâi


procedee fizice aplicate la studiul activităţii constituenţilor chimici ai
celulei.
În celulă se găseşte un amestec de constituenţi chimici care
alcătuiesc un spectru global. Uneori, unul din constituenţii acestui amestec
poate să absoarbă, în mod caracteristic, unele lungimi de undă, permiţând
astfel localizarea şi chiar dozarea lui. Plecând de la faptul că unii compuşi
biologici au un spectru de absorbţie caracteristic, fie în radiaţiile vizibile, fie
în UV sau infraroşu. Caspersson a pus la punct un microspectrofotometru
care permite să se stabilească spectrul de absorbţie al particulelor cu
diametrul mai mic de 1nm. În urma determinărilor efectuate, a precizat că
  15
acizii nucleici şi constituenţii lor (nucleotidele) prezintă un maxim de
absorbţie în UV la λ= 260 nm; de asemenea, a mai constatat că nici o
substanţă protoplasmatică, în afară de acizii nucleici şi nucleotidele, nu
prezintă acest maxim de absorbţie şi nici nu-l interferează. Studiul
secţiunilor de ţesuturi vegetale şi animale supuse tehnicii Feulgen-
Rossenbeck a permis să se efectueze pe cale microspectrofotometrică
determinări precise de ADN (Soran, 1976).

Cromatografia – este o metodă de separare între două faze heterogen


nemiscibile a mai multor componente chimice dintr-un amestec.

Fig. 4. Cromatografia de partiţie: plasarea fazei mobile (produsul de


cercetat) pe suportul de hârtie (faza staţionară)

Componentele se distribuie în mod diferit într-o fază staţionară (fixă)


şi una mobilă. În funcţie de suportul folosit ca fază staţionară există diferite
tipuri de metode cromatografice:
- cromatografia de partiţie;
- cromatografia de absorbţie.

Cromatografia de partiţie constă în separarea componentelor dintr-un


amestec pe baza coeficientului de repartiţie diferit, între două lichide parţial
miscibile:
  16
- faza apoasă;
- solvenţi neapoşi.
Faza apoasă este staţionară într-un suport de hârtie de filtru, cu
porozitate constantă. Faza mobilă, reprezentată de solventul neapos, se
deplasează prin pori de-a lungul suportului (fig. 4). În timpul acestei
deplasări are loc o continuă redistribuire a substanţelor din amestec între
cele două faze lichide, după formula:

distanţa străbătută de substanţă


Rf = ---------------------------------------
distanţa străbătută de solvent

Dintre două substanţe cu Rf (coeficient de repartiţie) diferit, cea cu


Rf mai mare va avea şi viteză de deplasare mai mare şi deci va fi găsită mai
departe de strat.
Cromatografia de partiţie poate fi:
- descendentă (cea mai folosită);
- ascendentă;
- circulară.

Cromatografia de absorbţie sau cromatografia pe schimbători de


ioni, constă, ca principiu, în stabilirea multiplelor legături electrostatice între
sarcinile electrice ale macromoleculelor şi sarcinile opuse ale suprafeţei
schimbătorilor. Un schimb reversibil de ioni are loc între faza solidă şi
lichidă fără ca în structura fazei solide să apară schimbări esenţiale.
Faza solidă este reprezentată de particule de răşină cu o reţea
tridimensională de hidrocarbură pe care sunt grefate un număr mare de
grupe ionizabile (grupări active). În funcţie de suportul macromolecular pe
care sunt grefate grupările active, schimbătorii de ioni se împart în mai
multe categorii:
- schimbători de ioni pe bază de polistiren sau acid polimetacrilic
(răşini schimbătoare de ioni);
- schimbători de ioni pe bază de dextran (Sephadex);
- schimbători de ioni pe bază de celuloză (Celux).

Gaz cromatografia (GC) este un tip de cromatografie utilizată în


analizele biochimice pentru separarea şi analiza compuşilor care se evaporă
uşor. În mod uzual, prin GC se obţine purificarea unor substanţe sau
separarea diferiţilor compuşi dintr-un amestec (cantitate relativă a acestor
compuşi putând fi determinată). Cu anumite proceduri, GC poate ajuta la

  17
identificarea unor compuşi şi chiar izolarea lor dintr-un amestec în stare
pură. În gaz-cromatografie, faza mobilă este un gaz, în mod uzual unul inert,
cum este heliu, sau un gaz nereactiv, cum este azotul. Faza staţionară este
un lichid sau un polimer solid inert, inclusă într-o piesă tubulară de sticlă
sau metal numită columnă. Instrumentul utilizat pentru gaz-cromatografie se
numeşte gaz cromatograf, aerograf sau separator de gaz (fig.5).
Gaz cromatografia este, de asemenea, cunoscută drept vapor-phase
chromatography (VPC) sau gas–liquid partition chromatography (GLPC).

Fig. 5. Echipament de gaz cromatografie (GC)

Electroforeza reprezintă fenomenul de migrare a ionilor (A+ şi B-)


dintr-o soluţie sub acţiunea câmpului electric conform legii lui Coulomb.
Cationii A+ se vor deplasa spre polul negativ (catod), iar anionii se
vor deplasa spre polul pozitiv (anod); se foloseşte pentru fracţionarea ionilor
dintr-o soluţie. Un echipament de electroforeză utilizat în laborator este
prezentat în fig. 6.

  18
Fig. 6. Aparat de electroforeză orizontală

1.4. Autohistoradiografia

Tehnică extrem de precisă, autohistoradiografia constă în a face să


pătrundă în celule un compus radioactiv şi apoi a-i decela localizarea
datorită proprietăţilor pe care le posedă radiaţiile emise de acestea (β, γ) de a
impresiona o emulsie fotografică. Celulele astfel tratate sunt acoperite cu un
strat de emulsie şi, după un timp de expunere convenabil, developarea
startului de emulsie permite să se observe prezenţa de granulaţii negre de
argint redus la nivelul situs-urilor radioactive. Radioizotopii cei mai folosiţi
în acest scop sunt: 3H, 14C, 35S, 32P, 15N; ei se găsesc sub formă ionică în
diverse combinaţii chimice, care mai poartă denumirea de molecule
marcate.
În general, în cercetările de biologie celulară se folosesc acele
molecule marcate pe care celula le poate utiliza ca precursori în diverse
biosinteze. Astfel, timidina marcată cu tritiu (3H) se utilizează pentru
urmărirea biosintezei ADN, uridina marcată cu tritiu pentru ARN,
carbonatul acid de amoniu marcat cu 14C pentru cercetarea proceselor
fotosintetice, etc.

1.5. Electronomicroscopia

Niciuna dintre tehnicile utilizate în cercetările de biologie celulară n-


a putut, până în prezent, să furnizeze o gamă aşa de largă de informaţii, cum
a reuşit să o facă electronomicroscopia. Microscopia electronică a dat
posibilitatea obţinerii unor cunoştinţe precise asupra materiei vii, începând
cu arhitectura ultrastructurală a celulei şi sfârşind cu aceea a ansamblului

  19
structural – funcţional al biomoleculelor (fig. 7). În afară de înalta putere de
rezoluţie a microscopului electronic şi a contribuţiei celorlalte procedee de
investigaţie biologică asociate, o importanţă deosebită prezintă fixatorii
utilizaţi. Tetraoxidul de osmiu şi permanganatul de potasiu (fixatori
metalici) s-au dovedit a fi cei mai buni fixatori pentru studiul
biomoleculelor, iar aldehidele (glutaraldehida, aldehida formică,
paraformaldehida şi acroleina) pentru cercetarea cromatinei şi punerii în
evidenţă a structurilor fibrilare ale citoplasmei; utilizarea ca fixatori a
carbodiamidei solubilă în apă, urmată de o postfixare osmică, poate asigura
conservarea a numeroase enzime.  

Fig. 7. Microscop electronic cu transmisie, Leo 912AB

Avantaje: avantajul cel mai important este magnificarea mult


crescută faţă de microscoapele optice, de la 300.000 până la 2.000.000 de
ori (Hitachi S-5500) şi nu în cele din urmă, modurile multiple de investigare
de pe urma cărora se poate obţine o gamă vastă de informaţii.
Dezavantaje: costul ridicat al aparaturii, sensibilitatea ridicată la
diverşi factori externi (câmpuri electromagnetice, vibraţii) şi faptul că unele
  20
probe (de exemplu, ţesuturile vii) trebuiesc preparare în prealabil sau au
nevoie de condiţii speciale în timpul examinării la microscop şi, în unele
cazuri, chiar nu pot fi studiate eficient cu ajutorul unui microscop cu
electroni.
Rezultatele obţinute de electronomicroscopia aplicată la studiul
celulei, în general, dovedindu-se de la început spectaculoase, au trezit
interes în rândul cercetătorilor care au căutat să îmbunătăţească şi mai mult
tehnica fixării materialului de cercetat. Dintre aceste realizări de un real
folos s-a dovedit criodecapajul (freeze-etehing), procedeu bazat pe
congelarea extrem de rapidă a materialului şi care asigură obţinerea de
replici fidele ale constituenţilor celulari. Această tehnică reduce artefactele
şi asigură totodată păstrarea structurii şi compoziţiei chimice a materialului
studiat. O îmbunătăţire a tehnicilor de microscopie electronică o constituie
şi coloraţia negativă. În linii mari, ea constă dintr-o prealabilă impregnare  a
celulei, în anumite condiţii, cu o soluţie, fie de acid fosfotungstic, fie de
acetat de uranil. În aceste condiţii de lucru, piesa de studiat prin evaporarea
părţii lichide, este acoperită cu substanţa opacă la electroni şi care nu
realizează nici o combinaţie cu constituenţii celulari. Secţiunile ultrafine
obţinute din materialul astfel tratat, examinate la microscopul electronic,
apar clare pe un fond întunecat, de unde şi denumirea de coloraţie negativă
dată acestei tehnici care permite să se observe cele mai mici detalii
structurale ale celulei. În prezent, există posibilitatea să se facă examene
electronomicroscopice pe celula vie, folosind camere de examinare în care
se realizează o presiune şi temperatură compatibile cu supravieţuirea celulei.

1.6. Culturile de celule şi ţesuturi

Una dintre tehnicile relativ recente, care a adus şi aduce contribuţii


importante la studiul celulei, o constituie şi cultura celulelor şi ţesuturilor
vegetale şi animale. Prin practica culturilor de ţesuturi se poate obţine o
masă apreciabilă de celule omogene necesare cercetărilor de citofiziologie
vegetală şi animală.
Progresele înregistrate în domeniul cercetării fundamentale de
biologie celulară au făcut posibilă demonstrarea totipotenţei celulei
vegetale, ipoteză formulată încă de Haberlandt la începutul secolului nostru,
demonstrându-se că orice celulă nucleată vie din corpul plantei conţine toată
informaţia genetică necesară pentru a regenera o plantă întreagă. Tehnicile
de culturi in vitro permit exprimarea potenţialului regenerativ al celulei
vegetale prin expunerea acesteia la condiţii nutriţionale, hormonale şi fizice
riguros controlate; aproape toate operaţiunile de cultură se execută în

  21
condiţii sterile, utilizând hota cu flux laminar (fig. 8) şi cameră de creştere
(fig. 9) cu parametrii controlabili (lumină, temperatură, umiditate, etc.).
Metodele de micropropagare (clonare) prin culturi de ţesuturi sunt
de un million de ori mai rapide decât cele tradiţionale. Clonarea in vitro
facilitează deci, înmulţirea în ritm intensiv a explantelor valoroase obţinute
de către amelioratori. Plantele neoformate in vitro deţin toate calităţile
plantei donatoare.  
Metodele de multiplicare şi propagare in vitro sunt practicabile la
orice specie vegetală. În horticultură şi silvicultură aceste procedee au
cunoscut o extindere mai mare, întrucât materialul de plantat – săditor –
rezultat prezintă calităţi superioare, în raport cu acela obţinut prin
metodologiile clasice de înmulţire vegetativă.
Plantele generate in vitro sunt juvenilizate (întinerite), lipsite de boli
şi mai viguroase, prezentând calităţi de excepţie, imposibil de păstrat prin
înmulţirea sexuată. Pe de altă parte, tehnicile de cultivare pe medii aseptice
a unor explante vegetale permit şi multiplicarea speciilor care fie nu au
seminţe viabile, fie nu se înmulţesc natural, pe cale vegetativă, sau le lipsesc
polenizatorii, în cazul importului de specii din alte zone ale lumii. Toate
acestea conduc la ridicarea producţiei vegetale şi a calităţii produselor. 
Un procedeu care se dovedeşte de un real folos în studiul celulei
vegetale este obţinerea protoplastului. Acest procedeu se bazează pe
degradarea enzimatică a membranei pectocelulozice, fără afectarea
conţinutului celular situat în interiorul acestei membrane, adică protoplastul.
Folosirea protoplaştilor ca material de cercetare a permis în ultimii
ani rezolvarea unora dintre cele mai importante probleme pentru biologia
celulei vegetale, deoarece absenţa peretelui celular pectocelulozic dă
posibilitatea să se utilizeze metode extrem de blânde şi indispensabile pentru
a izola nu numai nucleele intacte, dar şi alte organite celulare. Datorită
folosirii lor au fost obţinute date precise privind proprietăţile fizico-chimice
ale plasmalemei, procesele de pinocitoză, neoformarea peretelui celular şi
biosinteza produşilor chimici care intră în constituţia lui, relaţiile nucleo-
plasmatice, pătrunderea virusurilor, mecanismele hibridării somatice, etc.
Paralel cu punerea la punct a tehnicilor enzimatice de izolat
protoplaştii din diverse organe vegetale au fost elaborate şi o serie de
procedee de cultivare a lor, unele folosind medii lichide, altele medii solide.
Prin aceste tehnici s-a putut stabili că protoplaştii izolaţi posedă trei
caracteristici cu implicaţii teoretice şi practice deosebite:
- totipotenţa, fiind capabili să regenereze plante complete, cu
structuri morfologice normale;

  22
- proprietăţi pinotice şi fagocitice, ceea ce fac din ei un excelent
material pentru cercetările de inginerie genetică în scopul
inducerii transformărilor celulare;
- capacitatea de fuziune, care permite obţinerea de hibrizi somatici
parasexuali sau celulari, realizându-se astfel recombinarea
genomurilor unor specii sexual incompatibile. 
O importanţă deosebită au biotehnologiile moderne pentru
manipularea genomului celulei vegetale şi animale în vederea creării de
soiuri de plante şi rase de animale pe căi neconvenţionale, mult mai repede
şi mai eficient.
În ultimele două decenii şi jumătate transgeneza la organismele
vegetale şi animale a devenit o metodă tot mai larg folosită pentru transferul
unor gene utile şi obţinerea unor organisme cu rezistenţă sporită la condiţiile
de mediu, cu productivitate superioară, capabile să utilizeze medii
nespecifice, etc. Dacă prin metodele clasice de ameliorare puteau fi
transferate doar gene utile de la rude cultivate sau sălbatice, utilizarea
ingineriei genetice permite transferul oricărei gene la oricare organism viu.

Fig. 8. Hota cu flux laminar utilizată în culturile de celule şi


ţesuturi

  23
Avantaje excepţionale pentru activitatea de creare a unor genotipuri
noi într-un timp mai scurt prezintă aplicarea metodei numită haploidie
experimentală. Haploidia este o stare specifică procariotelor şi mai puţin
întâlnită la eucariote. A fost observată mai frecvent la alge unicelulare,
ciuperci, muşchi. Uneori haploidia a fost depistată şi la unele animale (mai
ales la insecte), dar şi la plantele superioare (mai ales la angiosperme).
Organismele haploide au în celulele lor un număr înjumătăţit de
cromozomi (n), numărul specific gameţilor. Datorită faptului că organismele
haploide posedă un singur set de cromozomi, în fiecare poziţie a unei gene
din cromozom (locus) este prezentă doar o singură alelă. Acest organism
manifestă o stare specială, cea de hemizigoţie.
Această stare permite manifestarea fenotipică a tuturor genelor
prezente în cromozomi (nu există fenomenul de dominanţă şi recesivitate
între gene), existând o concordanţă deplină între genotip şi fenotip. 
Frecvenţa haploizilor la plante în natură este foarte scăzută. Rieger
(1963) aprecia la cca. 0,025 – 0,037% la bumbac, cca. 0,018% la laur, cca.
0,05% la porumb, cca. 0025% la grâu, etc. Impactul practic deosebit al
haploizilor şi anume cel al obţinerii într-un timp incomparabil mai scurt al
liniilor izogene (pure din punct de vedere genetic) comparativ cu metoda
clasică de purificare a materialului biologic a determinat o activitate
susţinută pentru identificarea unor tehnici pentru inducerea haploidiei.
Desigur, o serie de tehnici utilizate la început n-au avut eficienţa
aşteptată. În ultimul timp, o atenţie deosebită se acordă obţinerii haploizilor
şi liniilor izogene cu ajutorul culturilor de ţesuturi in vitro, respectiv prin
androgeneză şi ginogeneză experimentală.
Metoda constă în cultura in vitro a anterelor sau microsporilor
uninuleaţi haploizi (androgeneză experimentală), sau a ovarelor sau ovulelor
nefecundate (ginogeneză experimentală). Plantele regenerate au un singur
set de cromozomi (patern prin androgeneză şi respectiv matern prin
ginogeneză).
Plantele haploide (cu ”n” cromozomi) au o talie mică şi sunt mai
puţin viguroase comparativ cu plantele originare diploide (”2n”
cromozomi). La haploizi se manifestă un grad înalt de sterilitate, cauzată de
anomaliile meiozei.
Prezenţa în celulele - mamă ale gameţilor a unui singur set de
cromozomi elimină procesul conjugării şi segregării. Ca urmare, în meioza
haploizilor cromozomii se repartizează neregulat spre cei doi poli,
producând nuclei anormali şi sterilitate totală sau aproape totală.

  24
La plantele alogame efectele haploidiei sunt şi mai puternic
exprimate decât la cele autogame, starea haploidă permiţând manifestarea
unor mutaţii recesive cu efect dăunător asupra organismului.
Toate aceste inconveniente pot fi eliminate prin dublarea numărului
de cromozomi cu ajutorul tratamentului cu colchicină (0,01-0,1%) sau cu
alte substanţe antimitotice într-o concentraţie adecvată. De multe ori s-a
observat că dublarea numărului de cromozomi poate avea loc în mod
spontan, prin menţinerea plantulelor cu origine androgenetică sau
ginogenetică în cultura in vitro.
Prin dublarea somatică a cromozomilor hemizigoţi şi prin inducerea
embriogenezei rezultă plante dublu haploide, cu meioză normală,
producătoare de seminţe, cu genotip diploid, perfect homozigot.  Haploizii
posedă două atribute de interes major pentru amelioratori:
• scurtează timpul necesar pentru obţinerea liniilor pure,
homozigote;
• reduc dificultatea identificării şi manipulării caracterelor dorite,
deoarece încă din primele faze ale selecţiei pot fi eliminaţi indivizii
necorespunzători, toate genele nefavorabile manifestându-se fenotipic.
Dezvoltarea tehnicilor de cultură a celulelor vegetale a făcut
posibilă, în ultima vreme, cultura celulelor în suspensie, similar
microorganismelor. Ea presupune, deci, cultivarea de mici agregate celulare
sau celule izolate (în culturi monocelulare), submersia materialului putând fi
efectuată în regim staţionar (caz care presupune subcultivări periodice
deoarece creşterea încetează când nutrienţii de bază s-au redus cantitativ sau
chiar s-au epuizat), fie cel mai adesea într-un regim de agitaţie continuă,
realizat cu ajutorul unor aparaturi adecvate. Aceste aparate automate poartă
diferite denumiri (agitatoare rotatorii sau vibratorii, chemostate, fitostate,
bioreactoare, fermentatoare, turbidostate, etc.) urmăresc realizarea unor
condiţii optime de mediu nutritiv, lumină, temperatură, pH, aerisire, etc.
Fermentatoarele sunt utilizate atât pentru cultura continuă, cât şi în cultura
de volum mediu limitat, stabilit iniţial. Chemostatele sunt utilizate pentru
cultura continuă, în timp ce fitostatele pentru reglarea culturii semicontinue,
aparate în care rata de creştere şi densitatea celulară sunt menţinute
constante prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi şi
hormonali. Turbidostatele sunt sisteme deschise de cultură continuă, în care
mediul proaspăt se adaugă în momentul creşterii turbidităţii culturii şi a
eliberării prin spălare şi eliminarea excesului de celule. Rata eliminării
celulare este echilibrată prin formarea de noi celule în vasul de cultură.
Sistemul poate fi de tip continuu închis, caz în care se produce o
reîmprospătare a mediului, dar fără eliberarea de celule, biomasa rămânând

  25
să se acumuleze continuu în sistem (acestea sunt limitate în timp).
Suspensiile celulare se pot iniţia fie direct din ţesuturi vegetale inoculate în
mediu lichid, fie din fragmente de calus sau din cultură de protoplaşti.
Agitarea continuă a mediului de cultură lichid facilitează fragmentarea
ţesuturilor şi formarea de mici agregate celulare, fapt ce asigură un bun
contact al celulelor cu componentele mediului de cultură şi în acelaşi timp, o
intensificare a schimbului de gaze.  Pentru realizarea unei culturi celulare în
suspensie, eficientă din punct de vedere economic, este necesară cultivarea
unui material biologic de mare productivitate şi stabil genetic. În timpul
perioadei de cultură, procesul de diviziune mitotică începe la o zi-două de la
iniţiere şi se intensifică la maximum la 7 zile, după care frecvenţa mitozelor
scade progresiv, încetând definitiv la sfârşitul celei de-a treia săptămâni de
cultură. Această fază a suspensiei este saturată. Dacă aceasta este diluată
prin subcultură la conţinutul celular iniţial, se repetă acelaşi ciclu de
creştere.

Fig. 9. Cameră de creştere cu parametrii controlabili

La scară industrială, unele substanţe utile de provenienţă vegetală ar


putea fi obţinute prin sinteză chimică, dar moleculele lor sunt adesea foarte
  26
complexe. În egală măsură, este posibil să se obţină aceste molecule pornind
de la culturile realizate în câmp. O ultimă tehnică utilizată este cultura in
vitro de celule vegetale. Ea pune totuşi două probleme fundamentale:
sinteza metabolitului dorit să fie în cantitate suficientă şi posibilitatea
cultivării în bioreactoare, cu timp de generare lung pentru celulele vegetale. 
Această biotehnologie modernă are mari implicaţii aplicative. Pe această
cale se obţin linii celulare cu mare capacitate biosintetică a unor metaboliţi
care, în condiţii normale sunt sintetizaţi în cantităţi foarte mici de către
plante (alcaloizi, enzime, proteine furajere, diferite alte substanţe). Liniile
celulare selecţionate in vitro produc o multitudine de substanţe necesare
pentru fabricarea medicamentelor, în alimentaţia umană, pentru furajarea
animalelor, în industria chimică, etc. (Raicu, 1990).

Substanţele produse în culturile de celule vegetale sunt


următoarele: acizi nucleici, alcaloizi, antrachinone, agenţi antileucemici,
agenţi antitumorali, agenţi antivirali, arome, benzochinone, calcone,
diatrone, enzime, flavonoide, furanocumarine, glucide şi polizaharide,
glicozide cardiotonice, uleiuri, inhibitori de enzime, insecticide, latex,
lipide, naftochinone, nucleotide, opiate, fenol, pigmenţi, proteine, steroizi,
taninuri, terpene şi terpenoide, vitamine. 
Ideea de a transforma plante cultivate în ”uzină de medicamente” îşi
face încet loc. A fost posibil să se introducă în patrimoniul ereditar al rapiţei
o genă responsabilă de fabricarea neuropeptidei foarte utilizată în farmacie
(encephaline).
Planta transformată sintetizează în cantităţi importante aceste
proteine umane. De asemenea, hormoni, cum ar fi gonadotropinele, au fost
produşi în plantele de tutun. Cercetătorii doresc să exploateze în viitor
plantele ale căror organe de rezervă (tuberculi, de exemplu), ar putea fi
locuri de depozitare ale unor astfel de molecule. Cartoful este un foarte bun
candidat.
Iată câteva randamente de producţie ale culturilor de celule şi ale
plantei întregi:
ƒ antrachinona - producţia este de 900 nmol/g masă uscată în
cultura celulelor de Morinda citrifolia şi de 110 nmol/g masă
uscată de rădăcini;
ƒ ajmalicina şi serpentina: - producţia este de 1,3 masă uscată
de celule în cultura de Catharanthus roseus şi de 0,26 plantă
masă uscată;

  27
ƒ diosgenine - producţia este de 26 mg/g masă uscată de celule
în cultura de Dioscorea deltoidea şi de 20 mg/g tuberculi
masă uscată;
ƒ saponine de ginseng - producţia este de 0,38% masă
proaspătă de celule în cultura de Panax ginseng şi de 0,3-
3,3% plante masă proaspătă.
Majoritatea tipurilor de celule animale pot supravieţui în condiţii
corespunzătoare într-un vas de cultură in vitro. Prin cultura de celule
animale se obţine o multiplicare a celulelor provenite dintr-un ţesut sau
organ.
Ross Granville Harrison (1907) este primul cercetător care a propus
o tematică de studiu în acest domeniu, fiind considerat părintele şi
fondatorul unei noi ştiinţe, cea a culturii de celule animale. El este cel care a
propus tehnica de cultură în picătură în suspensie (fig.10). 
În cultura experimentală se poate studia comportamentul celulelor în
condiţii controlate, strict definite; este posibil să se determine efectele
asupra comportamentului celular prin adăugarea în mediul de cultură a unor
molecule specifice – hormoni sau factori de creştere - şi să se obţină
populaţii celulare omogene care pot fi utilizate în analize biochimice sau
pentru studiul interacţiunilor între un tip celular sau altul.
Observaţiile se verifică în comparaţie cu comportamentul celular in
vivo (mediu natural).

Fig. 10. Schema culturii de ţesut animal în suspensie (Harrison,


1907).
  28
Tehnica culturilor de celule şi ţesuturi animale permite:
- studiul caracterelor morfologice şi proprietăţile biologice ale
celulelor din diferite ţesuturi, separate de organism şi sustrase influenţei
sistemului nervos şi curentului sanguin;
- studiul unor probleme de biologie tisulară (cum ar fi afinitatea sau
antagonismul între suşe tisulare diferite).  
Cultivarea celulelor animale şi umane este în prezent o tehnicǎ larg
utilizatǎ de multe discipline biologice, de la cele clasice la biologia
molecularǎ, în ultimii ani având largi aplicaţii practice în biotehnologii.
Culturile de celule animale permit obţinerea unei game largi de
produşi cu activitate biologică: imunomodulatori, anticorpi, factori de
creştere, citokine, enzime şi hormoni. În prezent, mari firme cu profil
biotehnologic produc din culturi de celule şi comercializează vaccinuri
virale, activatorul tisular al plasminogenului (facilitează dezintegrarea
cheagurilor de sânge), interferonul α (utilizat în terapia cancerului),
anticorpi monoclonali şi antigene tumor-specifice (incluse în kituri
diagnostic), etc. Astfel, culturile de fibroblaste / keratinocite prelevate de la
pacienţi cu arsuri sunt folosite în vindecarea lor, cele din condrocite sunt
larg utilizate în procesele de regenerare a cartilajului articular, etc. De
asemenea, culturile celulare pot fi utilizate în studii de toxicologie,
farmacotoxicologie sau cosmetologie, înainte de lansarea unor produse noi
pe piaţă.
Domeniile şi disciplinele care beneficiază de dezvoltarea ştiinţei
culturilor de celule animale sunt următoarele:
Oncologia prin studiul dezvoltării tumorilor maligne în linii celulare
maligne stabile (ex. HeLa); prin studiul efectelor agenţilor fizici, chimici,
etc., asupra tumorilor.
Microbiologia prin posibilitatea obţinerii anticorpilor monoclonali;
cultivarea virusurilor.
Genetica moleculară şi ingineria genetică prin posibilitatea
analizei genetice a celulelor somatice animale şi umane; prin aplicarea
manipulărilor genetice în vederea obţinerii unor produse (insulina, hormoni
de creştere, etc.).
Imunologia prin studiul în linii celulare a componentelor ţesutului
hematopoetic; prin studiul mecanismului de acţiune al anticorpilor.
Medicina prin studiul arterosclerozei prin culturi de celule
endoteliale din capilare; prin analiza celulelor obţinute prin amniocenteză în
vederea evidenţierii problemelor genetice sau virale la fetuşi; terapia
celulară.

  29
Capitolul 2

TEHNICA MICROSCOPICĂ. PREPARATELE


MICROSCOPICE.

Studiul celulei a progresat în ultima perioadă şi datorită


perfecţionării metodelor de investigare, permiţând acumularea de noi
observaţii. Astfel, microscopia electronică de transmisie cu voltaj înalt a
îngăduit observarea pentru prima dată a celulelor vii. Utilizarea difracţiei cu
raze X a produs o revoluţie în ştiinţele biologice prin descifrarea structurii
spaţiale a proteinelor şi acizilor nucleici; combinată cu microscopia
electronică a permis obţinerea structurii tridimensionale a unor ansambluri
ca de exemplu bacteriorodopsina. Metoda difracţie – dispersie a permis
descifrarea organizării moleculare a cromatinei. Rezonanţa magnetică
nucleară de înaltă rezoluţie a fost utilizată în elucidarea interacţiunilor
moleculare.

Fig. 11. Aspectul structural al celulei în microscopie


fotonică şi electronică
30
Tehnicile de spectrofluorometrie s-au perfecţionat în ultimul timp
permiţând aprecierea prin probe de fluorescenţă a vâscozităţii membranelor,
a difuziei sau rotaţiei proteinelor membranare, iar tehnicile biochimice de
biologie moleculară au ajuns de neînlocuit, atât ca o completare a metodelor
amintite cât şi în mod independent. În ultimii ani s-au elaborat tehnologii de
biologie celulară şi moleculară complexe bazate pe culturi celulare, fuziuni
celulare, purificări de gene (tehnologia ADN-ului recombinat), etc. (fig.11).
Dintre mijloacele tehnice morfologice, o primă etapă în studiul celulei este
reprezentată de microscopia fotonică.

2.1. Microscopul fotonic

Microscopul fotonic este un aparat optic de mărit care utilizează ca


sursă de radiaţie fotonul, element din spectrul undelor electromagnetice.
Examenul citologic în microscopia fotonică este limitat de puterea de
separare sau rezoluţie a aparatului, calitatea cea mai de preţ a unui
microscop. Puterea de rezoluţie reprezintă cea mai mică distanţă la care
două puncte pot fi văzute distinct şi se calculează după formula lui Abbe. Se
consideră ca limită maximă pentru puterea de rezoluţie a microscopului
fotonic este de 0,2 microni, valoare care nu va putea fi depăşită din cauza
lungimii de undă mari a fotonului.
Prin montarea unor dispozitive speciale la microscopul fotonic
obişnuit, se poate realiza :
• microscopia în contrast de fază;
• microscopia în lumină fluorescentă;
• microscopia pe fond întunecat;
• microscopia în lumina polarizată.

2.1.1. Microscopul fotonic obişnuit

Microscopul fotonic obişnuit se compune din trei părţi: mecanică, optică


şi sursa de lumină.
Partea mecanică sau stativul microscopului este construit din metal şi
reprezintă suportul pentru partea optică şi sursa de lumină.
Se compune din:
Talpa sau piciorul microscopului asigură stabilitatea aparatului; în ea se
găseşte montată sursa de lumină, oglinda proiectoare şi un diafragm.
Coloana este ataşată la piciorul microscopului printr-un dispozitiv de
articulaţie şi are montate: platina sau măsuţa microscopului, tubul şi
dispozitivul de punere la punct a imaginii.

31
Platina este un dispozitiv pe care se fixează preparatul de examinat. Are
o formă rotundă sau pătrată şi este dispusă perpendicular pe axa optică a
microscopului; în centru are o deschidere rotundă sau dreptunghiulară prin
care trec razele de lumină spre preparatul de examinat. Cu ajutorul a două
vize laterale, platina se poate deplasa în plan orizontal în vederea examinării
preparatului pe toată suprafaţa sa. Pe faţa ei superioară se găsesc două
dispozitive de fixare a portobiectului (valeţi) şi o riglă gradată destinată
reperării unor teritorii de pe suprafaţa preparatului (fig. 12 şi 13).
Tubul are montat la extremităţi sistemul obiectiv – ocular (în partea
inferioară sistemul obiectiv, iar în partea superioară sistemul ocular). Cu
ajutorul a două şuruburi numite vize, tubul se deplasează în sus sau în jos,
mişcări necesare pentru obţinerea unei imagini clare.
Revolverul este dispozitivul pe care se montează elementele sistemului
obiectiv (la microscopul ML4 sunt montate cinci obiective de puteri
măritoare crescânde care pot fi aduse în axa optică a microscopului). Este
format din două discuri: unul mobil pe care se fixează cele cinci obiective
cu puteri măritoare crescânde şi altul fix care se ataşează la extremitatea
inferioară a tubului; acesta din urmă este prevăzut cu un dispozitiv de
stopare care blochează fiecare obiectiv în parte când axa acestuia coincide
cu axa optica a microscopului.
Dispozitivul de punere la punct este necesar pentru obţinerea de imagini
clare şi se realizează prin deplasarea sistemului obiectiv – ocular în sus sau
în jos. Această mişcare se face cu ajutorul a două şuruburi numite vize: viza
macrometrică pentru deplasări grosiere şi rapide şi viza micrometrică pentru
deplasări reduse şi lente, folosită pentru punerea la punct a imaginii.

Partea optică este formată din sistemul ocular şi sistemul obiectiv.


Sistemul ocular este constituit din două lentile montate într-un tub
metalic scurt care se introduce la extremitatea superioară a tubului
microscopului. Microscopul ML4 este prevăzut cu oculare care măresc de
5X., 7X., 10X., şi 15X.
Sistemul obiectiv este alcătuit dintr-o asociaţie de lentile montate într-o
anumită ordine într-un tub metalic care se înşurubează pe capul revolver.
Lentila inferioară, plan convexă, numită lentila frontală, orientată cu faţa
plană spre preparat, este cea mai importantă. Microscopul ML4 este dotat cu
obiective uscate cu puterea de mărire de 6X., 10X., 20X., 40X., şi cu
imersie (ulei de cedru) care are o putere de mărire de 90X (fig.14).

32
Fig. 12. Microscopul fotonic obişnuit:
1 - talpa microscopului; 2 - coloana; 3 - platina; 4 - dispozitivul
de mişcare a platinei; 5 - idem; 6 - sursa de lumină;
7 - condensatorul; 8 – macro- şi microviza; 9 - tubul microscopului;
10 - revolverul; 11 - obiective; 12 - ocularul

Sursa de fotoni şi dispozitivul de transmisie cuprinde:


Sursa de lumină este inclusă în talpa microscopului şi este reprezentată
de un bec de 6V alimentat de un transformator.
Dispozitivul de transmisie este reprezentat de o oglindă plană montată în
talpa microscopului şi are rolul de a orienta razele luminoase în axul optic al
microscopului cu ajutorul a două vize. Între sursa de lumină şi oglindă se
găseşte un diafragm iris.
Condensatorul de lumină este un sistem de lentile montate într-un
dispozitiv mobil aflat sub platină şi are rolul de a focaliza lumina pe
preparatul microscopic. Pentru o iluminare eficientă a preparatului este
necesară corectarea aperturii numerice a condensatorului cu cea a

33
obiectivului şi se realizează cu ajutorul unui diafragm iris manipulat cu o
pârghie.

Fig. 13. Microscop fotonic binocular de laborator:


A - Tubul microscopului cu oculare; B - revolver cu obiective;
C - obiectiv; D - platina sau măsuţa microscopului; E - dispozitiv
de mişcare a platinei; F - condensatorul; G - macroviza;
H - microviza; I - sursa de lumină; K - buton de închis/deschis;
L - intensitate lumină; N - talpa microscopului

Tehnica de lucru
- se stabileşte legătura între becul microscopului şi transformator care se
conectează apoi la reţeaua de 220V;
- prin rotirea revolverului se aduce în axul optic al microscopului obiectivul
de 10.X;
- privind prin oculare, se coboară condensatorul până când se obţine o
lumină uniformă şi de intensitate mare;
- se aşează lama portobiect cu lamela în sus pe faţa superioară a platinei,
fixând-o cu ajutorul valeţilor;

34
- privind lateral, cu ajutorul vizei macrometrice se coboară tubul până la o
distanţă mai mică decât distanţa focală a obiectivului (pentru obiectivul
10.X distanţa focală este de 16mm);
- se fixează distanţa interpupilară a examinatorului prin apropierea sau
îndepărtarea laterală a celor două tuburi oculare;
- privind prin ocular, se ridică încet tubul cu ajutorul vizei macrometrice
până când apare o imagine în câmpul microscopului; dacă nu apare nici o
imagine înseamnă că: obiectivul nu se află în axul optic, preparatul nu se
află în câmpul microscopului sau am ridicat prea repede sistemul optic. Prin
mişcarea vizei micrometrice în ambele sensuri se obţine o imagine clară şi
luminoasă a preparatului.

Fig. 14. Sursa de lumină, partea optică şi formarea imaginii la


microscopul fotonic

ATENŢIE - imaginea nu se va căuta prin coborârea tubului deoarece


există riscul de a deteriora lentila frontală a obiectivului şi lama portobiect;
în timpul examinării se recomandă să se ţină în permanenţă mâna pe viza
micrometrică în vederea menţinerii unei imagini clare în timpul deplasării

35
câmpului deoarece preparatul nu are o grosime uniformă; cu ajutorul celor
două vize montate pe partea laterală a platinei se va mişca lama cu
preparatul în vederea examinării lui în totalitate; se roteşte revolverul
aducând pe rând în axul optic al microscopului obiectivele 20X, 40X şi
imersie, ridicând condensorul pentru a obţine o iluminare puternică.

ATENŢIE - în cazul folosirii obiectivelor mari, pentru punerea la punct a


imaginii se utilizează numai viza micrometrică. Utilizarea obiectivului cu
imersie necesită ridicarea la maximum a condensatorului iar diafragmul iris
deschis complet; pe preparatul fixat pe lamă (frotiu de sânge colorat) se
pune o picătură de ulei de cedru. Cu tubul ridicat se roteşte capul revolver şi
se aduce în axul optic obiectivul de imersie; privind lateral, se coboară tubul
cu ajutorul vizei macrometrice până când lentila frontală a obiectivului a
făcut contact cu picătura de ulei de cedru şi se află în imediata vecinătate a
lamei portobiect (aproximativ 2 mm). Privind prin ocular, se prinde
imaginea coborând sau ridicând încet tubul microscopului cu ajutorul vizei
macrometrice, iar punerea la punct a imaginii se obţine cu viza
micrometrică; după examinare, se ridică tubul microscopului cu 1-2 cm., se
dă jos lama portobiect de pe platină şi se îndepărtează uleiul de cedru de pe
lentila frontală a obiectivului prin ştergere cu vată înmuiată în xilol sau
benzen; după folosire, microscopul se deconectează de la reţea şi se pune la
adăpost de praf (sub husă).

2.1.2. Microscopia prin fluorescenţă

Microscopia prin fluorescenţă pune în evidenţă fenomene luminoase


care iau naştere în structuri biologice primare (naturale) sau a celor
secundare provocate cu ajutorul substanţelor numite fluorocromi.
Metoda se bazează pe proprietatea unor substanţe care, iradiate cu un
fascicul de lumină cu o lungime de undă mică şi cu o frecvenţă înaltă emit
radiaţii cu o lungime de undă mare şi o frecvenţă mai joasă deci, de culoare
diferită. Aceste substanţe se numesc fluorescente. Fluorescenţa este
condiţionată (Mayer) de prezenţa unor grupări fluorofore cum ar fi: azin,
oxazin, etc.
În practica curentă, prin fluorescenţă se înţelege emiterea de radiaţii
luminoase de către o substanţă supusă acţiunii razelor ultraviolete (300 - 400
milimicroni). Se formează o imagine vizibilă, colorată, care poate fi
observată cu ochiul protejat de un filtru pentru radiaţiile ultraviolete sau care
impresionează placa fotografică (fig. 15).
Emisia spectrului de fluorescenţă se prezintă sub formă de benzi
(linii Stokes) şi nu este un spectru continuu, fiind în funcţie de mărimea
36
moleculei. Fenomenul poate fi observat în orice stare de agregare a
substanţei, fiind mai intens la lichide şi solide.

Fig. 15. Reprezentarea schematică a microscopului prin fluorescenţă

Fluorescenţa unui preparat microscopic poate fi clasificată în două


categorii:

37
1. Fluorescenţă primară, naturală sau autofluorescenţă produsă de
substanţe care se găsesc în mod natural în celule sau ţesuturi (lipofuscina,
cromolipidele, fenilalanina, tirozina, adrenalina, noradrenalina, etc.);
2. Fluorescenţă secundară sau provocată indusă prin tratarea secţiunilor de
ţesut cu fluorocromi (ex: acridin – orange); prin această metodă se pot
detecta acizii nucleici, fibre de colagen, reticulină şi elastice, mucinele, etc.
Microscopia în lumina fluorescentă foloseşte un microscop obişnuit
cu următoarele particularităţi:
• sursa de lumină este o lampă cu vapori de mercur (H.B.O. – 200W,
3,3 – 3,9 A) care emite radiaţii UV;
• filtre de lumină care opresc radiaţiile vizibile şi calorice; se folosesc
două tipuri de filtre:
- filtre de excitaţie care au rolul de a opri toate radiaţiile în
afara celor UV; se montează în talpa microscopului, între
oglindă şi condensor;
- filtre de protecţie care protejează retina şi se montează între
obiectiv şi ocular.
• condensatorii utilizaţi în microscopia de fluorescenţă sunt de trei
feluri: condensator UV cu apertură numerică 1.20, pentru câmp
întunecat şi cu oglindă, care se montează în locul condensatorului
obişnuit.

Tehnica de lucru
- după montarea dispozitivelor menţionate, se porneşte lampa H.B.O. şi se
aşează pe platina microscopului preparatul de examinat aplicat pe o lamă
portobiect nefluorescentă;
- pentru găsirea câmpului şi punerea la punct a imaginii se procedează la fel
ca în capitolul 2.1.1.;
- după examinare se întrerupe alimentarea de la reţea a lămpii H.B.O.

ATENŢIE - este interzis a se privi radiaţiile produse de lampa H.B.O. fără


ochelari de protecţie UV; este interzisă manipularea carcasei în timpul
funcţionării lămpii sau imediat după stingerea ei înainte de răcire întrucât
există pericol de implozie.

Aplicaţii practice
Microscopia în lumina fluorescentă reprezintă o metodă cu o largă
aplicabilitate în biologia celulară.
Cu ajutorul fluorescenţei primare pot fi identificaţi:

38
• pigmenţii: portfirinele (fluorescenţa roşie), lipocromii sau pigmenţii
carotenoizi (fluorescenţa verde), cromolipidele (fluorescenţa galben
- verde), lipofuscina (fluorescenţa roşu - brun);
• acizii aminaţi: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescenţa
albastră);
• unele virusuri şi bacilul Koch emit o fluorescenţă verde strălucitor;
• dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se
deosebeşte de cel artificial;
• aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescenţă
verde).
Cu ajutorul fluorocromării cu acridin orange se pot identifica:
• acizii nucleici ARN-ul - fluorescenţa roşie, ADN-ul - fluorescenţă
verde - galben;
• fibrele de colagen, elastice şi de reticulină - fluorescenţa verde;
• nucleii leucocitelor au o fluorescenţă verde iar citoplasma lor şi
eritrocitele rămân opace;
• muricinele - fluorescenţa verde.
Frecvent, coloraţia cu acridin orange se mai utilizează în
citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul acizilor nucleici în condiţiile
unui proces tumoral).
Cea mai importantă aplicaţie este imunofluorescenţa care se bazează
pe cuplarea unui acid cu un fluorocrom; prin fluorescenţa indusă poate fi
identificată localizarea antigenelor în celule.
Microscopia prin fluorescenţă se deosebeşte de microscopia cu raze
ultraviolete al cărui principiu de funcţionare se bazează pe absorbţia luminii
ultraviolete de moleculele preparatului.
Microscopia în ultraviolet este asemănătoare spectrofotometriei, dar
rezultatele sunt înregistrate fotografic. Razele ultraviolete trec prin lentile
speciale şi prin secţiunea preparatului de examinat dând, datorită unui fond
diferit de absorbţie, o imagine invizibilă pentru ochi dar care este
înregistrată pe placa fotografică. Metoda este utilizată pentru detectarea
acizilor nucleici, a bazelor purinice şi pirimidice ale nucleotidelor ca şi la
detectarea proteinelor ce conţin anumiţi aminoacizi.
Grupările -CH, -OCH3, -CH3, -CN, măresc intensitatea fluorescenţei,
altele ca -CO, -COO, -NO2 o slăbesc, ceea ce reduce gama preparatelor care
pot fi vizualizate printr-o astfel de tehnică. Prin metodele de preparare a
secţiunilor se pot elimina astfel de inconveniente, lărgind astfel posibilitatea
de utilizare a microscopiei prin fluorescenţă.

39
2.1.3. Microscopia în contrast de fază

Microscopia în contrast de fază utilizează un tip special de


microscop fotonic ce realizează contrastul unor obiecte de examinat,
permiţând astfel studiul celulelor în stare vie, nefixate şi necolorate (fig. 16).
Aparatul pentru contrast de fază este un microscop obişnuit, cu
următoarele particularităţi:
- condensatorul are un diafragm inelar (un inel transparent într-un disc
opac);
- în obiectiv se găseşte o placă sau un inel de fază care are rolul de a
modifica transmisia unei părţi din razele luminoase care formează imaginea
câmpului microscopic (este un proces de defazare între razele luminoase
care sunt transmise direct şi cele care sunt difractate de preparat). Aceste
două particularităţi permit modificarea sistemului optic, adică transformă
diferenţele de fază invizibile pentru ochi în diferenţe de amplitudine care
măresc contrastul elementelor preparatului.

Tehnica de lucru
- se montează condensatorul de contrast de fază în locul
condensatorului obişnuit;
- în locul obiectivelor microscopului propriu-zis, se înşurubează
obiectivele de contrast de fază;
- într-unul din tuburile oculare se introduce microscopul ocular;
- se aduce în axa optică a microscopului obiectivul 10x sau de puterea
de mărire cu care dorim să examinăm; prin rotirea inelului condensorului
facem să coincidă cifra de pe aceasta, care corespunde aperturii lui, cu
apertura obiectivului folosit;
- privind prin pupila de ieşire a ocularului, se reglează microscopul
ocular (apropierea sau îndepărtarea lentilelor care compun ocularul) până în
momentul când în câmpul vizual apar clar conturate două inele (a
diafragmei condensatorului şi a inelului de fază);
- cu ajutorul a două cheiţe se acţionează asupra şuruburilor de reglare
ale condensatorului până în momentul suprapunerii inelului din diafragma
condensorului peste inelul din obiectiv – reglajul se face pentru fiecare
obiectiv în parte;
- se înlocuieşte microscopul ocular cu ocularul propriu-zis;
- se recoltează fragmente din ficat de şobolan care se pun pe o placă
de sticlă; cu o lamă portobiect se fac amprente prin apăsarea ei pe
fragmentele de ficat peste care se pun 2-3 picături dintr-un mediu de cultură;
se acoperă cu o lamelă după care se aşează preparatul pe platina
microscopului;
40
- se pune la punct imaginea după tehnica descrisă la 2.1.1. şi se
examinează preparatul.

Fig. 16. Schema de principiu a microscopului cu contrast de fază

Aplicaţii practice
Microscopia în contrast de fază permite:
• studiul celulelor în stare vie (celulele nefixate şi necolorate);

41
• scoate în evidenţă unele detalii de structură care nu se pot observa la
microscopul fotonic obişnuit ca endocitoza, mişcarea cililor şi
flagelilor, diviziunea celulară, etc.;
• studiază reacţiile celulare la diferiţi agenţi fizici sau chimici;
• studiază benzile cromozomilor.
Din microscopia cu contrast de fază au derivat:
- microscopia cu interferenţă care permite aprecierea cantitativă a
masei unor componente tisulare;
- microscopia cu interferenţă diferenţială utilă pentru a evalua
proprietăţile suprafeţei celulare şi a altor structuri biologice.
Principiul unui microscop cu interferenţă este următorul: fasciculul
de lumină incident este divizat în două fascicule de o oglindă
semireflectorizantă; fascicul care traversează oglinda pătrunde într-un
microscop care poartă preparatul; razele de lumină reflectate pătrund în alt
microscop şi iluminează un preparat “martor”; la ieşirea din cele două
microscoape, cele două fascicule se recompun într-un fascicul unic, graţie
unei alte oglinzi semireflectorizante, deasupra căreia se află ocularul; cu
ajutorul unor filtre se poate varia faza şi amplitudinea unei radiaţii şi
provoca interferenţa cu o altă radiaţie.
Metoda interferometrică a dat rezultate interesante asupra
evoluţiei aparatului mitotic (RUSTAD, 1959), a concentraţiei substanţelor
solide în nucleol, nucleu şi citoplasma celulelor nervoase (MERRIAM şi
KOCH, 1960), etc.

2.1.4. Microscopia în lumina polarizată

Prin această tehnică se obţin imagini ale unor constituenţi în care


structurile examinate sunt anizotrope, acestea făcând ca viteza de propagare
a luminii polarizate să varieze cu direcţia de propagare; mediile respective
se numesc birefringente.
Birefringenţa se poate clasifica:
- în structurile fibrilare (colagen, mielina, fibrele musculare striate, etc.)
poate exista o birefringentă pozitivă - când indicele de refracţie este mai
ridicat în lungime decât în plan perpendicular şi birefringentă negativă,
în caz contrar (fibrele nucleoproteice).
- birefringenţa cristalină sau intrinsecă observată în sistemele sau
moleculele în care ionii prezintă un aranjament asimetric regulat şi este
independentă de indicele de refracţie a mediului de montare; se observă
în structuri constituite din proteine sau lipide;

42
- birefringenţa de formă sau structură apare atunci când particulele
submicroscopice sunt orientate regulat într-un mediu cu indice de
refracţie diferit;
- birefringenţa de tensiune se observă la structurile izotrope care sunt
supuse unei constrângeri mecanice şi se întâlneşte la nivelul muşchilor şi
în ţesuturile embrionare;
- dicroismul apare în momentul în care absorbţia unei lungimi de undă
dată de lumina polarizată variază în funcţie de orientarea obiectului
examinat. Aceste variaţii apar datorită diferenţelor de intensitate
(amplitudinea luminii transmise de obiect). Unii coloranţi organici ca
roşul de Congo sau thionină, pot induce dicroismul în unele structuri
biologice datorită unei orientări preferenţiale a moleculelor.
Microscopul cu lumina polarizată are două dispozitive speciale
numite: polarizor şi analizor (fig.17); ele sunt constituite dintr-o peliculă
de film polaroid sau dintr-o prismă Nicol în calcită. Polarizorul se găseşte
sub condensator, iar analizatorul se află deasupra obiectivului. Dacă planul
de polarizare al analizatorului este perpendicular pe cel al polarizorului,
lumina nu va fi transmisă. Punând pe platina microscopului un preparat
birefrigent, planul de polarizare va devia datorită întârzierii provocate de
întreruperea probei de examinat. Învârtim preparatul până când în câmpul
microscopului apar puncte cu luminozitate maximă şi minimă.

Tehnica de lucru
- se coboară tubul microscopului apropiind obiectivul de condensor
până la obţinerea unei iluminări maxime şi uniforme a câmpului
microscopic;
- se rotesc cei doi nicoli – analizorul şi polarizorul – până când se
obţine întunecarea maximă în câmpul ocularului;
- pe platina microscopului se aşează o lamă port obiect pe care sunt
lipite secţiuni din rinichi, intestin sau ficat, colorate după metoda topo-
optică Romanyi şi col. 1978 (materialul se fixează în formol, se secţionează
la microtomul de congelare, iar secţiunile se colorează cu o soluţie de
albastru de toluidina la pH. 4,5 urmând o postfixare cu fericianid de potasiu
care are capacitatea de a se lega de lipidele şi glicoproteinele din structura
biomembranelor);
- imaginea se face clară prin tehnica descrisă la 2.1.1.

43
Fig. 17. Schema optică a variaţiilor luminoase de maxim şi
minim ale unui obiect anizotropic când este plasat între
analizor şi polarizor şi rotit cu un unghi de ± 450

Aplicaţii practice
• se pot studia structurile a căror compoziţie chimică macromoleculară
au un aspect liniar ca de exemplu fibrele de colagen, mielina, fibrele
musculare striate etc.;
• se utilizează pentru studiul structurilor: membrane biologice, etc.;
• se evidenţiază structurile cu simetrie radială – granule proteice,
lipide, colesterol.

44
2.2. Microscopia electronică

Metoda difracţiei cu raze X furnizează informaţii de mare valoare


ştiinţifică pentru biologie, dar este o metodă extrem de laborioasă,
interpretarea datelor fiind uşurată astăzi de utilizarea computerului. Forţarea
barierelor invizibilului cu consecinţe aproape de nebănuit pentru ştiinţele
biologice, s-a făcut după 1933, odată cu apariţia microscoapelor electronice.
Microscopul electronic constituie un exemplu de felul cum au fost aplicate
în practică unele din marile descoperiri făcute în fizică la sfârşitul secolului
trecut. Aceste descoperiri au fost rodul a numeroase cercetări începute încă
din 1750 iar printre ele, de o deosebită importanţă pentru construirea
diferitelor tipuri actuale de microscoape electronice, se consideră
următoarele: descoperirea razelor X în 1895 de către W.C. Rontgen,
demonstrarea existenţei electronului în 1897 de către K.F. Braun, stabilirea
caracterului ondulator al electronilor şi asemănarea acestora cu fotonii în
1924 de către Louis de Broglie, stabilirea rolului de funcţionare ca lentilă a
câmpurilor electromagnetice cu simetrie axială asupra electronilor în 1926
de către Brusch, după ideea originală a lui Gabor. Toate aceste descoperiri
au dus la fundamentarea opticii electronice ce stă la baza construirii
microscoapelor electronice a acceleratoarelor de particule, a tuburilor
cinescopice. Fizicianul francez Louis de Broglie a emis în 1924 ipoteza că
electronii au proprietăţi ondulatorii, adică le este asociată o undă, din acest
punct de vedere asemănându-se cu fotonii. Această lungime de undă a
electronului se numeşte “lungime de undă Bronglie” şi este dată de formulă:

h
λ=
m⋅v

λ = lungimea de undă a electronilor;


h = constanta lui Planck;
v = viteza electronului;
m = masa electronului.

Prin aceasta de Broglie a demonstrat asemănarea dintre radiaţiile


electronice şi cele luminoase. În toate tipurile de microscoape electronice,
electronii generaţi de un tun electronic şi supuşi unor tensiuni de accelerare
la alegere, sunt focalizaţi şi dispersaţi pentru a forma o imagine prin trecerea
lor prin câmpuri electrostatice sau electromagnetice în funcţie de tipul
constructiv de microscop.

45
Lungimea de undă a fasciculului de electroni este aleasă în funcţie
de tensiunea de accelerare, de la 0,0859 A la 20 kV, la 0,0028 A la 400kV,
permiţând explorări în microcosmosul celular până la nivel molecular. Cele
mai perfecţionate microscoape electronice aflate în exploatare în diferite
laboratoare au rezoluţii garantate de 2-3 A (în condiţii speciale 1,2 A şi
putere maximă de mărire pe placa fotografică de 800.000x).
Microscoapele electronice existente se împart după tipul de
construcţie şi destinaţia lor în câteva grupe:
1. Microscoape electronice de transmisie, sau prescurtat TEM
(Transmission Electron Microscope), utilizate pentru cercetări
ultrastructurale.
2. Microscoape electronice de baleiaj, sau de tip SEM (Scanning
Electron Microscope), folosite la studiul ultramorfologiei suprafeţelor cu
ajutorul electronilor secundari sau reflectaţi.

Tipul de imagine

relief geometric sau topografic


- cu electroni secundari potenţial de distribuţie
rata de emisie electronică
relief geometric
- cu electroni reflectaţi compoziţie (numărul atomic mediu)
- cu electroni absorbiţi compoziţie (numărul atomic mediu)
- cu forţe electromotrice caracteristici fizice şi electrice ale
semiconductorilor
- cu electroni transmişi structura internă
- cu catodoluminiscenţă distribuţia şi concentraţia materialelor
fluorescente

3. Microscoape electronice de transmisie şi baleiaj, STEM (Scanning


Transmission Electron Microscope), ce permit studiul ultrastructural prin
transmisie de electroni şi al suprafeţelor prin electroni secundari sau
reflectaţi pe principiul SEM.
4. Microscoape electronice analitice de transmisie, TEAM – folosite
pentru cercetări simultane ultrastructurale şi analitice.
5. Microscoape electronice sistemice – aparate cu funcţionalitate de
sistem ce permit cercetări multiple simultan pe acelaşi preparat.
6. Microscoape electronice cu fotoemisie, PEM (Photoelectron
Emission Microscope) cu aceleaşi aplicaţii ca şi cele de tip SEM.

46
7. Microscoape electronice – EPI (Electron Probe Instrument) –
utilizate în analize elementare şi în studiul suprafeţelor.
8. Microscoape ionice cu emisie de câmp, FIM (Field Ion
Microscope) – cu ajutorul cărora se poate vizualiza direct orientarea
atomilor într-un material.

2.3. Metode pentru examenul citologic în microscopia fotonică

Studiul structurii celulelor eucariote, de o deosebită complexitate


morfo-funcţională, este posibil de realizat doar într-o mică măsură cu
microscopul fotonic deoarece are o putere de rezoluţie redusă. Acest studiu
necesită utilizarea unor tehnici speciale de citomorfologie, citochimice,
citoenzimologie, etc., a căror atribut este conservarea integrităţii structurale
în condiţii cât mai apropiate de cele existente în organismul viu.
Examinarea morfo–funcţională a celulelor se face pe preparate
microscopice. Un preparat microscopic este format din: secţiuni subţiri,
plane şi transparente, de organe sau ţesuturi, frotiuri sau amprente de
organe, aşezate pe o lamă de sticlă sau portobiect cu laturi paralele şi
dimensiunile 76/26 mm şi 1,5 – 2 mm grosime, protejate cu o lamelă de
sticlă de formă pătrată sau dreptunghiulară, cu dimensiuni variabile de
18/18, 22/22, 22/32 mm şi o grosime de 0,16 – 0,18 mm. Înainte de a fi
folosite, atât lamele cât şi lamelele vor fi bine curăţate şi degresate
(detergenţi, alcool etilic) (fig. 18).

Fig. 18. Lamela şi lama portobiect (schemă).

Preparatele microscopice se clasifică în: preparate permanente sau


durabile şi preparate extemporanee, proaspete sau temporale.
a. Preparate permanente sau durabile care permit un studiu
amănunţit al celulelor pe secţiuni fixate şi colorate; ele rezistă în timp şi se
pot realiza prin:
a. metoda efectuării secţiunilor fine;
b. metoda etalării materialului biologic în monostrat (frotiu,
amprente de organe).

47
Obţinerea unor preparate microscopice permanente necesită
efectuarea unor timpi operatori succesivi, fiecare din ei având o influenţă
hotărâtoare asupra reuşitei finale. În ordinea executării lor, aceştia sunt:
recoltarea, fixarea, spălarea, includerea, secţionarea, aplicarea secţiunilor pe
portobiect, colorarea, montarea şi etichetarea. În funcţie de tehnica aleasă,
succesiunea acestor timpi poate fi modificată, unii dintre ei putând fi omişi
(fig. 19).

Fig. 19. Elementele unui preparat microscopic permanent


1- lamă; 2 - lamelă; 3 - obiect de examinat; 4 - mediu de
montare

Dacă unele greşeli în efectuarea secţionării, colorării sau montării


mai pot fi ulterior corectate parţial, recoltarea, fixarea şi includerea incorect
făcute, compromit definitiv calitatea preparatelor microscopice.

b. Preparate extemporanee, proaspete sau temporale.

2.3.1 Metoda efectuării secţiunilor fine

Realizarea unui preparat microscopic permanent prin metoda


efectuării secţiunilor fine necesită o anumită tehnică care se desfăşoară în
următoarele etape: recoltare, fixare, spălare, includerea, secţionarea, etalarea
materialului biologic pe lamă, colorarea, montarea şi etichetarea.

2.3.1.1. Recoltarea

Recoltarea reprezintă unul din timpii cei mai dificili din tehnica de
biopsie celulară deoarece după sacrificarea animalului de experienţă sau
obţinerea unui fragment de ţesut sau organ prin biopsie sau alt operator, cu
maximum de operativitate trebuie să confecţionăm o piesă de material
biologic care să conţină populaţia de celule necesară studiului propus.

48
Recoltarea materialului biologic din organismele vii se poate efectua
prin:
a. Biopsie – se prelevă prin secţionare un fragment mic de ţesut (ex.
biopsie ganglionară, cutanată, musculară).
b. Puncţie biopsică – se obţin fragmente dintr-un ţesut cu ajutorul unui
tub ascuţit – trocar – ex. puncţie sternală pentru obţinerea unor fragmente
din măduva hematopoietică, puncţie hepatică, renală, ganglionară.
c. Aspiraţie endoscopică – pentru recoltarea cu ajutorul unui endoscop a
produselor biologice existente în cavităţile naturale (ex. endoscopie
gastrică).
d. Puncţia cavităţilor – pentru obţinere secreţilor normale sau patologice
ca: lichide pleurale, peritoneale, otice, lichid cefalorahidian.
e. Raclarea mucoaselor – (superficială sau profundă) pentru recoltarea
materialului din cavitatea uterină, vaginală, faringe, cavitatea bucală, etc.
f. Prelevarea intraoperatorie – se efectuează în timpul unei intervenţii
chirurgicale pentru stabilirea unui diagnostic imediat.
g. Recoltarea de material biologic de la cadavrele umane – secţionarea
unor fragmente de organ pentru examinarea lor.
h. Recoltarea de la animalele de experienţă sacrificate în acest scop.

De asemenea pentru studiul unor aspecte ale activităţii celulare


(mişcarea, fagocitoză, diviziune celulară, etc.) se realizează şi preparate din
culturi celulare.
Recoltarea se face pe o placă de plută sau de P.V.C. foarte curată; se
folosesc pense fine, fără dinţi, care se manipulează cu delicateţe pentru a nu
strivi preparatul; în acelaşi scop, la fasonarea pieselor se folosesc lame de
ras noi, degresate.
În cazul în care ţesutul are o consistenţă moale (sistem nervos
central, testicul) şi fasonarea pieselor nu se poate face fără riscul strivirii lor,
se preferă fixarea unor fragmente mai mari timp de 1-2 ore, perioadă în care
structurile superficiale se întăresc şi permit obţinerea lor.
Piesele astfel recoltate trebuie să aibă feţele plane şi paralele iar
grosimea lor nu trebuie să depăşească 1-4 mm, aceasta facilitând
pătrunderea mai rapidă a fixatorului şi evită apariţia alterărilor post-mortem.

2.3.1.2. Fixarea

Fixarea, timp obligatoriu în realizarea preparatelor permanente, are


drept scop esenţial conservarea, (imobilizarea) constituenţilor celulari într-o
stare cât mai apropiată de starea vie şi de pregătirea lor în vederea
manevrelor ulterioare (includere, colorare). Aceasta depinde în primul rând
49
de proteine, principalii constituenţi ai materiei vii ceea ce însemnă că un bun
fixator histologic trebuie să fie în primul rând un fixator al proteinelor.
Mecanismul intim al fixării proteinelor nu este încă perfect cunoscut.
Se cunoaşte însă faptul că, fixatorii histologici determină o coagulare sau o
insolubilitate a proteinelor şi în majoritatea cazurilor, un anumit grad de
polimerizare a acestor elemente organice. De exemplu, formaldehida,
element principal al fixatorilor uzuali se combină cu numeroase grupări
funcţionale a moleculelor proteice, formează legături între moleculele
învecinate şi constituie astfel edificii macromoleculare insolubile.
O altă consecinţă importantă a acestei coagulări a proteinelor este
blocajul reacţiilor enzimatice pe care le antrenează, împiedicând astfel
distrugerea autolitică a ţesuturilor.
Fixarea trebuie privită diferit în funcţie de:
- gradul conservării morfologice pe care dorim să-l obţinem -
fixarea se realizează în mod diferit pentru microscopia
electronică faţă de cea fotonică; în primul caz trebuie păstrate
relaţiile între constituenţii chimici ai celulei la scară moleculară
ceea ce nu este indispensabil în acelaşi grad pentru microscopia
fotonică;
- de natura constituenţilor chimici ce trebuie conservaţi - anumite
edificii macromoleculare sunt uşor de conservat (este cazul
constituenţilor celulari fundamentali cum sunt proteinele) în timp
ce alţii, foarte labili, sunt extrem de dificili de fixat (de ex. ozele
sau oligozaharidele);
- de volumul fragmentelor tisulare ce trebuie conservate -
problema fixării unui frotiu celular este diferită de cea a fixării
unui organ de şoarece sau a unui encefal uman; viteza de
pătrundere a fixatorului devenind în acest caz elementul esenţial
al fixării;
- de tipul reacţiilor de culoare sau histochimice pe care dorim să le
efectuăm - nu vom fixa în acelaşi fel când vom folosi o coloraţie
simplă “topografică” sau vom încerca decelarea lipidelor sau
enzimelor.
Un bun fixator citologic trebuie să întrunească următoarele calităţi:
ƒ să pătrundă rapid în ţesut;
ƒ să producă o retracţie cât mai mică a pieselor evitând modificarea
taliei, formei şi raporturilor dintre celule;
ƒ să permită o bună includere;
ƒ să permită o bună colorare a structurilor a căror evidenţiere se
doreşte;

50
Fixarea se realizează prin:
1) agenţi fizici
2) agenţi chimici

Fixarea prin agenţi fizici


În acest capitol se încadrează metodele ce folosesc căldura, desicarea
la temperaturi scăzute (congelare - desicare sau criodesicare), desicarea la
temperatura laboratorului, metodele ce presupun răcirea preparatului
biologic urmată de acţiunea unui fixator lichid (congelare - substituţie),
răcirea nereprezentând un procedeu de fixare, ea având ca efect oprirea
proceselor de autoliză; această oprire a modificărilor postmortem încetează
însă odată cu revenirea la temperatura laboratorului, ceea ce face imperios
necesară completarea cu o fixare în adevăratul sens al cuvântului.

Fixarea prin căldură


Acest tip de fixare mult depăşit în prezent de alte metode, îl cităm
doar pentru importanţa sa istorică. Este una din cele mai vechi metode de
fixare; principiul ei este coagularea proteinelor sub efectul căldurii. Însă,
chiar autorii clasici au observat inconvenientele majore pe care le prezintă
din punct de vedere morfologic acest tip de denaturare a compuşilor
protidici. Una din principalele aplicaţii ale fixării prin căldură, a fost
introdusă de Erlich în 1877, şi se referă la pregătirea frotiului de sânge
pentru colorarea cu amestecul triacid cunoscut.

Fixarea prin desicare la temperatura laboratorului


Desicarea rapidă la temperatura laboratorului este folosită pentru
pregătirea frotiului de sânge destinat colorării cu metodele hematologiei
morfologice. Ea poate fi aplicată şi pentru frotiul de măduvă osoasă şi
amprentele de organe. În afara acestor situaţii particulare, indicaţiile sale
sunt destul de limitate, nefiind vorba de o veritabilă fixare. Denaturarea
proteinelor obţinută astfel nu merge până la pierderea solubilităţii lor în apă,
astfel că desicarea trebuie totdeauna completată în momentul colorării
frotiurilor prin acţiunea unui alt fixator (ex. alcool metilic ce se foloseşte ca
solvent pentru eozinatul de albastru de metilen din compoziţia colorantului
May-Grümwald).

Fixarea prin desicare la temperatură scăzută


A fost introdusă în 1890 de Altman, iar perfecţionările acestei
metode de fixare făcută de Gresh (1932) au dus la rezultate citologice
spectaculare (Bensley şi Gersh – 1933).

51
Congelarea – desicarea sau criodesicarea nu este o fixare în sensul
propriu al termenului pentru că ea nu determină denaturarea proteinelor
tisulare. Principiul ei este foarte simplu, bazându-se pe eliminarea prin
sublimare a apei conţinute în piese, răcire la o temperatură inferioară de 0°
şi plasarea într-o incintă unde presiunea este inferioară valorii de 4,6 mm Hg
(coloană de mercur). Numeroasele aplicaţii industriale ale metodei justifică
numărul mare de lucrări consacrate principiilor fizice şi realizării tehnice a
acestei metode. Metoda a fost pusă la punct în 1958 de către Neumann iar
lucrările lui Lison şi Pearse (1960) trec în revistă datele esenţiale în ceea ce
priveşte locul criodesicării în tehnica citologică.
Din punct de vedere tehnic metoda fixării prin criodesicare are trei
etape:
1. congelarea piesei care are drept scop principal oprirea rapidă a
tuturor reacţiilor vitale, ceea ce se poate obţine prin folosirea unei
temperaturi de -50° - -70°; la această temperatură se obţine oprirea reală a
tuturor reacţiilor enzimatice ce s-ar putea derula în interiorul ţesuturilor.
Congelarea reprezintă etapa crucială a acestei metode - defecţiunile acestei
etape pot duce la artefacte grosiere reticularea ţesuturilor ce ar face piesa
recoltată inutilizabilă;
2. desicarea sub zid – sublimarea apei ce are drept scop eliminarea
apei, prezentă în mare parte sub formă de cristale de gheaţă conţinute în
interstiţiile ţesutului.
3. tratamentul ulterior al piesei – piesa odată deshidratată nu
prezintă la examenul microscopic nici o retracţie comparativ cu starea
proaspătă, proteinele tisulare sunt seci, dar nu denaturate. Urmează apoi
impregnarea şi includerea în parafină.

Avantaje şi inconveniente. Indicaţii şi contraindicaţii.


Avantajele teoretice ale criodesicării sunt evidente existând însă
unele limite ale acestei metode şi contraindicaţii. Este vorba înainte de toate
de necesitatea folosirii unor piese foarte mici. Apoi, există riscul
compromiterii structurilor datorită formării, în momentul congelării
ţesuturilor, a unor cristale de gheaţă de talie superioară limitei puterii de
separare a microscopului fotonic. O “reticulare” a ţesuturilor face piesa
aproape inutilizabilă şi este imposibil de evitat dacă dimensiunile
preparatului depăşesc 2 mm şi chiar în cazul în care dimensiunile corespund
tuturor exigenţelor, această reticulare este foarte dificil de evitat în multe
cazuri.
Lison, în 1960, arată că anumite ţesuturi (ficat, pancreas, tegument)
sunt bine conservate prin această metodă, în timp ce altele (rinichi, intestin)

52
se conservă satisfăcător; conservarea devine necorespunzătoare în cazul
testiculului, ţesutului nervos, măduvei spinării, osoase şi ganglionilor
limfatici.
Deşi din punct de vedere morfologic rezultatele criodesicării pot
rivaliza uneori cu cele obţinute folosind fixarea prin agenţi chimici,
exigenţele sale materiale sunt mult prea mari, preţul său de cost mult mai
ridicat decât cel al fixării pe cale chimică.
Fără a-i contesta avantajele, în prezent se consideră că această
metodă de fixare trebuie rezervată numai unor cazuri bine definite, în afara
cărora ea nu prezintă nici o superioritate raportată la alte procedee mult mai
rapide, mai puţin minuţioase şi mai ieftine.

Fixarea prin congelare – substituţie


Imaginată de Simpson (1941) şi utilizată de un mare număr de
cercetători, acestui procedeu i s-a acordat o importanţă mult mai mică decât
criodesicării. Principiul său este apropiat de cel al criodesicării şi avantajele
sunt asemănătoare. Primul timp al acestei metode este asemănător cu cel al
criodesicării: piesele foarte mici sunt congelate cu aceleaşi precauţii dar
deshidratarea se bazează pe cu totul alt principiu. Ţesuturile congelate sunt
transferate în etanol, eter sau glicol răcit la o temperatură cuprinsă între -20°
şi -50°. În aceste condiţii se stabileşte un echilibru între faza solidă
reprezentată de gheaţă şi o fază lichidă conţinând apă şi solvent organic în
proporţii variabile în funcţie de temperatură. De exemplu, la -20° echilibrul
se realizează pentru amestecuri apă-etanol conţinând în jur de 30% apă.
Când excesul de solvent este mare, toată apa poate fi astfel extrasă din piesă,
difuzia moleculelor de apă în excesul de solvent asigurând o deshidratare
progresivă, fără ca apa ţesuturilor să revină în stare lichidă. Din punct de
vedere practic această metodă este mult mai simplă în raport cu
criodesicarea.
Fără a oferi toate garanţiile teoretice ale criodesicării, metoda
congelării-substituţie permite obţinerea unor preparate bune din punct de
vedere morfologic.

Fixarea prin agenţi chimici


Dintre toţi fixatorii fizici trecuţi în revistă numai căldura asigură o
fixare în adevăratul sens al cuvântului, adică o denaturare a proteinelor
tisulare încât în majoritatea cazurilor, se impune intervenţia agenţilor
chimici susceptibili a asigura această denaturare. Înţelegem astfel rolul
esenţial pe care îl joacă fixatorii şi amestecurile fixatoare chimice.

53
Printre criteriile de clasificare a fixatorilor chimici se iau în
consideraţie în primul rând acţiunile lor asupra proteinelor, deoarece
denaturarea proteinelor reprezintă piatra de temelie a fixării. În afara
denaturării proteinelor, fenomen ce merge în paralel cu o serie de modificări
din care cea mai vizibilă este o schimbare a caracterelor solubilităţii,
lanţurile care reprezintă proteinele de structură sunt depliate; apar legături
intermoleculare noi ce conferă ansamblului o anumită rigiditate; o serie de
grupări pot deveni active în timp ce altele care puteau reacţiona înaintea
denaturării sunt mascate acum. Cum de altfel a şi fost remarcat, denaturarea
nu este un fenomen uniform, totdeauna acelaşi; fixatori diferiţi pot fi cauza
unor denaturări diferite, ce vor modifica o anumită proprietate a proteinelor
asupra cărora acţionează.
În funcţie de tipul de acţiune asupra ovalbuminei (floculare sau
coagulare) se poate face o clasificare a agenţilor chimici fixatori în:
1. coagulanţi (metanol, etanol, acetonă, acid nitric, acid clorhidric,
trioxidul de crom, etc.)
2. necoagulanţi (acid acetic, tetraoxid de osmiu, bicromat de potasiu,
formaldehida).
De asemenea, trebuie avute în vedere acţiunile agenţilor chimici
fixatori şi asupra glucidelor şi lipidelor tisulare, gradul de penetrare în
interiorul pieselor, retracţia ţesuturilor sub acţiunea lor, modificările
morfologice ale organitelor, etc. Numărul fixatorilor chimici simpli este
relativ mic în comparaţie cu varietatea amestecurilor fixatoare. Vom trece în
revistă în continuare câţiva dintre fixatorii simpli şi amestecurile fixatoare
cel mai frecvent utilizate.

Fixatori simpli
a. Etanolul – lichid incolor, uşor miscibil cu apa, uneori utilizat ca
fixator la concentraţii variind între 70% - 100%. Este utilizat în special în
scopul fixării glicogenului şi conservării elementelor minerale insolubile în
alcool; în marea majoritate a cazurilor este folosit în amestecuri (alcool-
formol, amestecul Carnoy, etc.). Utilizat singur este un fixator mediocru
prezentând o serie de inconveniente (ex. retracţia ţesuturilor după un anumit
timp de acţiune).
b. Formaldehida – este un gaz ce este utilizat sub formă de soluţie în
apă cu o concentraţie de 36% - 40% fiind în mod obişnuit numită formol.
Soluţiile formaldehidei constituie fixatorii cei mai folosiţi, fiind
utilizaţi frecvent singuri şi nu în amestecuri. Aceste soluţii trebuie însă
neutralizate adăugând carbonat de calciu sau de sodiu sau tamponate până la
neutralitate.

54
În caz contrar, se formează progresiv acid formic prin oxidare, ceea
ce reprezintă un inconvenient important pentru fixare. Formolul face parte
totodată din numeroase amestecuri fixatoare.
c. Acizi organici şi minerali – nu sunt utilizaţi singuri, ci ca
adjuvanţi în amestecurile fixatoare.
Exemple:
1) acidul acetic - unul din cei mai vechi fixatori cunoscuţi, este utilizat în
diferite amestecuri: Bouin, Hollande, Carnory, etc.; este un bun fixator al
nucleului.
2) acidul tricloracetic – în soluţii apoase de 5-10% are proprietăţi
asemănătoare, prezentând şi o capacitate decalcifiantă; intră în alcătuirea
amestecului Bouin tricloracetic şi a fixatorului Heidenhain denumit “Susa”.
3) acidul picric – este un excelent fixator al proteinelor şi adăugarea lui în
soluţiile fixatoare favorizează anumite coloraţii cum ar fi cele ale
colagenului sau cele folosite pentru studiul glandelor endocrine.
4) acidul cromic – în soluţie apoasă 1% este utilizat exclusiv ca adjuvant în
anumite amestecuri (ex: Flemming, Benda, etc.).
d. Tetraoxidul de osmiu – este cel mai bun fixator citologic cunoscut,
rămânând încă fixatorul de bază pentru studiile de microscopie electronică,
deoarece păstrează cel mai bine structurile tisulare şi relaţiile dintre acestea.
Prezintă dezavantajul de a fi puţin penetrat şi de a face ţesuturile foarte
friabile, făcând dificilă confecţionarea secţiunilor. Pentru aceste motive şi
datorită preţului ridicat şi toxicităţii sale (conjuctivite), este puţin utilizat ca
fixator în microscopia fotonică.
Este folosit doar pentru conservarea mitocondriilor sau a aparatului
Golgi sau în stare de vapori pentru fixarea frotiurilor. Alte substanţe folosite
ca fixatori chimici simpli sau intrând în compoziţia unor amestecuri
fixatoare sunt: sărurile de metale grele (bicromat de potasiu), clorura
mercurică, acetonă, dioxanul, etc.

Amestecuri fixatoare
Sunt amestecuri de doi sau mai mulţi fixatori simpli la care se pot
adăuga substanţe destinate realizării unui anumit pH al soluţiei.
Principalele amestecuri fixatoare utilizate în biologia celulară se pot
sistematiza în patru grupe:
1. Amestecuri cromo-osmice (Flemming, Benda, Champy, Benoit
Nassonov) conservă foarte bine structurile nucleare, centriolii, aparatul
fusorial, diferenţieri ale plasmalemei ca marginea în perie, platoul striat şi
cilii. Restricţiile sunt mici şi piesele se pot include în parafină. Timpul
optim de fixare este de 12-24 ore.

55
2. Amestecurile cromice fără OsO4 şi acid acetic (Orth, Kopsch,
Regaud, Helly, Maximov) sunt utilizate pentru studiul mitocondriilor şi
permit impregnarea argentică a complexului Golgi; conservă granulele de
secreţie, iar gama de coloranţii şi reacţii citochimice după aceste fixări este
foarte largă.
3. Amestecuri de bază de metale grele în afară de crom şi OsO4
(Ramony Cajal, Da Fano, Aoyama) conservă mitocondriile şi permit
impregnarea argentică a complexului Golgi. Timp optim de fixare 3-25 ore.
4. Amestecurile cromo-acetice (Telliensniczky, Zenker, Kolmer,
Sanfelice) se folosesc în studiul granulelor de secreţie, a ergastoplasmei,
cililor precum şi în cariologie. Timp optim de fixare 12-24 ore.
Alţi fixatori: în afara celor patru grupe descrise mai sus, se pot
utiliza cu rezultate asemănătoare şi alţi fixatori.
1. Amestecul formol-calciu (Baker) reprezintă un excelent fixator
pentru mitocondrii şi complexul Golgi.
2. Fixatorii Clarke şi Carnoy conservă foarte bine reticulul
endoplasmatic granular.
3. Fixatorii Bouin, Susa, Heidenhein sunt utilizaţi în studiul
produşilor de secreţie, iar amestecurile pe bază de sublimat şi formol sau
acid acetic pot servi pentru conservarea centrozomului, aparatului fusorial şi
cililor.

Practica fixării
Arta fixării constă în utilizarea corectă a fixatorilor ce corespunde
fiecărui caz în parte, adică de a şti ce fixator trebuie folosit în funcţie de
obiectivele lucrării, cunoscut fiind faptul că nu există un fixator universal.
Un fixator simplu e greu să întrunească toate calităţile necesare unei
bune fixări, motiv pentru care se recurge la amestecuri fixatoare în care
diverşi constituenţi îşi modifică reciproc acţiunea.
La alegerea fixatorului se ţine cont de: natura ţesutului sau
organului; detaliile de structură care trebuie evidenţiate; coloraţia pe care o
vrem să o facem.

Reguli generale ale fixării


a. Evitarea alterărilor autolitice – fixarea trebuie făcută cât mai repede
posibil după recoltarea materialului biologic
b. Spălarea fragmentelor – într-o soluţie fiziologică şi nu în apă care
poate provoca umflarea ţesuturilor
c. Evitarea uscării ţesuturilor – făcând toate manevrele ce preced
fixarea într-un mediu umed (ex. acoperind fragmentele cu o soluţie

56
fiziologică, umectând lamele de ras şi celelalte instrumente cu
aceeaşi soluţie).
d. Tăierea unor fragmente suficient de mici
e. Facilitarea la maximum a penetrării fixatorului – în organe şi
ţesuturi; pentru aceasta se vor utiliza flacoane mari cu fundul plat şi
dop rodat; nu se va lăsa sânge sau mucus la suprafaţa piesei; se evită
ca acestea să se lipească de pereţii recipientului în care se face
fixarea, agitând din timp în timp flaconul.
f. Utilizarea unui volum suficient de fixator În afara unor cazuri
particulare, volumul fixatorului trebuie să fie de aproximativ 40-50
ori mai mare decât a fragmentului fixat.
g. Piesele se introduc în amestecul fixator ambalate în tifon şi purtând
un număr de ordine pentru identificare.
h. Durata fixării variază în funcţie de compoziţia amestecului fixator,
structura şi dimensiunea pieselor, temperatură – existând o durată
optimă pentru fiecare fixare.
i. Un fixator utilizat odată nu poate fi folosit pentru fixarea altei piese.
Nici un fixator citologic nu este universal şi de aceea arta fixării constă
în alegerea corectă a amestecului în raport de ceea ce trebuie studiat.
În tabelul 1 sunt prezentaţi principalii fixatori citologici şi utilizarea
lor:
Tabel 1. Principalii fixatori citologici şi utilizarea acestora
Nr.
ORGANIT FIXATORI UTILIZAŢI
crt.
1. Nucleul Clarke, Carnoy, Bouin + CrO3
2. Cromatină sexuală Amestecuri cromo-osmice
3. Nucleolul Sanfelice şi fixatori pe bază de CrO3
4. Complex Golgi Champy, Nassonov, R.Y.Cajal, Da Fano
5. Mitocondrii Orth, Kopsch, Regaud, Altman, Benoît
6. R.E.G. Bouin, Susa, Heidenhaim, Clarke, Carnoy
7. Tonofibrile Canoy
8. Microvili Canoy, Flemming, Benda, Campy, Benoît
9. Cili Sanfelice, Kolmer, Champy, Benda
10. Granule de secreţie Bouin, Zenker, Susa, Clarke, Caroy

Compoziţia chimică a fixatorilor citologici

A. Amestecuri cromo-osmice
1. Fixatorul Flemming

57
- tetraoxid de osmiu 2% 4 ml
- trioxid de crom 1% 15 ml
- acid acetic 1 ml
2. Fixatorul Benda
- tetraoxid de osmiu 2% 4 ml
- trioxid de crom 1% 15 ml
- acid acetic 3 pic.
3. Fixatorul Altman
- tetraoxid de osmiu 2% 10 ml
- bicromat de K 5% 10 ml
4. Fixatorul Champy
- tetraoxid de osmiu 2 % 4 ml
- trioxid de crom 1% 7 ml
- bicromat de K 7 ml
5. Fixatorul Benoît
- tetraoxid de osmiu 2% 5 ml
- bicromat de K 5% 6 ml
- clorură mercuriană 5% 5 ml
- nitrat de uranil 4% 4 ml

B. Amestecuri cromice
1. Fixatorul Kopsch
- bicromat de K 3,5 % 4 ml
- formol 40% 1 ml
2. Fixatorul Orth
- lichid Müller 9 ml
- apă distilată 100 ml
- bicromat de K 2,5 g
- sulfat de Na 1g
- formol 40% 1 ml
3. Fixatorul Regaud
- bicromat de K 3 % 4 ml
- formol 40 % 1 ml
4. Fixatorul Helly
- lichid Zenker 9,5 ml
- clorură mercurică 5g
- apă ditilată 100 ml
- formol 40% 0,5 ml

C. Amestecuri pe bază de metale grele în afară de Os şi Cr


1. Fixatorul R.Y.Cajal
- nitrat de uranil 2% 85 ml
- formol 40% 15 ml
2. Fixatorul Da Fano
- nitrat de cobalt 1% 85 ml
- formol 40% 15 ml

D. Alţi fixatori
1. Fixatorul Bouin

58
- soluţie apoasă saturată de acid picric 75 ml
- acid acetic cristalizat 5 ml
- formol 40 % 25 ml
2. Fixatorul Carnoy
- alcool etilic 100% 60 ml
- cloroform 30 ml
- acid acetic 10 ml

Piesele se trec direct în alcool etilic 100 %.

2.3.1.3. Includerea în parafină

Introdusă în tehnica histologică de Krebs încă din 1869, includerea


în parafină reprezintă şi astăzi cea mai utilizată din toate tehnicile de
includere (celoidină, unele mase plastice, gelatină).
Produsul cunoscut sub numele de parafină este un amestec de
hidrocarburi alifatice prezentând o serie de caractere fizice de care depind
calitatea includerii şi a secţiunilor: gradul de fisurare ce indică prezenţa între
cristale a aerului şi impurităţilor lichide, duritatea, plasticitatea şi
vâscozitatea. Din punct de vedere chimic parafina nu este miscibilă nici cu
apa nici cu alcoolurile: metilic, etilic şi propilic, nici cu glicerina; este
miscibilă cu eterul sulfuric, anilina, dioxanul, sulfura de carbon,
hidrocarburile benzenice, etc. (fig.20).
Includerea în parafină este condiţionată de aceste caractere de
solubilitate şi o penetrare perfectă a pieselor necesită în primul rând
deshidratarea lor şi apoi impregnarea cu un lichid miscibil cu parafina;
numai piesele tratate prin criodesicare pot fi impregnate bine cu parafina
fără nici o baie complementară.
Utilizarea cu succes a parafinei în citologie se datorează tocmai
proprietăţilor sale:
1. solubilitatea în agenţi clarifianţi şi topirea la temperaturi apropiate
de 55° ce permite impregnarea ţesuturilor fără ca acestea să sufere alterări
structurale importante.
2. ea redevine solidă, fără a fi de o duritate excesivă la temperatură
obişnuită, fapt ce permite confecţionarea de “blocuri” în care fragmentul
tisular inclus, este perfect menţinut şi va putea fi secţionat la grosimi foarte
mici.
Includerea în parafină a ţesuturilor fixate prin una din metodele
descrise anterior se realizează parcurgând următoarele etape principale:
deshidratarea, clarificarea, impregnarea cu un solvent al parafinei,
impregnarea cu parafină urmată de includerea propriu-zisă.

59
Fig. 20. Bateria de includere în parafină

2.3.1.4. Deshidratarea

Deoarece parafina nu este solubilă în apă nu se pot include ţesuturile


fixate ce conţin multă apă, fără o prealabilă deshidratare. Aceasta se face cu
un agent chimic anhidru capabil să absoarbă apa din ţesuturi în condiţiile în
care acestea nu modifică structurile celulare. În practică, cel mai des utilizat
este alcoolul absolut; uneori se foloseşte însă diaxonul sau acetona.
Uzual, această operaţie se realizează trecând ţesuturile fixate prin
alcooluri de concentraţie crescătoare, de exemplu, alcool 60°, 70° 80°, 95°,
100°, deoarece unii autori consideră că acţiunea brutală a alcoolului absolut
antrenează o retracţie a ţesuturilor. Totuşi, când piesele au fost fixate cu
ajutorul unui lichid pe bază de alcool, chiar şi cei mai prudenţi citologi
admit începerea deshidratării la un grad alcool metric superior fixatorului
(96° sau chiar alcool absolut - Carnoy). Pentru ţesuturile fragile se
recomandă o deshidratare lentă începând cu alcool 50° iar pentru celelalte se
începe cu alcool 70°. Volumul alcoolului din baia de deshidratare trebuie să
fie de aproximativ 10 ori mai mare decât volumul piesei.

60
Este preferabilă utilizarea mai multor băi de scurtă durată o singură
baie abundentă şi prelungită. Durata deshidratării este în funcţie de volumul
fragmentelor tisulare. Pentru cele de talie mijlocie deshidratarea se
efectuează în 2-3 ore. Deshidratarea trebuie să se încheie întotdeauna, în
cazul în care se face în etanol, cu o baie de alcool absolut nou, ce nu a fost
folosit.

2.3.1.5. Clarificarea

Se face după deshidratare, piesa fiind trecută prin băi succesive de


solvent organic. Acesta poate fi: toluen, xilen, benzen, cloroform.
Clarificarea se face în general în 3 băi de 1-6 ore pentru piesele
mijlocii şi de 15-30 min. pentru un fragment biopsic sau o piesă foarte mică

2.3.1.6. Impregnarea cu parafină

Se face în parafină menţinută în stare lichidă, prin plasarea ei într-un


termostat la 56°. Se adaugă la parafină o mică cantitate (5-10%) de ceară de
albine care îmbunătăţeşte consistenţa blocului şi va permite o bună
secţionare.
Calitatea secţiunilor depinde în mare parte şi de absenţa oricărei
urme de solvent în parafină; aceasta se obţine prin trecerea pieselor prin cel
puţin 3 băi succesive de parafină înaintea turnării blocului. Durata
impregnării variază în funcţie de volumul piesei, fiind în medie de 6 ore.
Unii autori au imaginat sisteme de impregnare sub vid, camera
termostatului fiind branşată la o pompă de vid. Acest procedeu permite o
impregnare mai rapidă şi este, în special, foarte bună pentru impregnarea
ţesuturilor aerate, cum ar fi fragmentele pulmonare.

2.3.1.7. Includerea propriu-zisă

După ieşirea din ultima baie de parafină, piesa se aşează în parafină


nouă, neutilizată, care se toarnă într-o formă, în general alcătuită din bare
metalice - barele Leuckhardt – (se pot utiliza şi bare realizate din carton,
aluminiu sau plastic (fig. 21). Răcirea acestei parafine duce la solidificarea
ei şi obţinerea unui bloc gata de a fi secţionat. Răcirea este în general
obţinută lăsând parafina la temperatura laboratorului. Pentru identificarea
diferitelor piese dintr-un bloc ne servim în continuare de aceleaşi cartonaşe
cu numere de ordine care le-au însoţit pe parcursul prelucrării lor, inclusiv
în băile de parafină.

61
Fig. 21. Barele Leuckart

Parafina este mediul de includere cel mai frecvent utilizat dar, există
şi alte medii şi tehnici de includere: în paraplast, în celoidină, dublă
includere în celoidină şi parafină, în dietilen sau polietilenglicol sau în
gelatină, unele dintre ele fiind introduse destul de recent în practica
citologică şi vor căpăta probabil o mare dezvoltare în viitor.
1. Includerea în paraplast
Paraplastul este un amestec de parafină purificată şi polimeri plastici
care prezintă o mare rezistenţă şi elasticitate. Includerea pieselor în acest
amestec permite confecţionarea de secţiuni deosebit de fine de ţesuturi dure
sau de consistenţă diferită cu rezultate foarte bune; în acest domeniu, această
metodă tinde să înlocuiască tot mai mult procedeele clasice de includere în
celoidină sau de dublă includere. Anumite laboratoare utilizează în mod
curent paraplastul în locul parafinei. Tehnica de includere este aceeaşi ca şi
în cazul includerii în parafină.
2. Includerea în celoidină
Celoidina, utilizată în soluţie cu un amestec de eter şi etanol, este un
mediu de includere care are avantajul de a realiza impregnarea ţesuturilor la
rece. Ea este o formă purificată de nitroceluloză.
Includerea pieselor este foarte simplă: după fixare ele sunt
deshidratate apoi impregnate cu soluţii de celoidină în concentraţie
crescătoare, la temperatura laboratorului; când este gata impregnarea se lasă
să se întărească ultima soluţie prin evaporarea solventului şi blocului astfel
obţinut este gata pentru secţionat. Acest procedeu de includere prezintă faţă
de includerea în parafină avantaje şi dezavantaje.
Dintre avantaje amintim faptul că:
- tehnica este simplă şi principiul său nu necesită încălzirea;
- mediul de includere conservă bine structurile şi raporturile între
ţesuturi de consistenţă diferită;
- consistenţa sa fermă şi elastică este un excelent suport pentru
ţesuturile dure;

62
Aceste proprietăţi fac din celoidină mediul de includere ideal pentru
organele formate din ţesuturi de consistenţă diferită, pentru formaţiuni
chistice, ţesuturi fibroase sau musculare din care adesea este dificil de
obţinut secţiuni regulate şi omogene după includerea în parafină.
Consistenţa sa permite secţiuni de dimensiuni mai mari; acest
procedeu este folosit pentru includerea organelor cum ar fi: uterul, glanda
mamară, etc. şi mai ales encefalul, includerea în celoidină reprezentând
metoda de bază în tehnica neurologică.
Dintre inconveniente amintim:
- metoda este lentă şi unele etape mai dificile;
- mediul de includere nu permite confecţionarea unor secţiuni foarte
fine (sub 10 microni);
- blocurile nu pot fi conservate ca atare: este necesară păstrarea lor
în etanol 70% sau 80%.
3. Dubla includere în celoidină şi parafină
Această metodă combină unele dintre avantajele metodei includerii în
celoidină cu cele ale includerii în parafină (rapiditate, obţinerea de secţiuni
fine, etc.).
Există mai multe moduri de realizare a acestei metode, cele mai
simple constând în: deshidratarea şi impregnarea în soluţii de celoidină în
concentraţie crescătoare şi apoi printr-o soluţie (ex: benzen) de clarificare,
luând impregnarea piesei cu parafină ca în procedeul uzual al includerii în
parafină.
4. Includerea în dietilen şi polietilen glicol
a. Dietilen-glicolul “Ester Waxes” – mediu mult mai dur decât
parafina, prezintă unele avantaje faţă de parafină şi celoidină; blocurile
rezultate sunt mai dure decât cele de parafină şi este necesară utilizarea unui
cuţit foarte rezistent şi a unui microtom foarte stabil.
b. Polietilen-glicolii “Poliester Waxes” – sunt medii de includere
care prezintă un mare interes teoretic pentru faptul că sunt hidrosolubili,
nefiind necesară deshidratarea pieselor şi folosirea unui agent clarifiant, în
felul acesta economisindu-se timp (o includere se poate face în 4-5 ore) şi
realizându-se o diminuare a retracţiei ţesuturilor.
Piesele nefiind trecute prin alcooli sau solvenţi organici, lipidele sunt
conservate în secţiunile care sunt mai fine şi mai regulate decât cele obţinute
prin congelare.
Din păcate, în ciuda optimismului numeroşilor cercetători, secţiunile
sunt destul de dificil de realizat şi de etalat pe lamă din cauza higroscopiei
polietilen glicolului. Astfel, această metodă de includere este folosită doar
pentru anumite cercetări cum ar fi studiul lipidelor sau punerea în evidenţă a
lipidelor şi a mucopolizaharidelor.
63
5. Includerea în gelatină
Este utilizată în cazul unor ţesuturi fragile sau de volum mic.
Fragmentele fixate sunt trecute prin soluţii de gelatină de concentraţie
crescătoare, aşezate apoi în gelatină turnată într-o formă, blocul de gelatină
se solidifică şi este gata de a fi secţionat.
Procedeul prezintă un inconvenient: gelatina solidifică prin acţiunea
formolului nu poate fi prea mult îndepărtată ceea ce creează dezavantaje la
colorarea secţiunilor
6. Includerile automate
Intreprinderi specializate furnizează de câţiva ani aparate ce permit
trecerea automată a pieselor prin diferiţi agenţi chimici utilizaţi pentru
includere. Aceste aparate au cunoscut un mare succes şi echipează în
prezent multe laboratoare. Ele prezintă un avantaj: economisirea timpului
deoarece aparatele funcţionează continuu, zi şi noapte şi sunt înzestrate cu
sisteme de agitare a pieselor în diferiţi solvenţi, ceea ce creşte viteza de
impregnare. Dau rezultate bune când sunt folosite la includerea fragmentelor
de volum asemănător, timpii de trecere a pieselor prin diferite băi fiind în
funcţie de acest volum.

2.3.1.8. Secţionarea

Confecţionarea secţiunilor pare la prima vedere cea mai simplă


manoperă din cadrul celor care duc în final la realizarea unui preparat.
Realitatea este însă cu totul alta. Obţinerea unor secţiuni bune nu
este un lucru chiar atât de uşor, fiind posibilă numai după o experienţă
îndelungată. Modul în care sunt realizate secţiunile, influenţează calităţile
optice ale preparatelor finale la fel de mult ca şi fixarea.
Secţionarea se realizează cu ajutorul microtoamelor, existând două
tipuri:
1. Microtoame cu mişcare verticală, piesa deplasându-se de sus în jos,
secţionarea fiind realizată de un cuţit cu tăişul înalt (ex: microtomul rotativ
Spencer YD-202, Minot etc.) (fig. 22, A).
2. Microtoame cu mişcare orizontală: în acest caz piesa poate fi
menţinută fix, cuţitul deplasându-se orizontal, sau invers cuţit fix şi piesa în
mişcare.
Primul tip de microtom este cel mai utilizat, fiind folosit pentru
secţionarea blocurilor de parafină. Al doilea tip este folosit mai ales pentru
blocurile de celoidină, pentru cele care au suferit o dublă includere sau
pentru blocurile mari de parafină.

64
A B

Fig. 22. A - microtomul de parafină Spencer YD-202; B - microtomul de


mână pentru secţiuni vegetale.

Piesele esenţiale ale unui microtom tip rotativ sunt: cuţitul, suportul
cuţitului care-l menţine în poziţie şi permite orientarea lui, port-obiect şi
dispozitivul lui de fixare, şurubul micrometric cu ajutorul căruia se fixează
grosimea secţiunii, dispozitivul pentru avansarea piesei şi roata motrice.
Pentru secţiuni vegetale se poate folosi şi un microtom de mână (fig. 22, B).
Înaintea secţionării propriu-zise, blocul de parafină ce conţine
preparatul se va modela în formă de trunchi de piramidă patru unghiulară
astfel încât în jurul piesei să rămână o bandă de parafină de 1-2 mm
grosime. Astfel finisat el se fixează, indiferent de mediul de includere
folosit, cu baza mare pe un port-obiect care se montează la microtom ( fig.
23).
Pentru blocurile de parafină această operaţie este foarte simplă: se
încălzeşte port-obiectul metalic apoi se aplică blocul de parafină, se introduc
apoi în apă rece, menţinând în contact cele două piese până când blocul
aderă solid la port-obiect.
Montarea blocurilor de paraplast, Ester Wax, sau a celor obţinute
prin dublă includere se realizează la fel ca şi în cazul blocului de parafină.
Blocurile de celoidină şi Necol sunt montate pe port-obiecte din
lemn sau plastic pe care se pune un strat dintr-o soluţie de celoidină 2% în
alcool-eter; blocul este menţinut apoi apăsat pe port-obiect timp de o oră şi
ansamblul este apoi introdus în alcool 70% timp de o jumătate de oră,
înainte de a fi fixat la microtom.

65
Fig. 23. Banda de secţiuni seriate
A-secţiunile la parafină; B-etalate pe lama port-obiect

2.3.1.9. Etalarea şi lipirea secţiunilor pe lamă

În vederea prelucrării lor ulterioare (colorare), secţiunile trebuie


aplicate pe un port-obiect (lamă de sticlă cu dimensiunile de 76/26 mm şi
grosimea de 1-1,5 mm) bine degresat. Metodele de etalare şi lipire variază în
funcţie de procedeul de includere ce a fost folosit:
1. Pentru secţiunile în parafină, paraplast sau Ester Wax: panglicile
de parafină obţinute prin procedeul secţionării la microtom sunt plisate şi
trebuie etalate pe un mediu lichid, slab încălzit, pentru ca pliurile să dispară.
Pentru aceasta se pot utiliza două procedee:
a. Etalarea la bain-marie:
În această tehnică, numită de flotare (“floating technics”), panglicile de
parafină conţinând una sau mai multe secţiuni, sunt puse la suprafaţa apei la
bain-marie la aprox. 40°. Sub influenţa căldurii parafina se înmoaie şi
pliurile dispar. Panglicile nu trebuie încălzite prea mult pentru a se
împiedica topirea parafinei ceea ce ar duce la disocierea secţiunii.
Când pliurile au dispărut, secţiunile se trec pe o lamă de sticlă pe
care s-a aplicat în prealabil o peliculă subţire de gelatină.
b. Etalarea pe lamă – este procedeul cel mai frecvent utilizat.
O lamă de sticlă este acoperită cu o picătură de soluţie apoasă de
gelatină (0,1-0,2%) sau albumină Mayer (50g albuş de ou, 50g glicerină şi
1g salicilat de sodiu dizolvat în puţină apă distilată, amestec care se va filtra
sub un clopot) – cel mai des utilizat sau soluţie de amidon sau amilopectină,
plasmă umană sau soluţii agar care se întind bine cu ajutorul pulpei
66
auricularului. Din panglica de parafină se taie fragmente conţinând 3-4
secţiuni care se aplică (cu faţa lucioasă în jos) pe suprafaţa unsă cu albumină
Mayer a lamei; se picură apă distilată la una din extremităţile panglicii de
parafină şi înclinăm puţin lama pentru ca secţiunile să plutească; o aşezăm
orizontal pe o placă încălzitoare reglată la o temperatură inferioară velei a
punctului de topire al parafinei folosită pentru includere.
În câteva secunde secţiunile se descreţesc şi se întind complet (la
nevoie pentru întinderea completă a secţiunilor se pot folosi două ace de
disociere).

Fig. 24. Suportul pentru uscarea preparatelor

După întinderea completă, apa în exces se îndepărtează iar lamele


puse înclinat pe un stativ de lemn se introduc într-un termostat la 37°C
unde, timp de 24 ore se desăvârşeşte uscarea şi lipirea secţiunilor (fig. 24).
Ferite de praf, aceste preparate pot fi conservate necolorate timp îndelungat.
2. Pentru secţiunile în celoidină – pot fi utilizate trei modalităţi de
etalare şi lipire:
a. Transportul secţiunilor culese în etanol 70%, în diferiţi reactivi
sau coloranţi: pelicula de celoidină menţine textura secţiunii astfel încât
aceasta nu suferă alterări în cursul manoperelor; secţiunea va fi montată pe o
lamă fără eliminarea peliculei de celoidină.
b. Se poate de asemenea lipi secţiunea pe o lamă de sticlă cu ajutorul
unei soluţii de celoidină; procedeul nu poate fi aplicat decât în cazul când
coloraţiile ulterioare nu colorează celoidină care nu este eliminată înaintea
montării.
c. Când coloranţii folosiţi se fixează pe celoidină secţiunile trebuie
lipite cu ajutorul unei soluţii de gelatină.
3. Secţiunile în celoidină-parafină sunt în general etalate şi lipite ca
şi secţiunile la parafină.
4. Secţiunile în polietilen-glicol
Secţiunile vor fi etalate folosind o soluţie de gelatină sau albumină,
dar la rece. Etalarea corectă este adesea dificil de obţinut datorită

67
higroscopiei polietilen-glicolilor folosiţi, dar utilizarea mediului Reid şi
Sarantakos îndepărtează acest inconvenient.

2.3.2. Metoda etalării materialului biologic în monostrat

Această metodă cuprinde tehnica frotiului şi amprentelor de organe.


Prin tehnica frotiului, se realizează întinderea celulelor în monostrat pe
lame de sticlă, putând fi examinate celulele sanguine (periferice şi
medulare) celulele epiteliale descuamate sau exfoliate (din piele, cavitate
bucală, faringe, căi respiratorii extra şi intrapulmonare, vagin, col uterin,
endometru, căi galactofore, lichid cefalo-rahidian, lichid pleural, lichid de
ascită), amprente de organe.
Metoda este mult utilizată în citologie, devenind prioritară atât în
domeniul cercetării biologice cât şi ca procedeu de diagnostic în practica
medicală.

Tehnica frotiului de sânge


Executarea unui frotiu de sânge constituie o tehnică de bază a
microscopiei clinice, căci după principiile executării sale se execută şi
frotiurile de măduvă osoasă , suc gastric, sedimente de lichide seroase, etc.
Un preparat hematologic sau citologic este inutilizabil dacă este
realizat cu o tehnică necorespunzătoare care distruge morfologia
elementelor celulare. Numai un frotiu corect executat permite o interpretare
microscopică corespunzătoare, utilă diagnosticului sau cercetării biologice.
Lamele pe care se execută frotiul trebuie să fie perfect curăţate şi degresate,
altfel nu se obţin preparate bune (fig. 25).
a. Prelevarea sângelui – se face la adult prin puncţionarea părţii
laterale a pulpei degetului inelar sau mediu, iar la nou născut şi sugar din
lobul urechii, partea laterală a halucelui sau din călcâi. Locul puncţionării se
dezinfectează şi se degresează cu ajutorul unui tampon îmbibat în alcool sau
eter.
Se prinde degetul subiectului cu mâna stângă, fixându-l între index şi
police şi printr-o mişcare rapidă se puncţionează locul dezinfectat cu un ac
pentru injecţii subcutanate, sterilizat.
Primele două picături se şterg cu ajutorul unei comprese uscate
deoarece conţin prea mult lichid interstiţial sau impurităţi de pe piele.

68
Fig. 25. Diferitele etape ale realizării frotiului de sânge

b. Efectuarea frotiului propriu-zis – constă în întinderea pe o lamă


port-obiect curată a unei picături de sânge într-un strat subţire şi uniform.
Picătura de sânge care apare pe pulpa degetului se ridică cu
marginea mică a unei lame şlefuite şi se aplică pe una din extremităţile unei
lame port-obiect aşezate orizontal. În momentul contactului cu lama port-
obiect, se imprimă lamei pe care se află picătura de sânge o mişcare de
lateralitate pentru ca sângele să se întindă pe toată linia de contact după care
se imprimă lamei şlefuite o mişcare de translaţie în lungul lamei port-obiect.
Frotiul este bine executat dacă are:
- două margini laterale şi se termină în franjuri;
- o grosime potrivită: elementele figurate să nu fie suprapuse şi
totodată suficient de dese.
Grosimea frotiului de sânge depinde de:
1. mărimea picăturii de sânge (picătură mică, frotiu subţire);
2. unghiul dintre lama şlefuită şi lama port-obiect ce trebuie să fie de
30°-35° (frotiu subţire) ;
3. viteza de întindere (viteză mare – frotiu gros).
c. Fixarea frotiului – se poate face prin:
- uscare – sau desicare la temperatura laboratorului prin agitarea lamei
pentru a obţine o uscare rapidă; uscarea lentă duce la ratatinarea celulelor;

69
- soluţii fixatoare – frotiu umed; alcoolul etilic absolut timp de 15 min.,
alcool etilic absolut şi eter în părţi egale timp de 5-15 min., alcool metilic
timp de 2 min. sau prin vapori de OsO4 (soluţie 2%)
După fixare se execută colorarea preparatului.
d. Colorarea frotiului de sânge
Frotiul trebuie colorat cât mai curând după realizarea lui (imediat
după întinderea lui sau în primele 24 ore) întrucât pe lamele necolorate
celulele se alterează pierzându-şi afinitatea tinctorială.
Actualmente se foloseşte colorarea dublă cu soluţie May-Grümwald-
Giemsa ce dă indicaţii asupra compoziţiei chimice a substanţei vii celulare.
May-Grünwald-Giemsa aparţine coloranţilor neutri şi este o coloraţie
panoptică (metoda permite identificarea în mod selectiv a componenţilor
celulari în funcţie de pH-ul specific). Este colorantul de elecţie al frotiurilor
sangvine.
Compoziţia colorantului utilizat:

a. soluţia May-Grümwakd
- eozinat de albastru de metilen 1 g.
- glicerina neutră p.a. 50 ml.
- alcool metilic p.a. 100 ml.

b. soluţie Giemsa
- eozinat de azur metilen 3 g.
- azur de metilen 0,8 g.
- glicerină neutră 250 ml.
- alcool metilic p.a. 200 ml.

Tehnica colorării
Reactivi şi materiale necesare:
- soluţie May-Grümwald;
- soluţie Giemsa;
- apă distilată neutră;
- pipete Pasteur, pipete gradate.
PH-ul apei distilate trebuie să fie 7 sau 7,2. Apa distilată este de
obicei acidă. Neutralizarea ei se obţine adăugând câteva picături dintr-o
soluţie slab alcalină de carbonat de sodiu 1% la 500 ml apă distilată,
încercându-se pH-ul cu un indicator universal de hârtie; pH-ul apei se mai
controlează şi prin adaos de câteva cristale de hematoxilină (colorarea apei
în roz este indicaţia de neutralitate – hematoxilina este violet-albastră în
mediu alcalin şi galbenă în mediu acid);

70
- se acoperă frotiul cu soluţie May-Grümwald şi se lasă 2-3 min.
(timp în care soluţia realizează o fixare a frotiului);
- se adaugă apoi peste soluţia May-Grümwald un număr egal de
picături de apă tamponată, se omogenizează şi se lasă 2 min.
(diluată, soluţia May-Grümwald acţionează ca un colorant);
- se îndepărtează colorantul fără spălare şi se acoperă cu soluţie
Giemsa diluată cu apă distilată tamponată în proporţie 1/1 (1
picătură soluţie Giemsa pentru un mililitru apă); se lasă 15-20 min;
- se spală lama sub jet de apă;
- sugativare uşoară;
- se aşează în stativ pentru uscare.
Colorarea pentru trombocite se face la fel, prelungind doar timpul de
colorare cu Giemsa la 45 min., iar spălarea lamei nu se face sub jet puternic
de apă fiindcă apa antrenează trombocitele.
Clasa unui element sau gradul lui de maturare se stabileşte pe baza
unor criterii ce privesc bazofilia citoplasmei elementelor tinere, afinitatea
tinctorială a granulaţiilor granulocitelor şi acidofilia eritrocitelor mature.
Această metodă de colorare dă indicaţii asupra pH-ului
componentelor celulare. Astfel, coloranţii acizi sunt fixaţi de porţiunile
alcaline ale celulei, care sunt acidofile, iar coloranţii bazici sunt fixaţi de
părţile acide, care sunt bazofile. De exemplu eozina, colorant acid, este
fixată de granulaţiile eozinofile ce sunt alcaline (pH = 11); albastrul de
metilen, colorant bazic, este fixat de acidul ribonucleic din citoplasma
eritroblastului bazofil colorând-l în albastru; azurul de metilen fixează
acidul dezoxiribonucleic din nucleul eritroblastului bazofil. Nucleolul
fixează albastru de metilen deoarece conţine acid ribonucleic de tip
citoplasmatic.
Cu cât o celulă este mai tânără cu atât citoplasma ei este bazofilă, dat
fiind concentraţia mare de acid ribonucleic. Pe măsura măturării celula
devine tot mai acidofilă deoarece scade concentraţia în acid ribonucleic (ex:
evoluţia eritroblaştilor).
Termenii de eozinofil, bazofil, acidofil, indică afinitatea faţă de
coloranţii acizi.

Examinarea frotiului de sânge colorat, la microscopul fotonic se


începe cu obiectivul de 10 pentru verificarea calităţii tehnice a frotiului (fig.
26):
Apoi se pune la punct cu obiectivul cu imersie şi se examinează pe
rând:
- morfologia eritrocitelor;
- frecvenţa şi morfologia trombocitelor;
71
- frecvenţa şi morfologia leucocitelor, eventual cu întocmirea
formulei leucocitelor (exprimarea procentuală a diferitelor forme
de leucocite).
Pentru întocmirea formulei leucocitare, se examinează frotiul de
sânge pe margine, lama deplasându-se într-o singură direcţie, notându-se
fiecare tip de leucocit din 100 de leucocite numărate.

Formula leucocitară normală


Granulocite neutrofile nesegmentate NN = 1-4%
Granulocite neutrofile segmentate NS = 50-70%
Granulocite eozinofile E = 1-4%
Granulocite bazofile B = 0-1%
Limfocite L = 30-45%
Monocite M = 4-8%
Pentru a creşte gradul de credibilitate a unei formule leucocitare se
examinează 200-400 de elemente şi apoi se face procentajul fiecărei clase de
elemente. Cifra absolută reprezintă numărul fiecărui dintre elemente pe mm3
precum şi variaţiile reale.
Cifre absolute normale
- neutrofile nesegmentate 50-320/mm3
- neutrofile segmentate 3000-4500/mm3
- eozinofile 100-200/mm3
- bazofile 20-10/mm3
- limfocite 1250-2400/mm3
- monocite 240-840/mm3

Variaţiile formulei leucocitare şi ale numărului de leucocite în


funcţie de vârstă (după J. Bernard)

Nou-născut 9 luni 3 ani 10 ani Adult


Număr/mm3
10000- 4000- 5000- 5000- 4000-
20000 15000 10000 10000 10000
Neutrofile 60-70% 25-40% 35-50% 45-60% 50-70%
Eozinofile 1-2% 1-4% 1-4% 1-4% 1-4%
Bazofile 0,4% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1%
Limfocite 20-25% 50-70% 45-60% 40-50% 30-45%
Monocite 12% 8% 6% 6% 6%

72
Variaţii fiziologice ale numărului elementelor sângelui periferic

HEMOGRAMA
Eritrocite - variaţii după sex:
- bărbat adult 4500000-5500000/mm3
- femeie adultă 400000-5000000/mm3
- variaţii după vârstă:
- la naştere 4500000-7000000/mm3
- până la 12 ani 4000000-5000000/mm3.
Leucocite
- adulţi 4000-9000/mm3
- la naştere 15000-25000/mm3
Trombocite
- valori normale 130000-300000/mm3.
Aceste elemente variază nu numai în funcţie de vârstă după cum se
observă şi din tabelul de mai sus ci şi după sex. La aceste variaţii se adaugă
cele care survin în cursul unei activităţi musculare mai intense, în timpul
digestiei, în funcţie de anotimp, de altitudine (poliglobulie).
Examinarea frotiului de sânge
În examinarea frotiului de sânge colorat se recomandă ordinea
arătată anterior (studiul atent al morfologiei eritrocitelor, a trombocitelor şi
apoi a leucocitelor), deoarece, începând cu studiul leucocitelor, atrăgătoare
prin variaţiile lor de formă, structură şi culoare, riscăm neglijarea unor
detalii, uneori foarte importante ale aspectului hematiilor sau trombocitelor
(fig.26; 27).

Fig. 26. Tipuri de elemente figurate evidenţiate pe frotiul de sânge uman

73
Fig. 27. Interpretarea unui frotiu de sânge

• Granulocite neutrofile (nucleu segmentat)


Pe un frotiu recoltat din sângele periferic se observă predominanţa
celulelor anucleate, respectiv a hematiilor. Din loc în loc se găsesc şi
elemente nucleate. Leucocitele neutrofile (granulocitele neutrofile) sunt cele
mai numeroase leucocite, fiind prezente în sânge în procent de 45-75%.
Sunt celule globuloase, emit pseudopode ceea ce le conferă o mare
mobilitate. Durata de viaţă a neutrofilelor este de 2-5 zile, ele persistând în
sânge 6-12 ore. Au nucleu caracteristic, segmentat, prezentând 2-5 lobi
nucleari legaţi între ei prin punţi de cromatină. Aşezarea lobilor în neutrofil
realizează forme diferite, asemănătoare literelor din alfabet (C, E, U, V, S,
Z, Y). La sexul feminin aproximativ 3% din neutrofile prezintă la unul din
lobii nucleari corpusculul Barr, ce reprezintă cromatina sexuală condensată
a unuia din cei doi cromozomi X. Corpusculul sexual apare la microscop ca
o prelungire a lobului nuclear sub forma unui baţ de tobă. Citoplasma
neutrofilului este slab acidofilă, colorată în roz palid. Gradul de segmentare
al nucleului corespunde cu vârsta celulei. În citoplasmă se găsesc numeroase
granulaţii fine.
• Limfocite (nucleu sferic)
Limfocitul este o celulă sferică sau uşor ovală, se găseşte în sânge în
proporţie de 25-45%. Nucleul limfocitului este mare, uşor incizat, colorat în
violet, ocupând mare parte din citoplasma care este redusă la un inel
perinuclear. Citoplasma este bazofilă, conţine granulaţii azurofile, organite
74
celulare. Durata de viaţă în sângele periferic este diferită, fiind situată între
câteva zile şi un an, dar unele limfocite pot atinge şi vârsta de 5-25 ani.
Limfocitele joacă un rol important în imunitate (limfocitele B şi T).
• Granulocite eozinofile (nucleu bilobat)
Eozinofilul se găseşte în sângele periferic în proporţie de 1-5%, fiind
printre cele mai mari elemente din grupul granulocitelor segmentate.
Celulele sunt sferice, cu nucleu bilobat sau "în desagă". Se pot întâlni în
sângele circulant şi eozinofile cu nucleu trilobat. Citoplasma este intens
acidofilă, conţine organite celulare şi granulaţii acidofile. Durata de viaţă a
eozinofilelor este de 8-12 zile.
• Monocite (nucleu reniform)
Monocitele se găsesc în sângele periferic în proporţie de 6-8%. Se
împart în monocite mici-inactive şi monocite mari active. Sunt celule
globuloase, cu citoplasma abundentă, bazofilă, ce se colorează în albastru-
cenuşiu. Nucleul celulei este nesegmentat, mare, deseori reniform.
Monocitul împreună cu macrofagul tisular joacă un rol important în apărarea
organismului. Durata de viaţă în sângele circulant este de 10-60 ore.

Celula stem adultă este o celulă nediferenţiată care poate fi găsită


printre celulele diferenţiate dintr-un ţesut sau organ, se poate reînnoi singură
şi se poate înmulţi dând naştere tipurilor principale de celule specializate din
ţesutul sau organul respectiv. Rolurile principale al celulelor stem adulte
dintr-un organism viu constau în menţinerea şi repararea ţesutului în care se
găsesc ele. Celulele stem hamatopoetice dau naştere tuturor tipurilor de
celule sangvine: eritrocite, limfocite B, limfocite T, leucocite, nutrofile,
bazofile, euzinofile, monocite, macrofage şi trombocite.

75
Capitolul 3

COLORANŢII ŞI MECANISMELE COLORĂRII

Capitolul cuprinde noţiuni fundamentale privind coloranţii şi


mecanismele generale ale colorării precum şi importanţa acestora pentru
evidenţierea unor structuri celulare.
Colorarea structurilor celulare şi tisulare este un fenomen foarte
complex şi încă incomplet elucidat, în care intervin factori fizici şi
mecanisme chimice.

3.1. Coloranţii. Generalităţi.

Toţi coloranţii, în sensul strict al termenului utilizat în tehnica


citologică, sunt compuşi organici, marea lor majoritate corespunzând seriei
aromatice. Un colorant este un produs ce poate colora durabil o substanţă
sau un ansamblu de substanţe. Pentru aceasta au nevoie de:
1. grupări atomice specifice ce conferă culoarea numite cromofore
2. grupări ce permit o fixare permanentă pe substanţa de colorat
numite grupări auxocrome.
Se ştie că fenomenul “culoare” este legat de absorbţia selectivă de
către o substanţă dată a unor anumite lungimi de undă din spectrul vizibil
astfel încât lumina reflectată de această substanţă apare colorată;
responsabile de această absorbţie selectivă sunt grupările cromofore.
Compuşii organici ce conţin grupări cromofore sunt numiţi şi
“cromogeni”. Cromogenii nu sunt obligatoriu coloranţi deoarece ei necesită
prezenţa unei grupări ce le conferă proprietatea de a se ioniza, permiţându-le
fixarea grupărilor auxocrome. Grupările auxocrome din punct de vedere
chimic sunt, cel mai ales, funcţii simple, fără duble legături, polare sau
semi-polare. Grupările hidroxil, amino, carboxil, cian, sulfonil sunt
principalii auxocromi. Grupări chimice care nu sunt nici cromofore nici
auxocrome pot interveni modificând culoarea unui colorant; printre acestea
sunt grupări metil, fenil, etc. Se admite existenţa unui raport între puterea de
colorare a compuşilor cu duble legături conjugate şi schimbarea rapidă a
configuraţiei moleculare, acesta jucând un rol esenţial alături de absorbţia
undelor electromagnetice. Legăturile duble cu electroni mobili, sunt la
originea caracterului cromofor a grupărilor nesaturate.

76
3.2. Clasificarea coloranţilor

Coloranţii utilizaţi în citologie pot fi clasificaţi după mai multe


criterii:
1. După origine:
- naturali, de origine vegetală (hematoxilină, safranină) sau de origine
animală (carminul)
- sintetici (albastru de metil, etc.)
2. După natura auxocromilor ce determină şi comportamentul lor în
soluţie, coloranţii se împart în:
a. coloranţi acizi sau anionici
b. coloranţi bazici sau cationici
c. coloranţi neutri
Termenul de acid sau bazic nu se referă la caracterul acid sau bazic
al soluţiilor colorante; clasificarea se referă la auxocromi:
a. coloranţii care conţin auxocrom anionic (ex: CO2H) sunt
coloranţi acizi ce colorează componentele subcelulare încărcate pozitiv; cel
mai utilizat colorant acid este eozina ce colorează în roz citoplasma.
b. coloranţii bazici conţin auxocromi cationici (ex: NH2). Ei
colorează componentele subcelulare încărcate negativ, cei mai utilizaţi fiind:
tionina, violet de metil, hemalaunul.
c. coloranţii neutri sunt purtătorii de grupări cationice şi anionice;
se obţin din soluţii apoase de coloranţi bazici şi coloranţi acizi amestecate în
anumite proporţii; de exemplu, eozinatul de albastru de metilen şi eozinatul
de azur de metilen.

3.3. Mecanismele colorării

Mecanismele fixării coloranţilor pe structurilor celulare sau tisulare


sunt complexe, realizându-se prin intermediul unor factori fizici şi a unor
mecanisme chimice în proporţii variabile. Marea majoritate a reacţiilor de
colorare au însă o explicaţie în special chimică; proteinele ce nu sunt extrase
în cursul prelucrărilor ce preced colorarea, reprezintă substratul molecular la
nivelul căruia se ataşează coloranţii. Anumite coloraţii nu par să evidenţieze
decât parţial mecanisme chimice, de aceea s-au luat în considerare şi unii
factori fizici printre care:
1. penetrarea pur mecanică a colorantului în interiorul anumitor
structuri tisulare prin osmoză sau capilaritate;
2. adsorbţia ce joacă un rol important în coloraţiile diferenţiale a
unor elemente tisulare (anumiţi ioni fiind adsorbiţi mai uşor decât alţii de

77
anumite substanţe) şi în fenomenele de mordansare, atât de importante în
anumite tehnici citologice;
3. absorbţia legată de structura fizică a constituenţilor tisulari.

3.4. Principalele metode de colorare

Tehnicile de colorare se clasifică după următoarele criterii:


1. Numărul coloranţilor utilizaţi:
- simple, când se foloseşte un singur colorant, fie nuclear
(hematoxilina), fie citoplasmatic (eozina);
- combinate, când secţiunile se colorează succesiv cu doi sau mai
mulţi coloranţi (dublă: hematoxină-eozină, triplă - hematoxilină-eozină-
albastru de metilen) sunt folosite pentru colorarea în mod diferenţiat a
diverselor elemente ale unui ţesut şi a facilita astfel analizarea structurii lui.
2. Utilizarea unor adjuvanţi:
- directă: colorantul se fixează prin simplul contact cu secţiunea
(colorarea cu hematoxilină-eozină);
- indirectă sau prin mordansare – necesită prezenţa unui mediator
sau mordant (alanurile, iodul, sărurile de fier, etc.) care fixează colorantul de
componentele celulare; combinaţia dintre colorant şi mordant se numeşte
lac.
3. Intensitatea colorării
- progresivă – se fac încercări succesive sub control microscopic până
se ajunge la tenta de culoare optimă a structurii celulare după ce opreşte
colorarea prin spălare (de ex: hemalaunul colorează nucleii tuturor tipurilor
de celule în albastru, în 4-6 min.; dacă lăsăm secţiunile mai mult timp în
contact cu colorantul, se colorează şi alte structuri celulare);
- regresivă – se face o supracolorare care prinde şi alte structuri
celulare decât cele dorite, după care, excesul de colorant, este îndepărtat prin
substanţe decolorate sau diferenţiatorii (de ex: după ce am colorat secţiunea
în negru intens cu hematoxilină ferică Heindenhain, introducem lama într-o
soluţie de alaun de fier amoniacal până în momentul în care a rămas colorată
numai cromatina nucleară, celelalte elemente celulare - mitocondriile,
centrul celular - decolorându-se).

4. Starea materialului
- coloraţia vitală se face pe celule în stare vie prin utilizarea unor
coloranţi vitali şi care persistă numai atât timp cât supravieţuieşte celula; se
utilizează pentru evidenţierea unor organite celulare (mitocondrii - verde
Janus B sau complexul Golgi - roşu neutru) şi a unor activităţi fiziologice
celulare;
78
- coloraţia permanentă se face prin colorarea unor preparate
permanente.

3.4.1. Colorarea secţiunilor la parafină

Necesită o serie de timpi executaţi înainte şi după coloraţia propriu-


zisă.
a. etapa de precolorare cuprinde:
1. Deparafinarea – secţiunile parafinate lipite pe lamă se
deparafinează trecându-le prin băi succesive cu solvenţi ai parafinei: xilol,
benzen, toluen 5-10 min., deoarece parafina împiedică colorarea.
2. Hidratarea – este necesară eliminarea solventului parafinei pentru
a face posibilă colorarea. Se realizează prin trecerea secţiunilor în 5 băi de
alcool etilic în concentraţii descrescânde (3 băi cu alcool absolut, apoi 96%
şi 70%) timp de 1-2 min.
Apoi secţiunile se trec în apă distilată dacă soluţia colorată este
apoasă. În cazul folosirii unei soluţii colorate alcoolice se efectuează
aceleaşi operaţii, omiţându-se trecerea în apă distilată, secţiunile
transferându-se direct în soluţie colorantă alcoolică.
b. colorarea propriu-zisă
c. etapa de postcolorare
1. Spălarea cu apă distilată este necesară pentru oprirea colorării şi
îndepărtarea excesului de colorant.
2. Deshidratarea este absolut necesară pentru obţinerea unui
preparat microscopic permanent. Se face prin trecerea secţiunilor colorate
prin 5 băi de alcool etilic de concentraţii crescânde (70%, 96% şi 3 băi cu
alcool etilic 100%).
3. Clarificarea îndepărtează alcoolul din secţiuni şi le conferă o
transparenţă necesară examinării lor la microscop; se face prin trecerea
secţiunilor în 3 băi succesive de xilol, toluen, benzen.
4. Montarea lamelei pe secţiunile colorate
Montarea are triplu scop: protecţia mecanică a secţiunilor,
conservarea cât mai mult timp posibil a coloraţiilor sau reacţiilor
histochimice şi obţinerea unui grad de transparenţă şi a unui indice de
refracţie avantajos din punct de vedere optic.
Mediile de montare folosite în realizarea unor preparate
microscopice permanente pot fi:
a. apoase (miscibile cu apa): glicerină-gelatină, sirop Apathy, etc. Se
folosesc în cazul în care secţiunile nu au fost deshidratate. Indicele lor de
refracţie este însă net inferior faţă de cel al mediilor anhidre, ceea ce

79
reprezintă un inconvenient deoarece este vorba de secţiuni colorate; de
asemenea un număr mare de coloraţii nu se conservă bine în aceste medii.
b. mediile de montare miscibile cu alcoolul – necesită o deshidratare
a preparatelor mergând până la alcool 80° sau chiar 85°. Folosirea lor este
indicată atunci când se dovedeşte evitarea folosirii alcoolului absolut şi a
hidrocarburilor benzenice necesare când se foloseşte balsamul de Canada
sau alte rămăşiţe sintetice. Cel mai utilizat dintre aceste medii miscibile cu
alcoolul este euparolul (Gilson 1906). După mulţi autori, conservarea
majorităţii coloranţilor şi reacţiilor histochimice este foarte bună. Avantajul
principal al utilizării pentru montare a euparolului este evitarea deshidratării
prin alcool absolut a secţiunilor în celoidină nelipite (este indicaţia
principală a acestui procedeu).
Montarea propriu-zisă se realizează punând 1-2 picături din mediul
de montare pe lama cu secţiunea lipită şi colorată pe care se aplică apoi o
lamelă de sticlă.
În această etapă, esenţială este manipularea lentă a lamelei pentru a
se evita formarea bulelor de aer între lamă şi lamelă.
Scoaterea bulelor de aer se face prin apăsarea uşoară pe lamelă cu un
ac de disociat. Preparatele astfel montate se pun la termostat la 37°C, 10-12
ore sau la temperatura camerei dar ferite de praf 1-2 zile, în vederea
uniformizării grosimii stratului şi uscării mediului de montare.
c. anhidre, răşinoase (miscibile cu hidrocarburi benzenice) (ex:
balsam de Canada) ce necesită nu numai deshidratarea completă a
secţiunilor dar şi impregnarea cu un solvent al materialului de montare, deci
cu o hidrocarbură benzenică. Alături de balsamul de Canada se pot folosi şi
alte răşini sintetice.
5. Etichetarea preparatului este ultima etapă în obţinerea unui
preparat microscopic permanent: constă în lipirea unei etichete pe port-
obiect, pe faţa cu secţiunea colorată, pe care se trec datele înregistrate în
condica de lucru şi coloraţia făcută. Preparatele microscopice se păstrează în
cutii sau histoteci, ferite de lumină şi praf.

3.4.2. Tehnica colorării cu hemalaun-eozină (HE)

Coloraţia cu hemalaun-eozină este probabil cea mai răspândită


coloraţie de rutină în majoritatea laboratoarelor de citologie normală şi
patologică, fapt ce impune şi justifică necesitatea cunoaşterea acesteia.
Metoda coloraţiei cu hemalaun-eozină foloseşte succesiv un colorant
nuclear bazic, hemalaun (hemateină + alaun de K) şi un colorant
citoplasmic, acid, care este în general eozina.

80
Hematoxilina este un compus natural, de origine vegetală (extrasă
din Haematoxylon campechianum) a cărui utilizare pentru colorarea
ţesuturilor vegetale sau animale era cunoscută de indigenii din America
Centrală înainte de cucerirea spaniolă. Introdusă apoi în Europa, a fost
utilizată în industria textilă.
Formula ei stabilită încă din 1810 de către Chevreul este: C16H14O6.
Se ştie de asemenea că hematoxilina însăşi nu este un colorant şi că ea
capătă această proprietate după oxidarea în hemateină (C16H12O6 – pierderea
celor doi atomi de hidrogen făcându-se fără intrarea oxigenului în
moleculă).
Oxidarea hematoxilinei, denumită curent maturare, se face:
- prin maturare naturală – expunere prelungită la aer;
- prin maturare artificială – tratare cu agenţi oxidanţi;
Se preferă însă procesul de maturare lentă, naturală. Hemateina
utilizată în tehnica citologică sub formă de lacuri, prin mordansare cu un
alaun (alaun de K), se numeşte hemalaun.
Ea permite obţinerea unei coloraţii nucleare bune în albastru violet.
Numărul formulelor de hemalaun folosite este mare (ex: hemalaunul
Hansen, Mason, etc.).
Eozina. Există în realitate mai mulţi coloranţi care poartă numele de
eozină. Toţi sunt derivaţi de xantină şi mai precis din fluoresceină. Printre ei
este şi eozina Y (sau eozina galbenă) care dă cele mai bune rezultate în
asociere cu hemalaunul.
Acest colorant este sarea de sodiu a derivatului tetrabromat al
fluoresceinei. Mai este numit şi eozină hidrosolubilă. Derivaţii săi metilaţi şi
etilaţi sunt mult mai puţin folosiţi (eozina etilată sau eozina S, solubilă în
alcool este utilizată pentru punerea în evidenţă a corpusculilor Negri ai
turbării).
Eozina B sau albastră, derivatul dibromat al dinitrofluoresceinei, este
utilizată mai rar ca eozina Y în asociere cu hemalaunul, dovedindu-se utilă
atunci când este combinată cu azur A sau albastru de toluidină.
Timpii acestei metode sunt:
1. operaţiunile etapei de precolorare: deparafinare, hidratare.
2. colorarea propriu-zisă ce cuprinde:
a) introducerea secţiunilor hidratate într-o baie care conţine hemalaun,
timp de 5-10 min;
b) spălarea în apă curgătoare 5-10 min;
c) diferenţierea în alcool clorhidric (alcool 96° - 100 ml. Soluţie acid
clorhidric – 0,5 ml.) când nucleii sunt supra coloraţi. Pentru virare,
secţiunile se trec în soluţia saturată de carbonat de litiu;

81
d) introducerea secţiunilor spălate într-o baie cu soluţie apoasă de
eozină 1% timp de 1-2 min;
e) spălarea secţiunilor timp de câteva secunde în apă distilată pentru
eliminarea excesului de colorant;
h) sugativare uşoară.
3. operaţiunile etapei de postcolorare: deshidratare, clarificare,
montarea lamelei, etichetare.

Rezultate:
- nucleii apar coloraţi în albastru violet cu hemalaun. Hemalaunul este
un colorant bazic deci, conţinutul nuclear este bazofil (principalii
constituenţi chimici ai nucleului, ADN şi ARN, posedă radicali fosfat acizi
ce reprezintă locuri de ataşare pentru colorantul bazic-hemalaunul).
- citoplasma se colorează în roz cu eozina. Eozina este un colorant
acid, deci citoplasma este acidofilă (cele mai multe proteine citoplasmatice
se comportă la pH-ul respectiv ca baze, expunând grupările NH3+ care,
reprezintă locul de ataşare pentru colorantul acid-eozină).
În cazul în care se folosesc secţiuni de ficat uman pentru colorare cu
HE se observă: hepatocitele dispuse în cordoane celulare, separate prin
spaţii în care sunt capilarele sanguine; în citoplasma acidofilă a
hepatocitelor pot fi observate uneori formaţiuni granulare bazofile, colorate
în albastru-violet - corpii Berg – ce reprezintă ergastoplasma, cantitatea
mare de ARN, datorată ribozomilor ataşaţi membranei RE, reprezintă
substratul acestei bazofilii.
Pe o secţiune efectuată la nivelul pielii se identifică cele trei straturi
(epiderm, derm şi hipoderm), foliculi pilari, glande sebacee, etc. În
hipoderm se găsesc grupuri de celule adipoase, încărcate cu lipide care
ocupă aproape toată citoplasma. Celulele au formă sferică, citoplasma
necolorată (lipidele nu se colorează). Lipidele intracitoplasmatice împing
nucleul la periferie, turtindu-l, adipocitul căpătând astfel aspectul de " inel
cu pecete".
Glande exocrine cu mecanism de secreţie de tip merocin - celula îşi
menţine integritatea între cicluri secretorii succesive. În coloraţia HE,
citoplasma acinilor mucoşi nu este colorată, datorită prezenţei produşilor de
secreţie (mucopolizaharide acide şi neutre).
În coloraţia HE o insulă Langerhans apare ca o structură mai puţin
colorată printre acini, care sunt intens coloraţi. Este formată din câteva zeci,
până la câteva mii de celule endocrine, de dimensiuni mici, rotunde sau
poligonale, cu citoplasma eozinofilă, palidă, cu nuclei rotunzi, albastru-
violet. Celulele sunt aşezate în cordoane care se anastomozează şi printre
care se găsesc numeroase capilare sangvine. Celulele din centrul insulei
82
(mai numeroase - 70%) denumite celule B sau β, secretă insulina, iar
celulele din exteriorul insulei (mai puţine 20%) denumite celule A sau α,
secretă glucagonul. Cei 2 hormoni (insulina şi glucagonul) intervin în mod
decisiv în metabolismul glucidic.
- spaţiile goale, necolorate în citoplasma hepatocitelor; aceste spaţii
goale reprezintă locurile ocupate de: incluziuni granulare de glicogen (ce nu
se colorează cu HE), spaţiile ocupate de granulele de glicogen apar
neregulate şi cu un contur neclar; incluziuni granulare lipidice – locurile
ocupate de acestea, apar sub formă sferică.

3.4.3. Coloraţii nucleare

Coloraţiile nucleare utilizează coloraţii bazice: hematoxilina,


kernechtrot, albastru de toluidină, safraniană, etc.

1. Coloraţia cu hematoxilină ferică Heidenheim.


Cel mai utilizat colorant este hematoxilina ferică Heidenheim care
oferă detalii structurale nucleare preţioase; el mai evidenţiază incluziuni
celulare şi striaţiile muşchilor striaţi.
a. Se prepară o soluţie mamă de hematoxilină 10% în alcool etilic
96° care se lasă să se matureze la lumină 2-3 săptămâni.
b. Prepararea soluţiei colorante 1%.
- soluţie hematoxilină 10%......10 ml.
- apă distilată…………………90 ml.
c. Înaintea colorării, preparatele vor fi mordansate (operaţie
intermediară între fixare şi colorare care are drept scop creşterea
selectivităţii pentru colorant a structurii citologice).
Mordantul utilizat:
- alaun de fier şi amoniu (cristale violete)….3 g.
- apă distilată……………………………100 ml.
d. Diferenţiatorul este tot o soluţie de alaun, de o concentraţie mai
mică.
- alaun de fier şi amoniu (cristale violete)…….1-2 g
- apă distilată………………………………...100 ml.
e. Tehnica de lucru. Secţiuni la parafină sunt aduse la apă.
- Mordansare pentru nucleu 30 min, pentru alte structuri până la 24 ore.
- Colorare hematoxilină Heidenheim 1%......30 min. – 24 ore.
- Spălare rapidă în apă distilată.
- Diferenţiere sub microscop.
- Spălare în apă distilată.
- Colorare de fond.
83
Deshidratare, clarificare şi montare în balsam de Canada.

Rezultate: cromatina apare colorată în negru-albăstrui, citoplasma


incoloră; coloraţia prelungită mai pune în evidenţă centrozomii, granulele de
secreţie.
2. Colorarea cromatinei sexuale (corpuscul Barr)
Studiul cromatinei sexuale se poate face pe frotiuri de mucoasă
bucală sau vaginală, amprente de biopsii cutanate şi pe secţiuni la parafină.
Rezultatele cele mai bune le oferă variantele clasice ale metodei Feulgen şi
Rossenbeck (pentru acizii nucleici). Prezentăm mai jos tehnica propusă de
Klinger şi Ludwig (1957) care dă rezultate mulţumitoare şi e mai puţin
laborioasă.
a. Fixare în alcool etilic 96° pentru frotiuri timp de 30 min. - 3 ore,
pentru piese din ţesuturi sau organe, fixarea se face în lichidul
Davidson…..3 - 24 ore.
- alcool etilic 96°….30 ml.
- formol 40%...........20 ml.
- acid acetic……….10 ml.
- apă distilată……...30 ml.
b. Secţiuni deparafinate şi deshidratate.
c. Hidrolizare soluţie HCl 5 N……20 min.
d. Spălare în apă distilată.
e. Colorare 15-60 min. în amestecul:
- soluţie saturată de tionină în alcool etilic 50°….40 min.
- tampon Michaelis pH 6,4.
- soluţie HCl 0,1 N……..19,6 ml.
- veronal sodic 0,1 M…..20,4 ml.
f. Spălare repetată în apă distilată, apoi în alcool etilic 50°.
g. Îndepărtarea excesului de colorant cu alcool etilic 70°.
h. Deshidratarea, clarificarea, montare în balsam Canada.

Rezultate: corpusculul Barr este colorat în albastru intens, alţi


cromozomi în albastru deschis, fibrina şi mucinele metacromice (roşu la
violet).
3. Colorarea nucleolilor.
Nucleolii, structuri constante ale nucleilor celulelor eucariote, de
formă sferică, foarte refringenţi în celula vie, în general omogeni în
microscopia fotonică pe preparate fixate, cu aspect electronodens, este
implicat în sinteza ARN ribozomal care se acumulează la acest nivel, înainte
de a trece în citoplasmă.

84
Datorită componenţei cromozomiale situată la exteriorul nucleolului,
metoda lui Estable şi Sotelo pune în evidenţă această structură periferică
numită nucleololemă.
a. Fixarea în formol, amestec Sanfelice sau alţi fixatori pe bază de
trioxid de crom.
b. Secţiuni deparafinate şi hidratate.
c. Imersia secţiunilor într-o soluţie apoasă de alaun de fier 3%.... 1-2
min.
d. Spălarea rapidă în apă distilată.
e. Imersia secţiunilor într-o soluţie apoasă de fericianură de K 1% în
care, după 30 sec. se adaugă 7-10 picături din soluţia apoasă de pirogalol
2%; coloraţia este aproape instantanee.
f. Spălarea în apă curgătoare.
g. Deshidratarea, clarificare, montare în balsam de Canada.

Rezultate: nucleololema se colorează în albastru închis, aproape


negru. Nucleolul se poate evidenţia şi prin alte metode de colorare nucleară.

3.4.4. Coloraţii citoplasmatice

Din punct de vedere tinctorial, citoplasma are afinitate pentru


coloranţi acizi. Cei mai utilizaţi sunt: eozina în soluţie apoasă 1% (roz-
cărămiziu), roşu Congo (virează în albăstrui în prezenţa acizilor) în soluţie
apoasă 0,5%, fuxina acidă 1/200 în apă acetifiată 1%, ponceau R în soluţie
apoasă 1% cu 1 ml acid acetic, verde lumină în soluţie apoasă 20,35 g % sau
în soluţie alcoolică 0,82%.

1. Punerea în evidenţă a mitocondriilor


Fixatorii recomandaţi sunt amestecurile: Benoît, Flemming, Regaud,
Helly.
Tehnica Benoît
Etape de lucru:
a. Fixare în amestecul Benoît………….24-48 ore
b. Spălare în apă curgătoare……………….24 ore
c. Postfixare în formol 10%.........................24 ore
d. Spălare în apă curgătoare……………….24 ore
e. Secţiunile de 2-3 microni, deparafinate, hidratate, sunt colorate la
cald cu fuxină Altman…..5 min.
- fuxină acidă………………….6 g.
- apă anilinată saturată…….100 ml.
f. Spălare energetică şi rapidă în apă distilată.
85
g. Diferenţiere sub microscop cu o soluţie saturată de acid picric în
alcool 96°.
h. Oprirea diferenţierii printr-o spălare rapidă în alcool etilic 70°.
i. Colorarea cu o soluţie apoasă de verde lumină 0,1-0,2%....3-5 min.
j. Deshidratare directă în alcool absolut.
k. Clarificare, montare în balsam de Canada.

Rezultate: mitocondriile apar colorate în roşu, citoplasma şi nucleii


în verde, lipidele osmiofile în negru. Cu această tehnică se evidenţiază
microvilii şi cilii vibratili din rinichi, intestin, trahee. Rezultate bune se mai
obţin prin utilizarea metodelor: Benda, Nassonov, impregnaţii argentice.

2. Punerea în evidenţă a complexului Golgi. Tehnica Cajal-DaFano


a. Fixare în amestecul preparat extemporaneu 3-24 ore.
- nitrat de cobalt……….1 g.
- formol 40%................15 g.
- apă distilată……....100 ml.
b. Spălare rapidă în apă distilată.
c. Impregnare în soluţia NO3Ag 1,5% la întuneric……24-48 ore.
d. Spălare rapidă în apă distilată.
e. Reducere în amestecul…….8-24 ore.
- hidrochinonă………………2 g.
- formol neutru 40%.............15 ml.
- apă distilată……………….85 ml.
- sulfit de Na anhidru……0,1-0,5 g.
f. Spălare rapidă în apă distilată.
g. Deshidratare, clarificare, includere la parafină.
h. Secţiunile pot fi virate în Cl2Au 1%....10-20 sec. şi fixate în
tiosulfat de Na 1%......30 sec.
i. Spălare în apă curentă………2.5 min.
j. Supracolorare cu violet de crezil 1%.........1 min.
k. Diferenţiere în alcool 90° până la violet palid.
l. Deshidratare, clarificare, montare în balsam de Canada.

Rezultate: complexul Golgi apare sub forma unor filamente în reţea


colorate în negru; fără supracolorare, citoplasma are o tentă aurie. Se obţin
rezultate bune cu metoda Mann-Kopsch (cu tetraoxid de osmiu 1%), tehnica
lui Elftman (cu azotat de argint).

86
3. Punerea în evidenţă a R.E.G.
Toate tehnicile se bazează pe bazofilia acidului ribonucleic,
constituentul caracteristic al acestui organit. Cele mai bune rezultate se obţin
prin detectarea histochimică.
a. Fixare fragmente scoarţă cerebrală în formol 10%......24 ore.
b. Spălare apă curgătoare……………………………..12-24 ore.
c. Deshidratare, clarificare, includere la parafină.
d. Secţiuni de 4-5 microni, deparafinate şi hidratate.
e. Colorare cu soluţie apoasă de albastru de toluidină 10%..... 10
min.
f. Spălare în apă distilată + 1 picătură dintr-o soluţie suprasaturată de
carbonat de litiu….5-10 sec.
g. Spălare în apă distilată…..2 min.
h. Diferenţiere pe stativ cu alcool etilic absolut 100ml + 1 ml acid
acetic + 1 pic. Amoniac (până la obţinerea unei tente bleu-albastru).
i. Oprirea diferenţierii cu alcool etilic absolut, evitându-se
decolorarea preparatului.
j. Clarificare, montare în balsam Canada.

Rezultate: corpusculii Nissl se colorează în bleu închis, citoplasma


în bleu deschis. Corpusculii Nissl mai pot fi evidenţiaţi cu soluţie apoasă 1%
de tionină.

4. Punerea în evidenţă a centrosomului. Coloraţia Flemming


(varianta Matthey).
a. Fixare în amestecul Flemming…………….24 ore.
b. Spălare în apă curentă până la dispariţia tentei galbene.
c. Deshidratare, clarificare, includere la parafină.
d. Secţiuni de 5-10 microni, deparafinare, hidratate.
e. Colorarea cu soluţie hidro-alcoolică de safranină……..2,1/2 ore.
- safranină……………1g.
- alcool etilic absolut……….100ml.
- apă distilată………..50 ml.
f. Spălare în 3 băi de apă distilată.
g. Tratarea cu soluţie…5 min.
- iodură de K…….2g.
- alcool etilic 70°-80°….300 ml.
- iod………………………1g.
h. Spălare rapidă în apă distilată.
87
i. Colorarea cu soluţie apoasă 1% violet cristal………..15 min.
j. Spălare în apă distilată.
k. Tratarea cu soluţie iodurată alcoolică timp de….20 sec.
l. Deshidratate în 2 băi cu alcool etilic absolut………10 sec. fiecare.
m. Diferenţiere în esenţă de cuişoare saturată cu orange G.
n. Eliminarea excesului de diferenţiator prin xilol, montate în balsam
de Canada.

Rezultate: citoplasma are o tentă galben-brună, diferenţierile


fibrilare, centrozomul se colorează în brun închis. Se mai utilizează cu bune
rezultate metoda Hortega (impregnare cu argint amoniacal).

3.4.5. Coloraţiile vitale

Consideraţii generale
Coloraţia vitală reprezintă o metodă a cărei semnificaţie teoretică şi
practică depăşeşte simpla punere în evidenţă a unor detalii de structură la
nivelul ţesuturilor sau celulelor. Importanţa acestei metode de studiu s-a
impus încă de la primele încercări sistematice şi un număr mare de
discipline biologice beneficiază astăzi de rezultatele ei.
Punctul de plecare al acestei metode a fost punerea în evidenţă a
anumitor ţesuturi, celule sau anumitor organite, evidenţiere obţinută prin
administrarea la un animal viu, a unor coloranţi bine aleşi. Acest stadiu este
depăşit însă de mult. În prezent, anumite coloraţii vitale sunt utilizate în
scop pur morfologic dar interesul principal al metodei rezidă în explorarea
permeabilităţii tisulare şi celulare, în analiza fenomenelor ce se derulează în
timpul absorbţiei, transportului de substanţe în organism, a acumulării şi
eliminării substanţelor introduse în mediul intern în scop experimental.
O coloraţie vitală este în realitate o experienţă de fiziologie celulară
iar fiecare timp trebuie să fie atent supravegheat. Coloraţiile vitale nu sunt
metode de rutină, ele reprezintă metode de cercetare şi un procedeu de
diagnostic.
În ceea ce priveşte definiţia acestei metode, deşi un număr mare de
publicaţii şi cercetări au început să dea o definiţie satisfăcătoare coloraţiei
vitale, nu s-a ajuns încă la un acord în acest sens.
Astfel Fischel (1910) propune de asemenea cu numele de coloraţii
vitale, metodele ce permit obţinerea unei coloraţii a anumitor elemente
citologice fără a sacrifica în prealabil animalul folosit ca material biologic
de studiu.
Pentru Mollendorff (1920, 1926) acest termen de coloraţie vitală este
rezervat coloraţiilor obţinute în timpul vieţii animalului; în spiritul acestei
88
definiţii, coloraţiile vitale sunt opusul coloraţiilor supravitale sau post-vitale,
executate pe ţesuturile unui organism ce tocmai a fost sacrificat ca şi în
cazul coloraţiilor ţesuturilor fixate.
Vonwiller şi apoi Gicklhorn încearcă definirea acestei metode,
insistând asupra imposibilităţii trasării unei limite rigide între coloraţiile
vitale şi postmortem printr-o definiţie riguroasă şi absolută.
În general deci, se foloseşte termenul de coloraţie vitală pentru toate
coloraţiile executate pe elemente vii, obţinute administrând colorantul la
animalul de experienţă în întregime, iar cel de coloraţie post-vitală pentru
coloraţia aplicată ţesuturilor sau celulelor extrase din organismul viu deşi, se
pare că această separare nu este justificată, cunoscut fiind faptul că viaţa
celulelor nu încetează obligatoriu şi imediat ce sunt extrase din organism şi
că ea poate continua un timp în condiţii de mediu favorabile, iar colorarea
anumitor structuri obţinute în condiţii “vitale” pot reprezenta, la nivel
celular, un fenomen post-mortem.
Numărul coloranţilor este mare, tehnica variind în funcţie de
colorant şi animalul de experienţă. De exemplu, pentru studiul celulei în
general se folosesc coloraţiile vitale cu roşu neutru, verde Janus, albastru de
metilen. Interpretarea coloranţilor vitali şi explicarea mecanismelor de
acţiune ale acestora sunt probleme cu grad sporit de dificultate. Problemele
de ordin fizico-chimic pe care le pune coloraţia vitală a celulelor şi
organitelor sunt departe de a fi soluţionate. Ar fi iluzoriu să considerăm, în
momentul de faţă, având în vedere stadiul actual al cunoştinţelor din acest
domeniu, că se poate forma o teorie unică ce ar permite interpretarea
coloraţiei tuturor structurilor de către toţi coloranţii vitali.
Este sigur însă că mecanismele ce intervin în fenomenul global al
colorării in vitro, al diverselor structuri, sunt numeroase şi variate.

Clasificarea coloranţilor vitali


În mod clasic se disting coloranţi vitali acizi şi bazici dar această
clasificare nu include şi substanţe din familia Sudan care pot fi considerate
coloranţi vitali ai lipidelor întrucât administrarea lor prin ingestie sau prin
injectare permite obţinerea colorării tuturor incluziunilor lipidice a căror
punct de topire este inferior temperaturii corpului.
Deşi în afara acestor compuşi, în general grupaţi în categoria “alţi
coloranţi”, principalii coloranţi vitali pot fi clasificaţi în:
1. coloranţi acizi: alizarina, roşu Congo, albastru pirol, albastru
tripan, cerneală de China, carminatul de amoniu; nu sunt coloranţi în sensul
propriu al cuvântului dar sunt incluşi în această categorie deoarece ei sunt
utilizaţi pentru evidenţierea elementelor histiocitare.

89
2. coloranţi bazici: albastru de metilen, albastru de toluidină şi
azurul de metilen - ce sunt tiozine, roşu neutru şi verde Janus ce sunt azine,
violetul de cresil, albastru de Nil, - oxazine, etc.

Etapele coloraţiei vitale


Lui Mollendroff îi revine meritul de a fi insistat primul asupra
importanţei pe care o reprezintă studiul coloraţiilor vitale în funcţie de timp.
Acest autor defineşte trei stadii succesive ale unei coloraţii vitale: absorbţia,
repartiţia intracelulară şi acumularea electivă a colorantului.
Este vorba de trei fenomene a căror delimitare este absolută, fiecare
având reguli diferite de definiţie fiind condiţionat de factori diferiţi. De aici
interesul major pentru delimitarea acestor trei stadii în momentul descrierii
coloraţiilor vitale.
Într-o lucrare a lui Gicklhorn sunt analizate aceste trei stadii ale unei
coloraţii vitale, evidenţiindu-se faptul că pătrunderea unui colorant vital în
interiorul celulelor depinde de permeabilitatea normală sau modificată a
plasmalemei avute în vedere ca şi de capacitatea celulei de a fixa colorantul
respectiv. Repartiţia colorantului în interiorul organismului viu face să apară
problema specificităţii la nivel celular, tisular sau al întregului organism.
În ceea ce priveşte acumularea colorantului, aceasta depinde de
structura şi compoziţia chimică a celulelor şi ţesuturilor. Acumularea
colorantului vital sub formă granulară reprezintă modalitatea cea mai
frecventă. Această acumulare se face în mod diferit în cazul coloranţilor
bazici faţă de coloraţii acizi.
Coloranţii bazici se acumulează înainte de toate la nivelul
formaţiunilor preexistente, adică organite celulare sau paraplasmă.
Dimpotrivă, coloranţii acizi se acumulează în granule sau vacuole
care se formează în momentul acestei acumulări. Această regulă formulată
de Mollendorff este valabilă şi astăzi, în linii mari. În ceea ce priveşte
mecanismul acumulării este vorba, după opinia aceluiaşi cercetător de o
floculaţie, intervenind şi unele fenomene electrostatice.

Particularităţile fizico-chimice ale soluţiilor coloranţilor vitali


Cercetările efectuate de Mollendorff au arătat că formula de
structură a colorantului vital ar avea mult mai puţină importanţă decât
particularităţile fizico-chimice ale soluţiei utilizate. Această concluzie este
valabilă mai ales în cazul coloraţiei vitale în care se folosesc coloranţi acizi.
Natura chimică a colorantului utilizat nu reprezintă decât unul din
factorii din ansamblul celor ce determină proprietăţile soluţiei administrate
animalului de experienţă. Mărimea particulelor, încărcarea lor electrică, pH-
ul, presiunea osmotică, vâscozitatea, constanţa dielectrică a mediului,
90
prezenţa coloizilor şi altor factori, intervin în mod esenţial în determinarea
caracterelor fizico-chimice a acestor soluţii, iar rezultatul coloraţiei vitale
depinde în mare măsura de acestea.
Este deci necesară întotdeauna, ca odată cu prezentarea rezultatelor
unor coloraţii vitale să fie precizate şi caracterele fizico-chimice ale
soluţiilor utilizate în cursul experienţelor.

Reguli generale de aplicare ale coloranţilor vitali


Modul de aplicare al coloranţilor vitali variază într-o mare măsură în
funcţie de structurile ce se doresc a fi evidenţiate şi de funcţia pe care se
doreşte a o explora.
1. Folosirea coloranţilor acizi. Anumiţi coloranţi acizi pot fi
administraţi pe cale orală aşa cum este albastrul de trepan. Rezultatele nu
sunt totuşi satisfăcătoare decât la unele nevertebrate.
Injectarea colorantului în mediu intern al animalului de experienţă
rămâne metoda cea mai indicată. La vertebrate, această injectare poate fi
făcută subcutanat, intraperitoneal, sau intravenos.
Se observă în acest caz, coloraţii ”locale” sau „de vecinătate” (ţesut
conjunctiv vecin locului de injectare subcutanat, epiplon în caz de injectare
intraperitoneală, elemente histocitare ale ficatului, splinei, măduvei osoase
în caz de injectare intravenoasă). Acumularea electivă a colorantului în
anumite ţesuturi sau organe este precedată de prezenţa difuză în tot
organismul animalului de experienţă.
Viteza de apariţie a colorării unui organ dat depinde de calea de
administrare; administrarea intravenoasă duce la repartizarea cea mai
omogenă colorantului în corpul animalului de experienţă şi la acumularea
cea mai rapidă în organe.
Inconvenientul major al acestei căi de administrare constă în
toxicitatea majorităţii soluţiilor coloranţilor vitali, toxicitate ce imprimă o
reducere sensibilă a dozei ce va fi administrată pe cale intravenoasă.
Soluţiile trebuie preparate proaspăt deoarece marea majoritate a soluţiilor de
coloranţi vitali capătă pe măsura trecerii timpului (chiar în cazul conservării
în condiţii aseptice şi la temperaturi scăzute) o toxicitate a cărei origine este
încă necunoscută.
Examinarea ţesuturilor şi celulelor colorate prin intermediul unui
colorant vital acid poate fi făcută în stare proaspătă sau după o fixare.
Contrar coloranţilor vitali acizi poate fi conservată prin folosirea
unei serii de agenţi fixatori chimici, aceasta putând duce la erori de
interpretare. De aceea modalitatea ideala este de a examina in vitro şi in situ
celulele sau ţesuturile ce conţin acumulări de coloranţi acizi.

91
Acest lucru este uşor de realizat pentru unele ţesuturi şi organe
(mezenter, plămân, cornee), posibil în alte situaţii (ex: rinichi de şoarece) şi
imposibil de realizat în majoritatea cazurilor, astfel încât realizarea
secţiunilor la congelare şi de material proaspăt este de maximă importanţă
pentru examinarea rezultatelor coloranţilor vitali.
Alegerea fixatorului, prelucrarea ulterioară a pieselor şi alegerea
coloraţiilor de fond depinde de colorantul vital şi de ţesut.
2. Folosirea coloranţilor bazici. Condiţiile de aplicare şi mai ales
tehnica examinării sunt particulare în cazul coloranţilor vitali bazici.
Conservarea prin fixatori chimici este imposibilă în majoritatea
cazurilor şi de aceea este necesară urmărirea in vivo a tuturor fazelor
coloraţiei.
Anumiţi coloranţi, ex: verdele Janus, nu sunt utilizaţi decât pentru
aplicări locale; ca roşu neutru sau albastru de metilen pot fi aplicaţi local sau
injectaţi în mediul intern al animalului de experienţă. Modalităţile şi
precauţiile de preparare semnalată pentru coloranţii vitali acizi sunt valabile
şi în cazul coloranţilor bazici.

Colorarea vitală a mitocondriilor


a. Se face o soluţie apoasă de albastru de metilen 1%.
b. Se încălzeşte la temperatura corpului.
c. Se injectează în vena cozii la şoarece 0,5 – 1 ml. din soluţia 1% de
albastru de metilen la temperatura
de 25 -270C.
0

d. După 24 de ore se sacrifică animalul şi fragmentele de rinichi se


fixează 4-6 ore în amestecul:
- soluţie apoasă saturată acid picric…..60 ml.
- formol 40%..........................................20ml.
- soluţie apoasă saturată molibdat de amoniu….20ml.
e. Spălare în apă curgătoare………………..12+24 ore.
f. Deshidratare, clarificare, includere la parafină.
g. Secţiunile de 3+5 microni deparafinate şi hidratate se colorează cu
safranină pentru nuclei.
h. Spălare în apă distilată.
i. Deshidratare, clarificare, montare în balsam de Canada.

Rezultate: glomerulii apar incolori iar mitocondriile din nefrocite se


colorează în albastru.

92
Coloraţia cu hematoxilina ferica (Hf) Heidenheim
Oferă detalii structurale nucleare preţioase, incluziuni celulare, fibre
musculare striate.

Etape de lucru:

A) Pregătirea colorantului
- Hematoxilina 10%+ alcool etilic 96%, maturare 2-3 săptămâni
- Soluţia coloranta: 10ml sol. Hematoxilina 10% + apa distilata 90ml.
- Mordansare= pregătire selectivităţii pentru colorant

B) Tehnica de lucru
- Mordansare pentru nucleu 30 min. - 24h
- Colorare cu HF 30 min - 24h
- Spălare rapidă cu apă distilată
- Diferenţiere la microscop
- Spălare
- Colorare
- Deshidratare, clarificare, montare în balsam de Canada.

C) Rezultate
Cromatina apare colorată în negru-albăstrui,
Citoplasma incoloră
Centrozomii şi granulele de secreţie pot fi evidente

Pe o secţiune efectuată la nivelul unei tumori maligne se identifică


grupuri de celule neoplazice de diferite mărimi şi forme care prezintă
următoarele modificări:
- inversarea raportului nucleu/citoplasmă (normal<1, tumora>1);
- nuclei pleomorfi, monstruoşi, ce ocupă aproape toată citoplasma,
inegali ca formă şi mărime, cu cromatina nucleară laxă;
- nuclei denudaţi, membrana nucleară este incizată, margini
neregulate, crenelate, citoplasma redusă;
- mitoze atipice;
- nucleoli modificaţi ca forma şi mărime.

93
Capitolul 4

LUCRĂRI PRACTICE DE LABORATOR

LABORATOR 1

Izolarea membranelor plasmatice eritrocitare prin centrifugare

Hematiile adulte sunt lipsite de nucleu şi conţin 90% hemoglobină;


se pretează foarte bine pentru izolarea membranelor plasmatice.

Materiale necesare:
- NaCl 9% 0 (ser fiziologic);
- apă distilată;
- detergent;
- eprubete;
- pipete gradate de 5 şi 10 ml;
- pahare Berzelius de 150 ml;
- hârtie de filtru;
- tifon;
- aparat de centrifugă;
- sânge recoltat pe anticoagulant.

Fig. 28. Stratificarea sângelui uman

94
Modul de lucru:
Sângele recoltate pe anticoagulant se lasă în eprubetă pentru
sedimentara hematiilor; cu o pipetă se îndepărtează plasma şi elementele
albe (fig. 28). Se fac două spălări repetate a hematiilor cu ser fiziologic
pentru îndepărtarea proteinelor de pe suprafaţa membranelor eritrocitare.
Se pun apoi hematiile într-un vas cu apă distilată timp de 10 minute,
pentru producerea şocului osmotic (ruperea membranelor) şi eliberarea
hemoglobinei. Se face apoi o centrifugare la 3000 g/min., timp de 20 de
minute, pentru sedimentarea membranelor; se îndepărtează supernatantul.
Se mai fac două sau mai multe spălări cu apă distilată, urmate de o
centrifugare uşoară – la 1000 g/min., timp de 10 minute până când
membranele plasmatice se deschid la culoare.

Rezultate:
Sedimentul obţinut reprezintă membranele plasmatice eritrocitare.
Cu un detergent se poate face solubilizarea lor, dovedind că natura lor
chimică este lipoproteică.

95
LABORATOR 2

Izolarea şi purificarea nucleilor hepatici într-un mediu


de suspendare cu acid citric

Tehnicile de izolare a nucleilor, numeroase şi variate, pot fi împărţite


în două categorii şi anume:
- tehnici de izolare a nucleilor în medii apoase;
- tehnici ce utilizează medii de suspendare.
Tehnicile ce utilizează medii de suspendare apoase prezintă o serie
de avantaje: păstrează integritatea structurală a organitului, proteinele
nucleare nu sunt denaturate, enzimele nu difuzează în mediul de suspendare
şi activitatea lor rămâne relativ nealterată.

Materiale necesare:
- soluţie de acid citric 1,5%;
- soluţie de acid citric 2,5%;
- soluţie de sucroză 0,88M;
- soluţie de sucroză 0.25M sau alcool etilic absolut;
- alcool metilic 960 sau alcool etilic absolut;
- eprubete, omogenizator;
- lame, lamele, tifon, baghetă de sticlă;
- pâlnie de sticlă, tifon, cutii Petri, pahare Berzelius de 150 ml;
- bisturiu, foarfece;
- baloane Erlenmayer de 100-200 ml;
- centrifugă;
- material biologic (ficat).

Modul de lucru:
Ficatul animal (cobai, şobolan, pui etc.), recoltat proaspăt, se
plasează într-un vas şi se mărunţeşte cu un bisturiu sau foarfece. Ficatul
mărunţit se spală cu o soluţie de acid citric 2,5% la temperatură scăzută
(40C). Operaţia de spălare se repetă de 3 ori, facilitând îndepărtarea
hematiilor.
Ţesutul hepatic se introduce apoi într-un omogenizator Potter 2-3
minute, peste care se adaugă soluţie de acid citric 2,5% la pH= 2,3. Volumul
mediului de suspendare variază în funcţie de cantitatea ţesutului de cercetat.
Ţesutul se omogenizează 2-3- minute la rece, după care se ajustează
volumul final al mediului. Omogenatul se filtrează apoi printr-un tifon.
Pentru a uşura trecerea prin tifon se amestecă uşor omogenatul cu o baghetă.

96
Dacă tifonul se îmbibă puternic cu material, se înlocuieşte.
Omogenatul celular se centrifughează la o turaţie de 3000 g/min, timp de 10
minute. Supernatantul se aruncă, iar sedimentul se resuspendă în 25 ml
soluţie de sucroză 0,24 M în acid citric 1,5% la rece (40C). Se
centrifughează din nou la 3000 g/minut timp de 10 minute, nucleii
acumulându-se în sediment. Ei se suspendă într-o soluţie de sucroză-acid
citric (5 ml soluţie).

Rezultate:
Nucleii izolaţi prin acest procedeu au o puritate de 80%.
În vederea purificării ulterioare se utilizează eprubete de centrifugă
cu o capacitate de 25 ml, în care se toarnă 15 ml soluţie de sucroză 0,88 M
în acid citric 1,5%. Peste soluţia de sucroză se stratifică 3 ml suspensie de
nuclei. Turnarea se face cu o pipetă al cărui vârf se plasează pe peretele
eprubetei, la nivelul sucrozei. Se centrifughează la 9000 g/minut, timp de 10
minute. Pe o lamă de microscop se pune o picătură de suspensie nucleară,
către una dintre extremităţi şi se execută un frotiu (se prinde picătura la
unghiul format de lamă şi lamelă şi se deplasează lamela către celălalt capăt
al lamei). Frotiul se usucă la aer 10 minute. Se examinează la microscop.
Nucleii apar sferici sau ovalari, înconjuraţi de anvelopa nucleară, cu unul
sau doi nucleoli mai refringenţi decât nucleoplasma (fig. 29). Pe acest frotiu
se pot executa coloraţii specifice ( Feulgen, May-Grünwald Giemsa, Benoit
etc.).

Fig. 29. Nucleul interfazic evidenţiat la microscopul fotonic

97
LABORATOR 3

Izolarea şi purificarea ADN-ului nuclear

Tehnica permite izolarea ADN-ului din celule hepatice, timice,


celule în cultură, nuclei izolaţi (vezi lab. nr.2), etc.

Materiale necesare:
- NaCl 0,9%, NaCl cristalizată, dodecilsulfat de sodiu 5%;
- alcool etilic de 450, 900, 950, acetonă, agitator magnetic, baghetă
de sticlă;
- cilindru gradat de 25 ml, eprubete, pahare Berzelius de 100-150
ml;
- hârtie de filtru, tifon, pipete de 5 sau 10 ml, material biologic.

Modul de lucru:
Suspensia nucleară obţinută prin tehnica descrisă anterior, se
suspendă în 100 ml NaCl 0,9%, la care se adaugă 9 ml dintr-o soluţie de
dodecilsulfat de sodiu 5% în alcool etilic 450. Soluţia se agită pe un agitator
magnetic timp de 1-2 ore, timp în care ADN-ul trece în soluţie.
Dodecilsulfatul de sodiu (DDSA) are rolul de a sparge membranele nucleare
eliberând ADN-ul din complexul cu proteinele. Proteinele se alterează şi
precipită. Se adaugă NaCl cristalizată până când concentraţia salină a
soluţiei devine 1M (4,04g). Concentraţia crescută de sare facilitează
disocierea acizilor nucleici de proteine. După adăugarea suplimentară de
sare se continuă agitarea încă 30 de minute. Soluţia nucleară, vâscoasă, se
centrifughează la 3000 g/minut timp de 20 de minute. Supernatantul obţinut
se precipită cu un volum egal de etanol 950, într-un cilindru gradat. Alcoolul
se toarnă peste supernatant cu multă atenţie, astfel încât să plutească peste
faza apoasă. Cu o baghetă de sticlă foarte curată se amestecă cele două faze.

Rezultate:
ADN-ul precipită sub forma unor fire, care se răsucesc pe baghetă.
Agitarea continuă până când cele două faze sunt complet amestecate şi tot
ADN-ul este prins pe baghetă. Deoarece ADN-ul conţine încă destule
proteine, operaţia de dizolvare în NaCl-DDSA şi precipitare cu alcool se
repetă de două ori. ADN-ul prins pe baghetă se usucă în alcool de 700,
alcool de 900 şi acetonă. După extracţie, raportul extincţiilor citite la
spectrofotometru 230/260=0,37 indică o izolare bună a ADN-ului (fig.30).

98
Pentru o purificare completă se fac tratamente ulterioare cu pronază şi
ARN-ază.

Fig.30. Structura ADN-ului (schemă)

99
LABORATOR 4

Izolarea mitocondriilor din ficat

Mitocondriile sunt organite permanente ale celulei, răspândite în


toată masa citoplasmatică, mai refrigerente decât ea, cu un diametru de 0,3-
10 microni lungime; lungimea condriocontelor ajunge până la 30 microni.
În celula vie se constantă că elementele condriomului sunt mai puţin
refrigerente ca celelalte organite citoplasmatice, ceea ce face practic
imposibilă observarea lor la microscopul obişnuit, însă se observă destul de
net în contrast de fază.
Studierea lor în microscopia fotonică este mult uşurată prin folosirea
coloratului vital verdele Janus B., care colorează în verde numai
mitocondriile. Această coloraţie se atribuie fixării verdelui Janus pe
flavoproteinele din mitocondrie, care datorită conţinutului ei ridicat de
citocromoxidază împiedică reducerea colorantului în leucoderivat,
menţinându-l astfel în forma lui oxidată, iar mitocondria apărând colorată în
verde.
Lipsa acestor enzime din citoplasmă şi din celelalte organite celulare
explică de ce în coloraţiile vitale, apar colorate în verde numai elementele
condriomului.

A B

Fig. 31. A - schema unei mitocondrii: 1- membrana externă;


2- membrana internă; 3- cristă; 4- matrix; 5- spaţiul perimitocondrial;
6- ADN; 7- ribozomi; 8- oxizomi
B – mitocondria văzută la microscopul electronic

100
Materiale necesare:
- acid citric 2,5%;
- soluţie de sucroză conc. 1-2 M;
- tampon TRIS-HCI 0,01 M, pH=7,2;
- omogenizator Potter;
- foarfecă (bisturiu), pensă, cutie Petri;
- pahar Berzelius de 150 ml, pipetă de 5 ml.

Modul de lucru:
Ficatul de animal proaspăt se plasează la rece (40C), apoi se
mărunţeşte cu o foarfecă sau un bisturiu foarte bine. Ţesutul se spală cu o
soluţie rece (40C) de acid citric 2,5% după care se introduce într-un
omogenizator Potter, de asemenea, răcit. Ficatul se omogenizează timp de 1-
2 minute la rece (40C), într-un volum mic (2 ml) de soluţie de acid citric
2,5% după care se diluează la un raport de 1/10g/v.
Nucleii şi resturile de membrane sunt îndepărtate prin centrifugare la
rece, la o viteză de 4000g/min. timp de 30 de minute. Sedimentul care
conţine nuclei, resturi de membrane, se aruncă, iar supernatantul se
păstrează.
Mitocondriile din suparnatant sunt colectate printr-o centrifugare la
7000g/min timp de 30 de minute. Pentru o bună spălare a mitocondriilor,
sedimentul mitocondrial se resuspendă în 5 ml soluţie acid citric 2,5% şi se
centrifughează din nou la 7000 g/min. timp de 30 de minute. Operaţia se
repetă de două ori.
Mitocondriile obţinute prin acest procedeu reprezintă o fracţie
mitocondrială brută, care conţine pe lângă mitocondrii, lizozomi şi
peroxizomi.
Purificarea ulterioară a acestei fracţii se face prin ultracentrifugare la
100.000 g/min. timp de 3 ore, în gradient de sucroză. Astfel, într-o eprubetă
de centrifugare se obţine un gradient de densitate discontinuu. În acest scop,
se pipetează cu multă atenţie 3 ml de sucroză, din soluţii cu concentraţii
molare între 1-2 M, în ordine descrescătoare.
Suspensia brută de mitocondrii se plasează deasupra gradientului de
sucroză, suspendată într-un volum mic din soluţia de acid citric 2,5%. Prin
centrifugare la viteză mare (100.000 g/min.) timp de 3 ore, cele trei fracţii
celulare se separă.
Fracţiile sunt colectate din eprubete cu o seringă, sunt diluate cu o
soluţie tampon TRIS-HCI 0,01 M, pH=7,2, până când concentraţia în
sucroză scade la o valoare de 0,25 M.

101
Rezultate:
Mitocondriile (fig.31) sunt depuse în sediment, prin centrifugare la
10.000 g/min. timp de 10 minute. Ele sunt suspendate într-un volum final
adecvat (2 ml) cu soluţia de acid citric 2,5%.
Pe frotiul executat din sedimentul mitocondrial, uscat la aer şi fixat
cu fixatori mitocondriali (aldehidă formică neutralizată de bicromat de
potasiu, acid osmic, biclorură de mercur, etc.), se pot face coloraţii specifice
cu hematoxilină, fucsină Altmann, verde Janus B., etc.

102
LABORATOR 5

Coloraţia Feulgen cu hidroliză acidă pentru evidenţierea ADN

Această coloraţie reprezintă una din cele mai precise reacţii de


identificare a acidului dezoxiribonucleic (ADN). Ea se bazează pe
eliberarea, în urma unui proces de hidroliză acidă, a grupărilor aldehidice
din molecula de ADN.
Reactivul Schiff care conţine un derivat incolor al fucsinei, se leagă
de grupările aldehidice şi formează un compus colorat în roşu-violaceu, care
poate fi vizualizat.
Pentru buna reuşită a coloraţiei este necesar ca hidroliza acidă să fie
făcută în timpul şi în condiţiile optime, iar reactivul Schiff să fie de bună
calitate.

Materiale necesare:
- fucsină bazică, verde lumină, acid clorhidric normal;
- metabisulfit de sodiu (sau potasiu), cărbune activ;
- alcool metilic, termometru de laborator de 0-1000C;
- baloane de 200 şi 500 ml, pipete gradate de 5 şi 10 ml;
- cilindri gradaţi de 25 şi 100 ml, pahare Borrel;
- pahare Berzelius, pâlnie de sticlă, hârtie de filtru;
- hârtie neagră, sticlă cu dop rodat de 250 ml, mojar cu pistil.

Pregătirea reactivilor:

Reactivul Schiff
Se mojorează 1 g fucsină bazică; pulberea se trece într-un balon de
sticlă rezistentă la foc. În balon se toarnă peste fucsină 200 ml apă distilată
clocotită. Se continuă fierberea la flacără mică, încă 5 minute. Se lasă
soluţia să se răcească la 500C se filtrează. În filtrat se adaugă 30 ml acid
clorhidric normal.
Se lasă soluţia să se răcească la 250C, după care se dizolvă 3 g
metabisulfit de potasiu sau sodiu. Soluţia se păstrează timp de 24 de ore la
rece, într-o sticlă bine închisă, de culoare brună sau învelită într-o pungă
neagră de material plastic. În soluţie se adaugă 0,5 g cărbune activ, se agită
puternic şi se filtrează printr-o hârtie de filtru rapidă. Atât pâlnia cât şi sticla
în care se filtrează reactivul Schiff vor fi foarte curate.
Reactivul Schiff, care se prezintă ca un lichid perfect incolor, va fi
păstrat tot timpul în frigider, într-o sticlă brună închisă ermetic. Acest

103
reactiv va fi folosit şi pentru evidenţierea histochimică a glucidelor prin
reacţia PAS.

Apa sulfuroasă
Se dizolvă 0,5 g metabisulfit de sodiu în 4,5 ml apă distilată. Soluţia
de metabisulfit de sodiu 10% se toarnă în 100 ml apă distilată, peste care se
adaugă 6 ml acid clorhidric normal. Soluţia se prepară în momentul folosirii.

Soluţia de verde de lumină


- se dizolvă 0,1 g verde lumină în 500 ml apă distilată.

Modul de lucru:
Frotiurile sau amprentele se usucă la aer, apoi se fixează timp de 30
secunde în alcool metilic şi se usucă la aer.
Se pun la încălzit la termostat, la 56-60 0C, pahare Borrel cu acid
clorhidric închise ermetic. Se aşteaptă circa o oră, până când baia de acid
clorhidric normal a atins temperatura termostatului.
Preparatele se hidrolizează timp de 12 minute la 56 0C sau 5 minute
0
la 60 C. În baia de acid clorhidric normal; sunt clătite apoi în acid
clorhidric normal la temperatura camerei.
Preparatele se colorează timp de o oră cu reactivul Schiff la
temperatura camerei.
Pentru a atinge această temperatură reactivul Schiff este scos din
frigider cu o oră înainte. Preparatele colorate se spală un minut cu apă
sulfuroasă.
Se colorează citoplasma cu verde lumină 1/5000 timp de 10 secunde,
apoi preparatele se spală şi se usucă la aer.

Rezultate:
Cromatina nucleară (ADN) se colorează în roşu de nuanţe diferite, în
funcţie de concentraţia ADN din nucleii celulelor. Nucleolii nu se colorează.
Citoplasma este verzuie (fig.32).

104
Fig. 32. Nuclei interfazici şi în diviziune coloraţi cu reactivul Schiff

105
LABORATOR 6

Coloraţia cu verde-metil şi pironină pentru evidenţierea


selectivă a acizilor nucleici

Aceasta este o coloraţie dublă, în care ADN-ul nuclear se colorează în


verde-albăstrui cu verde de metil, iar ARN-ul nuclear şi citoplasma se
colorează în roz.

Materiale necesare:
- verde de metil, pironină, acid acetic glacial;
- acetat de sodiu cu trei molecule de apă cristalizare;
- cloroform, alcool absolut, alcool etilic de 960C;
- alcool butilic, xilen, balsam de Canada;
- balanţă, cutie cu greutăţi, pipete gradate de 1,5 şi 10 ml;
- cilindri gradaţi de 25, 50 şi 100 ml;
- balon de sticlă de 200 ml rezistent la flacără;
- pâlnie de separare de 200 ml;
- hârtie indicatoare de pH pentru domeniul acid;
- pahare Borrel, pensă mare, tifon.

Pregătirea reactivilor:

Soluţia-tampon acetat 0,1 M cu pH=4,4


Se prepară două soluţii în modul următor:
- soluţia A: se diluează 1,2 ml acid acetic glacial în 100 ml apă
distilată;
- soluţia B: se dizolvă 2,7 g acetat de sodiu cu trei molecule de apă în
100 ml apă distilată.
Prin amestecul a 62 ml din soluţia A cu 38 ml din soluţia B se
realizează 100 ml soluţie tampon 0,2 M. Această cantitate se diluează cu 10
ml apă distilată şi se obţine soluţia tampon acetat 0,1 M cu pH=4,4.

Purificarea verdelui de metil


Verdele de metil se transformă spontan în violet de metil. Se admite
că circa 20% din pulberea de verde de metil este formată din violet de metil.
Separarea acestor substanţe se realizează pe baza faptului că violetul de
metil este solubil în cloroform. Se fierbe într-un balon de sticlă 100 ml
soluţie tampon acetat 0,1 M. Când soluţia clocoteşte se ia de pe foc şi se
adaugă 0,63 g verde de metil nepurificat. Se aşteaptă răcirea soluţiei, care

106
este apoi trecută printr-o pâlnie de separare. Se adaugă peste soluţie 30 ml
cloroform şi se agită puternic pâlnia de separare, având grijă să se susţină
fiecare dop cu câte o mână. Se aşteaptă separarea cloroformului colorat în
violet de soluţia de verde de metil. Se lasă să se scurgă cloroformul, care
fiind mai greu decât apa, ocupă partea de jos a pâlniei de separare. Se
adaugă încă 30 ml cloroform. Operaţia se repetă până când cloroformul nu
se mai colorează. După ultima decantare, soluţia conţine circa 0,5% verde
de metil purificat.

Soluţia de colorare
În soluţia de verde de metil purifiat se adaugă 0,2 g pironină Y şi se
obţine soluţia de verde de metil-pironină.

Fixatorul Carnoy
Se obţine prin amestecul a 6 părţi alcool absolut cu 2 părţi cloroform
şi 1 parte acid acetic glacial; fixatorul se prepară în momentul folosirii.

Modul de lucru:
Frotiurile şi amprentele sunt fixate după uscare, cu fixatorul Carnoy,
timp de 10 minute. Fixarea se realizează prin cufundarea preparatelor în
pahare Borrel, în care s-a turnat fixator proaspăt. Se spală lamele timp de 2
secunde în alcool etilic absolut. Se spală lamele câteva secunde în apă
distilată apoi se lasă să se usuce.
Lamele uscate sunt colorate timp de 30 secunde cu verde de metil-
pironină; lamele colorate se spală câteva secunde în apă distilată, după care
sunt puse la uscat în poziţie verticală. Imediat după uscare se face
diferenţierea în alcool butilic câteva secunde.
Se clarifică în xilen şi se montează în balsam de Canada.

Rezultate:
ADN-ul nuclear apare colorat în verde sau în albastru-verzui.
Nucleolii şi citoplasma bazofilă se colorează în roz (fig. 33).

107
Fig. 33. Coloraţia cu verde-metil şi pironină: nucleul (ADN-ul nuclear)
apare colorat în albastru-verzui, nucleolul şi citoplasma în roz

108
LABORATOR 7

Colorarea proteinelor cu albastru de bromfenol mercuric

Albastru de bromfenol se fixează de structurile proteice prin


intermediul mercurului, care are rolul de mordant.
Mercurul se leagă de proteine prin intermediul grupărilor carboxil,
sulfhidril şi amino libere.

Materiale necesare:
- fixator Carnoy, albastru de bromfenol mercuric 0,1%;
- alcool etilic 95%, clorură mercurică 0,1%, roşu neutru;
- soluţie-tampon fosfat 0,1 M cu pH=7,0;
- lame, pipete de 5-10 ml, hârtie de filtru, sticlă picătoare.

Modul de lucru:
Fronturile celulare sunt uscate la aer şi fixate în fixator Carnoy, apoi
sunt incubate într-un amestec format din albastru de bromfenol mercuric
0,1% preparat în alcool etilic de 95% şi clorură mercurică 0,1% (v/v), timp
de 10 minute. Excesul de colorant se îndepărtează prin spălări cu alcool de
95% din sticlă picătoare. Se execută apoi o coloraţie cu roşu nuclear timp de
10 minute pentru coloraţia nucleilor.
Colorantul virează spre albastru prin spălarea lamelor cu apă sau
soluţie-tampon fosfat 0,1 M cu pH=7,0.

Rezultate:
Proteinele din celule, în funcţie de cantitatea lor şi afinitatea pentru
colorant, apar colorate în albastru deschis sau închis. Uneori se pot observa
tente violacee cu nuanţe închise. În figura 34 este prezentată structura
spaţială cuatenară a unei proteine (hemoglobina).

109
Fig. 34. Structura cuaternară a unei proteine (hemoglobina)

110
LABORATOR 8

Evidenţierea glicogenului prin reacţia PAS

Glicogenul este un polizaharid caracteristic pentru celula animală. El


reprezintă forma de depozitare a glucozei, principala substanţă energetică a
celulei. Glicogenul celular se evidenţiază prin reacţia PAS. Reacţia PAS
(Periodic Acid Schiff) decurge în linii mari astfel: acidul periodic, care este
o substanţă oxidată, transformă grupele de tip glicol (CHOH-CHOH) ale
glicogenului în grupe aldehidice (CHO-CHO). Aceste grupe reacţionează cu
fucsina şi acidul sulfuros din reactivul Schiff, astfel că în final, glicogenul
apare colorat în roşu. Pentru reuşita reacţiei este necesară prezenţa unui
număr suficient de mare de grupări aldehidice, care să asigure vizualizarea
unui produs colorat. Edificiul macromolecular nu trebuie distrus, deoarece
ozele simple nu sunt colorabile. Această metodă dă rezultate deosebit de
spectaculoase pe amprentele de ficat, deoarece hepatocitele sunt principalele
depozitare ale glicogenului în organism.

Materiale necesare:
- acid periodic, reactivul Schiff, acid clorhidric normal;
- metabisulfit de sodiu, hematoxilină, oxid roşu de mercur;
- alaun de potasiu (sulfat de potasiu şi aluminiu), acid acetic glacial;
- pipete gradate de 5 şi 10 ml, cilindri gradaţi de 25 şi 100 ml;
- baloane Erlenmayer de 200 şi 500 ml, pahare Borrel, vas Laveran;
- alcool etilic absolut, alcool metilic.

Pregătirea reactivilor:

Soluţia de acid periodic 1%


Se cântăreşte 1 g acid periodic şi se dizolvă în 100 ml apă distilată.

Apa sulfuroasă
Această soluţie este necesar să fie proaspătă. Este nevoie de circa
300 ml soluţie. Pentru această se dizolvă 1,5 g metabisulfit de sodiu în 13,5
ml apă distilată şi se obţine o soluţie 10%. Această soluţie se diluează în 300
ml apă distilată.
Peste amestec se adaugă 18 ml acid clorhidric normal. Balonul în
care s-a preparat această soluţie se acoperă până în momentul folosirii cu un
dop uşor de vată.

111
Hermalaunul Harris
Se dizolvă 1 g hematoxilină în 100 ml alcool etilic absolut. Separat,
se dizolvă 20 g alaun de potasiu în 200 ml apă distilată şi se încălzeşte. Se
amestecă cele două soluţii şi se fierb. Se scoate din flacără şi se adaugă cu
multă atenţie 0,5 g oxid roşu de mercur. Se mai lasă să fiarbă timp de 5
minute. Se pune balonul în apă rece şi se răceşte repede; se filtrează şi se
adaugă 2 ml acid acetic glacial. Se poate folosi imediat. Soluţia de hemalaun
Harris se păstrează timp de 1-2 luni, însă trebuie filtrată înainte de fiecare
întrebuinţare.

Modul de lucru:
Frotiurile sau amprentele uscate la aer se fixează timp de 15 minute
în alcool metilic, în pahare Borrel. După fixare, preparatele se hidratează
timp de 3 minute în apă distilată.
Se realizează o oxidare a preparatelor timp de 7 minute în acid
periodic 1%. Preparatele se spală apoi în 2-3 băi de apă distilată.
Se face o baie în apă sulfuroasă, timp de 1 minut. Preparatele sunt
trecute apoi într-o baie scurtă de 20-30 secunde în reactivul Schiff. Baia se
realizează la temperatura camerei, însă la întuneric, într-un pahar Borrel
acoperit cu hârtie neagră.
Preparatele se trec în trei băi de apă sulfuroasă, a câte 5 minute
fiecare baie. Este de preferat ca lamele să rămână într-un pahar Borrel şi la 5
minute să se reînnoiască apa sulfuroasă.
Se face o clătire cu apă distilată, urmată de o spălare în apă
curgătoare timp de 10 minute.
Se colorează nucleii cu hemalaun Harris timp de 3 minute; se spală
preparatele în apă curgătoare timp de 3 minute şi apoi se usucă la aer, la
temperatura camerei.

Rezultate:
Nucleii sunt coloraţi în albastru-negru. Glicogenul se colorează
intens în roşu (fig. 35).

112
Fig.35. Coloraţia PAS pentru glicogen şi glicoproteine pe ţesut glandular
(parotidă)

113
LABORATOR 9

Evidenţierea histochimică a lipidelor

Lipidele sunt constituenţi chimici care intră în alcătuirea


membranelor celulare şi a organitelor celulare. Ele pot fi depozitate ca
material de rezervă în anumite tipuri de celule. Sub diferite forme, lipidele
pot constitui produse de secreţie sau produse catabolice ale metabolismului
celular. Evidenţierea specifică a lipidelor cu Sudan negru B se bazează pe
faptul că acesta este solubil în lipide.

Materiale necesare:
- sudan negru B, fenol, fosfat disodic;
- alcool absolut, alcool de 700, formol;
- pahare Borrel, cilindri gradaţi de 50 şi 100 ml;
- pipetă gradată de 10 ml, flacoane Erlenmayer de 200 ml;
- placă (cutie) Petri, hârtie de filtru;
- colorantul concentrat Giemsa.

Pregătirea reactivilor:

Soluţia-tampon
Se dizolvă 16 g fenol în 30 ml alcool absolut. Separat se dizolvă 0,3
g fosfat disodic în 100 ml apă distilată. După completa dizolvare se
amestecă cele două soluţii.

Soluţia-stoc de Sudan negru B


Se dizolvă 0,3 g Sudan negru B în 100 ml alcool absolut. Flaconul
cu această soluţie alcoolică a colorantului se ţine la temperatura camerei,
acoperit cu un dop bun şi se agită din când în când. Completa dizolvare se
obţine după 2-3 zile.

Soluţia de lucru
Se amestecă 40 ml soluţie-tampon cu 60 ml soluţie-stoc de Sudan
negru B. Se omogenizează. Această soluţie de colorare îşi păstrează
proprietăţile 3-4 săptămâni.

Soluţia de colorare Giemsa 10%


În apă neutră se prepară după tehnica cunoscută. Iniţial se prepară
100 ml apă neutră prin amestecarea a 90 ml apă distilată cu 10 ml apă de

114
robinet. La 90 ml apă neutră se pun, picătură cu picătură, 10 ml soluţie
concentrată Giemsa. Soluţia de colorare se prepară strict înaintea folosirii.

Modul de lucru:
Amprente de măduvă roşie osoasă sau amprente de ficat se usucă la
aer şi se fixează în vapori de formol la temperatura camerei, timp de 10
minute într-o cutie Petri care are fixată în capac o hârtie de filtru îmbibată în
formol concentrat. Se evită contactul direct al preparatelor cu formolul.
Coloraţia se realizează prin imersionarea preparatelor timp de o oră
în soluţie de Sudan negru B. Preparatele se spală în alcool 700 până nu se
mai văd ,,nori“ de colorant. Preparatele se spală apoi cu apă, se colorează cu
soluţie Giemsa 10% timp de 30 minute, se spală cu apă şi se usucă la aer.

Rezultate:
Granulele sudanofile (lipidele) se colorează în albastru (fig.36).

A B

Fig. 36. A - Ţesut adipos subcutanat colorat cu hematoxilină Erlich –


săgeata indică nucleii lipocitelor; citoplasma este redusă la o bandă subţire
în jurul periferiei celulare; solvenţii au îndepărtat materialul lipidic din
celulele grase.
B – granule lipidice colorate cu Sudan.

115
LABORATOR 10

Evidenţierea fierului feric (Fe3+)

În organismele vii fierul este un element de importanţă majoră. El


este localizat în pigmenţii respiratori: hemoglobină, mioglobină şi
citocromi. Sub această formă fierul nu poate fi pus în evidenţă prin metode
obişnuite de colorare. În procesul de reciclare al fierului în organism, el se
concentrează sub formă ionică în celulele cu capacitate fagocitară din ficat,
splină şi măduva roşie a oaselor. În supra-încărcare experimentală cu fier, în
anemii provocate în mod experimental la animalele de laborator, precum şi
în maladiile cu complicaţii hemolitice, fierul se acumulează în cantităţi mari
în ficat, splină, măduva roşie a oaselor şi ganglionii limfatici. Majoritatea
depozitelor de fier din organism sunt formate din fier feric (Fe3+). Fierul
feros (Fe2+) se întâlneşte mai rar.
Coloraţia fierului se poate studia pe amprente şi fronturi provenite de
la animale sănătoase şi eventual de la animale la care cu 2-3 zile înainte s-a
făcut o injecţie intraperitoneală cu fier polimaltozat sau polizaharat
injectabil. Cu ajutorul unei fiole de 1 ml se vor injecta 4 şoareci de
laborator.

Materiale necesare:
- alcool metilic, ferocianură de potasiu;
- acid clorhidric concentrat;
- coloranţii May Grunwald şi Giemsa;
- pahare Berzelius sau Borrel, cilindri gradaţi de 100 ml;
- pipete gradate de 2 şi 10 ml, baie Laveran.

Pregătirea reactivilor:

Soluţia de acid clorhidric 2%


Se diluează 1 ml acid clorhidric concentrat în 50 ml apă distilată.

Soluţia de ferocianură de potasiu 2%


Se dizolvă 1 g ferocianură de potasiu în 50 ml apă distilată.

Soluţia de lucru
Se amestecă cele două soluţii preparate mai înainte exact în
cantităţile realizate. Se obţine o soluţie clorhidrică de ferocianură de potasiu
care se filtrează şi se foloseşte imediat.

116
Soluţia de colorare May Grunwald 1/1 în apă neutră
Se prepară strict înaintea folosirii prin diluarea unui volum de soluţie
concentrată cu un volum de apă neutră. Se prepară circa 10 ml soluţie de
colorare pentru 5 lame.
Apă neutră se prepară prin amestecarea a 9 volume de apă distilată
cu 1 volum de apă de robinet.

Modul de lucru:
Frotiurile şi amprentele uscate la aer se fixează în alcool metilic timp
de 1 minut, apoi se usucă la aer.
Se scufundă lamele în soluţie clorhidrică de ferocianură de potasiu
timp de 15 minute, după care se spală în apă curentă de robinet timp de 10
minute.
Se colorează timp de 5 minute în soluţie de colorare May Grunwald
1/1.
Se colorează timp de 30 minute în soluţie de colorare Giemsa 10%.
Se spală în curent de apă de robinet apoi se usucă la aer.

Rezultate:
Granulele sau aglomeraţiile de fier feric (Fe+++) sunt colorate în
verde. Nucleii sunt coloraţi în albastru; citoplasma apare în nuanţe de
albastru-palid sau roz (fig. 37).

Fig. 37. Secţiune prin rinichi de broască tratat cu fungicidul Champion


50WP. Se observă depozitele de fier colorate în verde-albăstrui
(PĂUNESCU şi PONEPAL, 2011)

117
LABORATOR 11

Evidenţierea peroxidazelor

Peroxidazele sunt enzime care participă în procesele oxidative ale


multor tipuri de celule. Zonele cu activitate peroxidazică din celule reţin
benzidina şi o oxidează în prezenţa apei oxigenate. Benzidina oxidată are o
culoare galben-brună. În fronturile şi amprentele de măduvă roşie a osului,
din organele limfoide şi sânge, leucocitele polimorfonucleare şi macrofagele
demonstrează activitatea peroxidazică. Eritrocitele, care conţin
hemoglobină, demonstrează o activitate pseudoperoxidazică.

Materiale necesare:
- alcool metilic, alcool etilic 96%, benzidină;
- perhidrol 30%, soluţie concentrată Giemsa;
- balanţă, cutie cu greutăţi;
- pipete gradate de 10 ml, cilindri gradaţi de 100 ml;
- baloane Erlenmayer de 200 ml, sticle brune cu dop rodat de 100 ml;
- pipete gradate de 2 şi 5 ml, sticluţă de penicilină foarte curată;
- pipete Pasteur, pahare Borrel sau baie Laveran, stativ de colorare.

Pregătirea reactivilor:

Soluţia alcoolică de benzidină 0,6%


Se dizolvă 0,3 g benzidină în 50 ml de alcool etilic de 96%. Soluţia
se conservă luni de zile în sticlă brună închisă ermetic.

Soluţia de apă oxigenată 10% în alcool


Se dizolvă 10 ml perhidrol în 90 ml alcool etilic 960. Se conservă
luni de zile în sticlă brună închisă ermetic.

Reactivul pentru colorare


Se prepară strict înaintea colorării, prin amestecarea într-o sticluţă de
penicilină foarte curată a 1 parte soluţie alcoolică de benzidină 0,6% cu 2,5
părţi soluţie alcoolică de apă oxigenată. Pentru 4-5 lame se prepară 7 ml
reactiv de colorare.

Soluţia Giemsa 10%


Se prepară după tehnica cunoscută, înaintea colorării.

118
Modul de lucru:
Se fixează frotiurile sau amprentele uscate la aer în alcool metilic
timp de 1 minut. Peste preparatele aşezate orizontal pe un stativ de colorare
se picură cu o pipetă Pasteur curată amestecul alcoolic de benzidină şi
perhidrol preparat. Coloraţia durează 3 minute.
Preparatele se scurg rapid şi sunt spălate într-un vas Laveran la apă
curgătoare timp de 5 minute. Se controlează coloraţia la microscop. Dacă s-
au format precipitate aciculare, lamele sunt ţinute 10 minute într-o baie de
alcool metilic. Se colorează în baia Laveran timp de 30-45 minute în soluţia
Giemsa 10%. Se spală preparatul colorat în flux moderat de apă de robinet
apoi se usucă la aer.

Rezultate:
Eritrocitele şi zonele de activitate peroxidazică din leucocite se
colorează în nuanţe de gălbui sau brun-gălbui. Eritroblaştii se colorează în
verde din cauza amestecului culorii gălbui a hemoglobinei cu nuanţele de
albastru care rezultă din colorarea ribozomilor citoplasmatici cu colorantul
Giemsa. Nucleii se colorează în albastru (fig. 38).

Fig. 38. Reacţia pozitivă a peroxidazelor în seria granulocitară

119
LABORATOR 12

Evidenţierea fosfatazei acide

Fosfataza acidă este o enzimă cu localizare predominant lizozomală


(fig. 39). Ea se află în cantitate mare în lizozomi, în fagozomi şi în vacuolele
de pinocitoză.
În cazul frotiurilor, fosfataza acidă poate fi identificată în leucocitele
polimorfonucleare neutrofile şi în monocitele macrofage. În amprentele de
măduvă roşie se pot identifica zone cu activitate acidfosfatazică în celulele
reticulare din măduva, în celulele seriei mielocitare în osteoclaste şi
megacaritocite. În amprentele de ficat se observă activitatea enzimatică în
hepatocite şi mai ales în celulele Kupffer.
Reacţia se bazează pe formarea ionului fosfat şi pe legarea sa cu un
precipitat vizibil. În prezenţa beta-glicerofosfatului de sodiu la pH acid (4,5-
5), fosfataza acidă generează glicerină şi ortofosfat de sodiu. Acesta
reacţionează cu ionii de plumb, care participă în punctele de hidroliză
enzimatică. Fosfatul de plumb cu polisulfura de amoniu, formează sulfura
de plumb de culoare neagră, exact în zonele cu activitate enzimatică din
celule.

Materiale necesare:
- beta-glicerofosfat de sodiu, azotat de plumb, soluţie Giemsa
concentrată;
- sulfură de amoniu proaspătă (preparată în laborator), formol;
- acid acetic glacial, acetat de sodiu cu trei molecule de apă de
cristalizare;
- balanţă, cutie cu greutăţi, pipete gradate de 2 ml şi 10 ml, cilindri
gradaţi de 100 ml;
- baie Laveran, pahare Borrel, cutie Peri, hârtie de filtru, pâlnie de
sticlă;
- baloane Erlenmayer şi sticle de diferite capacităţi pentru soluţii.

Pregătirea reactivilor:

Soluţia-tampon acetat cu pH=4


Se prepară din două soluţii diferite în următorul mod:
- soluţia A: se diluează 1,2 ml acid acetic glacial în 100 ml apă
distilată;

120
- soluţia B: se dizolvă 2,7 g acetat de sodiu cu trei molecule de apă de
cristalizare în 100 ml apă distilată;
Pentru obţinerea unei soluţii-tampon cu pH=4 se amestecă: 80 ml
din soluţia A cu 20 ml din soluţia B.

Soluţia de beta-glicerofosfat de sodiu 2%


Se prepară prin dizolvarea a 0,5 g glicerofosfat de sodiu în 25 ml apă
distilată.

Soluţia de azotat de plumb 2%


Se dizolvă 2,5 g azotat de plumb în 25 ml apă distilată.

Soluţia de incubare
Se amestecă 30 ml soluţie-tampon acetat cu pH=4, cu 10 ml soluţie
beta-glicerofosfat de sodiu 2%, cu 10 ml soluţie azotat de plumb 2% şi cu
50 ml apă distilată. După preparare, soluţia de incubare se ţine timp de 24
ore la 370C şi se filtrează înainte de folosire.

Soluţia diluată de sulfură de amoniu


Se diluează 1 ml sulfură de amoniu, preparată proaspăt, în 80 ml apă
distilată. Se ţine în pahar Borrel foarte bine închis.

Soluţia de colorare Giemsa 10% în apă neutră


Se prepară după tehnica cunoscută.

Modul de lucru:
Amprentele sau frotiurile sunt uscate la aer şi apoi fixate cu vapori
de formol concentrat timp de 3 minute, la temperatura camerei, iar apoi se
continuă fixarea în vapori de formol calzi la 370C încă 6 minute. Pentru
aceasta, lamele de fixat se pun într-o cutie Petri mare, al cărei capac este
tapetat cu hârtie de filtru îmbibată în formol concentrat.
Se spală preparatele timp de 5 minute în curent de apă de robinet.
Se incubează preparatele în soluţie de incubare, într-un vas Laveran
cu capac, timp de 6-8 ore la 370C, apoi se spală lamele 2 minute la curent de
apă de robinet.
Se virează 2 minute în soluţie diluată de sulfură de amoniu şi apoi se
spală din nou lamele în două băi de apă distilată a câte două minute fiecare.
Se colorează preparatele cu soluţia Giemsa 10% în apă neutră timp
de 30 minute.
Se spală în curent de apă de robinet şi se usucă la aer.

121
Rezultate:
Punctele de activitate acidfosfatazică sunt marcate printr-un
precipitat brun-negru. Nucleii apar coloraţi în albastru, iar citoplasma
diverselor tipuri de celule, în albastru palid sau roz.

Fig. 39. Lizozomii – sus - doi lizozomi secundari, cu un conţinut heterogen


(deoarece au început digestia); stânga jos - lizozm terţiar şi RER;
dreapta jos – corp multivezicular şi deasupra corpi reziduali

122
LABORATOR 13

Evidenţierea fosfatazei alcaline

Acestea sunt utile pentru diferenţierea leucozei mieloide cronice de


reacţiile leucemoide privind seria granulocitară. Activitatea fosfatazei
alcaline poate fi pusă în evidenţă numai în citoplasmă granulecitelor
neutrofile segmentare (care în mod normal au o activitate fosfatazică
alcalină slabă).
Monocitele, limfocitele, eozinofilele, plasmocitele şi celulele tinere
blastice, nu prezintă activitatea fosfatazică alcalină.
În reacţiile leucemoide privind seria granulocitară (infecţii acute,
infecţia tuberculoasă, carcinomatoza, anemii hemolitice, policitemii
adevărate, mieloscleroza) activitatea fosfatazei alcaline este mult
intensificată.
În leucoza mieloidă activitatea fosfatazei alcaline este slabă sau
lipseşte total; nu apar celule cu reacţii intens pozitive.

A. Metoda cu beta-glicerolfosfat

Principiu:
Constă în clivarea substratului glicerofosforic în prezenţa enzimei,
eliberând ioni fosforici care, cu nitratul de calciu formează fosfatul de
calciu. Fosfatul de calciu trece în fosfat de cobalt care, la rândul lui este
transformat în sulfură de cobalt de culoare neagră.

Materiale necesare:
- alcool metilic absolut (1/9), soluţie substrat tamponată;
- soluţie apoasă de safranină 2%;
- nitrat de calciu 2%, nitrat de cobalt 2%, sulfură de amoniu;
- cilindri gradaţi de 100 ml, baie Laveran, pahare Borrel;
- cutii Petri, pâlnie de sticlă, baloane Erlenmayer;
- pipete gradate, lame, lamele, sticle de diferite capacităţi pentru
soluţii;
- tifon, hârtie de filtru;
- materialul biologic.

Modul de lucru:
Fixarea frotiului de sânge sau măduvă se face, timp de 3 secunde,
într-un amestec format din 10 ml formol şi 90 ml alcool metilic absolut,

123
după care se spală câteva secunde. Se incubează timp de 2 ore la 370C într-o
soluţie de substrat tamponată, proaspăt preparată, care conţine:
- veronal sodic 10%.....................30,0 ml
- beta glicerofosfat de Na 3%......30,0 ml
- sulfat de magneziu M/10...........30,0 ml
- nitrat de calciu 2%.....................45,0 ml
- apă distilată .............................165,0 ml
După incubare urmează o spălare cu apă distilată în care s-au pus
câteva picături de nitrat de calciu 2%, timp de câteva secunde.
Se introduce lama într-o soluţie de 2% nitrat de cobalt şi se lasă 5
minute, apoi se spală temeinic cu apă, după care se acoperă frotiul cu o
soluţie slabă de sulfură de amoniu (circa 1 ml sulfură de amoniu la 80 ml
apă) lăsându-se în contract 10 secunde.
Se spală bine şi se colorează cu o soluţie apoasă de 2% safranină,
timp de 10 secunde. Se spală bine şi se usucă la aer.

B. Metoda cu naftilfosfat (metoda Kaplow)

Principiu
În această metodă este folosit ca substrat naftilfosfatul. Grupele de
naftol libere se unesc cu o sare de diazonium (Fast blue) formând un
precipitat insolubil, colorat bine, vizibil la locul acţiunii enzimei.

Materiale necesare:
- amestec metanol/formol (9-1), mediu de incubaţie;
- hidroxid de sodiu 1N, soluţie Hemalaun Mayer;
- cilindri gradaţi de 100 ml, baie Laveran, pahare Borrel;
- cutii Petri, hârtie de filtru, pâlnie de sticlă, baloane Erlenmayer;
- pipete gradate, lame, lamele, sticle de diferite capacităţi pentru
soluţii.

Modul de lucru:
Frotiurile proaspete sau amprentele ce urmează a fi studiate se
fixează 45 de secunde în metanol-formol (9/1=metanol 9 părţi şi formol 1
parte).
Fixatorul se păstrează la 40C. După fixare, preparatele se spală la apă
curentă timp de 45 de secunde.
Preparatele astfel fixate se ţin 2 ore la temperatura camerei în
următorul mediu de incubaţie, preparat:

124
- 0,2 M 2amino-2metil-1,3-propandiol …8,3 ml
- acid clorhidric M/10 …………………..1,7 ml
-apă distilată …………………………….33 ml
- natriu alfa metol acid fosfat ……………35 ml
- Fast blue RR ………………………… 35 ml
- pH-ul final al soluţiei de mai sus trebuie să fie peste 9. El se poate
ajusta cu câteva picături dintr-o soluţie de hidroxid de sodiu 1N.
După cele 2 ore de incubare preparatele trebuiesc spălate cu apă. Se
colorează apoi preparatele cu Hemalaun Mayer timp de 5 minute.
Pe scurt dăm câteva explicaţii şi indicaţii cu privire la prepararea a
două dintre soluţiile de mai sus.

Soluţia 0,2 M 2-amino-2metil-1,3propandiol


Cei 8,3 ml de 0,2 M 2-amino-2metil-1,3 propandiol se iau dintr-o
soluţie realizată prin dizolvarea a 10,5 g din substanţa menţionată în 500 ml
apă distilată.
O asemenea soluţie se păstrează la rece.

Hemalaunul Mayer
Se dizolvă într-un 1 litru de apă distilată caldă 50 g alaun de potasiu
şi 0,2 g de natriu iodat. Se agită. După răcire se adaugă 1 g hematoxilină.
Soluţia se lasă la temperatura camerei până apare o culoare violet-albastră.
Se adaugă 50 g clorat hidrat şi 1 g acid citric. Se agită din nou şi apoi se
fierbe timp de 5 minute. Se filtrează soluţia şi se păstrează la temperatura
camerei.

Rezultate:
În citoplasmă, zonele de activitate fosfatazică apar colorate în brun
mai mult sau mai puţin intens. Nucleul se colorează în albastru. Reacţia
fosftazei alcaline este negativă pentru limfocite, monocite, eozinofile,
plasmocite şi celule tinere blastice. În funcţie de numărul şi mărimea
granulelor, reacţia fosfatazică se notează: absentă, slab pozitivă, intens
pozitivă.
Se examinează 400 de granulocite neutrofile segmentate şi se
notează procentajul celulelor cu reacţia intens pozitivă, procentul celulelor
cu reacţie slab pozitivă şi al celulelor cu activitate fosfatazică absentă.

Interpretare:
În mod normal granulocitele segmentate neutrofile prezintă o slabă
activitate fosfatazică alcalină. În leucoza mieloidă activitatea fosfatazică
este mică sau absentă (fig. 40). Activitatea fosfatazică este mult crescută în
125
reacţiile leucemoidale privind seria granulocitară ca: infecţii tuberculoasă,
carcinomatoza, policitemia adevărată (fig. 41).
Pentru o exprimare cifrică a unei asemenea activităţi se foloseşte
metoda scorului, care se calculează după cum urmează: se adună cifra
procentuală a elementelor celulare aflate în activitate medie cu dublu
procentului de granulocite cu activitate crescută scorului.
La leucemia mieloidă cronică, fosfataza alcalină granulocitară se
apropie de 0, în timp ce în policitemia vera, de cele mai multe ori depăşeşte
100.
Scorul amintit este util în mod deosebit pentru identificarea
leucemiei nucleoide cronice şi a stărilor leucemoide, la aceasta din urmă
fiind normal sau crescut.
Exploatarea fosfatazei alcaline se mai practică în o serie de boli
infecţioase, hepatobiliare, obstetricale şi ginecologice, limfoproliferative, în
plasmocitemii, anemii, etc.

Fig. 40. Leucemie mieloidă cronică; se observă prezenţa unui megacariocit


şi a granulocitelor segmentate neutrofile care nu prezintă activitate
fosfatazică alcalină

126
Fig. 41. Policitemia vera – granulocite cu activitate fosfatazică
alcalină intens pozitivă

127
LABORATOR 14

Determinarea grupelor sanguine ABO

Descoperite de Landsteiner în 1901, grupele sanguine ABO se


caracterizează prin substanţe antigenice specifice de grupă denumite
izoaglutinogene şi anticorpi specifici sau izoaglutinine (fig. 42).
Aglutinogenele se află pe eritrocite, iar aglutininele în plasmă sau
ser. Prezenţa celor patru grupe arată o distribuţie inegală în rândurile
populaţiei. Datele statistice obţinute pe un număr de circa 40.000 donatori
(după V. Kondi, 1981) arată următoarele:
A=41%; B=15%; O=36%; AB=7%.
Determinarea grupelor sanguine ABO se face pe lamă sau în tub prin
două probe obligatorii:
- determinarea aglutinogenelor (proba Beth-Vincent)
- determinarea aglutininelor (proba Simonin)

Fig. 42. Distribuţia antigenilor pe membrana eritrocitară

Materiale necesare:
- seruri hemostat: 0 (anti-A, B), A (anti-B), B (anti-A);
- lame, pipetă, ac steril, vată, alcool;
- sânge de cercetat.

128
Determinarea aglutinogenelor (Proba Beth-Vincent)

Metoda pe lamă
Pe o lamă se pun succesiv, cu pipete diferite, câte o picătură de ser
hemostat în ordinea următoare: 0 la stânga, A la mijloc, B la dreapta.
Cu colţul unei lame se adaugă o mică cantitate de sânge pe fiecare
picătură de ser, schimbând colţul lamei pentru fiecare picătură de ser
hemostat, amestecându-se pentru omogenizarea, iar picătura de sânge să fie
de circa 10 ori mai mică decât cea de ser; sângele se recoltează steril prin
înţeparea pulpei degetului.
Lama se ia în mână şi i se imprimă o mişcare lentă, rotativă (fig. 43).
Citirea se face în primele 2-3 minute, cu ochiul liber (fig. 44).

Fig. 43. Plasarea pe lame a serului hemostat pentru determinarea


grupelor de sânge

129
Fig. 44. Determinarea aglutinogenelor (Proba Beth-Vincent) –
interpretarea rezultatelor

Interpretarea rezultatelor
Dacă în toate trei picăturile nu apare nici o aglutinare, amestecurile
rămân uniforme, colorate în roz, sângele de cercetat aparţine grupei 0. Dacă
apare aglutinare cu serurile 0 şi B şi lipsă de aglutinare cu serul A, sângele
de cercetat aparţine grupei A. Dacă apare aglutinare cu serurile 0 şi A şi
lipsă de aglutinare cu serul B, sângele cercetat aparţine grupei B. Dacă apare
aglutinare cu toate cele trei seruri, atunci sângele cercetat aparţine grupei
AB (fig. 44 46, A).

130
Fig. 45. Compatibilitatea grupelor de sânge

Detreminarea aglutininelor (Proba Simonin)

Determinarea se face punând în contact serul de cercetat cu eritrocite


test cunoscute de grupă 0, A, B. Se folosesc şi eritrocite 0 ca martor negativ
pentru a înlătura greşelile datorate aglutinărilor nespecificate sau
aglutinărilor specifice iregulare.

Metoda pe lamă
Pe o lamă se pun trei picături din serul de cercetat.
Pe prima picătură de la marginea stângă se adaugă eritrocite 0, pe
picătura din mijloc se adaugă eritrocite A şi pe picătura din dreapta eritrocite
B. Adaosul şi amestecul pentru fiecare picătură se face cu colţul unei lame,
aceasta schimbându-se la fiecare picătură.
Raportul între eritrocite şi ser trebuie să fie aproximativ 1/10.
Citirea se face prin rotirea lentă a lamei în primele 2-3 minute, cu
ochiul liber.

Interpretarea rezultatelor
Reacţia trebuie să fie negativă cu eritrocite 0 pentru toate cele trei
posibilităţi. Aglutinarea cu eritrocite A şi B arată că serul conţine aglutinine
anti-A şi anti-B, iar sângele cercetat aparţine grupei 0. Lipsa de aglutinare

131
cu eritrocite A şi eritrocite B arată că serul conţine aglutinine anti-B, iar
sângele cercetat aparţine grupei A. Aglutinarea cu eritrocitele A şi lipsa
aglutinării cu eritrocitele B arată că serul conţine aglutinine anti-A, iar
sângele cercetat aparţine grupei B. Când nu apare aglutinare nici cu
eritrocitele A şi nici cu eritrocitele B, serul este lipsit de aglutinine anti-A şi
anti-B, iar sângele cercetat aparţine grupei AB (fig. 46, B).

Fig. 46. Determinarea grupelor de sânge - interpretarea rezultatelor

Determinarea Rh-ului

Factorul RH a fost descoperit de Landsteiner şi Wiener în anul 1940,


în urma unui studiu făcut asupra grupelor sanguine la maimuţă Macaccus
rhesus. Acest factor este un antigen specific de grupă sanguină prezent pe
eritrocitele omului şi maimuţei Rhesus.
Spre deosebire de sistemul ABO, la care se găsesc în mod natural
aglutininele alfa sau beta, pentru factorul Rh şi pentru tot sistemul de factori
Rh nu există în mod spontan o aglutinină anti-Rh.
Anticorpii anti-Rh apar numai prin izoimunizare prin injectare de
sânge Rh de semn contrar, prin sarcină, când o mamă Rh negativ naşte un
copil Rh pozitiv, prin grefă tisulară izologă.
Se înţelege astfel importanţa practică a factorului Rh în problemele
de transfuzie cât şi în cele privind boala hemolitică a nou-născutului (fig.
47).

132
Modul de lucru:
O picătură de ser anti Rh cu o picătură de sânge de cercetat se
amestecă pe o lamă şi se lasă o oră la 370C. Pentru accelerarea reacţiei se
poate adăuga 1 picătură de papaină (reacţia se produce în 10 minute).

Rezultate:
Dacă picătura aglutinează, sângele este Rh+ (85% din cazuri).
Dacă picătura nu aglutinează, sângele este Rh- (15% din cazuri).

Fig. 47. Formarea anticorpilor anti-Rh şi a consecinţelor sale în cazul unei


mame cu Rh- şi a unui făt Rh+

133
LABORATOR 15

Identificarea acizilor nucleici cu acridin-orange

Sensibilitatea mare a metodelor fluorimetrice au permis dezvoltarea


unor tehnici de cercetare bazate pe proprietăţile coloranţilor bazici de a
emite lumină flourescenţă în anumite condiţii tehnice. În mod obişnuit, în
urma excitării luminoase a electronilor, revenirea la starea fundamentală se
face prin emiterea energiei acumulate sub formă de energiei calorică. Unele
substanţe însă pierd o parte a energiei absorbite, remit luminos o radiaţie cu
energie mai mică, deci cu lungime de undă mai mare care reprezintă
spectrul caracteristic substanţei emiţătoare. În general radiaţiile excitatoare
sunt în UV, iar cele flourescente în vizibil. Cei mai utilizaţi coloranţi cu
emisie de flourescentă pentru identificarea şi localizarea în celule a acizilor
nucleici sunt 3,6 diamino-acridina, acridin-oranjul şi alţi derivaţi ai
acridinei.

Materiale necesare:
- soluţie de acridin-orange 0,02% la pH=1,5-3,5;
- alcool metilic, soluţie Ringer-Krebs;
- lame, lamele, pahare Berzelius de 150 ml;
- cilindru gradat de 500 ml;
- pipetă de 5 ml, pipetă gradată de 10 ml, material biologic.

Pregătirea reactivilor:

Soluţia de acrin-orange
Se dizolvă 0,1 g acridin-oranj în 500 ml apă de robinet, înainte de
folosire.

Modul de lucru:
Frotiul de nuclei sau celule se usucă la aer şi apoi se fixează în alcool
metilic timp de 15 minute.
Se colorează cu soluţia de acridin-orange 0,02% la pH=1,5-3,5 timp
de 10-20 minute. Excesul de colorant se îndepărtează prin spălare cu o
soluţie Ringer-Krebs. Examinarea preparatelor la microscop în flourescenţă.

Rezultate:
ADN-ul prezintă o fluorescenţă verde, ARN-ul prezintă o
fluorescenţă roşie.

134
LABORATOR 16

Dozarea acizilor nucleici prin metoda Spirin

Acizii nucleici se pot doza pe baza conţinutului lor în fosfat sau


pentoze.
Metoda Spirin se bazează pe dozarea fosfatului din acizii nucleici.
Acizii nucleici se extrag din material biologic cu ajutorul acidului percloric
(HCIO4), care face şi hidroliza lor la temperatura de 1000C.
Extractul ce conţine acizii nucleici hidrolizaţi se centrifughează, iar
supernatatul este analizat (la spectofotometrul Beckmen) determinându-se
extincţia în lumină ultravioletă, la două lungimi de undă: λ (lambda)=270
nm şi λ=290 nm, aflându-se concentraţia de fosfat din acizii nucleici extraşi
din ţesut.

Materiale necesare:
- acid percloric 0,5 N;
- balanţa de torsiune;
- mojar cu pistil, sticlă pisată;
- bec de gaz;
- pahar Berzelius de 250 ml;
- centrifugă, eprubete de centrifugă;
- spectofotometru Beckman;
- material biologic.

Modul de lucru:
Ţesutul animal proaspăt recoltat (între 5-20 g) se cântăreşte precis la
balanţa de torsiune şi se notează greutatea, apoi ţesutul se majarează cu
sticla pisată şi se trece în eprubete de centrifugă, adăugând 5 ml acid
percloric 0,5 N (spălând mojarul de mai multe ori cu acid percloric, dar fără
a depăşi volumul de 5 ml acid percloric).
Eprubetele cu ţesut şi acid percloric se fierb pe baie de apă, timp de
30 minute. După fiecare fierbere eprubetele se răcesc şi se centrifughează 10
minute la 5000 rotaţii/min.; supernatantul se trece în cuve de 10 mm şi se
citeşte extincţia în UV, la două lungimi de undă diferite la spectofotometru
Beckman: λ=270 nm şi λ=290 nm, notându-se valorile pentru fiecare citire
faţă de acid percloric (martor).

135
Rezultate:
Calculul rezultatelor
Se face diferenţa între valoarea extincţiei la λ=270 nm şi la λ=290
nm, pentru aceeaşi probă, iar rezultatul se împarte la factorul 0,19 şi se află
concentraţia fosfatului din acizii nucleici într-un ml de extract în acid
percloric.
a) Calculul fosfatului se face după formula:

unde:
Conc. P(A.N.)= concentraţia fosfatului de acizii nucleici exprimat în mg/ml
extract.
E270 şi E290 = extracţia hidrolizatului total la λ=270 nm şi la λ=290 nm.
0,19 = indicele extincţiei specifice pentru A.N.

b) Calculul concentraţiei medii totale de acizi nucleici din extract se


face conform formulei:

unde:
10,3 = coeficientul mediu de transformare a concentraţiei de fosfat în
concentraţie de acizi nucleici (A.N.)

c) Calculul concentraţiei fiecărui acid nucleic


Concentraţia fiecărui acid nucleic ADN şi ARN, se calculează ţinând
seama de faptul că ADN şi ARN în soluţii pure au extincţii diferite, stabilite
experimental. Astfel, coeficientul mediu de transformare a P în acizi
nucleici este pentru ARN=10,5, iar pentru ADN=10,1, deoarece conţinutul
în procente al P în ARN este 9,5%, iar în ADN este 9,9%.
Concentraţia (în µg/ml) este obţinută conform formulelor:

136
d) Calculul concentraţiei de acizi nucleici dintr-un gram de ţesut
proaspăt.

Pentru aflarea concentraţiei de acizi nucleici dintr-un gram de ţesut


se procedează astfel:
- iniţial se calculează concentraţia de ARN şi ADN din 5 ml extract ce
cuprinde acizii nucleici din tot ţesutul cântărit (de ex. 18 mg)
înmulţind CARN (sau CADN) în µg/ml cu 5 ml;
- apoi, valoarea de ARN sau ADN din ţesutul cântărit se raportează la
1 g ţesut proaspăt, prin regula de trei simplă.

Exemplu:

18 mg ţesut cântărit .................................... X µg/ml ARN


1000 mg (1 g) ţesut .................................... Y µg/ml ARN

137
LABORATOR 17

Separarea electroforetică a proteinelor

Macromoleculelor biologice, suspendate sub formă de soluţii


coloidale într-un mediu apos, sunt încărcate cu sarcini electrice negative sau
pozitive. Dacă în soluţie se introduc doi electrozi şi se stabileşte un curent
electric, miceliile încărcate electronegativ se vor deplasa către electrodul
pozitiv (anod), iar cele încărcate electropozitiv se vor deplasa către
electrodul negativ (catod). Deplasarea către electrozi a macromoleculelor
biologice se va face cu viteze diferite. Viteza de deplasare a macro-
moleculelor depinde de volumul acestora şi încărcătura lor electrică. Prin
electroforeză diferitelor tipuri de proteine se separă sub formă de benzi pe
suportul pe care se face electroforeza. Benzile sunt evidenţiate apoi prin
tehnici de colorare.
Fracţionarea electroforetică necesită:
- o sursă de curent continuu şi constant (redresor de curent continuu);
- mediu sau suport de migrare – trebuie să îndeplinească următoarele
caracteristici - stabilitate chimică, neutralitate, absenţa absorbţiei şi
electroendosmozei, inerţie, stabilitate la variaţii de pH şi
temperatură, insolubilitatea în anumiţi solvenţi;
- soluţii tampon care să permită probei menţinerea în limitele unui pH
bine determinat.
Caracteristicile unui tampon pentru electroforeză sunt: pH şi forţă
ionică. Forţa ionică exprimă concentraţia efectivă a ionilor dintr-o soluţie. În
general, forţa ionică trebuie să fie cuprinsă între 0,1 şi 0,2;
- Valori < 0,1 duc la întinderea fracţiunilor;
- Valori > 0,2 duc la nesepararea fracţiunilor.
În cazul pH-ului de 8,5 toate proteinele se comportă ca anioni şi
diferenţa lor de mobilitate este cea mai corespunzătoare pentru separarea
fracţiunilor. În funcţie de sistemul de migrare există două tipuri de
electroforeză:
- electroforeză liberă – migrare în fază lichidă şi
- electroforeză de zonă – migrare în fază solidă.

Electroforeza proteinelor serice pe hârtie


Electroforeza de zonă este tipul cel mai folosit în laborator,
efectuându-se pe următoarele medii suport: hârtie de filtru Whatman,
geloză, amidon, acrilamidă, acetat de celuloză. Revelarea fracţiunilor
separate prin electroforeză se face prin colorare, ele având afinităţi specifice
pentru anumiţi coloranţi.
138
Determinarea cantitativă se face prin fotometrare directă, care constă
în măsurarea densităţilor optice ale colorantului fixat pe fracţiunile
desfăşurate electroforetic sau prin eluţia colorantului din fiecare fracţiune şi
măsurarea densităţilor optice.
Absorbţia colorantului şi deci implicit intensitatea spotului obţinut
este direct proporţională cu concentraţia fracţiunilor respective.
Efectuarea electroforezei de zonă necesită un aparat alcătuit dintr-un
redresor şi o cameră de electroforeză.
Redresorul - este alimentat de curent electric şi este prevăzut cu
dispozitive de reglare, voltmetru şi ampermetru. El furnizează curent
continuu reglabil la tensiunea dorită şi are instrucţiuni proprii de
funcţionare.
Camera de electroforeză – este construită din material plastic şi
conţine două bacuri care comunică între ele printr-o punte sau sifon.
Bacurile sunt prevăzute cu şicane montate într-un sistem de labirint pentru a
reduce difuzia produselor de electroliză formate în timpul funcţionării.
Fiecare bac conţine electrod confecţionat din platină, nichel sau cărbune. În
cazul electrozilor de cărbune se impune separarea lor de banda de hârtie prin
membrane poroase sau saci de ceolofan. Electrozii de platină sunt cei mai
folosiţi fiind şi cei mai rezistenţi. Ei sunt montaţi în diagonală în cele două
bacuri şi sunt conectaţi la două fişe, legătura cu redresorul efectuându-se
prin cablu electric. Camera de electroforeză este acoperită etanş cu un capac
de sticlă sau material plastic. Dimensiunile bacurilor şi forma camerei de
electroforeză diferă după necesitate şi după firma care livrează.

Materiale necesare:
- aparat de electroforeză;
- hârtie de filtru specială pentru electroforeză (Whatman nr.1,
4, 100, Schleicher Schull nr.2043 B, 2024).

Pregătirea reactivilor:

Soluţii tampon veronal pH=8,6 forţă ionică 0,1 (soluţia de bază):se


obţine din:
- Na dietilbarbituric medial veronal sodic …20 g
- acid dietilbarbituric (veronal acid) …….. 3 g
- merthiolat de sodiu ………………………..0,2 g
- apă distilată ………………………… .1000 ml
În momentul întrebuinţării soluţia de bază se diluează cu apă distilată
pentru a obţine următoarele soluţii tampon:

139
a) tampon veronal pH=8,6 f.i 0,075
Se obţine din 3 vol. soluţie de bază + 1 vol. apă distilată
b) tampon veronal pH=8,6 f.i. 0,05
Se obţine din 1 vol. soluţie de bază + 1 vol. apă distilată
c) tampon veronal pH=8,6 f.i. 0,035
Se obţine din 1 vol. soluţie de bază + 2 vol. apă distilată
d) tampon veronal pH=8,6 f.i. 0,025
Se obţine din 1 vol. soluţie de bază + 3 vol. apă distilată

Soluţii de coloranţi:
- Albastru de bromfenol – 0,1 g sau 1 g
Se prepară din sulfat de zinc (50 g), acid acetic glacial (50 ml) şi apă
distilată până la 1000 ml.
- Azocarmin B – 1 g
Se obţine din acid acetic glacial (28,2 ml), acetat de sodiu (3,96 g), glicerină
(100 ml) şi apă distilată până la 1000 ml.
- Amidoschwartz 10 B – 1 g
Rezultă din amestecul alcool metilic (900 ml) şi acid acetic glacial (100 ml).
- Naftalen negru 12 B 200 – 1 g
Conţine: acid acetic 10% - 1000 ml
- Verde Geigy – 1 g
Conţine: acid acetic 10% - 1000 ml

Soluţia de spălare
Conţine: acid acetic – 2 ml; apă distilată – 100 ml

Soluţia de viraj
Conţine: acid acetic – 10 ml; acetat de sodiu – 5 g; apă distilată –
100 ml.

Soluţia de eluare
Conţine:
- carbonat de sodiu – 4 g;
- metanol – 50 ml;
- NaOH – 4 g;
- apă distilată – 1000 ml.

Modul de lucru:
Se montează camera de electroforeză pe o masă perfect orizontală
(control cu bula de nivel). Cele două bacuri se încarcă cu soluţie tampon,

140
fiind aduse la acelaşi nivel cu ajutorul sifonului. Hârtia de filtru specială,
tăiată fâşii cu dimensiunile cerute de aparat (25cm/2cm) se numerotează, se
impregnează una câte una în soluţie tampon şi se aşează în aparat unde sunt
fixate orizontal prin adeziune de ramele bacurilor; capetele benzilor trebuie
introduse cel puţin 1 cm în soluţia tampon din cele două bacuri. Se
corectează cuvele la redresor; se reglează amperajul (0,2 mA/cm lăţime) şi
aparatul este lăsat să funcţioneze 30 minute pentru echilibrarea sistemului.
Se închide aparatul, se aplică serul de cercetat (0,005-0,01 ml) care trebuie
să fie clar şi nehemolizat. Aplicarea probei se face la capătul catodic (-) pe
banda de hârtie cu o micropipetă.
Se redeschide aparatul pentru controlul migrării, apoi se colorează
serul amestecând în el câteva cristale de albastru de bromfenol. Colorantul
migrează cu frontul aluneinelor. Durata de migrare variază între 4-5 ore
(migrare rapidă) sau între 16-18 ore (migrare lentă). Viteza de migrare
variază după pH-ul soluţiei tampon şi tensiunea la borne, amperaj, lăţimea
benzilor de hârtie, cantitatea de ser.
Când se constată că desfăşurarea migrării s-a terminat, se deschide
aparatul, se scot benzile de hârtie şi se usucă. După uscare benzile sunt
introduse într-o soluţie de colorant (30 minute – 12 ore) – soluţie de albastru
de bromfenol 0,1g – 1%; timpul de colorare variază după concentraţia
colorantului. Excesul de colorant se înlătură trecând proteinograma (benzile
de hârtie) prin trei băi de spălare (2 ml acid acetic + 100 ml apă distilată),
timp de 10 minute primele 2 băi şi 5 minute ultima baie. Se trec benzile 2
minute în soluţie de viraj (acid acetic + acetat de sodiu + apă distilată) şi
apoi se usucă benzile la etuvă (10-20 minute la 800C). După uscare se trece
la măsurarea densităţii optice a colorantului fixat pe fracţiunile desfăşurate
electroforetic prin fotometrare directă (aparat special) sau prin eluţia
colorantului din fiecare zonă şi măsurarea densităţii optice a soluţiei
obţinute cu fotometrul obişnuit. Pentru eluarea spoturilor se pregătesc 5
eprubete, prima eprubetă din serie purtând numărul probei corespunzătoare.
Luându-se benzile în ordinea numerotării, se taie cu foarfeca fiecare zonă
colorată şi se introduce în eprubeta corespunzătoare din seria de 5, în
ordinea migrării: în prima eprubetă albuminele apoi alfa-1, alfa-2, beta şi
gammaglobulinele. Tăierea se face pe zona cea mai puţin colorată dintre
fracţiuni. Se pipetează pe fiecare eprubetă câte 5 ml soluţie de eluare
(carbonat de sodiu + metanol + apă distilată), peste fragmentele de hârtie, se
pune dopul şi se agită puternic. Pentru o bună eluare se lasă 30 minute.
Extincţia eluentului fiecărei fracţiuni se citeşte la λ=590 nm, în cuve
de 1 cm, faţă de apa distilată. Se face suma extincţiilor celor 5 fracţiuni ale
unei probe şi se egalează cu 100. Prin regula de trei simplă se calculează
procentajul fiecărei fracţiuni faţă de această sumă.
141
Rezultate:
La serul normal prin electroforeza pe hârtie se disting 5 fracţiuni:
albumină, afla 1, alfa 2, beta şi gamma, care cu excepţia gammaglobulinelor
migrează spre anod, fracţiunea gamma care este electiv neutră migrează spre
catod datorită electroendosmozei (fig. 48).

Fig. 48. Electroforeza proteinelor din serul sanguin – aspectul normal

142
LABORATOR 18

Separarea electroforetică a proteinelor din membrana


plasmatică eritrocitară

Scopul lucrării este de a demonstra existenţa în membrana


plasmatică a unui complex proteic şi heteroproteic prin electroforeză în gel
de poliacrilamidă. Electroforeza în gel de poliacrilamidă poate fi făcută în
poziţie verticală (metoda disc-electroforezei) sau în poziţie orizontală
(metodă pe plăci). Această metodă este folosită în cercetare pentru controlul
purităţii fracţiunilor proteice.

Metoda disc-electroforezei

Materiale necesare:
- redresor
- două blocuri din material plastic în care sunt inserate tuburile care
conţin gel
- tuburi de sticlă de capacitate egală
- parafină sau plastilină

Pregătirea reactivilor:
- Tampon TRIS pH=8,9
Conţine: TRIS=4,5 g, HCl 1 N=6 ml, apă=100 ml.
- Tampon TRIS pH=8,3
Conţine: TRIS=0,6 g, glicocol=2,8 g, apă=1000 ml
- Acrilamidă, Bisacrilamidă
- TEMED
- Persulfat de sodiu
- Soluţie de albastru de bromfenol
Conţine: albastru de bromfenol=1 mg, apă=100 ml
- Soluţie de sucroză 20%
Conţine: sucroză=20 g, apă=100 ml, sau o picătură de glicerină ca atare
- Soluţie de colorare
Conţine: amidoschwartz=1 g sau 0,1-0,2%, acid acetic 7%=100 ml
- Acid acetic 7%
Conţine: acid acetic=7 ml, apă=100 ml
- Soluţii de decolorare
Conţine: acid acetic 7%
- Gel de acrilamidă

143
Gelurile de acrilamidă se obţin prin polimerizarea acrilamidei sub
acţiunea activatorului metilen bisacrilamidă. Formarea polimerului poate fi
indusă pe cale fotochimică sau chimică. Fotopolimerizarea se face în lumină
flourescentă în prezenţa de N, N, N', N', tetrametilendiamidă (TEMED), iar
polimerizarea chimică cu amestec de catalizatori persulfat de amoniu şi
TEMED (0,2 g%).
Reacţia nu are loc în prezenţa oxigenului atmosferic. Polimerizarea
este completă după 3 ore. Concentraţia de monomer poate varia de la 3 la
30%.
În tabelul de mai jos se dau grame substanţe % ml amestec acrilamidă:

Acrilamidă Bisacrilmidă Persuflat de TEMED Timp de


monomer activator amoniu catalizator gelificare (min)
catalizator
3% 0,08 g 0,03-0,06 g 10-20 µl/l 3-5
5% 0,13 g 0,02-0,03 g 10-20 µl/l 2-4
7% 0,18 g 0,01-0,02 g 8-15 µl/l 1-3
9% 0,24 g 0,01-0,02 g 8-15 µl/l 1-2

Timpul de pregelificare este durata de scurgere de la adăugarea


catalizatorului până la începerea gelificării.

Fig. 49. Originea eritrocitelor


144
Gelul de acrilamidă se poate prepara prin 2 metode:
Metoda I
Într-un cilindru gradat de 25 ml cu dop rodat se pun 1,7 g acrilamidă
şi 0,05 g bisacrilamidă.
Se adaugă 24 ml tampon TRIS pH=8,9, se agită şi se adaugă 10 µl
TEMED, agitându-se şi 0,25 ml soluţie persuflat (se cântăresc 0,07 g
persuflat care sunt dizolvate într-un mililitru apă, din care se iau apoi 0,25
ml).
Se agită bine şi se repartizează amestecul cu ajutorul unei pipete în
tuburi în prealabil astupate la capătul de jos cu plastilină sau parafină
(metoda disc-electroforeză).

Metoda II
Se prepară soluţiile 1, 2, 3 şi 4 care sunt păstrate la frigider timp
îndelungat, iar în momentul folosirii se face amestecul după formula de mai
jos:
Soluţia 1
Conţine: acrilamidă – 28 g, bisacrilamidă – 0,75 g, apă distilată adus
la 100 ml.
Soluţia 2
Conţine: NaCl 1N – 48 ml; TRIS – 36,6 g; TEMED – 0,23 µl.
Soluţia 3
Conţine: persuflat de amoniu – 0,28 g; apă distilată adus la 100 ml.
Soluţia 4
Conţine: apă distilată
Amestec:
2 vol. soluţia 1 + 1 vol. soluţia 2 + 4 vol. soluţia 3 + 1 vol. soluţia 4.
Se agită şi apoi tuburile sunt umplute ca în cazul metodei I.
Se recomandă ca înălţimea stratului de poliacrilamidă să fie aceeaşi
în toate tuburile.
Cu ajutorul unei pipete Pasteur bine efilată să se umple spaţiul rămas
liber din tub cu apă distilată şi se lasă până a doua zi.
Cantităţile de mai sus au fost date pentru un aparat în care se pun 6
tubuleţe de 8 cm lungime şi cu un diametru de 0,5 cm. În cazul altor
dimensiuni de tuburi se vor mări cantităţile păstrându-se însă proporţiile.

Modul de lucru:
Punerea probei: 0,01 ml probă 600-1000 µg (proteine extrase din
membrana eritrocitară) la care se adaugă sucroză pentru a forma o soluţie

145
10% (deci 0,01 g) sau glicerină. Sucroza măreşte densitatea soluţiei proteice
şi nu permite amestecarea ei cu tamponul.
Tubuleţele sunt fixate în partea de sus a aparatelor (după ce în
prealabil s-a scos parafilmul sau plastilina şi apa de deasupra) şi apoi sunt
scufundate în cuva inferioară 1-2 cm intrând în tampon.
În cele 2 cuve (de sus şi de jos) se pun câte 200 ml tampon TRIS
pH=8,3 sau cantitatea necesară în funcţie de dimensiunile cuvelor cu care se
lucrează.
Se lasă sistemul de echilibrare 1-2 ore.
Se reglează amperajul la 4 mA/tub şi se lasă gelul pentru echilibrare.
Se opreşte apoi aparatul şi se pune proba direct în fiecare tub, fără a-l scoate
din cuvă.
Timpul de migrare este de aproximativ 4 ore, migrarea probei se
observă după nivelul colorantului. După migrare se opreşte aparatul şi se
scoate cu grijă gelul din tub cu ajutorul unei seringi. Se lasă gelul în colorant
de la 10 minute la 30 minute, apoi urmează decolorarea. Astfel, gelurile se
spală cu soluţia apoasă de acid acetic 7% schimbându-se soluţia pe măsură
ce se colorează.
Spălarea se continuă până când tot colorantul nelegat de proteine
este eliminat din gel.

Rezultate:
După o bună spălare fracţiunile proteice apar colorate în albastru
intens sau negru, iar gelul devine incolor şi transparent.
Gelurile pot fi păstrate timp îndelungat în eprubetele cu acid acetic
3%.
Pentru interpretarea rezultatelor, benzile se desenează la scara 1/1 pe
hârtie milimetrică şi se măsoară cu precizie poziţia fiecărei benzi în gel şi
lăţimea benzilor.

Metoda pe plăci
Gelul poate fi turnat şi într-o cuvă de plastic iar după solidificare
(gelificare) se poate tăia exact după dimensiunile aparatului de
electroforeză. Gelul este pus pe un suport şi lăsat să migreze în aparatul de
electroforeză, legătura cu bacurile făcându-se cu hârtie de filtru obişnuită.
Pentru o placă de sticlă cu dimensiunile de 6,5×30×0,3 sunt necesare
aproximativ 6 ore de migrare atunci când se aplică o diferenţă de potenţial
de 500V.
Etapele de lucru, colorarea şi decolorarea sunt identice cu cele
descrise la metoda Disc-electroforezei.

146
LABORATOR 19

Cromatografia de partiţie (descendentă)

Consideraţii generale
Metoda cromatografiei descendente se realizează într-o cameră
cromatografică cu pereţi de sticlă prevăzută cu două jgheaburi fixate în
partea de sus, care conţine solvenţi neapoşi. Camera cromatografică este
acoperită ermetic cu o placă de sticlă.
În tehnica cromatografică solvenţii organici nemiscibili cu apa sunt
cei mai folosiţi. Înainte de utilizare ei sunt saturaţi cu apă. Saturarea se
efectuează prin agitarea anumitor cantităţi de solvent cu apă într-o pâlnie de
separare.
Amestecul se lasă în pâlnia de separare în repaus 1-2 ore, timp în
care se formează două straturi net diferite:
1- stratul care conţine solventul saturat cu apă
2- stratul apos, utilizat la saturarea cu vapori a camerei cromatografice.
Solvenţilor utilizaţi în cromatografie li se impun următoarele condiţii:
- nu trebuie să denatureze substanţa de cercetat;
- nu trebuie să reacţioneze cu substanţele de identificare, trebuie însă
să separe două sau mai multe substanţe cu structuri asemănătoare.
Diferenţa între Rf trebuie să fie cel puţin 0,05 cm.

Revelatorii
Sunt reactivi care dau în general reacţia de culoare şi sunt specifici
substanţelor de analizat.
Revelatorii pentru aminoacizi
Soluţia de 1% ninhidrină este revelatorul cel mai folosit şi este
comun pentru aminoacizi, peptide şi amine primare. Coloraţia variază de la
albastru la portocaliu în funcţie de natura aminoacizilor. Soluţia de
pulverizat se face de obicei 0,1-0,3% ninhidrină în butanol, alcool 96% sau
acetonă. La soluţia 0,3% ninhidrină în alcool 960 se poate adăuga 2%
cloroform, pentru obţinerea de nuanţe diferite ale spoturilor cromatografice.
Revelatori pentru glucide:
a) Metoda cu nitrat de argint amonical constă în pulverizarea
cromatogramei cu un amestec preparat extemporaneu din
AgNO3 N/10 + NH4OH 5N (volume egale).Spoturile obţinute
sunt de culoare neagră. Reactivul nu este specific deoarece dă
reacţii similare şi cu fenolii;

147
b) Soluţia de monoanilină a acidului ftalic este reactivul specific
glucidelor. Reactivul se prepară prin dizolvarea a 3,3 g acid ftalic
+ 2 ml anilină + 95 ml acetonă + 5 ml apă distilată;
c) Reactivul specific aldozelor: oxalatul de anilină, preparat din
acid axalic-anilină; acidul oxalic este dizolvat în acetonă sau
butanol. Uscarea cromatogramei pulberizate se efectuează la
temperaturi până la 800C;
d) Revelatori specifici cetozelor: naftorezorcinolul în mediul acid.
Se prepară prin amestecul în volume egale al unei soluţii 0,2%
naftolrezorcinol în alcool 96% cu o soluţie de 2% acid
tricloracetic.
În determinările cantitative ale zaharurilor se foloseşte ca reactiv 2%
clorură de trifeniltetrazoliu în soluţie de NaOH 0,5% în alcool metilic. Cu
acest reactiv cromatograma se umectează în întregime şi se lasă timp de 60
minute la 650C. Apoi petele sunt decupate şi evaluate într-o soluţie de 20%
acid acetic în alcool metilic. În aceste condiţii coloraţia soluţiei se menţine
timp de 14 zile. Extincţia se măsoară la fotocolorimetru sau spectofotometru
la λ=482 µm.

Metoda de lucru:
Constă din următoarele etape:

I. Pregătirea probelor de analizat


O serie de substanţe ca proteinele, lipidele, hidraţii carbon, sărurile şi
sarea, pot uneori împiedica desfăşurarea normală a crotamogramelor. În
aceste cazuri este necesară îndepărtarea prin precipitare (deproteinizare),
lipidele prin extracţii cu solvenţi organici, sărurile şi hidraţii de carbon prin
absorbţie pe schimbători de ioni.
Soluţiei de analizat i se cere un anumit grad de puritate şi o anumită
concentraţie, concentraţia optimă fiind în jurul a 1-5%.
Hidroliza se efectuează de obicei cu HCl 6N în tub închis prin
fierbere la 1050C sau cu refrigerent ascendent timp de 24 ore.
Pentru zaharuri hidroliza este de 6 ore cu H2SO46N; neutralizarea în
acest caz se efectuează cu bariu în prezenţa indicatorului roşu neutru, iar
sulfatul de bariu format se îndepărtează prin centrifugare.
În cazul când hidroliza se efectuează cu HCl, aceasta se îndepărtează
prin evaporare la sec în vid sau pe baie de apă. Stratul subţire de clorhidraţi
format se reia în apă sau alcool izopropilic 10%. Alcoolul izopropilic
constituie un bun mijloc de conservare. Prin hidroliză acidă (HCl) a

148
extractelor tricloracetice se formează cloroformul, produs care se poate
elimina foarte repede prin încălzire la 250C.

II. Aplicarea probelor de analizat


Aplicarea probelor pe hârtia de filtru se execută cu o micropipetă
efilată la vârf. Capătul pipetei se şterge bine cu o hârtie curată şi prin
atingerea hârtiei cu pipeta, soluţia de analizat este depusă în locurile fixate
cu creion negru. În tehnica cromatografiei descendente linia de start se face
la 5 cm de la capătul superior al hârtiei cromatografice. Distanţa între pete
trebuie să fie de circa 2,5 cm.
Pentru obţinerea unor rezultate bune se depune pe hârtia de filtru
cantitatea de 0,01 ml soluţie de cercetat într-o formă circulară cu s=10 mm.
În cazul utilizării unor cantităţi mai mari sau a unei soluţii foarte diluate,
soluţia de cercetat se aplică în acelaşi loc în mai multe etape, lăsându-se în
prealabil să se usuce pata precedentă.
După aplicarea şi uscarea lichidului de analizat hârtia de filtru se
introduce cu capătul superior în jgheab şi se fixează cu baghete de sticlă.
Linia cu probele de analizat trebuie să fie la distanţă de 2 cm după
bagheta de susţinere. Apoi jgheabul se umple cu lichidul de irigare specific
probelor de analizat şi se lasă la irigat timp de 24-120 ore. În tot acest
interval de timp temperatura trebuie să fie constantă şi atmosfera saturată cu
vaporii lichidului de irigare.
Hârtiile de filtru după ce sunt irigate, sunt scoase din cutia
cromatografică, uscate la temperatura camerei sau la etuvă (90-1000C).
Pentru identificarea, cromatograma uscată este apoi pulberizată cu
reactivul adecvat probelor de analizat (metoda identificării directe). În
cursul uscării la etuvă - etapă ce urmează după umectare – apar petele
colorate pe fondul alb al hârtiei.
Identificarea spoturilor apărute se face comparativ cu o
cromatogramă pe care s-au aplicat substanţe – etalon cunoscute. Prin acest
procedeu de comparaţie se stabilesc valorile ,,Rf“ caracteristice fiecărei
componente.

Pentru reproductibilitatea Rf trebuie respectate următoarele condiţii:


menţinerea unei temperaturi constante; etanşeitatea perfectă a vasului;
saturarea mediului din camera cromatografică cu vapori ai solventului
respectiv; respectarea condiţiilor descrise la aplicarea substanţelor, la

149
uscarea şi identificarea spoturilor; puritatea şi concentraţia substanţei de
analizat; distanţa între frontul solventului şi linia de start se impune să fie de
cel puţin 20-25 cm; durata de irigare de minimum 24 ore.
Pentru determinarea spoturilor cromatografice, în afara de metoda
identificării directe se pot folosi metode chimice şi fizico-chimice.
Studierea cromatogramelor în lumină ultravioletă constituie deseori
un bun mijloc de identificare.
Aparatul cromagrafic poate fi aşezat într-un loc fără mari variaţii de
temperatură, chiar în laborator, însă pentru executarea cromatogramelor în
serie este necesară o cameră specială, pentru a evita atât variaţiile de
temperatură, cât şi atmosfera toxică provocată de solvenţii utilizaţi în
cromatografie.
Identificarea aminoacizilor sau a zaharurilor din sânge prin
cromatografie descendentă.
Aplicarea acestei metode se face atât la sânge cât şi la urină.
Pentru identificarea aminoacizilor sau a zaharurilor în aceste probe
se recurge la operaţiile de defectare şi concentrare. În cazul sângelui total
sau al elementelor figurate din sânge, izolate prin anumite metode, se
impune în prealabil o liză totală apoi se prelucrează lizatul în acelaşi fel ca şi
serul.

Materiale necesare:
La 1 ml ser sau sânge se adaugă 1 ml apă, iar diluţia obţinută se
precipită cu 18 ml alcool etilic. Precipitatul se separă prin centrifugare.
Supernatantul se tratează cu 25 ml cloroform. Prin agitare intensă se
separă două straturi. Stratul apos se evaporă până la uscare. Reziduul se reia
într-o cantitate foarte mică cu alcool izopropilic 10%. Cu serul astfel tratat
se pun în evidenţă aminoacizii liberi.
Pentru evidenţierea aminoacizilor totali, serul este supus hidrolizei
acide (HCl6N) timp de 24 ore. Urina fiind săracă în unii aminoacizi se
impune a se lucra cu o cantitate mai mare de soluţie. Pentru îndepărtarea
sărurilor se folosesc răşini schimbătoare de ioni; astfel se evidenţiază doar
aminoacizii liberi.

Modul de lucru:
Pe fâşia de hârtia de filtru, cu lăţime de 4 cm şi lungime de 2-50 cm
se aplică, la distanţa de 6 cm de la capătul hârtiei, câte 0,01 ml din substanţa
de analizat, cu ajutorul unei micropipete. Pentru a obţine rezultate bune se
recomandă să se depună cantitatea de 0,01 ml soluţie într-o pată circulară
mică. După uscarea spoturilor hârtia de filtru se introduce cu capătul

150
superior în jgheabul de sticlă ce conţine lichidul de irigare (soluţie saturată
butanol-acid acetic-apă 5:10:40 sau fenol-apă 1:1).
Se fixează hârtia cu bagheta de sticlă pentru ca să nu cadă. Se lasă să
irige un timp determinat, menţinând temperatura constantă şi o atmosferă
saturată cu vaporii lichidului de irigare, în timpul irigării lichidului
antrenează în direcţie descendentă aminoacizii din soluţia depusă la punctul
de plecare.
După 15 ore fâşiile de hârtie sunt scoase din aparatul de
cromatografie, uscate în etuvă (105-1100C) şi pulverizate pentru identificare
cu lichidul de developare adecvat, de exemplu, soluţie de ninhidrină 0,1% în
butanol, pentru aminoacizi.
În cursul uscării la etuvă, etapa care urmează developării, apar petele
colorate caracteristice pe fondul alb al hârtiei, pete roz-violet la aminoacizi.

Rezultate:
Identificarea spoturile apărute se face comparativ cu cromatograma,
pe care s-au aplicat aminoacizii cunoscuţi. Modul de lucru este identic ca
pentru probă.
Prin acest procedeu de comparaţie se pot identifica componentele
soluţiilor de cercetat.
Pentru a avea 10-15 aminoacizi martori, determinaţi în acelaşi
condiţii, cromatograma se poate efectua pe coli late de hârtie de filtru (20-40
cm).
În acest caz se pot pune atât soluţiile de cercetat cât şi soluţiile etalon
pe o singură hârtie. Operaţiile sunt aceleaşi de la cromatograma efectuată pe
o hârtie de filtru lată de 4 cm.
Cromatografia de tipul celei descrise, efectuată într-o singură
direcţie numită cromatografia ,,unidimensională“ este completă de
cromatografia ,,bidimensională“, în acest caz se utilizează două lichide de
migrare şi o cantitate dublă de analizat faţă de cromatografia
unidimensională.

151
LABORATOR 20

Cromatografia de absorbţie (prin schimbători de ioni)


pe bază de dextran (Sephadex)

Consideraţii generale
Schimbătorii de ioni de tip Sephadex au la bază dextranul,
polizaharid al glucozei.
Aceşti schimbători de ioni sunt insolubili în soluţiile slab alcaline şi
acide. În soluţii puternic acide şi mai ales la cald are loc hidroliza legăturilor
glucozidice. Printre cei mai folosiţi schimbători de ioni tip Sephadex se
numără DEAE Sephadex, QAE ca anioni şi, CM Sephadex, SP Sephadex şi
SE sunt cationii.
Alegerea corectă a schimbătorilor de ioni care să posede anumite
grupări active, depinde de sarcina substanţelor de cromatografiat.
Substanţele sunt legate de schimbător, când sarcinile lor sunt de semn
contrar-legarea este electrostatică şi reversibilă. De asemenea, alegerea
acestora este în funcţie de greutatea moleculară a proteinelor, aşa cum se
arată în tabelul de mai jos:

Greutatea moleculară a proteinelor Tip de schimbător


Gr. mol. mici < 30.000 A25 – C25
Gr. molec. medii 30.000-200.000 A50 – C50
Gr. molec. mari > 200.000 A25 – C25

Aceşti schimbători sunt folosiţi în metoda batch şi metoda coloanei.


Indiferent de metodă schimbătorul de ioni pe bază de dextran trebuie să fie
hidratat şi echilibrat în tamponul de lucru.
Alegerea tamponului şi a pH-ului se face în funcţie de schimbători.
Tampoanele cationice se folosesc pentru schimbători anionici, iar
tampoanele anionice se folosesc pentru schimbători cationici; pH-ul
tamponului se alege astfel ca substanţele să aibă o sarcină netă opusă aceleia
a schimbătorului. Tamponul ales trebuie să aibă un pH şi o putere ionică
comparabile cu stabilitatea probei cercetate şi cu zona de eficienţă a
schimbătorului. Cele mai folosite tampoane în cromatografice sunt
tamponul fosfat pentru pH-uri în jurul neutralităţii (6-8), tamponul TRIS
pentru pH-uri în jurul lui 8 şi tamponul acetat pentru pH-uri acide în jur de
5. Hidratarea se face în soluţii slab alcaline la temperatura camerei sau în
baia de apă conform celor expuse mai sus. Durata de îmbinare care este în
funcţie de tipul de Sephadex este dată în tabelul alăturat:

152
Tipul de Sephadex Timpul minim de îmbinare
La temperatura camerei Pe baie de apă
G=10, G=15, G=25 3 ore 1 oră
G=50, G=75 24 ore 3 ore
G=100, G=150, G=200 3 zile 5 ore
LH=20 3 ore -

Deoarece legarea de schimbător se face în anumite condiţii de pH şi


forţă ionică, eliberarea sa de pe schimbător are loc prin variaţia acestor
parametri. În acest scop, coloana se conectează la vasul cu soluţie eluentă şi
proba este lăsată să curgă de-a lungul coloanei care este antrenată de soluţia
eluentă, iar fracţiunile sunt colectate în tuburi. Schimbătorul de ioni
Sephadex poate fi eluat cu soluţii de tampon în gradient de pH sau forţă
ionică, continuu sau în trepte.

Eluţia în trepte sau în gradient discontinuu


Se realizează prin trecerea succesivă peste schimbătorul de ioni a
unor soluţii de tampon cu pH şi putere ionică diferită.
Combinaţiile folosite sunt următoarele:
a) tampoane cu putere ionică din ce în ce mai mare, iar pH-ul din ce în ce
mai mic;
b) tampoane cu putere ionică şi pH-ul din ce în ce mai mare;
c) tampoane cu pH-ul constant, dar cu forţă ionică în creştere sau cu pH-ul
în creştere şi forţă ionică constantă.

Eluţia în gradient continuu


Se realizează cu ajutorul unei instalaţii speciale prin trecerea peste
schimbătorul de ioni a unei soluţii tampon a cărei forţă ionică este crescută
continuu, iar pH-ul se menţine constant sau scade.
Puterea de rezoluţie a separărilor în eluţia continuă este mai mare
decât în cea discontinuă.

Colectarea fracţiunilor
Fracţiunile sunt colectate în tuburi la volum constant, manual sau
automat. Viteza de scurgere a eluentului depinde în mare măsură de
dimensiunile particulelor schimbătorilor.
Dimensiunile de 40-20 mesh sunt folosite pentru scurgeri rapide.
Dimensiunile de 200-400 mesh sunt folosite pentru scurgerile lente.
Debitul de scurgere a eluentului în afară de dimensiunile
schimbătorului depinde de mai mulţi factori ca: diametrul şi lungimea

153
coloanei încărcată cu schimbător, compoziţia tamponului şi presiunea
aplicată.
Regenerarea schimbătorului de ioni tip Sephadex se face prin spălare
cu soluţie salină de concentraţii crescânde. După spălare şi regenerare,
schimbătorul se reechlibrează cu tamponul de pornire şi poate în aceste
condiţii să fie conservat timp îndelungat, în prezenţa unui agent
antimicrobian: azida de sodiu 0,1% sau methiolat 1%.

Tehnica de separare a proteinelor serice folosind schimbătorii


de ioni pe bază de dextron

Cromatografia de schimbători de ioni tip Sephadex se foloseşte


pentru separarea (scop analitic) şi identificarea (scop preparativ) a
substanţelor biologice active.
Separarea proteinelor (plasmatice, suc gastric, LRC) se face azi
curent în laboratorul clinic folosind schimbători de ioni tip Sephadex. Ca
exemplu se dă tehnica de separare a proteinei serice.

Materiale necesare:
- coloană cromatografică;
- schimbător de ioni tip DEAE Sephadex A50;
- soluţie tampon fosfat pH=6,6 u/0,02, NaCl;
- soluţie 1% acid sulfosalicilic (sau acid azotic concentrat);
- spectofotometru, tuburi (volum 5 ml);
- pipete, eprubete.

Modul de lucru:
Pe coloana cromatografică de 10/1 cm încărcată cu 0,1 g – 1 g
DEAE Sephadex A50 se pot fracţiona 2 ml ser uman. Serul în prealabil
trebuie să fie dializat faţă de soluţia tampon folosită la echilibrarea coloanei
(tampon fosfat pH=6,6 u/0,02).
Eluarea se face cu acelaşi tampon fosfat pH=6,6 cu concentraţii
crescânde de NaCl, conform figurii de mai jos. Colectarea fracţiunii poate fi
făcută manual sau automat, în tuburi cu volum de 5 ml.
Prezenţa sau absenţa proteinei se controlează cu o soluţie de 1% acid
sulfosalicilic sau cu acid azotic concentrat.

Rezultate:
Determinarea cantitativă a fracţiunii proteice se face prin absorbţie
specifică în ultraviolete (λ=280 um). Pentru obţinerea celor mai bune

154
separări de proteine este folosită proporţia 1 g schimbători de ioni Sephadex
la 0,1 g proteine.

Separarea diferitelor tipuri de hemoglobină

Pentru aceasta se utilizează schimbătorul de ioni CM Sephadex C50,


folosindu-se o coloană de dimensiunile: 0,9/60 cm, eluant tampon TRIS-
acid maleic, pH=6,5-8 şi rata de 20 ml/oră, s-a obţinut separarea a 5 tipuri
de hemoglobine: F, A, A2, S şi C, dintr-un amestec de hemoglobine realizat
în laborator.

155
LABORATOR 21

Separarea pigmenţilor clorofilieni prin cromatografie pe hârtie


(după E. Brugovitzky)

Cloroplastele sunt organite celulare responsabile de coloraţia verde a


plantelor, conţinând pigmenţii clorofilieni şi de multe ori pigmenţi accesorii.
Pigmenţii clorofilieni sunt implicaţi în fotosinteză, proces fiziologic
care permite plantelor verzi să transforme energia luminoasă emisă de soare
în energie chimică.

Materiale necesare:
- alcool etilic 960, benzină, acetonă, alcool metilic;
- balon Erlenmayer de 250 ml, pipetă, bec de gaz (lampă de spirt);
- sticlă de ceas, hârtie de filtru, cilindru sau borcan de sticlă;
- dop de cauciuc (care să acopere perfect cilindru sau borcanul de
sticlă) străbătut de o baghetă de sticlă îndoită sub forma unui cârlig.

Modul de lucru:

a) Extragerea pigmenţilor clorofilieni din frunze


Extragerea la cald: într-un balon Erlenmayer se pun 5 g frunze
proaspete (sau 1 g de frunză uscată) şi se adaugă alcool etilic până când se
acoperă complet frunzele. Se fierbe la o flacără mică, iar pentru a evita
aprinderea vaporilor de alcool, se acoperă vasul cu o sticlă de ceas. Se
obţine o soluţie adevărată de clorofilă, care se filtrează prin hârtia de filtru
uscată.

b) Separarea pigmenţilor clorofilieni


Pentru separarea completă a celor 4 pigmenţi (clorofila a, b, carotină
şi xantofilă) se procedează în felul următor: pe o fâşie de filtru lată de 3 cm
şi lungă de 20 cm se trasează la unul din capete, la o distanţă de 2 cm, o
dungă transversală de soluţie de pigmenţi cu ajutorul unei pipete cu vârf
ascuţit.
După ce se usucă, se trasează o a doua dungă peste prima; se repetă
această operaţie de 10-15 ori pentru a obţine o dungă intens colorată. Se
introduce apoi hârtia de filtru într-un cilindru de sticlă (borcan) care se
acoperă la partea superioară cu un dop de cauciuc, străbătut de o baghetă
îndoită în formă de cârlig la partea inferioară.

156
Hârtia de filtru se fixează la acest cârlig cu capătul opus dungii
colorate. Pe fundul cilindrului se găseşte un amestec compus din benzină 30
părţi, acetonă 1 parte şi alcool metilic 0,3 părţi.
Hârtia de filtru se ţine suspendată deasupra amestecului timp de 30
minute pentru ca în cilindru să se formeze o atmosferă saturată în vaporii
celor trei substanţe din amestec (fig. 50).

Fig. 50. Plasarea hârtiei de filtru şi migrarea pigmenţilor clorofilieni

Rezultate:
După trecerea celor 30 minute, se apasă bagheta pentru a introduce
capătul inferior al hârtie de filtru, pe o distanţă de 0,5 cm în solvent. Acesta
(solventul) se ridică de-a lungul hârtiei şi antrenează cu sine pigmenţii, care
datorită gradului diferit de absorbţie se repartizează astfel (fig. 51):
- la partea superioară – carotina – marcată printr-o dungă
portocalie; urmează apoi – xantofila – de culoare galbenă;
- pigmenţii verzi, fiind absorbiţi mai puternic, se găsesc la partea
inferioară şi anume: clorofila a – de culoare verde-albăstruie şi
sub aceasta clorofila b de culoare verde-gălbuie.

157
Fig. 51. Ordinea de separare a pigmenţilor clorofilieni

158
LABORATORUL 22

Izolarea hemoglobinei prin centrifugare

Hemoglobina este principala proteină implicată în transportul


oxigenului şi reprezintă 90% din substanţa uscată a eritrocitului. Ea este
alcătuită dintr-o componentă proteică, globina şi dintr-o feroprotoporfirină
(hem).
Hemoglobina este un tetramer, în componenţa sa intrând patru
monomeri. (fig. 52). Fiecare monomer este alcătuit dintr-un lanţ proteic de
globină şi dintr-o moleculă de hem încorporată în partea proteică. Greutatea
moleculară a hemoglobinei umane este de aproximativ 64.500; monomerii
au greutatea moleculară aproximativ egală, în jur de 16.000.
Hemul este grupare comună tuturor hemoglobinelor. El este format
dintr-o protoporfirină 9 (tip III) şi un atom de fier. Protoporfirina este
produsul final al ciclului de sinteză a porfirinelor.
Globina este componenta proteică a hemoglobinei, reprezentând
96% din greutatea acesteia. Ea este alcătuită din patru lanţuri polipeptidice
identice două câte două. Lanţurile polipeptidice ale hemoglobinelor cuprind
toţi cei douăzeci de aminoacizi din care se formează proteinele. În fiecare
lanţ, aceştia sunt dispuşi într-o succesiune determinată genetic.
Atunci când hematiile mor, membrana lor se rupe, hemoglobina este
hidrolizată iar Fe recuperat. Ciclul porfirinic se desface iar fragmentele sunt
metabolizate de ficat. În urma procesului rezultă o moleculă de CO pentru
fiecare moleculă de hemoglobină metabolizată. Procesul este unul natural şi
reprezintă o sursă de CO pentru corpul uman, monoxid care se elimină prin
aerul expirat. Produsul de metabolizare final este bilirubina, un pigment de
culoare galbenă a cărui nivel semnifică distrugerea hematiilor. Dacă ritmul
de degradare a hemoglobinei este prea rapid, ea poate bloca anumite
capilare mai ales capilarele din rinichi determinând apariţia unor boli.
Scăderea hemoglobinei neasociată cu scăderea numărului de hematii poartă
denumirea de anemie; anemia are drept principală cauză deficienţa de Fe.
Ca urmare a acestei deficienţe, scade sinteza de hemoglobină, hematiile vor
fi de tip hipocrom (sărace în pigment) şi microcitic (mai mici decât în mod
normal). În hemoliză (distrugere a hematiilor mai rapidă decât sinteza),
icterul asociat este cauzat de metabolitul bilirubinei şi de hemoglobina
circulantă care poate determina blocaj renal.
Hemoglobinopatiile sunt mutaţii la nivelul lanţului globinei, cele
mai des întâlnite fiind anemia falciformă (siclemia) şi talasemia; tot în
cadrul globinopatiilor sunt şi porfiriile, caracterizate de erori în sinteza
hemului.
159
Hemoglobina este urmărită în permanenţă în cadrul testelor
sanguine, (numărarea hematiilor), rezultatele fiind exprimate în unităţi de
concentraţie masică: g/L, g/dL, mol/L (1g/dL = 0,621mmol/L). Dacă
concentraţia Hb totale scade sub acest punct, este vorba de o anemie.
Determinarea Hb se face prin analiză sanguină şi urmărirea valorii
hematocritului care reprezintă volumul ocupat de hematii în cadrul
volumului sanguin.

Fig. 52. Modele de structură a catenei de hemoglobină

Se cunosc şase tipuri de lanţuri polipeptidice care pot fi întâlniţi în


formele de hemoglobină normală: alfa, beta, gamma, delta şi epsilon.
Lanţurile alfa au câte 141 de aminoacizi. Lanţurile beta, gamma,
delta şi epsilon au câte 146 de aminoacizi. Practic toate hemoglobinele au
câte 2 lanţuri alfa şi o pereche din tipuri de lanţuri beta, gamma, delta şi
epsilon.
Combinaţiile care iau naştere definesc tipuri de hemoglobină.

160
Fiecăreia dintre hemoglobine i se poate descrie o ,,formulă“, care
cuprinde simbolul lanţurilor, numărul lor şi tipul hemoglobinei. De exemplu
principala hemoglobină normală a adultului (A) cuprinde două lanţuri alfa şi
două lanţuri beta. Structura sa este notată: α2A, β2A.
Hemoglobinele umane normale sunt:
- embrionare: Grower 1 (ξ2, ε2), Gower (α2A, ε2), Pertland (ξ2, γ2)
- fetală: (α2A, γ2F)
- adulte: majoră, A (α2A, β2A) şi minoră, A2 (α2A, β2A).

Materiale necesare:
- ser fiziologic, apă distilată, pipetă de 5 sau 10 ml;
- balon Erlenmayer de 150 ml, eprubete de centrifugă, centrifugă.

Modul de lucru:
Sângele recoltat pe un anticoagulat este lăsat câteva ore pentru
sedimentarea hematiilor. Plasma supernatantă şi stratul subţire de globule
care se depune deasupra hematiilor se îndepărtează cu ajutorul unei pipete.
Se adaugă o soluţie izotonică (ser fiziologic – NaCl 0,15 M); se face
o centrifugare la 3000 rot./min. timp de 10 minute. Se repetă operaţiunea de
spălare şi centrifugare de două ori, de fiecare dată se îndepărtează
supernatantul şi se păstrează sedimentul.
După cele două spălări se obţine un sediment de celule eliberat de
plasma cu care erau amestecate. Se îndepărtează supernatantul şi se adaugă
apa distilată. Se lasă hematiile 10 minute în apă distilată, timp în care
acestea (hematiile) se umflă datorită osmozei, plesnesc, eliberând conţinutul
lor (hemoglobinei) în lichidul înconjurător.
Învelişurile hematiilor (,,fantomele“) şi resturile celulare se separă
printr-o centrifugare la 3000 rot./min. timp de 20 minute.

Rezultate:
Deoarece conţinutul globulelor roşii este reprezentat în cea mai mare
parte de hemoglobină, supernatantul constă practic dintr-o soluţie de
hemoglobină.
Această soluţie de Hb se titrează fotometric pentru a afla
concentraţia se citeşte extracţia la lungimea de undă 540 nm faţă de etalonul
de hemoglobină.
Pentru separarea diferitelor tipuri de hemoglobină se utilizează
cromatografia prin schimbători de ioni (CM Sephadex C50).

161
Fig. 53. Comparaţie între molecula de hemoglobină şi cea de clorofilă

162
LABORATOR 23

Evidenţierea histologică a histonelor şi în general a proteinelor bazice


prin tehnica de colorare cu verde intens FCF

Histonele sunt proteine cu greutate moleculară mică (11.000-21.000)


cu caracter bazic (sarcini pozitive) divizate în cinci clase: H1, H2A, H2b,
H3 şi H4. Ele au rol în organizarea moleculară a cromatinei.
La pH alcalin de 8,6 se formează o sare între gruparea acidă a
colorantului şi gruparea NH2 liberă de la diamino-aminoacizi. Această
reacţie conferă o colorabilitate selectivă a histonelor.

Materiale necesare:
- fixator Bouin, serie de alcool (50, 70, 90, 95, 100), benzol, (toluen),
- parafină (lichidă la 58-60), acid tricloracetic 5%,
- soluţie verde intens FCF 0,1%, NaOH 1 N, apă distilată,
- balsam de Canada, xilen, baie Laveran,
- pahare Borrel, cilindru gradat de 100 ml, pipete de 2,5 şi 10 ml,
- pahare Berzelius de 150 ml, lame, lamele, baghetă de sticlă, tifon,
- hârtie de filtru, bisturiu, foarfece, bec de gaz.

Prepararea reactivilor:

- formol neutru 10%: Neutralizarea se face folosind câteva bucăţele de


marmură care se menţin pe fundul vasului.
- soluţie de verde intens FCF: 0,1 g colorant; 100 ml apă distilată.
- albumină glicerinată: 50 ml albuş de ou; 50 ml glicerină; 1 g salicilat
de sodiu. Se agită puternic şi se filtrează prin pânză.

Modul de lucru
Se utilizează fragmente de organe sau ţesuturi proaspete, foarte mici.
Fixarea materialului biologic în formol neutru timp de 24 de ore.
Deshidratarea şi clarificarea se fac pentru scoaterea apei din ţesuturi
(apa este miscibilă cu parafina sau cu solvenţi ai parafinei). Deshidratarea se
face prin trecerea pieselor în băi succesive de alcooluri, din ce în ce mai
concentrate, până la alcoolul absolut (500, 700, 900, 950, 1000); clarificarea
se face prin spălarea pieselor în câteva băi de benzol sau toluen, pentru a
îndepărta alcoolul din ţesuturi şi a-l înlocui cu substanţe în care parafina este
solubilă; în cursul acestei operaţii piesele devin semitransparente (se
clarifică).

163
Incluziunea în parafină se realizează prin introducerea pieselor în 2-3
băi de parafină lichidă, la termostat la 580C, timp de 12-24 ore după mărirea
pieselor, pe o placă de sticlă încălzită se aşează două bare metalice, formând
un cadru în care se toarnă parafină lichidă. Rapid în parafina lichidă se
introduc piesele dându-le orientarea necesară în vederea secţionării lor după
un anumit plan. După solidificarea parafinei se fac blocuşoare mici,
îndepărtând restul de parafină. Impregnarea cu parafină a conferit piesei
consistenţa necesară în vederea secţionării.
Secţionarea la microtom se realizează prin plasarea pieselor pe
portobiectul microtomului, căruia i se imprimă o mişcare de înaintare spre
briciul care va secţiona piesa; se execută secţiuni de 8-10 microni; secţiunile
se aranjează pe un suport (hârtie, cutie etc.) în ordinea succesiunii lor.
Întinderea şi uscarea secţiunilor se face pe lame de sticlă pe care în
prealabil se întinde un strat subţire de albumină glicerinată; lamele se
încălzesc uşor având grijă să nu se topească parafina. În acest timp parafina
se ,,descreţeşte“ putând fi bine întinsă pe lamă; excesul de lichid se scurge
iar preparatele se pun la uscat în etuvă la 370C.
Deparafinarea şi hidratarea secţiunilor se realizează prin trecerea
preparatelor prin 2-3 băi de benzol sau xilon care dizolvă parafina din
secţiuni; prin băi succesive de alcooluri din ce în ce mai diluate, secţiunile
se hidratează deoarece coloranţii, în majoritatea lor, sunt soluţii alcoolice
sau apoase. Pentru a putea face colorarea cu verde intens FCF se trec
preparatele prin băi succesive de alcooluri (1 min/baie) 1000, 950, 700, etc.
până la apă distilată.
Tratarea cu acid tricloracetic 5% se realizează prin introducerea
pieselor pentru 15 minute în soluţie de acid tricloracetic 5% la fierbere. Prin
acest tratament acizii nucleici (ADN, ARN) sunt scindaţi şi trecuţi în soluţie
sub formă de nucleotide. Lamele se scot din acid tricloracetic şi se clătesc în
trei băi de apă distilată (2min/baie).
Colorarea. Piesele se plasează în colorant – soluţie verde intens FCF
0,1% la care s-au făcut corecţia de pH=8,6 cu NaOH 1 N. Colorarea pieselor
se face timp de o oră. După colorare piesele se clătesc în 2 băi de apă
distilată;
Deshidratarea şi clarificarea secţiunilor colorate se realizează
pentru obţinerea preparatelor de durată. Deoarece pentru includere se
utilizează balsamul de Canada, care nu este solubil în alcool sau apă
(pătrunse în ţesuturi) este necesară hidratarea cu băi de alcooluri de 95 şi
100 şi clarificarea în băi de xilon în care balsamul de Canada este solubil.
Montarea. Pe secţiunile scoase din ultima baie de xilon se pune o picătură de
balsam şi se acoperă cu lamela.

164
Fig. 54. Reprezentarea tridimensională a moleculelor de histone care intră în
structura nucleosomului – unitatea de structură a cromatinei

Rezultate:
Cromatina apare colorată în verde; zonele de citoplasmă care conţin
proteine bazine (ribozomi) apar colorate în verde.

165
LABORATOR 24

Localizarea intracelulară a calciului (tehnica de colorare


cu roşu de alizarină S)

În mediul acid, alizarina completează fosfatul de calciu sau calciul


liber cu formarea unor precipitate de alizarinat de calciu de culoare roşie-
orange (fig. 55).

Materiale necesare:
- fixator alcool-formol, tampon fosfat 0,2M, pH=7,0;
- trusa necesară tehnicii de secţionare şi impregnare în parafină;
- soluţie de roşu de alizarină S 0,2%, soluţie de amoniac diluată;
- pahare Borrel, baie Laveran, pipete de 2,5 ml;
- cilindru gradat de 100 ml;
- lame, lamele, microtom, etuvă (termostat).

Fig. 55. Secţiune prin rinichi de mamifer – depozite de calciu

Modul de lucru:
Ţesuturi sau celule libere sunt fixate în alcool-formol (alcool 70%,
formol 10%) sau formol tamponat (formol 10% în soluţie tampon fosfat

166
0,2M, pH=7,0). Piesele sunt incluse în parafină şi apoi secţionate la
microtom (secţiuni de 8-10 micromi).
Secţiunile sunt montate pe lamă, după care sunt deparafinate şi aduse
la apă.
Preparatele biologice se incubează într-o soluţie de roşu de alizarină
S în concentraţie de 0,2%, tamponată cu o soluţie diluată de amoniac, la un
pH=4,2. Incubaţia se face la temperatura camerei, timp de 30 minute.
Secţiunile se clătesc cu apă distilată, două băi a câte 2 minute/baie.
Deshidratarea, clarificarea şi montarea secţiunilor în balsam de
Canada.

Rezultate:
În structurile subcelulare, ionii de calciu apar sub formă de alizarinat
de calciu de culoare roşie-orange. Uneori membrana nucleară şi cromatina
apar colorate cu o tentă uşor roză.

167
LABORATOR 25

Determinarea activităţii glucozo-6-fosfat dehidrogenazei


(G-6PDH)

Enzima glucozei-6-fosfat dehidrogenază catalizează dehidrogenarea


glucozei-6-fosfat în NAD şi Mg rezultând 6-fosfat-glucono-
lactonă+NADPH+H+.
Activitatea enzimei se determină în funcţie de cantitatea de NADPH
format, care prezintă un maxim de absorbţie la lambda=340 nm; G-6PDH
este enzimă healoplasmică sau a citosolului.

Materiale necesare:
- tampon TRIS pH=7,5=0,2M, glucozo-6-fosfat (sare de sodiu sau
potasiu) 0,1M, clorură de Mg 2%, NADP 150 ml, extract tisular de
intestin.

Prepararea reactivilor:

NADP 3 mg/ml:
NADP – 3 mg; apă – 1 ml.

Prepararea extractului tisular


Se omogenizează un fragment de intestin de la un mamifer, în
soluţie izotonică de NaCl 6,5% în 0,2M tampon tri-HCl pH=7,4.
Omogenizarea se realizează cu un omogenizator Potter. Omogenatul obţinut
după 10 minute se centrifughează la 2500 tur./min. timp de 10 minute.
Supernatantul se utilizează în experienţă.

Modul de lucru:
Reacţia are loc în cuva spectrofotometrului. Cu o pipetă se pune în
cuva spectrofotometrului: tampon TRIS pH=7,5 – 1,4 ml, glucozo-6-fosfat
de Na-0,2 ml, clorură de Mg 2% - 0,4 ml, NADP – 0,4 ml, extract tisular –
0,4 ml.
Se măsoară densitatea optică la 30 secunde şi la 3 minute de la
adăugarea extractului tisular.

Rezultate:
- (extincţie la 3 minute – extincţie la 30 secunde) X 1000 =
unităţi/minut/ ml ext.

168
LABORATOR 26

Determinarea activităţii lactat-dehidrogenazei (LDH)

Este enzima care catalizează conversia acidului lactic în prezenţa


NAD rezultând acid piruvic + NADH + H+. LDH este enzimă
hialoplasmică sau a citosolului.
Metoda de dozare se bazează pe măsurarea vitezei de formare a
NADH care prezintă un maxim de absorbţie lambda=340 nm.

Materiale necesare:
- tapon fosfat de Na pH=8,8 0,1 M;
- lactat de Na 0,16 M, NAD 3 mg/ml;
- pipetă de 2 ml, baloane Erlenmayer de 150 ml.

Modul de lucru:
În cuva spectrofotometrului se pipetează: tampon fosfat de Na – 1
ml, lactat de Na – 0,5 ml, NAD – 1 ml, extract tisular – 0,2 ml.
Se determină densitatea optică a probelor la 30 secunde şi 3 minute
după adăugarea extractului tisular.

Rezultate:
Extincţia la 3 minute – extincţia la 30 secunde X 2000=
unităţi/min/ml extract tisular.

169
LABORATOR 27

Culturile celulare – modele experimentale moderne

Culturile de ţesuturi şi celule, domeniu de vârf în bilogia modernă,


sunt folosite în ultimii ani în tot mai multe laboratoare din lume pentru
elucidarea a numeroase probleme fundamentale şi aplicative ale biologiei
celulare normale şi patologice, ale fiziologiei, geneticii, agriculturii,
silviculturii şi industriei.
Ele reprezintă instrumente ideale pentru cercetările ce abordează
aspecte ale diferenţierii celulare şi morfogenezei, permit elucidarea
problemelor mai puţin cunoscute cu privire la natura şi semnificaţia
contactelor intercelulare şi a schimburilor de metaboliţi, formarea şi
funcţionarea plasmalemei şi a plasmodesmelor; dezvoltarea tensiunii şi
compresiunii în ţesuturile şi organele în curs de formare, etc.
Direcţii de cercetare interesante sunt cele care utilizează culturile de
celule pentru elucidarea problemelor legate de efectele şi mecanismele de
acţiune la nivel celular ale diferitelor substanţe chimice, testarea
pesticidelor, posibilităţile metabolizărilor, probleme legate de senescenţă,
etc.
În biologia experimentală, folosirea tehnicilor de culturi celulare ca
metode pentru propagarea vegetativă a făcut posibilă obţinerea de plante
libere de boli şi clonarea plantelor care se înmulţesc normal prin seminţe.
Un avantaj în plus este posibilitatea de multiplicare a hibrizilor
sterili, intensificarea ratei de propagare, scurtarea ciclului relativ lung la
plantele cu propagare vegetativă prin tuberculi, rizomi, bulbi. De o maximă
importanţă este descoperirea că la multe specii se pot obţine plante haploide
din antere (androgeneză) sau ovule (ovare) nefecundate (ginogeneză).
Importanţa decurge din faptul că celulele haploide sunt preferabile celulelor
heterozigote diploide sau poliploide în studiile genetice şi experimentale de
ameliorare.
Menţionăm, de asemenea, că a crescut mult interesul pentru folosirea
sistemelor de culturi celulare în scopul obţinerii la scară industrială de
produşi secundari de interes farmaceutic, cosmetic, alimentar.
În contextul acestor preocupări, un loc privilegiat ocupă protoplaştii
– care se pot obţine direct din plante în vegetaţie sau din culturi de calus şi
suspensii celulare. Protoplaştii proveniţi din celulele plantelor superioare
sunt instrumente importante pentru experimentele de hibridare somatică şi
inginerie genetică.

170
Prin fuzionări de protoplaşti ai unor celule somatice, se poate realiza
combinarea genotipurilor unor specii incompatibile sexual, deschizându-se
calea hibridării interspecifice îndepărtate.
În acelaşi timp, protoplaştii reprezintă un sistem ideal pentru
introducerea de material genetic străin în genomul unei specii premize
pentru transformarea dirijată a speciilor, deci de intervenţie a omului în
însuşi procesul evoluţiei.

Materiale necesare:
Culturile de celule şi ţesuturi se prepară într-un spaţiu de lucru steril,
amenajat special, ce include instalaţie de apă curentă, gaze, electricitate.

Laboratorul de culturi ,, în vitro“ trebuie să cuprindă:


1. Arie de lucru sterilă
2. Sticlărie şi vase de laborator
3. Instrumente chirurgicale diferite
4. Dispozitive de curăţat şi sterilizare
5. Hotă cu flux laminar de aer steril
6. Termostat, incubator
7. Aparate de distilat şi bidistilat apă
8. Balanţă analitică, balanţă tehnică
9. Agitator magnetic, pH-metru, frigider
10. Platformă sau instalaţie de agitare
11. Instalaţie de vid
12. Microscoape, stereolupe
13. Cameră de creştere
14. Mobilier
15. Substanţe chimice

Spaţiul de lucru steril necesită o iluminare adecvată, un trafic scăzut


de aer, suprafeţe de lucru uşor de curăţat, o hotă cu flux laminar şi tălpi de
ultraviolete.
Sticlăria trebuie să fie neutră, perfect transparentă, fără
neregularităţi; se împarte în recipiente speciale în care se fac culturile şi în
sticlărie obişnuită de laborator. Instrumentele trebuie să fie fine: bisturie,
lame sterile, pense, foarfeci chirurgicali.
Dispozitivele de curăţat şi sterilizat includ autoclave, un cuptor de
sterilizare şi spălătorie. Pentru stocarea sticlăriei curate sau sterile se
folosesc rafturi sau dulapuri; sticlăria se păstrează împachetată în hârtie.
Pentru stocarea mediilor de cultură, a serului, a substanţelor şi preparatelor
uşor alterabile se utilizează frigiderul sau o cameră frigorifică.
171
Hota cu flux laminar de aer steril trebuie să fie suficient de mare
pentru a putea pregăti mijloacele necesare preparării culturilor, cu o bună
iluminare şi un sistem de lumină UV pentru sterilizarea aerului.
Sursa de apă pentru clătire va fi pură, pentru acesta fiind necesare un
dezionizator, un aparat de sticlă pentru distilat şi un al doilea pentru
bidistilarea apei.
Reuşita culturilor de celule ,,in vitro“ depinde în mare măsură de
pregătirea stilcăriei, spălarea şi sterilizarea ei, de pregătirea instrumentarului
şi în special de tehnicile aseptice aplicate.
Tehnicile aseptice presupun următoarele reguli:
- accesul limitat în zona de culturi celulare;
- suprafeţele se decontaminează cu etalon 70% înainte şi după
utilizare;
- nu se pipetează cu gura, nu se mănâncă, nu se fumează în zona de
lucru;
- hainele de protecţie (halat, bonetă, mască etc.) se folosesc numai în
cadrul incintei, fiind interzisă purtarea lor şi în afara ei;
- se spală mâinile înainte şi după operaţii, iar părul se leagă;
- se controlează emisiile de aer, se sterilizează incinta cu lămpi UV.

Modul de lucru:
La baza cercetărilor care folosesc ca model experimental culturile
celulare stă capacitatea de diferenţiere, rediferenţiere şi totipotenţă proprie
celulei vegetale, ceea ce conferă posibilitatea regenerării unui organism în
condiţii controlate, pornind de la celule somatice de diverse origini.
În biologia vegetală, tehnicile de culturi de celule şi ţesuturi se
bazează în esenţă pe obţinerea de calusuri (mase de celule nediferenţiate)
pornind de la explante (fragmente de ţesut) din diferite organe ale plantei
(rădăcini, tulpină, frunze, antere, ovare, muguri etc.) inoculate aseptic pe
medii nutritive standard şi inoculate la temperatură şi lumină controlate.
Una din cele mai importante etape ale acestei tehnologii constă în
alegerea şi prepararea mediului de cultură. Mediul de cultură conţine
componente esenţiale: apă, săruri organice, o sursă de carbon (zaharoză sau
glucoză), vitamine, fitohormoni şi componente opţionale: azot organic, acizi
organici, extracte de diferite origini.
Fitohormonii sunt fie substanţe naturale, produse de plante – caz în
care sunt clasificaţi ca endogeni – fie substanţe de sinteză cu efect similar.
Principalii regulatori de creştere (fitohormoni) utilizaţi pentru culturile ,,in
vitro“ sunt auxinele, citochininele şi giberelinele. Toate aceste categorii de
fitohormoni au următoarele caracteristici comune: acţionează în doze mici,

172
reacţionează în mod specific la nivel celular - ţintă prin intermediul unor
receptori, acţionează în echilibru unii cu ceilalţi, induc efecte variabile în
funcţie de concentraţiile utilizate iar în doze mari se pot dovedi inhibitori
sau chiar toxici.
Auxinele. În afară de auxina naturală – acidul indolil acetat (AIA)
sunt utilizate şi auxine sintetice: acidul 2-4 diclorfenoxiacetic(2,4D), acidul
naftic acetic (ANA), acidul indolil butiric (AIB), acidul naftoxiacetic
(ANO). Auxinele induc formarea calusului, organogeneza şi embriogeneza.
Citochininele. Sunt, de asemenea, fie compuşi endogeni – zeatina,
isopentoniladenina sunt, fie substanţe de sinteză – benziladeina (BA) sau
benzil aminopurina (BAP), kinetina (6-furfuriladeina sau 6-
furfurilaminopurina). Adăugate în mediul de cultură stimulează
metabolismul şi diviziunea celulară, favorizând diferenţierea mugurilor
(efect caulogen).
Giberelinele. Au acţiune similară şi sinergetică cu a auxinelor.
Dintre gibereline acidul giberelic (GA3) inhibă rizogeneza la lumină în timp
de la întuneric, în asociaţie cu auxina, o stimulează; influenţează, de
asemenea, alungirea zonei aplicate axiale a materialului caulinar. La multe
specii evoluţia in vitro a culturii nu necesită prezenţa GA3.
De regulă, concentraţii mai mari de auxină faţă de citochinină
favorizează creşterea rădăcinilor (rizogeneza), un raport invers stimulează
formarea de tulpini (caulogeneza), iar raportul 1:1 favorizează creşterea
calusului (calusogeneza). De multe ori, concentraţii crescute de auxină şi
scăzute de citochinină determină, de asemenea, formarea calusului.
Frecvent, pentru introducerea calusului se utilizează 2,4D în cantitate de 1-
2mg/l.
Cel mai utilizat mediu de cultură pentru cultura celulelor vegetale
este mediul Murashige-Skoog (MS, 1962). Acest mediu se caracterizează
printr-o concentraţie ridicată de săruri. Prin manipularea balanţei hormonale
se pot realiza diferite variante de mediu.
Tabelul de mai jos prezintă compoziţia mediului de cultură
Murshige-Skoog, 1962:

Nr.crt. Componente Cantitate


Macroelemente
1 Ca(NO3)2 X 4H2O -
2 KNO3 1900
3 NH4NO3 1650
4 KCl -
5 KH2PO4 170
6 NaH2PO X 4H2O -

173
7 CaCl2 X 2H2O 440
8 MgSO4 X 7H2O 370
9 Na2SO4 -
Microelemente
1 Fe2(SO4)3 -
2 FeSO4 X 7H2O 27,8
3 Na2EDTA 37,3
4 MnSO4 X 4H2O 22,3
5 H3BO3 6,2
6 ZnSO4 X 4H2O 8,6
7 KI 0,83
8 Na2MaO4 X 4H2O 0,25
9 CuSO4 X 5H2O 0,025
10 CaCl2 X 6H2O 0,025
Compuşi organici
1 Biotonă -
2 Glicerină 2,0
3 Inozitol 100
4 Acid micotireic 0,5
5 Piridoxină - HCl 0,5
6 Tiamină – HCl 0,1
7 Acid falic -
8 Zaharoză 30.000

Explantul sau fragmentul de ţesut ce urmează a fi cultivat in vitro


este prelevat de pe o aşa-numită ,, plantă mamă“. Acest fragment poate fi
izolat din orice parte a organului vegetal cu condiţia să conţină ţesuturi vii.
Dintr-o primă categorie fac parte explantele ce conţin celule nediferenţiate.
Este cazul celulelor maristematice caulinare sau radiculare (mai rar
utilizate), ce-şi pot păstra tipul de funcţionare pe parcursul întregii vieţi a
plantei. Pentru cultivarea unor asemenea explante (apex, muguri, noduri sau
însuşi meristeme) mediul trebuie să permită doar declanşarea funcţionării
celulelor de aşa manieră încât ,,programul“ lor să se desfăşoare normal.
O a doua categorie regrupează explantele constituite din ţesuturi
diferenţiate, ale căror celule sunt specializate. Mediile destinate cultivării
acestei categorii de explante trebuie să inducă dediferenţierea sau pierderea
specializării, apoi redobândirea capacităţii de diviziune şi, în sfârşit,
constituirea unei structuri meristematice.
Iniţierea culturilor trebuie realizată în condiţii de sterilitate totală.
Este necesară atât sterilizarea ţesuturilor prelevate de la organismul vegetal
– care se realizează atât sterilizarea ţesuturilor prelevate de la organismul
vegetal – care se realizează cu ajutorul unor sterilizări de suprafaţă
(hipoclorit de calciu sau sodiu; clorură mercurică etc.) – cât şi manipularea
materialului sterilizat în aşa fel încât să fie exclusă orice recontaminare
174
ulterioară. Această problemă este soluţionată prin efectuarea diverselor
manipulări sub hote speciale unde aerul filtrat şi pulsat în hotă este steril.
Incubarea culturilor se realizează în incinte climatizate, cu regim
fotoperiodic şi termic reglabil.
Regenerarea plantelor din ţesuturile şi celulele cultivate in vitro se
poate realiza pe două căi: prin organogeneză somatică (via mugure) şi prin
embriogeneză somatică (via embrion somatic nonzigotic).
Prima cale presupune fie diferenţierea mugurilor adventivi direct pe
explant (organogeneză directă), fie parcurgerea mai întâi a etapei de calus şi
apoi, prin modificarea componenţei hormonale din mediul de cultură,
aceasta să parcurgă un proces de diferenţiere, mai mult sau mai puţin
intens, generând muguri (organogeneză indirectă). Lăstarii care se dezvoltă
din muguri trebuie separaţi şi transferaţi pe mediul de înrădăcinare.
A doua cale de regenerare – embriogeneza – constă în iniţierea
formării embriozilor în calus, din celule izolate sau din agregate celulare în
suspensie. Deşi se dezvoltă din celule somatice, embrioizii astfel formaţi
parcurg în dezvoltarea lor aceleaşi etape ca şi embrionii produşi pe cale
sexuală. Pe medii de cultură adecvate embrionizii formează plante.

175
LABORATOR 28

Protocol pentru inducerea şi creşterea calusului


la Daucus carota L.

Obţinerea de calus devine un scop principal când se urmăreşte


iniţierea unei culturi de celule, iar din aceasta a unei culturi de protoplaşti.
Instabilitatea genetică a celulelor care constituie calusul şi
poliploidizarea lor în anumite condiţii de cultură, fac din calus, ca şi din
cultura de celule, un material biologic asupra căruia agenţii mutageni şi
factorii stresanţi pot opera modificări permiţând selecţionatorului să obţină
forme utile.
Creşterea calusului este considerată ca fiind nedefinită, deoarece el
poate fi înmulţit şi cultivat prin subculturi periodice (la 4-6 săptămâni) pe
mediu proaspăt, asigurându-se astfel şi conservarea vitalităţii celulelor sale.
Calusul care se dezvoltă dintr-un explant vegetal se numeşte calus primar,
cel subdivizat şi replicat se numeşte calus secundar.
Calusul tipic, eliberat de influenţa explantului parental, poate fi
utilizat ca atare în studii biochimice, citologice, metabolice ca şi în
experimentele de multiplicare clonală.

Materiale necesare:
- rădăcini de morcov, mediu de cultură MS cu 2,4D 2 mg/l, apă
distilată;
- clorură mercurică 1% cu adaus de Tween 20 2-3 picături/l;
- hotă cu flux laminar (cu aer steril);
- baloane Erlenmayer de 250, 100 şi 700 ml;
- baloane cotate de 1000 şi 500 ml;
- pipete gradate de 1 ml şi 2 ml, pâlnii;
- cutii Petri cu diametrul de 10-20 cm;
- hârtie de filtru, pense, bisturie, lampă de spirt;
- alcool , tifon, creion pentru scris pe sticlă, folie staniol;
- etuvă, balanţă analitică şi tehnică;
- autoclav, pH-metru de laborator.

Modul de lucru:
Se execută mediul de cultură MS, 1962, conform reţetei, la care se
adaugă 2mg/l 2,4D; se pregătesc baloane cu apă distilată şi se sterilizează
totul la autoclav, la 1200C timp de 30 minute; sticlăria destinată manipulării
materialului biologic la hotă se sterilizează la etuvă, la 1200C timp de o oră,

176
după ce în prealabil a fost perfect spălată şi uscată; se sterilizează şi câteva
cutii Petri cu hârtie de filtru (în straturi suprapuse).

Fig. 56. Cultura de calus (stânga) şi regenerarea de plante din calus (dreapta)

Materialul vegetal (rădăcini de morcov) se spală şi se dimensionează


pentru a fi mai uşor de manipulat.
La hota sterilă fragmentele de rădăcini se sterilizează cu o soluţie de
clorură mercurică 1% cu adaos deTween 20, care se spală repetat
(aproximativ de 3 ori) cu apă distilată sterilă şi răcită, pentru îndepărtarea
agentului sterilizant foarte toxic.
Se scot rădăcinile de morcov într-un Petri, pe o hârtie de filtru sterilă
şi se operează secţionarea lor transversală în discuri de 2 cm înălţime, cu
instrumente (în prealabil aseptizate) proaspăt flambate (pensă, bisturiu) şi
răcite.
Se decupează apoi fragmente echivalente de ţesut (cuburi sau
cilindri), astfel încât inelul cambial să devină un amplasament central, iar de
o parte şi de alta a cambiului să se găsească aceeaşi cantitate de ţesut
conducător, respectiv liber şi lemn secundar.
Explantele de rădăcină de morcov se introduc în vase cu mediul de
cultură (Erlennmayer 100 ml).
Dacă mediul de cultură folosit este solid (cu agar) explantele se
orientează astfel încât cambiul să ocupe o poziţie perpendiculară pe mediu.
În cazul mediilor lipsite de agar, acestea trebuie agitate, aerate pe un
agitator.
177
Pe fiecare vas de cultură se notează genotipul avut în lucru, varianta
de mediu şi data înlocuirii.
Incubarea inoculilor se face în camere special amenajate – camere de
creştere – în regim de fotoperioadă 16 ore şi la o temperatură de 23-25 0C.

Rezultate:
Se observă periodic procesele de formare şi creştere a calusului.
Periodic (la cca. 4-6 săptămâni) calusul se repică (fragmentează) şi se
pasează (transferă) pe medii proaspete; se va ţine o evidenţă strictă a
numărului de repicaje suportate de către fiecare unitate de ţesut calusal.
Când se urmăreşte regenerarea de plante din calus, se recurge la mediul de
diferenţiere, cu alte concentraţii de hormoni (fig. 56).

178
LABORATOR 29

Protocol pentru inducerea şi creşterea calusului


la Nicotiana tabacum L.

Celulele ţesutului calusal pot fi legate între ele sau mai laxe, formând
un calus friabil, grunjos (separabil în fragmente sau mai greu dezagreabile)
ori scuamos (care se separă în fragmente tisulare fine), acesta fiind mai
adecvat pentru iniţierea unei culturi de celule. Consistenţa şi friabilitatea
calusului depind de specie, natura organelor, vârsta acestora, hormonii
utilizaţi şi uneori şi de condiţiile de cultură.
Capacitatea organogenă sau embrionară a ţesutului calusal este
dependentă de factori endogeni sau exogeni, cât şi de numărul replicajelor
făcute. Un rol important îl are şi vârsta calusului. Unele calusuri vor
regenera plantule şi după 5 ani (la tutun), alte plante, cum sunt cerealele, au
o capacitate organogenă mult mai scăzută.

Materiale necesare:
- tulpini de tutun de la plante neînflorite sau tulpini de la plante tinere,
fragmente de peţiol;
- mediu de cultură MS, 1962, cu adaos de Tween 20, hotă sterilă;
- balanţă analitică şi tehnică, etuvă, autoclav, baloane Erlennmayer de
100, 250, 750 ml, baloane cotate de 1000 şi 500 ml, cutii Petri de 10-
20 cm3, pipete gradate de 1 şi 2 ml, pâlnie, hârtie de filtru, pense,
bisturie, lampă de spirt, alcool, tifon, creion pentru scris pe sticlă.

Modul de lucru:
Se prepară mediul de cultură conform reţetei; se pregătesc baloanele
cu apă distilată şi se sterilizează totul la autoclav la 1200C timp de 30
minute; se sterilizează sticlăria – baloane Erlennmayer de 100, 250 ml, cutii
Petri – destinate manipulării materialului biologic la hotă, la etuvă la 1200C
timp de 1 oră; se sterilizează şi câteva cutii Petri cu hârtiile de filtru (în
straturi suprapuse). Dacă materialul biologic folosit pentru inducerea
calusului este reprezentat de ţesut medular, se procedează astfel:
- treimea mijlocie a tulpinii (de la plante neînflorite, de aproximativ 1
m înălţime) se taie în segmente de 3-5 cm;
- segmentele de tulpină se sterilizează cu clorură mercurică timp de 10
minute după care se spală repetat cu apă distilată sterilă;
- se extrage măduva şi se taie în segmente de 3 mm lungime;

179
- segmentele de măduvă se pun pe mediul de cultură (în prealabil
turnat şi răcit în vase Erlennmayer de 100 ml).
După sterilizare materialul biologic se manipulează la hotă cu
instrumentar steril inserat în alcool, flambat şi răcit; dacă nu sunt disponibile
tulpini mari, bogate în conţinutul medular, se utilizează tulpini de la plante
tinere sau fragmente de peţioluri. Pentru sterilizare se folosesc procedee
anterioare. Segmentele se secţionează longitudinal pe diametru în bucăţi de
3-4 mm şi se plasează cu partea plană în jos pe mediul de cultură. Incubarea
vaselor de cultură cu explantele se face în camera de creştere, la întuneric şi
temperatură 26-28 0C.
Rezultate:
La 3-4 săptămâni după izolarea iniţială a ţesuturilor apar, în mod
normal, creşteri considerabile ale explantelor de măduvă. Creşterea este mai
redusă, iar calusul friabil, atunci când explantele iniţiale au fost constituite
din segmente de tulpini mici. În general, de pe ţesutul iniţial pot fi desprinse
fragmente de calus de 20-50 mg, care, trecute pe un mediu identic, dau
naştere unor linii de calus uniforme. Pentru regenerarea de plante sunt
necesare alte variante hormonale şi condiţii de creştere (fig. 57).

Fig. 57. Calus embriogen (stânga) şi embrioni somatici (dreapta).

180
LABORATOR 30

Protocol pentru obţinerea unei suspensii celulare


din calus de Daucus carota L.

O cultură de celule poate fi obţinută pe mai multe căi; cea mai


uzuală metodă constă în realizarea în mediu de cultură lichid a unei
suspensii utilizând ca material iniţial calus – de preferinţă friabil – pentru ca
să se realizeze o dispersare a celulelor şi a agregatelor ce alcătuiesc masa de
calus, condiţie ce poate fi îndeplinită prin efectuarea unor subculturi repetate
de calus, pe medii cu balanţă hormonală adecvată în acest sens. Dacă nu
există indicaţii exprese, potrivite unui anumit tip de explant, se va utiliza
2,4D (acidul 2,4 diclofenoxiacetic), în concentraţii variate.
O altă metodă constă în omogenizarea organelor plantelor
(hipoclorit, vârf de rădăcină etc.) prin trituarare moderată, în omogenizator
de sticlă şi apoi inocularea pe mediul lichid al suspensiei de celule rezultate.
Alteori, se folosesc metode de liză enzimatică a lamelei mijlocii, de pectină
de calciu (care cimentează celulele în ţesuturi). Fireşte că, o cale de obţinere
a suspensiilor celulare o constituie cultura de protoplaşti.
Cultura de celule prezintă avantaje deosebite în efectuarea unor
studii aprofundate – la nivel celular, privind aspectele încă necunoscute ale
creşterii, ale metabolismului celular, permiţând executarea unor experimente
şi modelări genetice, etc. Deşi nici una din celulele dintr-o suspensie
celulară nu corespunde morfologic (celulele devin sferice, asemănătoare
algelor) şi fiziologic cu vreuna din tipurile de celule aparţinătoare corpului
plantei, din fiecare celulă cultivată in vitro există potenţialitatea generării
unei plante. Cultura de celule se constituie într-o populaţie omogenă de
celule în care poate fi indusă o variabilitate genetică şi pot fi selectate
mutante utile, în urma expunerii la acţiunea unor anumiţi agenţi fizici sau
chimici. Prin cultura de celule se produc substanţe de utilizate în industria
de medicamente, industria alimentară, industria chimică, etc. (produşi
secundari, pigmenţi, enzime, etc.).
Un aspect particular îl constituie capacitatea celulelor cultivate in
vitro de a transforma precursori sau anumiţi compuşi prezenţi în mediul de
cultură. Biotransformarea poate fi utilizată pentru diferite tipuri de reacţii:
hidroxilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiţie de carbon, etc.
Cel mai mare interes îl prezintă problema găsirii unor tehnici care să asigure
o extindere a fazei exponenţiale de creştere a culturilor celulare, cu
compoziţie celulară şi cu activitate metabolică constantă, controlabilă şi
reglabilă.

181
Materiale necesare:
- calus de morcov, mediul de cultură Murashige Skoog (MS) 1962 cu
adaos de 2,4 D x 10-8 g/ml, dispozitiv de mişcare rotativă în plan
orizontal, condiţii sterile de lucru (hotă cu flux laminar);
- cilindru gradat de 50 sau 100 ml, pipete de 10 ml, baloane
Erlennmayer de 250 ml.

Modul de lucru:
Se ia 1 g de calus şi se introduce într-un vas Erlennmayer de 250 ml
conţinând 60 ml mediu MS cu adaos de 2,4 D. Flaconul se asamblează pe
un dispozitiv cu mişcare rotativă în plan orizontal (şeicăr) cu 80-100
rotaţii/minut, la întuneric sau la lumină slabă şi temperatură de 250C. După
7 zile, în condiţii sterile se introduc 100 ml de mediu proaspăt aseptic. Se
lasă cultura să se sedimenteze timp de 10 minute, apoi se îndepărtează
supernatantul şi reziduul se trece într-un flacon de 250 ml cu 60 ml mediu
proaspăt. Flaconul se reaşează pe platforma rotativă.

Rezultate:
Menţinerea culturii se realizează prin transferuri repetate la interval
de 7 zile, pe mediu de cultură proaspăt, în condiţii sterile. Densitatea optimă
este de 105 – 3 x 105 celule/ml sau100 – 300 mg (greutate proaspătă) de
inocul în 60 ml mediu proaspăt. După 3-4 subculturi, reinoculările se pot
face transferând 10 ml din suspensia celulară (cu cilindru sau pipetă largă)
în 50 ml mediu proaspăt (după Reinert şi Yeoman, 1982).

182
LABORATOR 31

Protocol pentru izolarea protoplaştilor din suspensii derivate din


culturi de Nicotiana tabacum var. bright yellow

Termenul de protoplast defineşte acea parte din celula vegetală care


poate fi plasmolizată şi izolată, înlăturând peretele celular prin procedee
mecanice sau enzimatice. Lipsit de peretele celular, protoplastul devine apt
pentru o serie de manipulări experimentale ce nu pot fi aplicate celulelor
intacte, cum sunt: transferul de organite celulare, microorganisme sau
material genetic străin pentru producerea de celule modificate genetic,
formarea celulelor hibride somatic şi/sau a plantelor prin fuzionarea unor
protoplaşti cu diverse caracteristici genetice, selecţia unor linii rezistente la
diferiţi agenţi patogeni, compuşi toxici, studiul proceselor de pătrundere,
infecţie şi replicare a virusurilor, studiul specificităţii şi modului de acţiune
al patogenilor fungici şi bacterieni ai plantelor, etc.
Suspensiile celulare tinere, în creştere, constituie un material ideal
pentru izolarea protoplaştilor în cantităţi mari.

Materiale necesare:
- cultură de celule de Nicotiana tabacum; soluţie de enzime (0,2%
macerozină R-10; 1% celulază Onozuka R-10; 0,5 manitol), cu
pH=5,7; HCl 1N; manitol 0,7 M; baloane Delong de 50 ml;
centrifugă; agitator (shaker); condiţii de lucru sterile (hota cu flux
laminar).

Fig. 58. Protoplaşti de Nicoţiana tabacum.

183
Modul de lucru:
- centrifugarea suspensiei celulare la 300 rpm, 10 minute;
- resuspendarea a 500 mg celule în soluţie de enzime ajustat cu 0,1
HCl 1N sau NaOH în baloane Delong de 50 ml;
- agitarea soluţiei pe un agitator (50-100 rpm, 3-4 ore la 270C;
- centrifugarea la 100 rpm, 2 minute şi resuspendarea protoplaştilor în
manitol 0,7M;
- spălarea protoplaştilor de 3 ori cu manitol 0,7M (după Uchimya şi
Murashige, 1974).

Determinarea viabilităţii protoplaştilor la microscopul optic


O picătură din suspensia de protoplaşti se pune pe lamă şi se acoperă
cu o lamelă. Protoplştii viabili, preparaţi în condiţii de presiune osmotică
redusă, prezintă curenţi citoplasmatici clari (o mişcare ordonată a
mitocondriilor şi microcorpusculilor); mişcarea este browniană.
În cazul protoplaştilor izolaţi în condiţii de presiune osmotică
ridicată, curenţii protoplasmatici sunt mai grau de observat, deoarece
cloroplaştii formează un perete continuu la periferia protoplastului sferic,
ascunzând conţinutul. Totuşi, însăşi forma sferică, ca de altfel şi existenţa
acestui perete indică faptul că protoplaştii sunt viabili. Protoplaştii neviabili
au o formă neregulată şi cloroplaştii sunt aglomeraţi în grămezi
dezordonate.

Rezultate:
Colorarea protoplaştilor cu coloranţi vitali.
Capacitatea de a fixa asemenea coloranţi cum este, de exemplu, roşul
neutru, poate constitui un indiciu clar al viabilităţii protoplaştilor.

184
LABORATOR 32

Determinarea numărului de clule dintr-o suspensie


utilizând hemocitometrul

Rata de creştere a numărului de celule în decursul ciclului de


creştere a culturii celulare se modifică din momentul iniţierii culturii, până
la oprirea diviziunilor celulare. O primă fază după inoculare, constă într-o
întârziere a declanşării proceselor de multiplicare şi de creştere celulară, dar
în următoarele 10 zile numărul de celule şi greutatea uscată a acestora per
unitate de volum, cresc exponenţial după care urmează faza staţionară şi, în
final, de declin. Faza exponenţială de creştere este denumită şi creştere
logaritmică şi se caracterizează ca o perioadă finită de timp în care rata de
creştere a biomasei raportată la unitatea concentraţiei de biomasă (rata
creşterii specifice), este constantă şi măsurabilă. Faza de creştere
exponenţială este extinsă în condiţiile în care este iniţiată cu o densitate
scăzută a celulelor per unitate de volum.
Cultura de suspensii celulare se menţine prin inocularea unei
anumite cantităţi de mediu, cu densitate de celule cunoscută, dintr-o cultură
deja existentă, diluând-o cu mediu proaspăt. Densitatea celulelor în
subcultură iniţial nu trebuie să depăşească 0,5-2,5 x 105 celule/ml; în decurs
de 18-25 de zile densitatea va creşte în unele culturi până la 4 x 105
celule/ml; există şi tipuri de celule la care creşterea densităţii culturii se
produce în 6-9 zile.
Cel mai mare interes îl prezintă problema găsirii unor tehnici care să
asigure o extindere a fazei exponenţiale de creştere a culturilor celulare, cu
compoziţie celulară şi cu activitate metabolică constantă, controlabilă şi
reglabilă. În acest scop, cunoaşterea densităţii celulare per unitate e volum
este deosebit de importantă.
Numărătoarea celulelor dintr-o suspensie se face direct la microscop,
utilizând o cameră de numărat – hemocitometrul – numărând celulele aflate
într-un volum cunoscut de lichid, diluat într-o proporţie cunoscută. (figurile
59, 61). Hemocitometrul se foloseşte, de asemenea, pentru numărarea
elementelor figurate din sânge, aspect foarte important în stabilirea stării de
sănătate sau boală.

Materiale necesare:
- suspensie celulară;
- mediu de cultură (soluţie nutritivă);
- hemocitometru;

185
- pipetă Pasteur (sau cu vârf ascuţit);
- hârtie de filtru.

Modul de lucru:
Se prepară o suspensie celulară în mediu de cultură sau soluţie
nutritivă, conţinând aproximativ 2-5 x 105 celule/ml;
Se aplică lamela pe lama camerei de numărat, fie prin simplă
adeziune, fie cu ajutorul cavalerilor. Dacă camera nu are cavaleri, lama se
va umezi uşor pe margini, aburindu-se şi astfel aderă bine;
Cu o pipetă Pasteur (sau o pipetă cu vârf ascuţit) se va transfera o
mică cantitate de suspensie celulară în ambele camere ale hemocitometrului,
astfel: se agită pipeta timp de 2-3 minute, apoi primele picături sunt lăsate să
cadă pe o hârtie de filtru. Vârful pipetei se apropie de marginea camerei şi
se lasă să intre prin capilaritate în ambele camere ale hemocitometrului o
cantitate de lichid, în spaţiul format între lamă şi lamelă (fig. 60); este de
dorit să se introducă dintr-o dată atâta lichid încât spaţiul dintre lamă şi
lamelă să fie umplut în întregime, fără ca lichidul să treacă în şanţurile
laterale, fără ca lamela să se deplaseze, fără să intre bule de aer în cameră; în
caz contrar, operaţia se repetă după ştergerea camerei. Se aşteaptă câteva
minute sedimentarea celulelor pe grilaj;
Se examinează hemocitometrul la microscop; se începe
numărătoarea cu prima cameră a hemocitometrului şi se numără toate
celulele din pătratul din centrul camerei de 1 mm (figurile 61, 62, 65) şi din
pătratele de 1 mm din colţurile camerei (figurile 63, 64).
Notă: se numără celulele de sus şi stânga care ating mijlocul liniei
perimetrului fiecărui pătrat; nu se numără celulele care ating mijlocul
perimetrului din partea de jos şi dreapta, conform fig. 63. Se numără cele 4
pătrate din colţuri şi pătratul din mijloc în ambele camere; dacă mai mult de
10% dintre celule apar agregate, se repetă întreaga procedură, asigurându-se
o bună dispersare a celulelor prin agitarea suspensiei de origine şi printr-o
pipetare viguroasă. Dacă mai puţin de 200 sau mai mult de 500 de celule
(aprox. 20-50/pătrat) sunt observate în 10 pătrate, se repetă întreaga
procedură ajustând factorul de diluţie la unul potrivit. În fig. 61 – diagrama
unei camere standard – cercul indică suprafaţa aproximativ vizibilă la
microscop, mărire 100 x (10 x ocular şi 10 x obiectiv).

Rezultate:
Determinarea numărului de celule
Fiecare pătrat de 1 mm al hemocitometrului, acoperit cu
lamela, reprezintă un volum total de 0,1 mm3 sau 10-4 cm3. Dacă

186
1 cm3 este echivalentul la 1 ml, concentraţia celulelor/ml ( şi deci numărul
total de celule) va fi determinat astfel:

CELULE per ml = numărul mediu de celule per pătrat x


factorul de diluţie x 104

Exemplu:
Dacă numărul total de celule/pătrat este de 45 celule x 104 = 4,5 x 105
celule/ ml.

TOTAL CELULE = celule per ml x volum iniţial al suspensiei


celulare

Exemplu:
4,5 x 105 (celule/ml) x 10 ml (volum iniţial al suspensiei celulare)= 4,5 x
105 celule.
Pentru siguranţa acurateţii numărului, întreaga operaţiune se repetă
încă o dată.

Fig. 59. Schema unui hemocitometru

187
Fig. 60. Hemocitometru cu cele două camere goale şi pline cu suspensie
(sus); modul de umplere a camerei (la mijloc); umplerea unei camere de
numărat (jos).

188
Fig. 61. Diagrama unei camere standard a hemocitometrului

Fig. 62. Modul de numărare al celulelor

189
Fig. 63. Aspectul mărit al unui pătrat din colţul camerei

Fig. 64. Exemplu de procedeu de numărare pentru spermatozoizi.

190
Fig. 65. Imaginea plasării celulelor dintr-o suspensie în perimetrul
unui pătrat la microscopul optic

191
LABORATOR 33

Protocol pentru cultura şi regenerarea


protoplaştilor la plante

În privinţa regimului de nutriţie, protoplaştii izolaţi au aceleaşi


exigenţe ca şi celulele şi ţesuturile cultivate. În absenţa peretelui celular,
protoplaştii sunt încă foarte eficienţi în prelucrarea nutrienţilor de mediu.
Din această cauză, mediile nutritive utilizate pentru cultura protoplaştilor
sunt modificate, conţinând cantităţi mici de săruri minerale.

În principiu, un mediu conţine:


a) stabilizatori osmotici;
b) sursă de carbon;
c) vitamine;
d) azot organic;
e) nutrienţi anorganici;
f) reglatori de creştere.

Materiale necesare:
- mediu pentru cultura protoplaştilor;
- mediu pentru diferenţiere (inducerea lăstarilor sau embrionilor);
- mediu pentru înrădăcinarea lăstarilor; zaharoză 0,3M;
- baloane DeLong de 50 ml; tuburi de centrifugă de 25x150 ml;
- vase Petri de 10x55mm; pământ sterilizat, ghivece; pipete de 10 şi
25 ml;
- condiţii sterile de lucru (hotă cu flux laminar);
- cameră de cultură cu parametrii controlabili (lumină, temperatură,
umiditate etc.);
- etuvă, autoclav, pH-metru;
- tifon, hârtie de filtru, pense, pipete de 2 şi 5 ml,
- balanţă analitică şi tehnică, alcool etilic de 700.

Modul de lucru:
Uchimiya şi Murashige (1974) au regenerat plante de tutun pornind
de la protoplaşti izolaţi din suspensie celulară folosind o metodă ce
comportă următoarele operaţiuni (fig. 66):
- transferul protoplaştlor în baloane Delong de 50 ml, care conţin 5 ml
mediu de cultură pentru protoplaşti (tabelul); fiecare balon trebuie să conţină

192
aproximativ 5 x 105 protoplaşti; incubarea, fără agitare, la 270C, la 1000 lx,
timp de 16 ore;

Fig. 66. Etapele de izolare şi cultură a protoplaştilor


(după Cachiţă-Cosma, 1984)

- adăugarea după 1-2 săptămâni a unui volum egal de mediu de


cultură proaspăt, care conţine 1,6% agar, în locul manitolului se utilizează
zaharoză 0,3M;
- trecerea unui volum de 2-3 ml din suspensia celulară în vase Petri
sterile de 10 x 55 mm; după incubare, timp de 1-2 luni, pot fi obţinute

193
calusuri cu un diametru de 2-3 mm; transferul calusurilor în tuburi de
cultură de 25 x 150 mm care conţin 25 ml mediu de diferenţiere (tabelul);
- incubarea la 10.000 lx timp de 2-4 săptămâni;
- transferul plantelor înrădăcinate în pământ steril şi creşterea lor în
seră.
Mediul pentru cultura protoplaştilor
Săruri minerale din mediul Murashige-Skoog

Nutrienţi adăugaţi mg/l


Lactoză 15.000
Manitol 110.000
Acid α-naftilacetic 0,6
Kinetină 0,1
Timină-HCl 10
Piridoxină-HCl 10
Acid nicotinic 5
Mio-inozitol 100
Glicerină 2

Mediul nutritiv cu agar pentru inducerea lăstarilor


Săruri minerale din mediul Murashige-Skoog

Nutrienţi adăugaţi Cantitatea


Lactoză 103 g/l
Timină-HCl 0,4 mg/l
Mio-inozitol 100 mg/l
Kinetină 2 mg/l
Acid indolilacetic 2 mg/l
Adenină sulfat 2 H2O 80 mg/l
Na2H2PO4 x H2O 170 mg/l
L - tirozină 50 mg/l
Agar Bacto 800 mg/l

Mediul de înrădăcinare
Săruri minerale din mediul Murashige-Skoog

Nutrienţi adăugaţi Cantitatea


Lactoză 30 g/l
Timină-HCl 0,5 mg/l
Mio-inozitol 100 mg/l
Acid indolilacetic 2 mg/l
Agar Bacto 8 mg/l

194
LABORATOR 34

Protocol pentru obţinerea de plante haploide la Brassica oleracea


var. capitata prin androgeneză experimentală

Apariţia de embrioni şi plante haploide se poate realiza pornind de la


o celulă a gametofitului, fie mascul (androgeneza) fie femel (ginogeneza).
Haploidia experimentală este o tehnologie care elimină necesitatea
generaţiilor repetate şi autopolenizării, scurtând considerabil timpul necesar
pentru obţinerea liniilor homozigote. Pe de altă parte, condiţia hemizigotă
pentru toţi locii – la monohaploizi – reduce dificultatea identificării şi
manipulării caracterelor dorite.
Pentru inducerea unei devieri a programului normal de detvoltare a
gametofitului mascul există trei procedee: cultura de antere, cultura de polen
şi cultura de inflorescenţe. În general, se urmăreşte elaborarea unui protocol
experimental care să asigure numai dezvoltarea polenului, nu şi a ţesuturilor
somatice înconjurătoare.
Polenul se dezvoltă în interiorul anterelor, fie sub forma unor
structuri organizate – embrioizi, fie sub forma unor mase neorganizate de
celule – calus.

Materiale necesare:
- inflorescenţe recoltate la începutul perioadei de înflorire, soluţie de
clorură mercurică 0,1%, hotă cu flux laminar (aer steril), alcool etilic;
- mediu de cultură Murashige – Skoog (MS, 1962), modificat pentru
inducerea dezvoltării androgenetice (MS cu BAP 2 mg/l şi NAA 0,5
mg/l), mediu de cultură pentru regenerarea rădăcinilor (MS cu NAA 0,1
mg/l), mediu de creştere (MS lipsit de fitohormoni), apă distilată;
- etuvă, termostat, autoclav, pH-metru, balanţă analitică şi tehnică, vase
Petri, cu diametrul 0,5 cm, alcool etilic, vase Erlemmazer de 1 litru şi
750 ml, baloane cotate de 500 ml, 1 litru, pipete gradate de 1 şi 5 ml,
soluţii stok de BAP şi NAA, pense, bisturie, cameră de creştere cu
parametrii controlabili, refrigerator.

Modul de lucru:
- inflorescenţele se păstrează la 40 C timp de 24 de ore;
- se pregăteşte şi se sterilizează nişa cu aer steril;
- se sterilizează mediile de cultură preparate, apa distilată, sticlăria pentru
cultură, instrumentarul; înainte de autoclavarea mediilor, pH-ul trebuie
ajustat la 5,5, apoi se adaugă agarul;

195
- se răcesc mediile şi se toarnă în vasele de cultură la hotă, se acoperă
vasele cu staniol steril;
- se sterilizează inflorescenţele ăn HgCl2 0,1% timp de 10 minute şi se
spală de trei ori cu apă distilată sterilă şi răcită;
- se verifică stadiul de dezvoltare al microsporului din antere prin colorare
cu aceto-carmin şi vizionare la microscopul optic;
- se scot cu grijă anterele din butonii florali, se îndepărtează filamentul şi
se plasează pe mediul de inducere (tabel) în vase Petri (câte 50/vas; se
aleg antere de 2,5 mm, care conţin microspori uninucleaţi);
- vasele de cultură cu antere se plasează la întuneric pentru 6 zile, la
temperatura de 350C, după care vasele de cultură care conţin antere cu
embrioizi se trec la lumină (fotoperioadă 16 ore la 3000 lx.), la o
temperatură de 230C.

Rezultate:
Plantulele obţinute din embrioizi de trec pe mediu cu 0,5 mg/l NAA
pentru formarea completă a rădăcinilor şi apoi pe un mediu fără fitohormoni
pentru dezvoltarea şi creşterea plantelor; se acomodează la condiţii septice,
apoi se trec la ghiveci, în seră şi câmp experimental (fig. 67).
Pentru studiul citogenetic al plantelor obţinute şi certificarea
gradului de ploidie, la trecerea la ghiveci se recoltează vârfuri radiculare
care se prelucrează şi se colorează conform unei metode standard (de
exemplu, metoda Feulgen). Pentru diploidizarea plantele haploide se
tratează cu colchicină 0,5% timp de 24- 48 de ore sau se trec printr-o nouă
cultură „in vitro” iniţiată din diferite explante (peţiol, frunză, rădăcini, vârf
vegetativ); în acest caz, diploidizarea este spontană.

Mediul sintetic pentru cultura anterelor de varză (inducere)

Componente Cantitatea
Macroelemente MS
Microelemente MS
Vitamine B5 (Gamborg)
BAP 2 mg/l
NAA 0,5 mg/l
Zaharoză 30 g/l
Agar 8 g/l
pH 5,5

196
Fig. 67. Androgeneza experimentală la varză (Brassica oleracea L. ):
stânga sus - calus cu centre meristematice; drapta sus - plantule regenerate
din antere (dreapta) la varză; stânga jos – plantule de varză obţinute din
antere; dreapta jos - plante androgenetice complet formate la varză, în vase
de cultură şi ghiveci (Prisecaru, 1998)

197
LABORATOR 35

Protocol pentru obţinerea plantelor haploide prin ginogeneză


experimentală la Triticum aestivum L.

Ginogeneza experimentală constituie o alternativă pentru producerea


plantelor haploide şi constă în dezvoltarea unei plante întregi pornind de la
un macrospor.
Protocolul experimental trebuie să permită dezvoltarea unui embrion
sau calus (masă de celule) dintr-o oosferă nefecundată sau dintr-o altă celulă
haploidă a sacului embrionar. Pentru aceasta se utilizează cultura „in vitro”
pe medii sintetice, a ovarelor sau ovulelor nefecundate.

Materiale necesare:
- inflorescenţe recoltate cu 6 zile înainte de înflorire;
- medii de cultură MS (1962), pentru iniţiere (cu BAP 0,3 mg/l, NAA
0,1 mg/l şi 2,4 D 0,05 mg/l) şi pentru regenerare (cu BAP 0,1 mg/l şi
NAA 0,1 mg/l);
- soluţie de clorură mercurică =,1%, apă distilată sterilă;
- hotă cu flux laminar, etuvă, termostat, autoclav, pH-metru, balanţă
analitică şi tehnică;
- vase Petri, cu diametrul 0,5 cm, alcool etilic, vase Erlemmazer de 1
litru şi 750 ml;
- baloane cotate de 500 ml, 1 litru, pipete gradate de 1 şi 5 ml;
- soluţii stoc de BAP, NAA şi 2,4-D;
- pense, bisturie;
- cameră de creştere cu parametrii controlabili, refrigerator.

Modul de lucru:
- se pregăteşte şi se sterilizează nişa cu aer steril;
- se sterilizează mediile de cultură preparate, apa distilată, sticlăria
pentru cultură, instrumentarul;
- înainte de autoclavarea mediilor, pH-ul trebuie ajustat la 5,5, apoi se
adaugă agarul;
- se răcesc mediile şi se toarnă în vasele de cultură la hotă, se acoperă
vasele cu staniol steril;
- se sterilizează inflorescenţele în HgCl2 0,1% timp de 10 minute şi se
spală de trei ori cu apă distilată sterilă şi răcită;
- se scot cu grijă ovarele pentru a nu fi rănite şi se plasează pe mediul
de inducere;

198
- culturile se trec în camera de creştere, la 250C şi 16 ore fotoperioadă.

Rezultate:
După 3-8 săptămâni se scot ovulele mărite şi se trec în aceleaşi
condiţii de sterilşitate, pe mediul de creştere.
După 1-2 luni, plantele obţinute se acomodează la condiţii septice
(fig. 68).

Fig. 68. Ginogeneza la grâu (Triticum aestivum L.) : stânga sus - ovare de
grâu mult mărite, după o săptămână de cultură ; stânga jos – calus
ginogenetic provenit din ţesuturile ovulului ; dreapa sus – calus ginogenetic
cu numeroşi embrioizi vizibili la suprafaţă ; dreapta jos – plante de grâu
regenerate din calus ginogenetic
(Prisecaru, 1998).

199
Se păstrează apexuri meristematice pentru studiul citogenetic al
gradului de ploidie.
Se execută preparate histologice, conform procedurii obişnuite,
pentru studiul dezvoltării embrionare (ontogenia embrionilor ginogenetici).
Pentru diploidizarea plantele haploide se tratează cu colchicină 0,5%
timp de 24- 48 de ore sau se parcurge un ciclu de cultură in vitro iniţiată din
diferite explante.

200
LABORATOR 36

Metode de hibridare celulară

Creşterea variabilităţii genetice, atât de necesară în lucrările de


ameliorare şi selecţie, implică găsirea unor metode de rupere a barierelor de
incompatibilitate care izolează speciile între ele. Aceasta a devenit
realizabilă prin crearea de protoplaşti din celulele somatice izolate şi
fuziunea lor, ca unic mijloc de amestecare a genomurilor cloroplastice şi
mitocondriale.
La ţesuturile vegetale, membrana celulozică şi stratul pectic care
asigură sudura dintre celule face imposibilă manipularea directă a celulelor
în scopul fuzionării lor. De aceea s-a urmărit găsirea unor tehnici de
dezagregare a membranei pectocelulozice, ajungând la forma de protoplaşti.
Protoplaştii, celule somatice „nude” lipsite de membrane
pectocelulozice rigide (perete celular) au capacitatea de a fuziona, de a se
divide în continuare şi de a da naştere la noi plante (fig.69).

Protocol pentru hibridarea celulară la plante prin


fuziunea de protoplaşti

Metoda Kao (1976) şi Gamborg şi col. (1974) cu PEG


(polietilenglicol).
La plante, prin utilizarea culturii protoplaştilor în hibridarea
somatică se poate depăşi incompatibilitatea sexuală şi se pot înlocui
metodele convenţionale de ameliorare când acestea sunt ineficiente.
Plantele oferă două avantaje care nu pot fi întâlnite la sistemele
animale: se pot cultiva celule haploide şi se pot regenera plante întregi dintr-
o singură celulă somatică, inclusiv din cele hibride. Aceste aspecte sunt de
mare importanţă atât pentru agricultură, cât şi pentru biologia teoretică.

Materiale necesare:
- suspensie de protoplaşti proveniţi din două surse, preparaţi simultan;
- site de oţel inoxidabil cu ochiuri de 80 microni diametrul;
- filtru cu pori de 0,22 microni;
- centrifugă de laborator;
- pipete Pasteur, lame de microscop, cutii Petri de 50 mm diametrul,
baloane Kitasato;
- pH-metru;

201
- soluţie de PEG, soluţie de eludare, mediu pentru cultura
protoplaştilor (PCM), NaOH 0,1N, HCl 0,1N;
- hotă cu aer steril;
- cameră de incubare, autoclav, etuvă, trompă de vid.

Modul de lucru:
- protoplaştii proveniţi din cele două surse se filtrează împreună prin
sita de oţel inoxidabil cu ochiuri de 80µ;
- centrifugarea protoplaştilor în tub de centrifugă steril, la 100 rpm,
pentru 3 minute;
- resuspendarea protoplaştilor în soluţie apoasă şi repetarea operaţiei de
centrifugare pentru o bună spălare a protoplaştilor;
- se ia cu o pipetă pasteur 0,1-0,2 ml din supernatant şi se depune pe o
lamă protejată de un vas Petri; se lasă 5 minute pentru a permite
protoplaştilor să se aşeze la suprafaţa sticlei;
- în timpul examinării la microscop, se adaugă încet, cu picătura, câte
0,2 ml/picătură soluţie PEG, care acoperă suspensia de protoplaşti,
determinând aglutinarea lor;
- protoplaştii se spală cu soluţie PEG prin următorul procedeu:
• se adaugă 0,3 ml din mediul de cultură (PCM= protoplast culture
medium) în suspensia de protoplaşti, se aşteaptă 5 minute, după
care se înlătură 0,3 ml din lichid cuo pipetă Pasteur;
• se repetă operaţia de 5 ori, astfel ca de fiecare dată să rămână o parte
din mediu care să acopere protoplaştii în timpul spălării.
- se cultivă protoplaştii în 0,2-0,4 ml mediu de cultură pe lame sau vase
de sticlă; pentru păstrarea vaselor umede se adaugă câteva picături din
mediu în jurul lamelei;
- vasele Petri se închid ermetic cu parafilm sau leucoplast şi se
incubează în lumină slabă (50 lx);
- Diviziunile încep după 4-6 zile, iar în 2-4 săptămâni calusul devine
vizibil;
- Se adaugă în cultură volume din ce în ce mai mari de mediu de
cultură, a cărei concentraţie osmotică descreşte treptat.

Rezultate:
Când calusul ajunge la 2-3 mm se transferă pe mediul de
diferenţiere. Mediul pentru cultura protoplaştilor PCM se foloseşte pentru
diviziunea celulară şi formarea de calus din protoplaşti de Nicotiana
tabacum, N. glauca, N. rustica, N. langsdorfii, N. longiflora, N. debneyi.

202
Fig.69. Obţinerea unui hibrid somatic prin fuziunea protoplaştilor obţinuţi
din două specii le genului Nicotiana (N. langsdorfii şi N. glauca)

Soluţii pentru inducerea fuziunii protoplaştilor

Soluţie de spălare:
Glucoză – 0,5M; CaCl2 x 2H2O – 3,5mM; KH2PO4 x H2O-0,7 mM; pH=5,7

Soluţie PEG:
PEG 1,540 sau 0,09MPEg 6000 – 0,33 M; CaCl2 x 2H2O – 10,5mM;
KH2PO4 x H2O-0,7 mM; glucoză-0,1M; pH=5,5.
Se prepară înainte de folosire.

Soluţie de eluare:
1) CaCl2 x 2H2O-100 mM; glucoză-0,4M;
2) NaOH-glicină, tampon pH=10,5- 100 mM; glucoză-0,4M.
3) Se prepară soluţiile 1 şi 2 separat şi se amestecă (1:1) înainte de
folosire.

203
Mediul pentru cultura protoplaştilor (PCM)

A. Soluţie stoc de macroelemente B. Soluţie stoc de microelemente


(g/l): (mg/100 ml):
KNO3 - 25,0 MnSO4 x H2O - 1000
NH4NO3 - 2,50 H3BO3 - 300
CaCl2 x 2H2O - 9,0 ZnSO4 x 7H2O - 200
MgSO4 x 7H2O - 2,50 Na2MoO4 x 2H2O - 25
CaH2(PO4) x H2O - 50,0 CuSO4 - 2,5
(NH4)2SO4 - 1,34 CaCl2 x 6 H2O - 2,5
NaH2PO4 x H2O - 1,50

C. KI D. Sursa de ioni (g/l):


75 mg/ 100 ml FeSO4 x 7H2O - 5,57
Na2EDTA - 7,57

E. Vitamine (mg/100 ml): F. Acid 2,4 D (diclorfenoxiacetic):


Acid nicotinic - 10 1 mg/l
Tiamină – HCl - 100 G.6-benzilaminopurină (6-BAP)
Piridoxină – HCl -10 1 mg/l
Mio-inozitol - 1000 H.N6-dimetiladenină
0,01 mg/l

Pentru 200 ml de mediu de cultură se amestecă soluţiile stoc indicate


anterior în volumele următoare:
A – 20,0 ml; B - 0,2 ml; C - 0,2 ml; D -1,0 ml; E – 0,2 ml; F- 0,02
ml; G – 0,02 ml; H – 0,2 ml; lapte de cocos deproteinizat – 4,0 ml; xiloză
– 50,0 mg; glucoză – 13,7 mg; H2O - se aduce la 200 ml.
Se ajustează pH-ul la 5,7 cu 0,1 N NaOH sau 0,1 N HCl; mediul se
sterilizează prin filtru cu pori de 0,22 µm.

Identificarea protoplaştilor fuzionaţi


Natura hibridă a produşilor de fuziune este evidentă numai după
fuzionarea nucleilor mitotici şi parcurgerea mai multor cicluri celulare. În
urma procesului de fuziune pot rezulta două categorii de celule poliucleate
(policarioni): cu acelaşi tip de nucleu (homocarioni), proveniţi din acelaşi
tip de celule parentale şi cu nuclei diferiţi (heterocarioni), rezultaţi din celule
parentale diferite, aceştia fiind consideraţi adevăraţii hibrizi. În cazul în care
supravieţuiesc, în urma diviziunii nucleare şi a sincronizării diviziunii,

204
heterocarionii devin celule mononucleate, adică sincarioni. Aceştia se pot
menţine şi prolifera pe medii adecvate timp îndelungat, formând clone
celulare hibride (animale) sau calusuri din care pot regenera organisme
întregi (hibrizii vegetali).

Selecţia hibrizilor somatici vegetali poate avea loc în diverse faze:


- imediat după fuziune, înaintea apariţiei diviziunii;
- după diviziunea homo- şi heterocarionului;
- după apariţia calusului;
- după regenerarea de hibrizi somatici.
În fiecare din aceste faze se pot aplica metode diferite în funcţie de
produşii de fuziune. În general, identificarea celulelor fuzionate se bazează
pe:
- colorarea diferită a heterocarionilor;
- morfologia distinctă a cromozomilor şi a cloroplaştilor;
- dimensiunea structurilor granare sau stroma;
- conţinutul în clorofilă;
- tipul de incluziuni;
- trăsături morfologice, etc.
De asemenea, mai nou, se folosesc markeri biochimici, linii celulare
mutante, mutante rezistente la antibiotice, mutante albinotice, etc.

205
LABORATOR 37

Tehnica culturilor de celule şi ţesuturi animale

Majoritatea tipurilor de celule animale şi vegetale pot supravieţui în


condiţii corespunzătoare într-un vas de cultură in vitro. Prin cultura de
celule se obţine o multiplicare a celulelor provenite dintr-un ţesut sau organ.
În cultura experimentală se poate studia comportamentul celulelor în
condiţii controlate, strict definite; este posibil să se determine efectele
asupra comportamentului celular prin adăugarea în mediul de cultură a unor
molecule specifice – hormoni sau factori de creştere şi să se obţină populaţii
celulare omogene care pot fi utilizate în analize biochimice sau pentru
studiul interacţiunilor între un tip celular sau altul. Observaţiile se verifică în
comparaţie cu comportamentul celular in vivo (mediu natural).
Această tehnică permite:
a) Studiul caracterelor morfologice şi proprietăţile biologice ale
celulelor din diferite ţesuturi, separate de organism şi sustrase influenţei
sistemului nervos şi curentului sanguin;
b) Studiul unor probleme de biologie tisulară (cum ar fi afinitatea
sau antagonismul între suşe tisulare diferite).

Tipuri de culturi de celule


A). După felul substratului, culturile celulare pot fi:
- pe suport organic nutritiv;
- pe suport organic nenutritiv;
- pe suport anorganic;
- în suspensie pe mediu lichid.

B). După modul de iniţiere a culturii:


a. Culturi iniţiate cu fragmente de ţesut:
- pe suport nutritiv;
- pe suport nenutritiv.
b. Culturi iniţiate cu celule dispersate:
- culturi de celule libere n mod natural (culturi de celule
hematopoietice din măduva osoasă sau din exudate, culturi de leucocite
etc.);
- culturi de celule obţinute prin dispersarea fragmentelor de ţesut.

206
C). După tipul de material biologic:
- culturi de organe (organocultură) - reprezintă scoaterea unui fragment de
organ din organism (intestin, trahee, rinichi, etc.) şi cultivarea lui pe un
mediu nutritiv; această cultură se menţine in vitro un timp limitat;
- cultura de embrioni de diferite stadii;
- culturi de celule obţinute prin multiplicarea celulară in vitro: cultura de
celule în suspensie; cultura de fragmente de ţesuturi.

Materiale de lucru:
Culturile de celule in vitro se prepară într-un spaţiu de lucru steril,
amenajat special, ce include instalaţie de apă curentă, gaze, electricitate.
Nevoile de bază într-un laborator de culturi de celule sunt:
a. arie de lucru sterilă;
b. sticlărie, instrumente fine;
c. dispozitive de curăţat şi sterilizat;
d. recipiente de stocare pentru medii, ser, soluţii, sticlărie şi altele;
e. incubator şi hotă cu flux laminar;
f. sursă de apă curentă şi distilată;
g. microscop, agitator, balanţă tehnică şi analitică;
h. substanţe chimice.

Tehnicile aseptice
Tehnicile aseptice presupun următoarele reguli:
- accesul limitat în zona de culturi in vitro;
- suprafeţele se decontaminează cu etanol înainte de utilizare;
- nu se pipetează cu gura, nu se mănâncă, nu se fumează în zona de lucru;
- hainele de protecţie se folosesc numai în cadrul incintei;
- se spală mâinile înainte şi după operaţii, iar părul se leagă;
- se controlează emisiile de aer, se sterilizează incinta cu lămpi UV;
- vasele de cultură, mediile,instrumentarul, se sterilizează.

Mediile de cultură
Mediile de cultură trebuie să asigure:
- echilibru ionic obţinut cu soluţii izotone - pentru menţinerea constantă a
presiunii osmotice;
- pH optim (7.2 – 7,4), menţinut cu substanţe tampon (tampon fosfat,
tampon bicarbonat de sodiu – CO2);
- temperatura optimă;
- conţinutul de oxigen şi CO2 favorabil;

207
- elemente nutritive indispensabile metabolismului (microelemente şi
macroelemente, vitamine, hidraţi de carbon, aminoacizi esenţiali,
proteine, factori de creştere, hormoni;
- extracte embrionare pentru stimularea multiplicării şi creşterii celulare;
- evitarea contaminării cu germeni patogeni prin adăugarea de antibiotice
şi/sau antifungice.

Mediile de cultură se clasifică după mai multe criterii:


a) după consistenţă: lichide, semilichide (în mediu se adaugă agar sau
coagulant plasmatic sanguin) sau solide (se adaugă agar până la
solidificare);
b) după compoziţie: naturale, semisintetice, sintetice;
c) după valoarea nutritivă şi scopul urmărit: medii de creştere (permit o
proliferare abundentă a celulelor), medii de menţinere (păstrează activitatea
celulelor, fără a le favoriza proliferarea).
Un mediu nutritiv conţine în general:
- o soluţie salină (tampon + indicator);
- elemente proteice (ser, plasmă, lichid amniotic,, aminoacizi);
- elemente stimulatoare ale creşterii (extrase tisulare de origine
embrionară sau adultă);
- vitamine;
- antibiotice.

Toate etapele de lucru respectă riguros regulile de asepsie


Recoltarea se face din cele mai diverse ţesuturi şi organe, provenite
de la animale şi om, insecte, plante. După provenienţa lor, ţesuturile pot fi:
normale, embrionare, adulte, tumorale.
În cazul ţesuturilor animale, recoltarea trebuie să îndeplinească
următoarele condiţii:
- să evite contaminarea cu microorganisme prin respectarea riguroasă a
asepsiei;
- să evite traumatizarea în timpul recoltării şi manipulării ulterioare;
- să se realizeze cât mai curând după deces;
- de la recoltare şi până la iniţierea culturii, ţesutul se păstrează la rece
(+400C) într-o soluţie salină cu antibiotice, timp de 3-4 ore; arunci când
culturile nu se pot face în acest timp, ţesutul se spală şi se taie la 1-3 mm, se
păstrează la + 400C, într-un mediu nutritiv, în flacoane ermetic închise. Apoi
se spală cu soluţie salină cu antibiotice, se îndepărtează cheagurile de sânge
şi porţiunile inutilizabile şi se cultivă.

208
Protocol pentru iniţierea unei culturi de
ţesuturi embrionare umane

Pentru ţesuturi embrionare umane recoltarea se face de la embrioni


de 1-3 luni. Se evită excesul de dezinfectante. Embrionul se depozitează
într-un cristalizor steril, cu capac, ce conţine o soluţie salină cu antibiotice.
Astfel ambalaţi, embrionii sunt trimişi în cel mai scurt timp la laborator.
Metoda este identică şi atunci când se utilizează pentru cultură
placentă umană sau ţesuturi embrionare animale.

Materiale necesare:
- hotă cu aer steril, arie de lucru sterilă, medii de cultură nutritive (de
creştere şi de menţinere);
- etuvă, termostat (incubator), autoclav, recipiente de cultură,
centrifugă, cameră de numărat (hemocitometru);
- pipete Pasteur, soluţie salină, tripsină;
- pense, foarfeci, cutii Petri, alcool iodat.

Modul de lucru:
Tegumentul embrionului trebuie considerat contaminat. Sterilizarea
lui se face cu alcool iodat, având grijă ca antisepticul să nu pătrundă în
cavităţile embrionului după incizarea lui. Cu pense sterile, se aleg fragmente
de ţesut embrionar, îndepărtând cu atenţie cheagurile de sânge; fragmentele
curate se trec în altă cutie Petri sterilă cu soluţie salină. Transvazarea
fragmentelor se repetă de 2-3 ori şi de fiecare dată se folosesc alte
instrumente sterile; prin transvazarea succesivă se elimină cheagurile de
sânge şi porţiunile de ţesut strivite (neutilizabile).
După ultima spălare, fragmentele se pun într-o eprubetă de
centrifugă sterilă şi cu ajutorul unui omogenizator se obţine o masă cu
aspect omogen. Dacă dispersarea mecanică nu dă rezultate, celulele se
separă sub acţiunea tripsinei şi agitării. Acţiunea tripsinei se opreşte prin
răcirea soluţiei şi apoi se separă celulele de soluţia de tripsină prin
centrifugare; celulele se resuspendă în mediul nutritiv şi se efectuează
numărarea lor cu o cameră de numărat. În final celulele se introduc într-o
cameră de cultură. Cu o pipetă Pasteur sau cu o ansă sterilă se ia o cantitate
din suspensia de celule embrionare şi se întinde pe una din suprafeţele unui
recipient de cultură steril, făcându-se o repartizare cât mai uniformă a
suspensiei. Recipientul, cu faţa pe care este întinsă suspensia în jos, se lasă
la temperatura camerei sau la termostat la 370C, timp de 30-60 minute. După
trecerea acestui timp se introduce mediu nutritiv, având grijă ca el să nu

209
antreneze fragmentele de pe sticlă. Recipientele se astupă cu dop de cauciuc
şi se incubă la termostat la 370C. În timpul incubării recipientele nu trebuie
mişcate din loc cel puţin 3-4 zile. Metoda este analogă şi la recoltarea de
placentă umană, de ţesuturi embrionare animale şi ţesuturi embrionare de
pui (fig. 70).

 
 

Fig. 70. Tehnica culturii de celule pentru ţesuturi embrionare de pui

Pentru ţesuturi adulte provenite prin intervenţie chirurgicală (piele,


mucoase, muşchi, ţesut uterin, rinichi, splină, ganglioni, măduvă osoasă,
amigdale, apendice, tiroidă), fragmentele recoltate se introduc în soluţie

210
salină cu antibiotice, unde se lasă 2-3 ore şi apoi se efectuează etapele de
prelucrare preliminară identice cu ale embrionului.

Controlul culturii
Înaintea oricărui experiment se realizează controlul culturii prin:

- controlul mediilor: pentru contaminanţi (bacterii, fungi, micoplasme,


virusuri); controlul constantelor fizico-chimice (pH, proteine totale
etc.);
- controlul de eficienţă: aprecierea densităţii celulare pe suprafaţa
suportului, evaluarea eficienţei de formare a coloniilor celulare);
- controlul morfologic: aspectul morfologic al celulelor în cultură
(examinare în microscopie fotonică, examinarea celulelor în stare vie
la microscopul cu contrast de fază, examinarea preparatelor fixate şi
colorate; examinarea historadiografică; examinarea în microscopie
electronică).

211
Capitolul 5

METODE MODERNE DE INVESTIGAŢIE MOLECULAR –


BIOLOGICĂ ŞI APLICAŢIILE LOR

Progresele spectaculoase ale biologiei, aşa cum se exprimă ele în


realizările ingineriei genetice sunt strâns legate de înaintarea impresionantă
a tehnicilor analitice, ca ultracentrifugare, marcarea moleculelor prin izotopi
radioactivi, electroforeză, cromatografia de afinitate (de ex., tehnica
separării moleculelor complexe prin anticorpii monoclonali corespunzători),
electrofocalizarea bidimensională (permiţând analiza a 50 000 de proteine
ale unei celule), microanaliza (de ex., determinarea structurii primare a unei
proteine pornind de la numai 10 nanograme, dar şi a structurii altor
macromolecule biologice).
Descrierea compoziţiei şi structurii spaţiale a ADN de către J. D.
Watson şi Fr. Crick din anii 1953 au reprezentat cunoştinţele fundamentale
care au stat ulterior la baza noilor direcţii de cercetare, şi anume a
tehnologiei genetice. Faptul cǎ informaţia geneticǎ a organismelor vii se
găseşte acumulatǎ pe helixul ADN, iar acest material genetic poate fi izolat
iar cele douǎ lanţuri ale dublului helix ADN separate şi apoi fiecare din cele
douǎ lanţuri recombinate cu un alt lanţ de ADN străin complementar, dă
posibilitatea creării de noi organisme, atât în condiţii naturale, cât şi
laborator.
Prima reuşită de recombinare a fost realizată în SUA în 1970. Aceste
tehnici încearcă pe cale artificială combinarea informaţiei genetice (a
genelor) de la două organisme diferite, în vederea creării unui organism nou
cu proprietăţi prestabilite (ţintite); organismele rezultate sunt organismele
recombinate care formează astăzi obiectul unor studii cu implicaţii deosebite
în dezvoltarea ştiinţifică şi economică pe scară internaţională, cu mari
perspective de viitor.
Aceste tehnici de recombinare genetică stau la baza cercetărilor
fundamentale şi a aplicaţiilor în biologia moleculară, farmacologie şi în
medicina viitorului, în scopul investigării, ameliorării diagnosticului şi
terapiei medicale într-un număr mare de boli, dar şi în alte domenii, cum ar
fi agricultura, arheologia, mediu, etc.

5.1. Hibridarea

Este o tehnică de recombinare de acizi nucleici, care vizează


construirea unei molecule de acid nucleic dublu lanţ din două lanţuri unice,

212
separate, pe baza complementarităţii bazelor azotate. Împerecherea de baze
complementare se poate face intre:
¾ ADN – ADN; ADN–ARN; ARN-ARN
Totdeauna hibridizarea are loc între două lanţuri unice de acid nucleic.
Hibridizarea se foloseşte ori de câte ori se urmăreşte identificarea
secvenţelor nucleotidice pe un acid nucleic (secvenţa ţintă).

5. 1. 1. Principiu

Se analizează o secvenţa de acid nucleic unic lanţ (secvenţa ţintă).


Analiza acestei secvenţe necunoscute se face faţă de o sondă genetică (proba
de acid nucleic) marcată (radioactiv sau prin alte metode) cu o secvenţă de
baze cunoscute. Dacă sonda şi secvenţa ţintă sunt total sau parţial
complementare din punct de vedere al secvenţelor de baze nucleotidice, se
formează o moleculă hibrid de acid nucleic în care se identifică secvenţele
nucleotidice pe secvenţa ţinta, în raport cu bazele (complementare) de pe
secvenţa nucleotidică cunoscută a sondei genetice.
Pentru lucru, ADN dublu lanţ trebuie întâi denaturat (supus acţiunii
căldurii sau substanţelor chimice alcaline) pentru a fi disociat în lanţuri
unice. Lanţul unic va reprezenta apoi substratul pe care se va efectua
hibridizarea cu sonda genetică.

5. 1. 2. Denaturarea

După cum s-a arătat, pentru analiza şi identificarea secvenţelor


nucleotidice ale unui acid nucleic ţinta, acesta trebuie întâi adus la forma de
lanţuri unice prin denaturare.
Denaturarea reprezintă modificarea structurii acidului nucleic prin
tratament cu căldură (temperatura de 1000C) sau substanţe chimice, sau
supunerea în mediu alcalin (pH>l1). Folosind aceste metode se realizează
desfacerea legăturii de hidrogen dintre bazele complementare.

a) Denaturarea prin caldură


Reprezintă tăierea lanţului dublu ADN cu ajutorul temperaturii
înalte. Punctul de topire reprezintă temperatura la care 50% din respectivul
acid nucleic dublu lanţ disociază în unic lanţ. Acest punct de topire poate fi
influenţat de:
- o zonă bogată în guanină-citozină, care cere totdeauna o temperatură
mai înaltă, deoarece aceste baze se leagă prin trei punţi de hidrogen, în
timp ce bazele adenină-timină se leagă doar prin două punţi de

213
hidrogen;
- concentraţia în NaCl a soluţiei; o concentraţie scăzută de NaCl
determină destabilizarea moleculei de acid nucleic, aceasta necesită
ADN o temperatură de topire mai scăzută;
- concentraţia cationilor.

b) Denaturarea chimică
Se face prin adaos de substanţe denaturante (formamida, uree) care
determină scăderea punctului de topire.

5.1.3. Renaturarea (annealing/reannealing)

Reprezintă o hibridizare. Prin scăderea temperaturii sau a pH-ului


este favorizată refacerea gaturilor între bazele complementare de pe cele
două lanţuri unice de ADN - ARN sau ARN - ADN.
Reacţiile de renaturare se produc de regulă la temperaturi care
corespund unei diferenţe de 20-300C faţă de temperatura punctului de topire
al dublului lanţ de acid nucleic.
Dacă temperatura însa scade brusc, lanţurile rămân separate.
Cantitatea de acid nucleic unic lanţ, care prin renaturare trece în dublu lanţ,
depinde de:
- concentraţia moleculară a acidului nucleic din soluţie;
- lungimea moleculei de acid nucleic;
- zona bogată în guanină-citozină;
- concentraţia în NaCl;
- concentraţia de formamidă.

5.1.4. Factorul stringent

Este un important factor de hibridizare. Reprezintă intensitatea


reacţiei de hibridizare. Dacă două lanţuri unice de acid nucleic sunt pe toată
lungimea lor formate din baze implementare, iar condiţiile de reacţie sunt
favorabile, stringenta (intensitatea) reacţiei de îmbinare este foarte
puternică.
Dacă pe cele două lanţuri de acid nucleic există doar zone parţiale cu
baze complementare, stringentă este mai scăzută (această situaţie apare în
special atunci cADN cele două lanţuri de acid nucleic provin din două
organisme diferite).

214
5.1.5. Tipuri de hibridări

a. Hibridare Blotting:
a.1. Southern Blotting (ADN Blotting)
a.2. Norhern Blotting (ARN Blotting)
a.3. Western Blotting (Protein blotting)
a.4. Dot Blotting
a.5. Slot Blotting
b. Hibridare in situ;
c. Hibridare colonială.

a. Hibridizare Blotting

Este o tehnică specială prin care acidul nucleic ţintă (de cercetat)
este extras din materialul de cercetat prin încălzire la 1000C şi răcire la
gheaţă şi apoi depus pe o membrană (de nitroceluloză sau filtru de nylon) şi
fixat. Hibridarea acestui acid nucleic necunoscut are loc direct pe filtru cu
ajutorul sondei genetice (acid nucleic cunoscut şi marcat).
Noţiunea de "Blot" reprezintă filtrul + acidul nucleic fixat
(imobilizat). Acţiunea de "Blotting" reprezintă trecerea acidului nucleic pe
filtru. Există mai multe variante de hibridare Blotting şi anume:

a.1. Southern Blotting


A fost imaginată de Southern în 1975. Evidenţiază secvenţele
specifice ale unor fragmente de ADN separate prin gelelectroforeză.
Etapele reacţiei:
- se extrage ADN dintr-un produs patologic lichid (ser sanguin care
conţine acid nucleic viral) sau solid (celule, ţesuturi);
- ADN este tăiat cu enzime de restricţie;
- fragmente de ADN (de circa 1000 perechi de baze) sunt supuse
electroforezei şi separate în funcţie de greutatea lor moleculară;
- fragmentele ADN obţinute în gel sunt supuse denaturării;
- trecerea fragmentelor de lanţ unic ADN de pe gelul sensibil (de
nitroceluloză) care fixează aceste fragmente de ADN.
Pentru transferul respectivelor fragmente de ADN de pe gel pe filtru
se folosesc diferite metode, dintre care una este cea prin transfer capilar
(Fig.71):
• Gelul (2) este pus pe hârtie de filtru (1) umedă (care a absorbit
prin capilaritate lichid din vasul cu soluţie tampon); peste gel
(2) se pune altă hârtie de filtru (3) uscată, care se îngreunează
prin aplicare, deasupra ei, a unei lame de sticlă (4) şi a unei
215
greutăţi (5).
• Curentul de lichid care rezultă din soluţia tampon şi care se
formează prin capilaritate,de la hârtia de filtru umedă spre cea
uscată, acţionează şi scoate prin spălare moleculele ADN din
gel şi le trage către şi pe hârtia de filtru superioară (4).
• Fragmentele de lanţ unic ADN fixate pe hârtia de filtru
superioară prin acţiunea căldurii sunt tratate (hibridizate) cu
sonde genetice ADN sau ARN (marcate radioactiv).
• Hibridizarea se realizează prin incubarea hârtiei de filtru (3)
într-o soluţie care conţine sonda genetică radioactivă (de
exemplu, ADN marcat cu 32P); molecula-hibrid realizată va fi
evidenţiată prin metoda autoradiografică sub formă de benzi.
Prin apariţia unei mutaţii în genomul celulelor germinative
(modificarea unei baze), care se moşteneşte, respectiv ADN modificat, dacă
va fi supus acţiunii enzimelor de restricţie, va prezenta una din următoarele
două ipostaze posibile:
- lanţul ADN rămâne netăiat, deoarece enzimele de restricţie nu mai
recunosc situs-ul specific;
- din contră, poate apare un nou situs specific de tăiere pentru aceste
enzime. În acest al doilea caz, pot apărea în consecinţă noi tipare de
fragmente ADN; acest fragment a fost numit "polimorfism de lungime al
fragmentelor de restricţie" (RFLP). Studiul acestor fragmente şi a diferenţei
dintre ele, cu ajutorul metodei Southern Blotting a putut aduce noi
informaţii în cercetările efectuate asupra unor boli genetice şi în medicina
judiciară.
Astfel s-a putut demonstra că:
- la gemenii univitelini, aceste tipare RFLP sunt complet identice;
- la rude, aceleaşi tipare RFLP sunt în mare parte identice;
- în boli genetice se evidenţiază prezenţa unor gene defecte (pe baza unor
fragmente ADN cu un tipar individual);
- prezenţa unor modificări genetice în cazul unor procese tumorale;
- pe baza tiparelor RFLP s-au putut clasifica microorganismele (virusuri şi
bacterii);
- în medicina judiciară, pe baza pattern-urilor RFLP (ADN minisatelite =
fragmente hipervariabile din genom, care nu sunt transcriptibile) se poate
face determinarea paternităţii.
De asemenea, pe baza aceloraşi pattern-uri RFLP se pot face
identificări de persoane în criminalistică, prin studiul unor probe de sânge
sau spermă.
ADN de origine umană şi cel provenind de la cimpanzeu şi gorilă

216
sunt omologate în proporţie de 97% (diferenţa constă în cromozomul X).
Speciile de cimpanzeii sunt mult mai copiate de om decât alte specii de
maimuţă.

Fig.71. Hibridarea Southern Blotting


217
În Africa de Sud a fost studiată originea speciei Quagga (Equus
quagga), care a dispărut în 1883, şi pe baza studiilor filogenetice s-a stabilit
că aceasta reprezintă forma originară a tuturor speciilor de zebră;
Studiul genelor pentru globină la primate (responsabile pentru
sinteza proteinei hemoglobină) a demonstrat că aceste gene sunt localizate la
un loc, într-un cluster pe cromozomii umani 11 şi 16. Dimensiunea acestor
clusteri este asemănătoare la om, gorilă şi gibon.

a.2. Northern Blotting


Această variantă a hibridizării Blot pune în evidenţă secvenţe
specifice ale unor fragmente ARN departe prin gelelectroforeză.
Etapele reacţiei sunt:
• ARN este extras din materialul de cercetat;
• ARN este pus în prezenţa substanţei denaturate (glicoxal
dimetilsulfoxid formaldehidă sau metilmercur);
• ARN este supus separării electroforetice;
• transferul moleculelor ARN pe filtru (nylon sau mitriceluloză);
• hibridarea ARN de pe filtru cu o sondă genetică ARN sau ADN;
• evidenţierea moleculei hibrid construite.

Aplicaţii practice ale variantei Northen Blotting


- Determinarea ribotipurilor tulpinilor bacteriene (în studii genetice,
epidemiologice).
- În epidemiologie, reprezintă o metodă foarte modernă şi utilă de
cercetare pentru determinarea filiaţiei cazurilor în epidemii, această
metodă fiind mult mai sensibilă decât determinarea hizotipurilor de
tulpini. Astfel, în actuala a VII-a pandemie de holeră, cu ajutorul
metodei de ribotipare s-a putut demonstra că profilul genetic al tulpinilor
de Vibrio cholerae biotip eltor, prezente în Asia şi Europa, este în mai
mult de 70% din cazuri identic.

a. 3. Western Blotting (tehnica immunoassay)


Această variantă a hibridizării Blot nu reprezintă o reacţie de
hibridizare propriu-zisă (anume construirea unei molecule ADN dublu lanţ
din două lanţuri separate de ADN).
Această variantă foloseşte doar principiul reacţiei de hibridizare, şi
anume desfăşurarea substratului de cercetat pe gel de electroforeză şi apoi
trecerea acestuia pe o membrană de nitroceluloză, unde este apoi cuplat şi
evidenţiat prin intermediul unor grupări chimice complementare.

218
În acest caz de Western Blotting, substratul de cercetat nu este
reprezentat de un acid nucleic ci de o proteină.
Reacţia foloseşte la evidenţierea unor cantităţi foarte mici de
proteine prezente în lichidele sau celulele unui organism, prin cuplarea
acestora cu anticorpi specifici corespunzători (marcaţi).
Etapele reacţiei sunt următoarele:
- proteina este supusă electroforezei în gel SDS -
policrilamidă;
- transferul spoturilor proteice (antigene) pe membrana de
nitroceluloză;
- adaos de anticorpi specifici marcaţi (cu enzime sau
radionuclizi);
- spălarea anticorpilor rămaşi nefixaţi;
- aplicarea deasupra membranei de nitroceluloză a unui film
fotografic;
- expunere şi developare;
- citirea prin autoradiografie a benzilor de proteină cu ajutorul
anticorpilor specifici marcaţi şi fixaţi.
Avantajul metodei este acela de a pune în evidenţa prezenţa unei
anumite proteine, dintr-o mixtură complexă. Această metodă este folosită
pentru clonarea genelor.

a.4. Dot Blotting


Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri rotunde (fig.72). Este
necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din probele de cercetate
(ser,extracte celulare sau tisulare).
Proba de acid nucleic extrasă se depune într-unul din godeurile
rotunde ale plăcii de plexiglas. În fiecare godeu se depune altă probă de acid
nucleic, în total pe o placă depunându-se atâtea probe câte godeuri are
placa.
Apoi respectiva placă se acoperă cu hârtie de filtru, care absoarbe
eventualele probe de acid nucleic prezent. Nu se face nici o separare
electroforetică; probele de acid nucleic de pe hârtia de filtru sunt supuse
apoi denaturării (prin încălzire la 1000C şi răcire la gheaţă). Apoi probele de
acid nucleic denaturat de pe filtru sunt hibridizate cu sonde genetice.

219
Fig.72. Tehnica Dot Bloptting

a.5. Slot Blotting


Se execută pe o placă de plexiglas cu godeuri de formă
dreptunghiulară (Schlitz-uri = tăieturi sau Slot-uri). Principiul metodei este
identic cu cel de la Dot Blotting. Aceste ultime două variante de hibridizare
se folosesc atunci când se lucrează deodată cu un număr foarte mare de
probe patologice nefracţionate (probe de ser, extract celulare sau tisulare).

5.1.6. Hibridare in situ

Se efectuează direct pe celule şi ţesuturi. În cazul hibridizării


Blotting este necesară extracţia prealabilă a acidului nucleic din proba de
cercetat; prin această extracţie, se pierde însă informaţia asupra sediului
exact al respectivului acid nucleic (ADN sau ARN) din anumite structuri
celulare. Această informaţie se poate obţine numai cu ajutorul hibridizării in
situ. Prin această ultimă metodă se poate realiza evaluarea exactă a
distribuţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN direct in situ simultan cu

220
determinări calitative şi semicantitative.
Se folosesc fragmente de ţesuturi, amprente de celule, culturi
celulare (prelucrate, aplicative şi fixate pe lame obiective). Fixarea se face
cu xilol, etanol (100% şi apoi 70%). Lama obiectiv cu celule fixate
corespunde filtrului cu acid nucleic legat prin hibridizare Blotting.
Reacţia de denaturare şi hibridizare se face pe lama obiectiv şi
anume: după depunerea probei pe lama obiectiv, pentru denaturarea probei
se foloseşte o încălzire puternică sau tratarea cu proteaze şi digitonină,
ultima slăbind şi desfăcând citoscheletul şi rezultând molecula ţintă de acid
nucleic unic. Lama cu probă pentru denaturare se acoperă cu o placă,
realizându-se o cameră umedă. După denaturare, lama se spală (pentru
îndepărtarea particulelor nelegate) şi abia apoi urmează hibridizarea cu
sonda (ADN sau ARN) marcată; în cazul reuşitei hibridizării, secvenţele
ţintă din acidul nucleic de cercetat (din ţesuturi) sunt evidenţiate la
autoradiografie (prin cuplare cu secvenţele de acid nucleic complementare
din probele marcate cu biotină).
Biotina din sondă a fost fixată de un necleotid cu uracil; acest uracil
se va împerechea în lanţul de acid nucleic ţintă cu o adenină; după ce se
produce această reacţie de hibridizare, se face o spălare cu o soluţie tampon,
care îndepărtează moleculele nelegate de acid nucleic din probă. Marcarea
cu biotină este evidenţiată ulterior prin diferite variante de lucru (vezi
"Sonde genetice. Marcarea").
Aplicaţiile practice in situ sunt:
- evidenţierea şi localizarea diferiţilor agenţi infecţioşi în diferite
celule şi ţesuturi ale organismului: virusul hepatitei virale tip B,
HIV, virusul Epstein-Barr, virusul cito-megaliei, virusul herpes
simplex, virusul papiloma;
- cercetarea relaţiilor virus-procese oncogene (de exemplu, relaţia
virusul hepatitei virale tip B-carcinom hepatic);
- diagnosticul pre- şi postnatal în boli genetice;
- localizarea genelor defecte pe cromozom (de exemplu, în fibroza
chistică, distrofia musculară Duchenne);
- identificarea anormalităţilor cromozomiale (de exemplu: trisomia
21, sindromul Langdon Down, sindromul Turner);
- stabilirea sexului la embrion;
- cercetarea tiparelor de expresie genetică (stabilirea momentului
activării anumitor gene);
- stabilirea hărţii genetice cromozomiale (stabilirea relativă a
locus-ului fiecărei gene pe cromozom);
- hibridarea colonială.
Pe plăci cu medii de cultură se însămânţează colonii bacteriene
221
din două tipuri de clone:
- o clonă bacteriană de origine (cu plasmid);
- o clonă bacteriană cu ADN ţintă (cu plasmid + fragmente de
ADN ţintă).
Prin replica plating se obţine copii ale acestor colonii din cele două
clone pe un filtru de nitroceluloză. Aceste copii de clone bacteriene (de pe
filtru) sunt supuse lizei pentru a se obţine ADN.
ADN este supus denaturării pentru obţinerea lanţurilor unice de
ADN.
Lanţul unic ADN este supus hibridizării cu probele ADN cunoscut şi
marcat radioactiv. După fixarea probelor ADN radioactive (fixarea
complementară) pe lanţul unic de ADN ţintă (de cercetat) se procedează la
evidenţierea autoradiografică a marcării pe un film Roentgen.
Prin compararea imaginii radiografice se identifică şi se diferenţiază
clonele bacteriene care conţin fragmente de ADN ţintă faţă de clonele
bacteriene de origine. Clonele bacteriene care poartă ADN ţintă recombinant
(plasmid + ADN ţintă) vor fi multiplicate mai departe (sincron se vor
multiplica şi fragmentele de ADN straniu).

5.1.7. Importanţa reacţiei de hibridare pentru medicină şi


biologie
Această reacţie a pus bazele unui număr de tehnici care au ajutat la
progresul cercetării biologice fundamentale, cât şi la progresul
diagnosticului medical într-un număr de boli.
Astfel s-a reuşit:
- stabilirea concentraţiei anumitor secvenţe ADN sau ARN într-o
mixtură de secvenţe;
- determinarea numărului de copii dintr-o anumită secvenţă prezentă
într-un dovedirea gradului de înrudire între diferite organisme în raport
cu numărul de secvenţe ADN identice;
- stabilirea activităţii genelor pentru care s-au pus în evidenţă
moleculele de ARNm corespunzătoare;
- evidenţierea secvenţelor specifice ADN şi ARN în material biologic de
cercetat (sânge, celule, ţesuturi);
- evidenţierea acidului nucleic viral;
- în serul sanguin LCR, în vederea elucidării diagnosticului unor infecţii
virale cronice: evidenţierea acidului nucleic viral în aceste produse
semnifică prezenţa particulei virale în organismul respectiv.
Evidenţierea prezenţei acidului nucleic viral direct în produsele
patologice (ser, LCR) sau în materialul citologic reprezintă o

222
posibilitate de diagnostic rapid şi precoce, în vederea instituirii a unei
terapii de urgenţă în special la persoanele bolnave de SIDA sau la cele
imunosupresate (terapeutic) în urma unor transplante de organe.În
aceste cazuri diagnosticul serologic de obicei nu poate fi de ajutor
deoarece pozitivarea serului în cazul infecţiei cu HIV se produce abia
după câteva săptămâni de infecţie, iar în cazul imunosupresaţilor după
câteva luni sau chiar deloc;
- evidenţierea prezenţei virale în tumori de origine virală;
- studiul efectuat asupra produsului de transcriere (ARNm) a unor
secvenţe ADN celulare glucogene nevirale a ajutat la completarea şi
aprofundarea diagnosticului de tumoră. Astfel o reacţie de tip
imunohistochimic a putut pune în evidenţă un produs de transcriere
(ARNm) specific de ţesut (de exemplu, prezenţa unui anumit ARNm
corespunzător unei imunoglobuline prezente în caz de limfoame
maligne sau prezenţa unui anumit ARNm hormonal în anumite tumori
neuroendocrine. Această metodă reprezintă o unealtă foarte eficientă
pentru cercetarea activităţii genelor oncogene prin evidenţierea
indirectă imunohistochimică a produselor lor de translaţie (ARNm
corespunzător);
- diagnosticul pre- şi postnatal al bolilor ereditare (la femei care doresc
copii sau la care se pune problema întreruperii sarcinii);
- determinarea defectelor metabolice;
- utilizarea metodelor ce folosesc sonde genetice pentru diagnosticarea
infecţiilor virale ale arborilor fructiferi (cu o precizie de diagnostic
pentru o cantitate de antigen de 2x10 nanograme);
- aplicaţii în epidemiologia moleculară în vederea depistării unor noi
markeri genetici (de exemplu, robotip, pulsotip);
- se precizează ca în viitor metoda hibridizării să ofere posibilităţi
pentru elucidarea mecanismelor de reglare a activităţii genelor.

5.2. Sonde genetice

Cu ajutorul enzimelor de restricţie, astăzi se pot izola, teoretic, toate


genele tuturor organismelor vii, în vederea obţinerii unei bănci de gene (le
vivant mondial).
Principiul hibridizării în vitro a două ADN-uri complementare stă la
baza metodei care foloseşte sondele moleculare (coduri de ADN cunoscute
asociate cu un marker). Cu ajutorul unor asemenea sonde, la un individ
dintr-o anumită specie se pot repera codurile complementare pe care sonda
"le luminează" prin procesul de hibridizare moleculară. Cu ajutorul ADN-
polimerazelor s-a reuşit şi amplificarea ulterioară a acestor fragmente de
223
ADN bine determinate şi deci clonarea genelor pentru a face şi mai uşoară
(mai sensibilă) reperarea lor. Astăzi, graţie sondelor genetice, etichetarea,
reperarea şi cartografierea genelor au devenit operaţii de rutină în marile
laboratoare din lume, ceea ce va asigura în viitor progresul rapid al alcătuirii
hărţilor cromozomiale complete ale genomului uman. Sondele genetice
(probe de acid nucleic tip ADN sau ARN marcate) reprezintă unealta
esenţială de lucru în metoda de hibridizare pentru analiza secvenţelor
nucleotidice din secvenţele "ţintă" ale ADN-ului de cercetat (genele). Aceste
sonde genetice (proba de ADN sau ARN) sunt marcate (radioactiv sau
nonradioactiv) pe un singur nucleotid (cu o secvenţă de baze cunoscute).
În prezent sondele genetice pentru cercetare şi diagnostic se pot
comanda şi cumpăra de la casele producătoare. Sondele genetice se prepară
prin aceleaşi metode de hibridizare utilizate şi pentru secvenţierea
(sequencing) acidului nucleic, şi anume prin metodele Blot (Western
Blot,Southern Blot) şi metoda hibridizării in situ.

A. Prepararea probelor de acid nucleic (sonde genetice) pentru


reacţiile de hibridizare
Sondele genetice pot fi: probe de ADN şi probe de ARN.

a. Prepararea probelor de ADN:


a.1. Din fragmente ADN dublu lanţ clonate (în vederea obţinerii
ulterioare de sonde genetice).
Aceste fragmente se obţin prin încorporarea de fragmente da ADN
genomic (tăiate cu ajutorul enzimelor de restricţie) sau de fragmente ADNc
(sintetizate cu ajutorul reverstranscriptazei după modelul unei matrice
ARNm) într-un vector şi prin introducerea lor, odată cu acest vector
(recombinant), într-o celulă gazdă, unde vectorul se multiplică rezultând în
final o cantitate mare de ADN clonat. Pentru hibridizări sunt în special de
preferat fragmentele ADNc clonat, deoarece reprezintă secvenţe de ADN
fără introni şi fără altă secvenţă care ar putea reacţiona nespecific.
Moleculele ADNc sunt, iniţial, unic lanţ, dar prin diferite metode sunt
transformate în ADN dublu lanţ şi apoi introduse în vectori şi multiplicate
odată cu aceştia în celula gazdă. În acest caz, într-o moleculă finală de
ADNc dublu lanţ doar un lanţ conţine secvenţe corespunzătoare moleculei
matriţă ARNm, iar celălalt lanţ ADNc reprezintă secvenţele complementare
respectivului lanţ matriţă ARNm. Probele ADN dublu lanţ pot fi ulterior
marcate în vederea obţinerii sondelor genetice (vezi „ Marcarea sondelor
genetice”).
a.2. Sub forma de oligonucleotide ADN unic lanţ prin sinteza
chimică în "maşini de gene".
224
În aceste maşini se pot realiza concomitent sinteza şi marcarea
sondelor genetice.
Aceste oligonucleotide ADN-unic lanţ reprezintă baza materială
pentru:
ƒ sonde genetice;
ƒ sinteza de gene;
ƒ primeri pentru reacţii polimerazice în lanţ.

b. Prepararea probelor ARN (sonde genetice)


b.1. În " maşini de gene":ca şi probele ADN unic lanţ.
b.2. Prin metoda de transcriere in vitro cu ajutorul vectorilor de
transcriere.
Această metodă de transcriere in vitro (sinteza ARNm după o matriţă
ADN) se realizează cu ajutorul vectorilor de transcriere unidirecţionali şi
bidirecţionali, în vederea obţinerii de probe ARN lanţ unic (sondă genetică),
care se utilizează ulterior în reacţiile de hibridare.
Prin această metodă, ADN este transcris în afara celulei, în ARN,
ARN-ul respectiv putând fi marcat direct în cursul sintezei. Vectorii de
transcriere (clasă aparte a vectorilor de expresie), nu se folosesc ca şi ceilalţi
vectori de expresie pentru sinteza de proteine, ci pentru sinteza de ARN.
Vectorii de transcriere sunt formaţi dintr-un plasmid ADN, în care
au fost înglobaţi un fag promotor (SP6) sau doi fagi promotori (SP6 şi T7).
În cazul vectorilor cu un fag promotor (SP6), transcrierea in vitro va fi
unidirecţională, iar în cazul vectorilor cu doi fagi promotori, bidirecţională.
Promotorul reprezintă secvenţe de ADN de unde începe procesul de
transcriere, deci sinteza ARNm.

b.2.1. Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6


După înglobarea în sistemul SP6, ADN-ul străin este cel care
urmează a fi transcris în ARN. După linearizare se adaugă în mediu SP6-
ARN-polimeraza şi patru ribonucleotide (dintre care trei nucleotide marcate
şi unul nemarcat). ARN- polimeraza se va lega de promotorul SP6 pornind
transcrierea genelor în direcţia SP6>fragment MCS>fragment ADN nou
înglobat (fig. 73). Va fi transcris unul din cele două lanţuri de ADN nou
înglobat. În sinteză, ARN-polimeraza va folosi ribonucleotidele marcate şi
nemarcate, pentru formarea unei molecule ARNm conform matriţei ADN.
Având în vedere că transcrierea începe la nivelul promotorului SP6
şi se termină la locul de tăiere a enzimei de restricţie, înseamnă că prin
utilizarea diferitelor enzime de restricţie se poate prestabili lungimea
lanţului transcris şi se pot obţine lanţuri ARNm transcrise de lungimi
prestabilite.
225
Fig. 73. Transcrierea unidirecţională cu ajutorul φ SP6

b.2.2. Transcrierea bidirecţională cu ajutorul vectorului


bidirecţional cu doi promotori (φ SP6 şi φ T7).
Vectorul bidirecţional este format din ADN plasmidic, φ SP6, zona
MCS şi φ T7. Cei doi promotori dirijează transcrierea în două sensuri opuse.
Prin introducerea şi înglobarea într-un vector de transcriere bidirecţională a
unui dublu lanţ ADN (de exemplu, ADNc între două segmente de MCS şi
după linearizarea vectorului), se poate stabili de la început care din cele
două lanţuri ADNc va fi transcris în ARN. Fiecare din cele două polimeraze
necesare pentru transcrierea respectivului lanţ ARN şi anume, SP6 – ARN
polimeraza şi T7 - ARN polimeraza, se leagă specific doar de promotorul
corespunzător. După linearizare, în funcţie de enzima de restricţie folosită,
cât şi de ARN-polimeraza utilizată pentru transcriere, se va sintetiza ARN
sau ARN antisens.
Într-un dublu helix ADN:
- un lanţ ADN este complementar cu ARNm de origine utilizat pentru
sinteza ADNc;
- al doilea lanţ conţine aceleaşi secvenţe de nucleotide ca şi ARNm de
origine.
Prin transcrierea:
- primului lanţ ADN, rezultă ARN sens identic şi cu acelaşi sens ca şi
ARNm de origine;
- celui de-al doilea lanţ ADN, rezultă ARNm antisens = complementar
faţă de ARNm de origine: Acest ARN antisens se mai notează ARNc
(complementar) şi are sensul invers decât ARNm sens (normal).
Probele de ARN obţinute în maşini de gene cât şi prin metoda
transcrierii cu ajutorul vectorilor fagici, pot fi marcate direct în soluţia de
sinteză cu ajutorul nucleotidelor marcate (vezi „Marcarea”). Probele de lanţ
unic ARN astfel obţinute şi marcate se utilizează ulterior în reacţii de

226
hibridare, ca sonde genetice.

B. Marcarea
Se face pe un singur nucleotid, cu o substanţă care îl face vizibil din
punct de vedere biochimic sau imunohistochimic.

a. Marcarea radioactivă
Se face cu radioizotopi 3H,35S, 125I, 32P. La alegerea izotopului trebuie
ţinut cont de timpul de înjumătăţire (timp necesar pentru ca substanţă
radioactivă să se descompună în proporţie de 50%). Astfel, timpul de
înjumătăţire pentru :
3
H este de 12,35 ani;
35
S este de 87,4 ani;
125
I este de 60 de zile;
32
P este de 14,3 zile.
Atomul radioactiv introdus în probă prin dezintegrare va emite radiaţii
β care vor fi evidenţiate la autoradiografie (impresionarea plăcii Roentgen la
iluminarea cu radiaţii UV).
Timpul de expunere a filmului la UV va fi diferit în funcţie de izotopul
folosit:
- pentru hibridarea Blotting se foloseşte proba marcată cu 32P;
- pentru hibridarea in situ se foloseşte proba marcată cu 3H.
În ultima vreme există tendinţa ca substanţele radioactive să fie
abandonate din cauza efectului lor nociv asupra organismului şi înlocuirea
lor cu substanţe neradioactive.

b. Marcarea neradioactivă
Se face în două etape:
• Etapa I – marcarea probelor cu biotină (cel mai frecvent),
bromdeoxiuridină, digoxigenină.
• Etapa II – probele marcate sunt evidenţiate prin intermediul legării
markerului de avidină (glicoproteină din ou), streptovidină
(sintetizată din ciuperca Streptomyces avidinii) şi anticorpi
antimarker (de exemplu, antibiotina) marcaţi cu fluorocrom.

Etapa I
Markerul (biotina) se leagă printr-un lanţ de legare numit spacer de
baza uracil din nucleotid. Acest braţ de legare va uşura şi legarea ulterioară
a biotinei de proteinele avidină/streptovidină, în etapa II. În mod normal
uracilul se înglobează numai în ARN, nu şi în ADN, dar în condiţii de

227
laborator, prin intermediul spacer-ului de la biotină se pot realiza două tipuri
de legături:
- legătura cu nucleozidul natural;
- legătura cu nucleozidul artificial.
De exemplu: Bio – UTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat
Bio – dUTP; Biotină – spacer – uracil – zahăr – trifosfat.
Pentru aceste structuri se folosesc în laborator trifosfaţii
nucleozidelor. ATP-ul din nucleotidele ADN este transportor de energie
pentru metabolismul celular. Atât Bio – UTP, cât şi Bio – dUTP sunt
derivate biotinate ale dezoxiuridin – trifosftului şi, respectiv ribouridin –
trifosfatului şi vor fi înglobate în locul dezoxitimidin – trifosfatului şi,
respectiv în ARN, în locul ribouridin – trifosfatului. În momentul hibridării
cu segmente ADN ţintă, nucleotidele cu uracil se împerechează, pe lanţul
complementar de ADN ca şi pe lanţul ARN, tot cu un nucleotid cu adenină.

Etapa a II-a
Probele de mai sus biotinate se evidenţiază prin legarea biotinei de
avidină/streptovidină sau anticorpi antibiotină marcaţi cu fluorocrom.
Biotina prezintă o mare afinitate pentru avidină. Legătura biotină + avidină
este foarte puternică şi aproape ireversibilă. Din cauza unor reacţii
nespecifice se preferă streptovividina în locul avidinei. În final, pentru a se
evidenţia prezenţa complexului molecular hibrid biotină –
avidină/streptovidină, acesta este marcat prin diferite metode.

C. Înglobarea nucleotidelor marcate în sonda genetică


Se realizează prin:
I. Metode enzimatice
II. Metode chimice.

I. Metode enzimatice
Înglobarea nucleotidelor marcate radioactiv sau neradioactiv se face cu
ajutorul unei reacţii enzimatice, în prezenţa ionilor de Mg++.

a. Nick - translaţia
Cea mai folosită metodă pentru marcarea sondelor este Nick-
translaţia (translaţia prin tăiere). În această metodă se folosesc două enzime:
ADN-aza I şi ADN – polimeraza I.
ADN- aza I este o enzimă de restricţie extrasă din pancreas de bou; ea
taie legăturile fosfodiesterice de ADN unic sau dublu lanţ; nu atacă ARN şi
acţionează în prezenţa ionilor de Mg++ şi Mn++ (fig. 74).

228
Fig. 74. Acţiunea ADN- azei I pe dublul lanţ ADN în prezenţa ionilor de
Mg++ şi Mn++

ADN- polimeraza I (polimeraza Kornberg) este izolată din E. coli, are


acţiune polimerazică 5' > 3', fixează nucleotidul ADN la capătul liber 3'
(mai scurt) al moleculei ADN parţial dublu lanţ, în funcţie de
complementaritatea faţă de nucleotidele de pe lanţul matriţă corespunzător
(fig. 36). ADN – polimeraza I are şi o acţiune exonucleazică în ambele
sensuri: 5 ' > 3' şi 3' > 5' ; această acţiune apare doar când în cursul sintezei
unui ADN sunt introduse nucleotide false (fig.75).

Fig. 36 - Acţiunea 5 ' > 3' polimerazică a ADN- polimeraza I

Fig. 75 - Acţiunea exonucleazică în ambele sensuri ale ADN – polimerazei


I.
Astfel, după încorporarea nucleotidelor marcate, dublul lanţ ADN este
denaturat (cele două lanţuri sunt separate); se vor obţine fragmente de
lanţuri unice ADN marcate de diferite lungimi şi cu diferite secvenţe de
baze (sonde genetice) (fig.41).

229
b. Oligomarcare
(RADNom Priming, RADNom Priming Oligolabelling,Feinberg-
Vogelstein Technik)
Spre diferenţa de “nick-translatie”, în oligomarcare se folosesc drept
matriţe lanţuri unice de ADN rezultate dintr-o denaturare prealabilă a unui
lanţ ADN. Se foloseşte enzima Klenow Polimeraza care reprezintă un
fragment de ADN-polimeraza. Klenow Polimeraza posedă activitate 5’ – 3’,
şi 3’- 5’ exonucleazică (dar nu prezintă activitate 5’- 3’ exonucleazică).

Fig. 76 - Schema Nick – translaţiei (după Hermaun, 1991).

230
Se mai utilizează un amestec de hexanucleotide (oligonucleotide
sintetizate cu ajutorul unei maşini de gene); ele sunt structuri formate fiecare
din câte şase nucleoide care conţin practic toate combinaţiile de secvenţe
nucleotidice posibile, reprezentate de nucleotide ADN marcate (.), cât şi
nemarcate (o), aflate de obicei în proporţie de la 1 la 3.
Numele metodei de RADNom Priming derivă de la utilizarea drept
primeri a hexanucleotidelor cu secvenţe întâmplătoare (randomized primer).

c. Marcare terminală a lanţurilor ADN (Endlabelling).


Pot fi marcate capetele 3’ si 5’ ale moleculei ADN şi ARN. Spre
diferenţa de primele două metode (1 şi 2), prin care sunt marcate moleculele
de ADN probe (sonde genetice), în aceasta a treia metodă marcarea se face
numai la capetele moleculei ADN-proba rezultată; de aceea, sensibilitatea
moleculei de ADN rezultată prin această metodă este mult mai mică. Acest
tip de marcare se efectuează atât pe ADN unic lanţ cât şi dublu lanţ. Există
mai multe metode de marcare terminală. Marcarea terminală 3’ a ADN:se
face cu ajutorul enzimei transferaza terminală, denumirea completă fiind
dezoximetil-nucleotid-terminal-transferaza; enzima se foloseşte şi în
experienţe de clonare pentru obţinerea capetelor franjurate ale fragmentelor
ADN.
Această enzimă, în cazul de faţă, catalizează fixarea nucleotidului pe
capătul 3’-OH liber al moleculei ADN unic (sau dublu lanţ). Enzima nu are
nevoie de nici o matriţa; va rezulta deci un ADN lanţ unic cu un capăt 3’-
OH liber (şi respectiv un ADN cu un capăt format dintr-un lanţ 3’-OH care
atârna în afară). În aceasta metodă se foloseşte doar un singur nucleotid
ADN marcat (de exemplu, cu biotina): dezoxiribouridinbiotinat (Bio-
dUTP). Acest Bio-dUTP este legat prin acţiunea transferazei terminale de
capetele 3’-OH ale unei molecule ADN dublu lanţ, deci pe fiecare din cele
două lanţuri, la capetele 3’-OH formând o coadă cu aceleaşi nucleotide pe
ambele lanţuri ale dublului lanţ ADN (dar la capetele opuse). Lungimea
acestei cozi este dependentă de concentraţia cationilor de Co++şi de
concentraţia nucleotidelor. Cu ajutorul enzimei transferaza terminală se
poate, de asemenea, ataşa, unei molecule dublu lanţ ADN, o coadă cu
nucleotide nemarcate, care conţin toată timina. După denaturarea şi
hibridizarea unei asemenea “probe marcate”, această coadă cu timină poate
fi evidenţiată indirect prin fixarea, în cursul hibridizării, a unei cozi cu
adenină marcata cu biotin pe lanţul ADN proba (adenina se va fixa prin
complementaritate pe coada de timina).
În cazul acestei hibridizări, lanţul cu coada de timină reprezintă
secvenţa ţinta, iar cel cu coada de adenină, secvenţa proba.

231
II. Metode chimice
Reprezintă o marcare directa a acidului nucleic.

1. Marcarea cu fotobiotină.
Un asemenea tip de marcare este bazat pe legarea biotinei printr-un
braţ de legare chimică, de acidul nucleic, pe o grupare chimică activate în
prezenţa luminii (iluminare foarte scurtă). Se formează o legătură stabilă
între biotină şi acidul nucleic (lanţ unic sau dublu).

2. Marcarea cu acridin oranj.


Prin cuplarea între acridinester şi acidul nucleic se produce o
legătură de chemoluminiscenţă care eliberează lumina.

5.3. Clonarea ADN – ului

Clona bacteriană reprezintă un grup de celule bacteriene identice din


punct de vedere genetic, care provin dintr-o singură celulă bacteriană.
Clonarea se poate realiza prin încorporarea (printr-o tehnică de recombinare
ADN) a unui fragment de ADN străin într-un vector care ulterior este
introdus şi multiplicat într-o celulă gazdă. În biologia moleculară, clonarea
semnifică obţinerea unei culturi de celule dintr-o celulă unică, astfel încât să
se obţină populaţie uniformă din punct de vedere genetic.

A. Etapele principale ale metodei de clonare


Sunt următoarele:
ƒ extragerea unui fragment ADN, prin tăierea ADN genomic, cu
ajutorul enzimelor de restricţie;
ƒ introducerea fragmentului ADN într-un vector;
ƒ introducerea vectorului recombinant (plasmid care a înglobat
fragmentul ADN străin) în celula gazdă;
ƒ selectarea celulelor bacteriene care conţin vectorul recombinant.
Clonarea ADN se recomandă atunci cADN este necesară izolarea şi
multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). În majoritatea
experimentelor de clonare, se folosesc celule bacteriene de E.coli.

1. Extragerea unui fragment ADN.


Se lucrează pe celule de E..coli. Se folosesc enzime de restricţie de
tip sticky* şi un plasmid care poartă două gene (markeri de rezistenţa la
două antibiotice: ampicilina şi tetraciclina).
În scopul eficienţei de clonare:

232
a) pentru a împiedica circularizarea vectorului ADN străin, trebuie
îndepărtate grupările fosfat de la extremităţile 5’ ale moleculei
deschise de ADN a vectorului, cu ajutorul fosfatzei alcaline. În acest
fel, vectorul nu se va mai circulariza. Fosfataza alcalină se obţine din
celule de E.coli sau celule de intestine de oaie;
b) pentru a permeabiliza membrane celulei bacteriene la respectivul
plasmid vector, celula bacteriană trebuie tratată cu soluţie CaCl2
pentru a deveni competentă;
c) având în vedere faptul ca celulele bacteriene posedă sisteme care
protejează celula de pătrunderea unui ADN străin, se folosesc pentru
clonări celule bacteriene mutante (celule cu system de apărare mult
diminuat).

2. Introducerea vectorului recombinant în celula gazda


(competenta)
Acest fenomen reprezintă procesul de trasformare. În soluţia
nutritive în care se găsesc celulele bacteriene, sincron cu multiplicarea
celulelor bacteriene, se produce şi multiplicarea vectorilor recombinanţi
încorporaţi.
Ţinând cont de faptul că atât plasmidul cât şi fragmentele ADN au
locuri (situs-uri) de tăiere complementare, atunci când vectorul deschis şi
segmentul ADN străin vor veni in contact, din zonele sticky, se vor lipi şi va
rezulta lanţul ADN recombinant (fragmentul ADN a devenit inclus în
vector).
De obicei, pe plasmidul iniţial care poartă rezistenţa la antibiotice
(tetra şi ampicilina) se încorporează fragmentul ADN străin pe locul unuia
din cei doi markeri, elimină ADN markerul respective(de obicei se elimina
gena tetra şi rămâne cea pentru ampicilina în momentul tăierii lanţului ADN
de către enzimele de restricţie.

3. Testarea celulelor bacteriene supuse procesului de transformare


Aceasta testare se face cu scopul de a controla dacă celula bacteriană
încorporează respectivul plasmid recombinant. În acest sens, bacteriile
transformate (cele care au primit vector + ADN) se testează pe un mediu de
cultură cu ampicilină; vor supravieţui numai acele celule bacteriene care au
câştigat rezistenţa la ampicilina, prin acceptarea plasmidului recombinant,
purtător de genă pentru ampicilină (rezistenţa la ampicilină).
Din aceste bacterii cu vectori recombinant, însămânţate pe mediu de
cultură cu ampicilină vor creşte colonii bacteriene, din care fiecare va
reprezenta o clonă.

233
4.Selectarea celulelor bacteriene purtătoare de vector recombinant.
Selectarea acestor celule purtătoare de plasmid cu ADN străin
încorporate şi diferenţierea lor de celule (clone) fără ADN străin se face prin
însămânţare, prin replica plating, a coloniilor bacteriene pe un mediu cu
tetraciclina; pe acest mediu vor supravieţui doar clonele care nu conţin nici
un fragment de ADN străin (celule rezistente la tetraciclina).
Tip sticky = enzime care taie cele două lanţuri ale helixului ADN în
mod franjurat datorită faptului ca şi-au păstrat gena purtătoare de această
rezistenţă (este vorba de plasmidul “gol” fără ADN străin ataşat), în timp ce
clonele care au pierdut gena de rezistenţa la tetra (în momentul legării
plasmidului de ADN străin), prin formarea unui plasmid recombinant, nu
cresc pe acest mediu.
Abia din acest moment se poate studia mai departe clona care
conţine fragmentul ADN dorit, printr-o tehnică de hibridizare specială, şi
anume prin hidibridizare colonială.

B. Biblioteca genomică ADN (secvenţe de exoni + introni)


Dacă genomul unui organism este secţionat cu enzime de restricţie,
iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (în celule bacteriene), se va
obţine un număr de clone corespunzătoare de ADN diferitelor amestecuri
(vector plasmidic + segment ADN). Totalitatea acestor clone rezultate din
genomul unui organism iniţial reprezintă biblioteca genomică ADN. Acest
mod de clonare, care duce la formarea unei biblioteci genomice ADN prin
tăierea genomului (cu ajutorul enzimelor de restricţie) potrivit principiului
întâmplării şi prin unirea fragmentelor rezultate, reprezintă tehnica
“împuşcării” (shotgun).
Clona ADN genomică a unuia şi aceluiaşi organism este totdeauna
identică şi independentă de tipul celular, deoarece toate celulele aceluiaşi
organism posedă o înzestrare genetică identică. Din aceasta biblioteca se
obţin secvenţe ADN necesare pentru tehnica de hibridizare; acestea vor fi
folosite drept secvenţe ADN cu rol complementar (cu secvenţe ADN
cunoscute), în vederea identificării unor fragmente ADN noi, necunoscute, a
căror secvenţe nucleotidice trebuie cercetare şi identificate.
Clonele genomice ADN vor conţine atât secvenţe de introni, cât şi
exoni, corespunzătoare genomului celulei respective de origine.
Clonele din biblioteca genomică ADN se folosesc pentru:
- cercetarea structurii complete a genelor;
- cercetarea structurii exonilor şi intronilor;
- cercetarea secvenţelor reglatoare.

234
C. Biblioteca ADNc (ADN copie după matriţa de ARNm matur)
Reprezintă doar o informaţie pură formată numai din secvenţe de
exoni. Spre diferenţa de biblioteca genomică ADN, care rezultă din clonarea
de fragmente ADNc se sintetizează artificial în laborator, pe o molecula de
ARNm matur, drept copie complementară (în prezenţa enzimei
reverstranscriptaza).
Produsul acţiunii acestei enzime va fi o moleculă mixtă (hibrid):
ARNm-ADNc. Din acest hibrid, lanţul dublu ADNc se va forma din acest
lanţ unic ADNc, prin două posibilităţi:
- în prezenta ADN-polimerazei (Klenow= ADN-polimeraza I extrasă din
celula de E.coli);
- în vectori; vectorii recombinaţi (vector + lanţ unic ADNc) vor
determina ulterior formarea de clone bacteriene ADNc.
În timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate
celulele aceluiaşi organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele
tipuri de celule ale aceluiaşi organism. În fiecare tip de celule, aceluiaşi tip
de ADN genomic îi corespund alte gene active (exoni), ceea ce înseamnă că
în fiecare tip de celule poate apare un alt tip de ARNm matur, astfel încât,
aceluiaşi organism, biblioteca ADNc rezultată variază de la un tip celular la
altul.
Clonele din biblioteca ADNc se folosesc în special în scopul analizei
directe a secvenţelor de baze care codifica un anumit aminoacid sau
produsul proteic final (codificat de respectivul fragment ADNc). Secvenţa
clonelor ADNc este studiată în special prin experimentele de hibridizare.
Astăzi, în terapia bolilor tumorale se întrevede posibilitatea
identificării şi distrugerii ţintite a anumitor molecule ARNm, care induc
translaţia informaţiei pentru sinteza unor substanţe oncogene.
Cu ajutorul experienţelor de clonare s-a reuşit citirea de secvenţe de
ADN de pe lanţul ADN al genomului unui organism. Pasul următor îl
reprezintă obţinerea unor modificări ale acestor secvenţe ADN, cu ajutorul
unor tehnici de inginerie genetică (procese artificiale de recombinare ADN),
cât şi introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN în celule sau
organisme, unde aceste modificări urmează a se exprima.

5.4. Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR)

A fost numită de Lederberg, în 1993, “instrumental pentru


democratizarea biologiei moleculară”.Această reacţie dă posibilitatea ca
dintr-o mixtură de ADN să poată fi “pescuită” o singura moleculă de ADN,
şi aceasta sa fie ulterior amplificată enzimatic, cu mijloace tehnice relative
simple.
235
Spectrul de aplicabilitate al PCR este foarte larg: de la medicina
judiciară, diagnosticarea bolilor genetice până la “vânarea” şi identificarea
de noi virusuri şi studii de ecologie şi arheologie (studiul ADN-ului) din
fosile.
PCR este folosită pentru cercetarea unor cantităţi foarte mici de ADN
dintr-un produs biologic.
Avantajele acestei reacţii sunt următoarele:
- fiind foarte sensibilă, reacţia poate pune în evidenţă chiar şi prezenţa
unei singure molecule de ADN, în probele de cercetat (produs
biologic), deoarece reacţia oferă posibilitatea multiplicării (clonării)
ADN-ului chiar şi în afara celulei vii;
- reacţia permite chiar şi multiplicarea unei singure secvenţe de ADN.
Astăzi există maşini automate (Thermai Cycler) pentru realizarea unor
asemenea reacţii repetate; o multiplicare suficientă de secvenţe de ADN este
reprezentată de minimum 25 de cicluri de multiplicare; într-o maşina
automata se desfăşoară 30 de cicluri într-un interval de 4 ore.

A. Principiul reacţiei.
Se foloseşte drept matriţă un ADN monocatenar. În condiţii de
laborator in vitro, pe acest lanţ unic de ADN se poate sintetiza un lanţ
complementar cu ajutorul ADN-polimerazei şi în prezenţa unui
oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer (armorsa). Pentru a porni sinteza
noului lanţ ADN pe un lanţ ADN matriţă, ADN-polimeraza necesită
prezenţa pe matriţa a unui oligonucleotid primer cu capătul 3’-OH liber; la
acest capăt urmează a se fixa nucleptidele ADN care vor forma noul lanţ.

B. Efectuarea reacţiei
PCR poate porni de la punctul a sau b.
a. ADN genomic dublu lanţ (de cercetat) izolat din celule şi
tăiat în fragmente cu ajutorul enzimelor de restricţie;
b. Lanţ unic de ADNc, sintetizat în prealabil prin transcriere
inversă a ARNm.
La capatul 3’ al lanţului ADNc se ataşează o coadă de nucleotide -
guanina cu ajutorul enzimei trasferaza terminală.Urmează desfăşurarea PCR
cu doi primeri diferiţi utilizaţi simultan, câte unul corespunzător pentru
fiecare lanţ ADN (rezultat din ADN-ul dublu lanţ denaturant). Dintre cei doi
primeri, primul primer este nucleotide - timina, al doilea primer este
nucleotide - citozina.

236
Etapele reacţiei:
ƒ denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lanţ sau ADNc
(sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la temperatură înaltă (95
grade C). Acest ADN conţine secvenţe care urmează a fi multiplicate
(amplificate);
ƒ după scăderea temperaturii se adaugă primerul în exces. În aceste condiţii
fixarea primerului pe ADN-ul unic lanţ reprezintă un proces de hibridizare
ce are loc la temperatură scăzută (36-65 grade C). Primerul delimitează
capătul iniţial al fiecărei din cele două secvenţe ADN unic lanţ (rezultate
din denaturarea ADN-ului dublu lanţ) de multiplicat. Adaosul de primer se
face în exces, pentru a se obţine o hibridizare primer lanţ unic de ADN şi
nu o hibridizare între lanţurile unice de ADN rezultate din denaturare.
ƒ reacţia de sinteză a noului lanţ ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, în
prezenţa celor 4 tipuri de nucleotide ADN (adenine/timine/guanine/citidin
deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. ADN-
polimeraza se leagă de capatul 3’ al primerului şi sintetizează noul lanţ în
direcţia 5’->3’, folosind drept matriţă segmentul ADN lanţ unic de
amplificat. Primerul va fi încorporat în noul lanţ de ADN format. În acest
fel lanţul de ADN este dublat şi, odata cu acesta, un ciclu de PCR este
terminat.
ƒ începe un nou ciclu cu denaturarea de aceasta dată a ADN-ului dublu lanţ
nou sintetizat (în treapta anterioară); mai departe, acest nou ciclu şi acest
ADN nou-sintetizat (prin sinteza mijlocită de ADN-polimeraza);
ƒ cu fiecare nou ciclu (de denaturare/sinteză a ADN-ului) va fi dublată
cantitatea de ADN rezultată din ciclul anterior.
Pentru sesizarea eventualelor erori sau neajunsuri ale reacţiei PCR,
se recomandă;
- repetarea de mai multe ori a respectivei reacţii pentru aceeaşi probă;
- reacţia PCR sa fie însoţită, de fiecare dată, de controale negative.

C. Polimeraza utilizată în PCR.


În anii 1980, se folosea ADN-polimeraza Klenow (fragment de
ADN-polimeraza I de la E. coli); fiind termolabilă, această enzimă a fost
apoi înlocuită cu o ADN-polimeraza termostabilă, izolată de la o bacterie
termofilă Thermus acquaticus.
Aceasta ADN-polimeraza a fost numită Taq-polimeraza. Taq-
polimeraza este stabilă până la 950 C.
La fiecare nou ciclu al PCR se adaugă Taq-polimeraza proaspătă.
Optimum de activitate al acestei enzime este la 75-800C; această activitate
scade cu 50% la 600 C şi cu 90% la 370 C.

237
Dacă pentru PCR denaturarea ADN-ului se face la 950 C, noul adaus
de Taq-polimeraza declanşează de fiecare dată ciclu următor de sinteza
ADN. În acest fel, se poate efectua reacţia în care toţi reactivii se pun de la
început în recipient până la sfârşitul reacţiei nu mai trebuie adăugate noi
cantităţi.
Utilizarea Taq-polimeraza a făcut posibilă automatizarea totală a
acestei produceri în maşinile Thermal Cyclers. În condiţii normale, cu
ajutorul Taq-polimerazei se pot efectua consecutive 40 de cicluri PCR,
obţinându-se o amplificare ADN de ordinal 10 la puterea 6-10 la puterea 7.
Dacă se urmăreşte o amplificare ADN mai mare decât cea corespunzătoare
la 40 de cicluri PCR, trebuie începută o nouă serie de cicluri, cu ajutorul
ADN-ului amplificat, obţinut şi diluat de 1000-10000 de ori.
În acest fel, cu ajutorul a două serii câte 40 de cicluri PCR, se poate
obţine o amplificare de 109 a cantităţii de ADN. Pentru o multiplicare
suficientă de secvenţe ADN sunt necesare 25-30 de cicluri de reacţii
automatizate, care se efectuează, după cum am mai arătat, în aproximativ 4
ore.

D. Aplicabilitatea practică a PCR-ului.


Produsele ADN obţinute prin PCR sunt separate electroforetic în
funcţie de dimensiuni, sub forma de benzi, în gelul de electroforeză, iar apoi
benzile sunt făcute vizibile, în lumina UV prin tratarea prealabilă a gelului
cu etidiumbromid. Apoi se realizează hibridizarea ADN-ului cu sonde
genetice specifice prin metoda Souther Blotting.
PCR are un spectru de aplicabilitate foarte larg, după cum urmează:
a. În diagnosticul medical.
În acest scop, ADN-ul se extrage din celule proaspăt lizate şi din
celule fixate şi înglobate în parafină. ADN-ul astfel extras este supus reacţiei
polimerazei în lanţ şi apoi analizat cu ajutorul sondelor genetice prin reacţia
de hibridizare. PCR este utilizat în: diagnosticul bolilor ereditare (fibroza
chistica, anemia Cooley, distrofia musculară Duchenne, fenilcetonuria).
Diagnosticul bolilor ereditare, graţie PCR-ului, se poate face şi prenatal, în
făt, prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice; prin aceasta
metodă se poate face determinarea prenatal pentru sexul copilului şi se poate
pune şi diagnosticul unei eventuale boli genetice. În urma recoltării de lichid
amniotic este supus determinării cu ajutorul PCR-ului sau al anticorpilor
monoclonali, în acest fel fiind posibilă determinarea de defecte genetice
cromozomiale, metabolice (enzimopatii). diagnosticul bolilor infecţioase.
Diagnosticul infecţiei HIV cu ajutorul PCR-ului se poate face în
stadiile prococe ale infecţiei, prin identificarea prezentei acidului nucleic
viral în sânge (şi anume acidul nucleic viral fixat în genomul celulei
238
limfocitare umane), atunci când toate celelalte reacţii serologice sunt încă
negative. PCR poate da un rezultat precoce pozitiv chiar şi în prezenţa unei
singure celule infectate cu HIV ( din materialul de cercetat ).
Introducerea diagnosticului rapid al infecţiei HIV prin PCR este
astăzi absolut necesară în practică, în special în investigarea donatorilor de
sânge şi de organe.
Pentru diagnosticarea infecţiei HIV într-o encefalita declanşată de
acest virus, nu este necesară o probă de ţesut cerebral, ci este suficientă doar
o probă de LCR.
În general, pentru un diagnostic prin PCR, recoltarea de probe
reprezintă un stres minim pentru bolnav; în acest caz se folosesc drept
probe; spălătura bucala (cu celule epiteliale), epitelii de fir de par, probe
uscate de sânge. PCR mai este utilizat în diagnosticul următoarelor boli
infecţioase: hepatita virala, infecţia cu virus herpes simplex, virus Epstein-
Barr,virus papollima, Mycobacterium tbc., Pneumocistis carinii, Neisseria
meningitides, Clostridium difficile.
Recent, cu ajutorul reacţiei PCR au fost efectuate studii genetice
asupra tulpinei de Vibro cholerae grup 0139 (izolată pentru întâia oara, pe
glob, în 1992-1993, în Bengal), reuşind sa se demonstreze ca această tulpină
ar reprezenta rezultatul unor modificări genetice suferite de tulpina Vibrio
cholerae grup 01 biotip eltor, prin deleţia, de pe ADN-ul cromozomial, a
unui segment de 22 kb, concomitent cu inserţia unui segment nou de 35 kb.
PCR este utilizat şi în identificarea unor germeni microbieni ramaşi
până astăzi necultivabili, de exemplu în boala Whipple.
Boala Whipple a fost semnalată pentru întâia oara în anul 1907; este
primul exemplu în care s-a emis ipoteza prezenţei posibile a unei bacterii
necultivabile, imposibil de identificat prin posibilităţile clasice cunoscute. S-
au postulat apoi şi alte boli de etiologie posibil microbiană fără a fi însă
posibilă evidenţierea prezenţei unor microorganisme, probabil microbiană
fără a fi însa posibilă evidenţierea vizuală, în aceste cazuri fiind necesare
alte metode decât cultivarea pe medii de cultură, pentru detectarea şi
identificarea agenţilor patogeni. Noile metode îşi au rădăcinile în
filogenetica moleculară. Boala whipple se manifestă clinic prin astralgii
migratorii, febra, dureri abdominale, diaree, pierderi în greutate, apariţia în
ganglionii mezenterici de infiltrate macrofagice proeminente, depozite de
grăsime.
b. În medicina judiciară
PRR este folosit pentru evidenţierea identităţii unui fir de păr sau a
unei cantităţi foarte mici de sânge sau spermă. Astăzi PCR poate fi folosită
în combinaţie cu metoda fingerprinting în aceleaşi scopuri.

239
c. În studii ecologice
Cu ajutorul PCR s-a reuşit evidenţierea unui număr de
microorganisme în probe de pământ şi apă; au fost analizate
microorganisme care până astăzi nu au putut fi cultivate pe medii de cultură,
cât şi microorganisme de sol care au suferit în timp modificări genetice.
d. În arheologie
PCR a fost utilizată până în prezent şi pentru analiza ADN provenit
din mumii egiptene vechi de mai bine de 2400 de ani.

5.5. Secvenţierea ADN- ului

Analiza structurii ADN a început odată cu anii '70, cu ajutorul


metodei de secvenţiere ADN şi de analiză a secvenţelor nucleotidice din
aceste structuri.
Acest studiu a fost posibil datorită folosirii enzimelor de restricţie
(endonucleaze), care pot tăia moleculele de ADN în fragmente de câteva
sute până la câteva mii de perechi de baze. Aceste fragmente obţinute pot fi
apoi separate electroforetic şi analizate. La Los Angeles şi la Heidelberg
există în prezent bănci de date în care au fost strânse toate secvenţele ADN
cunoscute până în prezent. Genomul multor virusuri a fost total secvenţiat.
În 1995 a fost terminată secvenţierea completă a primului genom bacterian,
cel de Haemophilus influenzae, urmat la scurt timp de cel de Mycoplasma
genitalium. Curând vor fi terminate şi secvenţierile complete ale
genomurilor bacteriene Escherichia coli, Bacillus subtilis,
Methanobacterium thermoautotrophicum. La drojdii (drojdia de bere –
Saccharomyces cerevisiae), a fost secvenţiat pentru prima dată un
cromozom, şi anume cromozomul III, dovedindu-se că conţine 315 357
perechi de nucleotide şi 200 de gene; la această analiză s-a lucrat trei ani în
35 de laboratoare din lume.
Cu ajutorul acestei proceduri s-au obţinut informaţii şi asupra
materialului genetic inclus în cele 23 de perechi de cromozomi umani, şi
anume:
- locul relativ al genelor pe cromozomi;
- identificarea unui număr de gene;
- cauzele unor boli genetice.
În prezent este în curs de desfăşurare proiectul de cercetare asupra
genomului uman, genom care conţine circa trei miliarde de perechi de baze
(50 000 – 100 000 de gene).
Astăzi se ştie că doar 3 % din genomul uman reprezintă gene
funcţionale (exoni), restul de 97 % din genom reprezintă doar „balast
genetic” a cărui semnificaţie este încă necunoscută.
240
A. Principiu
Secvenţierea ADN (sequencing) înseamnă tăierea lanţului ADN în
secvenţe şi analiza ulterioară a secvenţelor de baze nucleotidice din aceste
fragmente. Prin descifrarea acestor secvenţe de baze se poate ajunge la
delimitarea genelor şi la stabilirea secvenţelor de aminoacizi codificate de o
singură genă. Ca urmare, analiza secvenţială a ADN-ului şi, indirect, cea a
proteinelor corespunzătoare pot furniza date cu privire la conformaţia
proteinei, funcţiei proteice, înrudirii dintre proteine, cât şi asupra bolilor
produse prin mutaţii.
Secvenţierea ADN este o variantă a tehnicii de recombinare ADN
cu ajutorul căreia se poate stabili secvenţa de baze din molecula ADN.
Condiţia de baza pentru realizarea acestei secvenţieri este prezenţa unui
număr suficient de copii ale moleculei de ADN. Acest lucru se poate realiza
prin clonarea ADN sau prin metoda PCR.

B. Metode
Pentru secvenţiere se folosesc două metode:
I. Metoda enzimatică; tehnica Sanger (Chain Termination Tehnique).
II. Metoda chimică; tehnica Maxam - Gilbert (de obicei combinată cu
metoda Sanger).

I. Metoda enzimatică
Tehnica Sanger
Principiu: se determină secvenţele de baze nucleotidice pe copia de
acid nucleic şi prin complementaritate se deduce secvenţa de baze de pe
lanţul de acid nucleic de origine.
Etapele reacţiei:
- lanţul dublu de acid nucleic (AN) este adus la forma de ADN unic lanţ;
- pe lanţul unic AAN se fixează un primer (moleculă starter sau amorsă).
Acest primer este un oligonucleotid scurt, preparat semiautomat prin
tăiere, cu ajutorul enzimelor de restricţie, a unui fragment ARN.
Primerul este astfel selectat încât capătul 3' să se potrivească prin
complementaritate, într-un punct, pe lanţul ADN de cercetat. Acest
primer este înglobat într-un vector sau secvenţă cunoscută;
- are loc sinteza lanţului ADN complementar (după modelul matriţei
ADN) în prezenţa celor patru dezoxinucleotid trifosfaţi (dATP, dTTP,
dGTP, dCTP), dintre care unul este marcat, a unui didezoxinucleotid
trifosfat (ddNTP) şi a ADN-polimerazei I sau reverstranscriptazei;
- sinteza lanţului ADN se va opri acolo unde în locul unui dNTP se va
îngloba un ddNTP corespunzător. În acest punct se va opri reacţia
241
polimerazei. Această reacţie de sinteză a ADN-ului se va desfăşura în
patru variante, în fiecare din variante fiind marcat altul din cele patru
dNTP-uri;
- cele patru molecule de ADN dublu lanţ obţinute sunt denaturate prin
căldură;
- lanţul de acid nucleic nou sintetizat cu un nucleotid marcat este separat
prin gel elecroforeză;
- în locul marcării radioactive, fiecare bază este colorată cu altă
substanţă fluorescentă. Apoi se face citirea bazelor colorate de pe gelul
de electroforeză prin autoradiografie.

II. Metoda chimică


Tehnica Maxam-Gilbert
Spre deosebire de tehnica Sanger, unde determinarea secvenţelor se
face pe lanţul copie, prin tehnica Maxam-Gilbert determinarea secvenţelor
se face pe lanţul de acid nucleic de origine. Tehnica se bazează pe o
modificare chimică a unei baze şi o tăiere specifică la nivelul altei baze (de
exemplu adenina), de pe molecula ADN. Aceste reacţii au loc pe lanţul
ADN originar. În ultimii ani, în S.U.A. în laboratoarele de Genetică ale
Universităţii Berkeley, s-au realizat aparate automate pentru citirea
secvenţelor de baze nucleotidice din acizii nucleici cu viteza de 7 000 – 8
000 secvenţe de baze pe zi.

5.6. Fingerprinting genomic (amprente de ADN)

a. Principiu
Pe baza analizelor de secvenţiere a ADN-ului, s-a demonstrat că
fiecare individ este caracterizat printr-un fingerprinting genomic (un pattern
individual al regiunilor hipervariabile din ADN-ul genomic, şi anume de pe
zona ADN- urilor minisatelizate).
Genomul uman conţine trei miliarde de perechi de nucleotide, dintre
care:
ƒ 70 % reprezintă secvenţe unice identice la toţi indivizii;
ƒ 30 % reprezintă secvenţe repetitive, şi anume:
- înalt repetitive 7 – 10 %; aceeaşi secvenţă de 300 perechi de
nucleotide se repetă de 30 000 – 1 milion de ori dispersat, pe
toată lungimea genomului;
- gene structurale pentru sinteza de ARNt, ARNr şi histone;
- zona spacer ce conţine gene criptice (silenţioase);

242
- ADN-uri satelite înalt repetitive, netranscriptibile,
necodificatoare de proteine.
ƒ 20 – 30 % moderat repetitive, fiecare secvenţă cu câteva sute până la
6 000 de perechi de nucleotide se repetă în 20 – 30 000 de copii.
b. Tehnica RFLP
Cu ajutorul acestei tehnici se pun în evidenţă zonele de ADN
variabil de la individ la individ. Aceste tipare de fragmente de ADN
individual sunt reprezentate de o amprentă RFLP specifică (polimorfismul
de lungime al fragmentelor de restricţie).
Pentru determinarea acestor tipare individuale, se izolează ADN-ul
genomic din celulele unui organism (diferite ţesuturi, rădăcini ale firului de
păr, sânge, salivă, spermă).
Tehnica RFLP cuprinde următoarele etape:
- ADN-ul extras este supus acţiunii enzimelor de restricţie;
- fagmentele de ADN (dublu catenar) sunt supuse migrării bidimensionale
într-un gel denaturat (conţinând un agent chimic denaturat ca ureea,
concentraţie 5 %);
- benzile de ADN unic lanţ obţinute în gel sunt supuse colorării cu
etidiumbromid;
- benzile ADN sunt vizualizate prin transiluminare la UV.
Această tehnică evidenţiază atât prezenţa/absenţa fragmentelor de
restricţie, cât şi polimorfismul de lungime al respectivelor fragmente.
Determinarea RFLP pentru organismele eucariote, inclusiv omul, are
semnificaţie, în mod deosebit, în cazul urmăririi transmiterii la descendenţi,
a informaţiei genetice parentale (prin compararea fringerprint - urilor între
generaţii). În cazul examinării singulare (a informaţiei genetice per individ),
se preferă metoda Southern Blotting a cărei capacitate discriminatorie este
considerată mai bună.
c. Tehnica AFLP
Această tehnică ce combină principiul analizei RFLP cu cel al
reacţiei PCR înalt specifică, detectează numai prezenţa sau absenţa
fragmentelor de restricţie, dar nu face şi analiza polimorfismului de lungime
a fragmentelor. Tehnica este considerată astăzi metoda universală pentru
determinarea prezenţei/absenţei unei anumite amprente de ADN în orice
sursă de origine bacteriană, vegetală, animală sau umană.

243
d. Aplicaţii ale metodei amprentelor ADN
În medicina judiciară:
- în criminalistică; urmărirea criminalului poate fi condusă în funcţie de
urmele găsite: amprente individuale prezente în resturi de piele, păr,
sânge, spermă. Dacă materialul genetic se află în cantitate foarte mică, se
recurge la PCR pentru amplificarea cantităţii de ADN;
- diagnosticul paternităţii; având în vedere că variaţiile de ADN- urile
minisatelite se moştenesc după legile mendeliene, metoda amprentelor
ADN este utilă pentru dovedirea unei înrudiri (amprenta genetică diferă de
la individ la individ, se potriveşte în mare parte la rude şi este identică la
gemenii univitelini);
În medicina clinică
- în boli genetice; în analiza de likage şi determinarea instabilităţii genetice;
- în oncologie; pentru diagnosticul modificărilor genetice din celulele
tumorale de la persoane cu carcinom mamar (se prepară şi se compară
amprente de ADN din celulele tumorale/elemente figurate sanguine cu
condiţia ca în proba de sânge să nu existe celule modificate oncogen;
- urmărirea epidimiologică a circulaţiei agenţilor infecţioşi pentru
determinarea pattern-urilor RFLP la virusuri şi tulpini bacteriene;
- stabilirea interrelaţilor virale şi bacteriene pe bază de amprente ADN, în
vederea încadrării taxonomice a unor noi agenţi infecţioşi;
- prin introducerea tehnicii de fracţionare a segmentelor de restricţie şi
separării acestora în gel cu gradient denaturat, se va putea, în viitor,
măsura frecvenţa mutaţiilor în genomul uman, se va putea analiza
instabilitatea genomului şi a relaţiei acestuia cu senescenţa şi neoplazia, se
vor putea realiza analize de linkage şi cartare de noi gene implicate în boli
genetice;
În biologie
- stabilirea paternităţii unor păsări de pradă ale căror ouă au fost clocite de
părinţi adoptivi;
- stabilirea de relaţii genetice între diferite specii pe baza structurii ADN-
ului, acest criteriu fiind superior celui al sistematizării de până în prezent,
efectuat pe bază simplelor caractere morfologice;
- stabilirea polimorfismului genetic în interiorul aceleiaşi specii (de
exemplu, heterozigoţii);
- pe baza existenţei RFLP-urilor au fost amplificate şi analizate secvenţe
nucleotidice din fragmente ADN provenite de la specii dispărute;
În arheologie
- s-a analizat ADN-ul provenit de la mumii egiptene vechi de mai bine de
2400 de ani (prin clonare şi secvenţierea unor fragmente ADN de circa
3400 de baze).
244
BIBLIOGRAFIE

1. ACATRINEI C., 1975 - Biologia celulei vegetale. Ed. Ştiinţifică şi


enciclopedică, Bucureşti;
2. ANGHEL I., 1979 - Citologie vegetală, Ed. Did. Şi Ped., Bucureşti;
3. ANGHEL I., BREZEANU A., TOMA N., 1981 - Ultrastructura
celulei vegetale - Atlas - Ed. Academiei RSR, Bucureşti;
4. ANGHEL I., TOMA N., 1975 - Citologie vegetală - Tehnici şi
metode de laborator. Tipografia Universităţii Bucureşti.
5. BUVAT R., 1969 - Plant cells. An introduction to plant protoplasm.
London, World University Library;
6. CHANTON R., OBRE A., 1971- Biologie cellulaire, II –
Physiologie cellulaire, Paris, Eds. Doin Deron et Cie;
7. CIOBANU I., 1971 - Morfologia plantelor, Ed. Did. Şi Ped.,
Bucureşti.
8. CONSTANTINESCU D. GR., HAŢIEGANU E., 1983 - Biologia
moleculară a celulei vegetale. Ed. Medicală, Bucureşti;
9. COMĂNESCU G. ,1993 - Curs de citologie şi histologie animală,
Ed. Univ. "Alex. I. Cuza", Iaşi;
10. DIACONEASA B., 1978 - Citologie vegetală, Tipografia
Universităţii “BABEŞ-BOLYAI” Cluj-Napoca;
11. DICULESCU I., ONICESCU D., MISCHIU L., 1971 - Biologie
celulară, Ed. Academiei, Bucureşti;
12. MANOLACHE V., 1986 - Citologie, histologie, embriologie
animală, Lito. Univ. Bucureşti;
13. NOUGAREDE A., 1969 - Biologie vegetale, tome I - Cytologie,
Ed. Masson et Cie, Paris;
14. PRISECARU MARIA, GHIORGHITA G., 2002 – Haploidia
experimentala in contextul biotehnologiilor moderne. Editura
Tehnica Bucuresti, 192p.;
15. PRISECARU MARIA, 1996 - Biologie celulară - caiet de lucrări
practice, Bac-Print, Bacău, 1996, 180p.;
16. BARABAS N., PRISECARU MARIA., 1999 - Histologie vegetala,
Ed. Emil Borcea, Bacau, 1999, 150 p.;
17. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, PRISECARU
FLORIAN, 2008 - Citologie - Metode de laborator, Ed. „Alma
Mater”, Bacău, ISBN – 978-973-1833-85-9, 120p.;
18 PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, 2008 - Histologie
animală - Metode de laborator, Ed. „Alma Mater”, Bacău, 130p.;

  245
19. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, RĂDUCANU
DUMITRA, TINA OANA CRISTEA; PRISECARU FLORIAN,
2008 - Ecotoxicologie – Curs universitar, Ed. „Alma Mater”,
Bacău, 300p.;
20. PRISECARU MARIA, VOICU ROXANA, RĂDUCANU
DUMITRA, PRISECARU FLORIAN, 2008 - Ecotoxicologie –
Metode de laborator, Ed. „Alma Mater”, Bacău, 100p.;
21. PRISECARU MARIA, STOICA IONUŢ, CRISTEA TINA OANA,
2011, Citologie vegetală, curs universitar,Editura „Alma Mater”,
Bacău, ISBN: 978-606-527-114-2;
22. PRISECARU MARIA, CRISTEA TINA OANA, STOICA IONUŢ,
2011, Histologie animală, curs universitar, Editura „Alma Mater”,
Bacău, ISBN: 978-606-527-115-9;
23. PRISECARU MARIA, CRISTEA TINA OANA, VOICU
ROXANA, 2011, Biologie celulară şi moleculară, curs universitar
Editura „Alma Mater”, Bacău, ISBN: 978-606-527-116-6;
24. PRISECARU MARIA, MORĂRAŞU NADIA, 2012 - Lumea
plantelor în viaţa omului, Ed. Alma Mater, Bacău
25. PRISECARU MARIA, STOICA IONUŢ, CRISTEA OANA TINA,
2012, Biologie vegetală – curs universitar, Ed, Alma Mater Bacău,
384 p.;
26. PRISECARU MARIA, STOICA IONUŢ, 2012 - Biologie vegetală
- Lucrări practice, Ed, Alma Mater Bacău, 133 p.;
27. RAICU P., 1984 - Informaţia genetică şi viaţa, Ed. Ştiinţifică şi
enciclopedică, Bucureşti;
28. RAICU P., 1974 - Genetica, Ed. Did. şi Ped., Bucureşti;
29. RAICU P., IONESCU-VARO M., GENEVICI G., MOISESCU G.,
1972 - Celula – structură, ultrastructură şi funcţii. Ed. Ac. RSR;
30. RAICU P., IONESCU-VARO M., STOIAN V., 1978 - Celula vie,
Ed. Şt., Bucureşti;
31. RAICU P., NACHTIAL M., 1969 - Citogenetica, principii şi
metode, Ed. Acad., Bucureşti;
32. STEOPOE I., 1967 - Citologie, histologie, embriologie, Ed. Did. Şi
Ped., Bucureşti;
33. TARNAVSCHI I. T., şi colab., 1974 - Practicum de morfologie şi
anatomie vegetală, Tipografia Universităţii Bucureşti;
34. TEODORESCU M., UNTU C., 1974 - Lucrări practice de
citologie, histologie, centrul de multiplicare, Univ. Bucureşti.
 

  246