UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE ŞTIINłE

Camelia Ciobanu

InfluenŃa unor extracte vegetale de

Chelidonium majus şi Berberis vulgaris
indicate pentru afecŃiuni hepatice
asupra şobolanilor intoxicaŃi experimental

Rezumatul tezei de doctorat

Conducător ştiinŃific,
Prof. Dr. Aurel Ardelean

ORADEA
2008

1
 Cuprins

Introducere 8
Partea generală 11
1. ImportanŃa fitoterapeutică a speciilor Chelidonium majus şi Berberis
vulgaris 12
1.1. Chelidonium majus 12
1.1.1. Date botanice 12
1.1.2. Produsul medicinal Chelidonii herba 14
1.1.3. Date fitochimice 16
1.1.4. Efecte fitoterapeutice ale extractelor 19
1.1.5. Forme farmaceutice şi medicamente 22
1.2. Berberis vulgaris 27
1.2.1. Date botanice 27
1.2.2. Produsul medicinal Berberidis cortex 29
1.2.3. Date fitochimice 30
1.2.4. Efecte fitoterapeutice ale extractelor 32
1.2.5. Forme farmaceutice şi medicamente 34
2. Modele experimentale de inducere a afecŃiunilor hepatice 36
2.1. Cercetarea influenŃei extractelor vegetale asupra organismului 36
2.2. IntoxicaŃia hepatică acută experimentală 37
2.3. Modele de experimentare a acŃiunii hepatoprotectoare
a extractelor vegetale 40
Partea experimentală 44
3. Premize şi obiective de cercetare 45
3.1. Precizări privind acŃiunea extractelor vegetale de
Chelidonium majus şi Berberis vulgaris 45
3.2. Obiectivele cercetării 47
4. Materiale şi metode 49
4.1. Extractele vegetale 49
4.1.1. DefiniŃie şi tipuri 49
4.1.2. Descrierea extractelor fluide 50
4.1.3. Prepararea extractelor fluide 50
4.2. Modele de organizare structurală şi ultrastructurală
a ficatului la şobolan 52
4.2.1. Lobulii hepatici 52
4.2.2. PopulaŃiile celulare hepatice 56
4.3. Tetraclorura de carbon, un xenobiotic cu tropism hepatic 61
4.3.1. AcŃiunea CCl4 asupra organismului 61
4.3.2. Bioactivarea hepatică a CCl4 62
4.3.3. Mecanismul de acŃiune al CCl4 63
4.3.4. Modificările hepatotoxice induse de CCl4 65

2
 4.3.5. Hepatectomia chimică 68
4.3.6. Sisteme celulare de protecŃie împotriva toxicităŃii CCl4 70
4.3.7. Utilizări experimentale ale CCl4 74
4.4. Metode şi tehnici experimentale 76
4.4.1. Metode histologice 76
4.4.2. Tehnici histochimice 76
4.4.3. Tehnici histoenzimatice 77
4.4.4. Metode biochimice 78
4.4.5. Metode electronomicroscopice 79
5. Organizarea experimentelor 80
5.1. Tipul experimentelor 80
5.2. Animalele de experienŃă 80
5.3. Loturile de experienŃă 81
5.4. SubstanŃele administrate 81
5.5. Dozele administrate 82
5.6. Calea de aministrare 83
5.7. Recoltarea probelor 83
6. Rezultate şi discuŃii 84
6.1. InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de
Chelidonium majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor senescenŃi
intoxicaŃi cu CCl4 84
6.1.1. Analizele experimentale 84
6.1.2. Discutarea rezultatelor 114
6.1.3. Concluzii comentate 120
6.2. InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de
Chelidonium majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor tineri
intoxicaŃi cu CCl4 123
6.2.1. Analizele experimentale 123
6.2.2. Discutarea rezultatelor 150
6.2.3. Concluzii comentate 152
6.3. InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis
vulgaris asupra ficatului şobolanilor tineri 155
6.3.1. Analizele experimentale 155
6.3.2. Discutarea rezultatelor 166
6.3.3. Concluzii 166
6.4. InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis
vulgaris asupra rinichilor şobolanilor tineri 167
6.4.1. Analizele experimentale 167
6.4.2. Discutarea rezultatelor 181
6.4.3. Concluzii 181
7. Concluzii finale 182
Bibliografie 185
Extras bibliografic al lucrărilor ştiinŃifice din teza de doctorat 202

3
 ImportanŃa teoretică şi practică
a studiului

Utilizarea plantelor în tratarea unor boli a devenit o tradiŃie, „farmacia

naturii” constituind o sursă importantă pentru terapie. În prezent, proprietăŃile
plantelor medicinale sunt reevaluate datorită progreselor realizate în cercetarea
chimică, farmacologică şi clinică a plantelor şi a formelor farmaceutice obŃinute din
produse vegetale, dar mai ales datorită avantajelor pe care acestea le oferă.
Cu toate acestea, remediile fitoterapeutice sunt destul de greu acceptate, pe
de o parte datorită faptului că mecanismele prin care ele acŃionează asupra
organismului sunt de cele mai multe ori insuficient cunoscute. Pe de altă parte,
cercetările care vizează efectele biologice ale plantelor medicinale sunt extrem de
laborioase, deoarece necesită animale de laborator, aparatură performantă, precum
şi extracte vegetale minuŃios pregătite, la care să se cunoască principiile active şi
modul de acŃiune la nivelul structurii, ultrastructurii şi metabolismului celulelor.
Lucrarea de faŃă prezintă cercetările asupra extractelor fluide obŃinute din
două plante medicinale care revendică efecte benefice în afecŃiunile hepatice:
Chelidonium majus (rostopasca) şi Berberis vulgaris (dracila). Datele acumulate în
literatura de specialitate arată că utilizarea fitoterapeutică a extractelor de
Chelidonii herba, respectiv de Berberidis cortex are la bază doar efectul
farmacologic major, mecanismul intim de acŃiune al celor două produse vegetale, la
nivel celular şi subcelular, nefiind cunoscute.
Pornind de la aceste premize, am considerat utilă iniŃierea unui studiu
comparativ privind influenŃa hepatoprotectoare a extractelor fluide de Chelidonium
majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor intoxicaŃi experimental cu
tetraclorura de carbon, un xenobiotic cu tropism hepatic. Astfel, ne-am propus să
investigăm prin metode şi tehnici histologice, biochimice şi electronomicroscopice
modificările structurale şi funcŃionale apărute în ficatul şi rinichii animalelor de
experienŃă tratate cu câte unul din cele două extracte vegetale, în scopul elucidării
mecanismului de acŃiune al acestor produse fitoterapeutice la nivel celular şi
subcelular.

Precizări privind acŃiunea extractelor vegetale

de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris

Plantele şi preparatele obŃinute din plante sunt întrebuinŃate de multă vreme

în tratarea unor boli. Folosite la început în mod empiric, efectele benefice ale
multor asemenea leacuri au atras atenŃia cercetătorilor care, prin studiile întreprinse
de-a lungul timpului, au clădit un suport ştiinŃific fitoterapiei.

4
 Extractele fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris se află în
compoziŃia a numeroase preparate farmaceutice şi sunt indicate mai ales pentru
acŃiunea lor coleretică-colagogă, antispastică şi hepatoprotectoare [FR X, 1993;
Tămaş şi Oniga, 2001]. Utilizarea celor două extracte ca remedii fitoterapeutice se
bazează pe o veche tradiŃie şi este susŃinută de progresele ştiinŃifice realizate în
ultimul timp în descifrarea compoziŃiei chimice şi a efectelor farmacologice ale
acestora [Stănescu şi col., 2002].
Primele cercetări efectuate în această direcŃie au identificat principiile
active, precizându-se componenta alcaloidică şi nealcaloidică pentru Chelidonium
majus, respectiv pentru Berberis vulgaris. De asemenea, au fost descrise
proprietăŃile farmacognostice ale celor două plante şi au fost puse în evidenŃă
acŃiunile biologice ale extractelor şi principiilor active izolate, stabilindu-se o
corelaŃie între compoziŃia chimică a produsului vegetal medicinal şi efectul
terapeutic. În paralel cu aceste studii, au putut fi perfecŃionate tehnicile extractive
prin care se obŃin din cele două specii vegetale diferite preparate farmaceutice.
Recent, principiile active au fost izolate din Ńesuturi şi celule provenite de la specii
de Berberis cultivate in vitro.
Baza ştiinŃifică care permite utilizarea în fitoterapie a celor două produse
vegetale a fost completată de studiile farmacologice realizate prin diferite
experimente efectuate pe animale, precum şi prin testări clinice. Cercetările
moderne au demonstrat că fitocomplexul de principii active extras din Chelidonium
majus are efecte antivirale, antitumorale, antimicrobiene, coleretice şi
colecistokinetice, hipolipemiante şi hipocolesterolemiante. Pentru extractele de
Berberis vulgaris au fost dovedite de asemenea, efecte coleretice şi colagoge,
antimicrobiene şi antitumorale.

Obiective de cercetare

Din literatura de specialitate publicată până în prezent despre extractele

bioactive de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris reiese că utilizarea acestora în
fitoterapie se bazează pe efectul farmacologic major, mecanismele de acŃiune la
nivelul Ńesutului şi celulelor hepatice nefiind la ora actuală elucidate. Se ştie însă că
remediile naturale pot deveni medicamente moderne dacă există date suficiente şi
aprofundate asupra impactului pe care îl au asupra organismului.
Acesta este motivul pentru care ne-am propus să cercetăm influenŃa
hepatoprotectoare a extractelor fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris,
prin investigarea, la nivel celular şi subcelular, a modificărilor structurale şi
funcŃionale produse în urma administrării la animalele de laborator a unor substanŃe
consacrate.
În acest scop am folosit ca model experimental intoxicaŃia hepatică acută
indusă la şobolani de tetraclorura de carbon (CCl4), una dintre cele mai cunoscute
substanŃe xenobiotice cu tropism hepatic, capabilă să producă leziuni grave ale

5
ficatului, similare celor apărute în hepatita şi ciroza descrise la om [Tanikawa,
1968; Mogoş şi Sitcai, 1988; Faroon şi col., 1994]. Inducerea toxicozei hepatice la
animalele de experienŃă prin administrarea CCl4 permite realizarea unei
hepatectomii chimice [Chanda şi Mehendale, 1996; Rusu, 1997; Rusu şi col.,
2005], utile pentru studierea eventualei regenerări a ficatului sub acŃiunea
remediilor fitoterapeutice. Extractele vegetale testate în experimentul nostru sunt
hidroalcoolice şi au un conŃinut standardizat de alcaloizi [FR X, 1993; Tămaş şi
Oniga, 2001], consideraŃi principiile active responsabile de efectele farmacologice
ale celor două plante.
Din dorinŃa de a obŃine rezultate cât mai exacte şi complete asupra
influenŃei hepatoprotectoare a celor două extracte vegetale la şobolanii intoxicaŃi,
am decis organizarea unei serii de două experimente acute, care diferă între ele prin
vârsta animalelor de experienŃă şi prin dozele de substanŃe administrate. Această
shemă de lucru ne-a permis să apreciem în mod punctual:
1) efectul hepatoprotector al extractelor vegetale de Chelidonium majus şi
Berberis vulgaris asupra şobolanilor senescenŃi şi tineri intoxicaŃi cu CCl4;
2) corelaŃia dintre doza şi acŃiunea biologică a CCl4 şi a extractelor vegetale;
3) impactul produs de cele două extracte vegetale asupra ficatului şi rinichilor
şobolanilor neintoxicaŃi, în vederea precizării eventualelor reacŃii adverse.
Pentru realizarea obiectivelor propuse am efectuat o gamă complexă de
analize experimentale, bazate pe metode şi tehnici histologice, histochimice,
histoenzimatice, biochimice şi electronomicroscopice [Reitmann şi Frankel, 1957;
Mureşan şi col., 1976; Hayat, 2000].

Materiale şi metode

Extractele vegetale

Conform FR X [1993], extractele vegetale sunt preparate farmaceutice

obŃinute prin extracŃia produselor vegetale cu diferiŃi solvenŃi, urmată de
evaporarea parŃială sau totală a solventului.
Prepararea extractului fluid de Chelidonium majus s-a realizat din
Chelidonii herba prin repercolare după tehnica Squibb, utilizând ca solvent
alcoolul de 70°[Popovici şi Lupuleasa, 2001]. Extractul a fost standardizat la un
conŃinut de 0,25% alcaloizi totali exprimaŃi în chelidonină. Analiza calitativă a
alcaloizilor s-a efectuat prin cromatografie în strat subŃire, iar determinarea
cantitativă după tehnica titrimetrică oficinală în FR X [1993]. Extractum Chelidonii
fluidum este produs în cadrul Laboratorului de MicroproducŃie al UMF Cluj-
Napoca [Tămaş şi Oniga, 2001].
Prepararea extractului fluid de Berberis vulgaris s-a realizat din
Berberidis cortex prin repercolare după tehnica Squibb, utilizând ca solvent
alcoolul de 70°[Popovici şi Lupuleasa, 2001]. Extractul a fost standardizat la un

6
conŃinut de 1% alcaloizi totali exprimaŃi în berberină. Determinarea cantitativă a
alcaloizilor s-a efectuat prin spectrofotometrie în UV. El a fost realizat între anii
1983-1997 în cadrul Laboratorului de MicroproducŃie al UMF Cluj-Napoca sub
numele de Tonobil, iar ulterior de SC Plafar Cluj-Napoca [Tămaş şi Oniga, 2001].

Tetraclorura de carbon, un xenobiotic cu tropism hepatic

Tetraclorura de carbon (CCl4) este o moleculă relativ non-reactivă şi devine

toxică pentru organism numai după activare enzimatică. Aceasta se produce în
ficat, la nivelul reticulului endoplasmic neted, prin sistemul de oxidaze cu funcŃie
mixtă (SOFM) [Orlandi şi Yezequel, 1972]. O componentă majoră a acestui
complex polienzimatic este o hemoproteină cu banda de absorbŃie spectro-
fotometrică de 450 nm, cunoscută sub denumirea de citocrom P-450. Dintre
multiplele forme ale acestui citocrom prezente în microzomii hepatici, citocromul
P-450 2E1 a fost identificat ca fiind cel mai important catalizator al bioactivării
hidrocarburilor la animale şi posibil la om [Ryan şi col., 1984].
În microzomi CCl4 este metabolizată pe cale reductivă la radicalul liber
triclormetil (-CCl3). De asemenea, CCl4 poate fi oxidată şi la fosgen (COCl2), dar
cantitatea foarte redusă care se formează face ca această substanŃă şi această cale de
biotransformare să fie nesemnificative pentru ficat. În condiŃii anaerobe, CCl4 este
metabolizată pe o cale alternativă de reducere, formându-se produşi de tip carbene
care se leagă de proteine şi acizi nucleici [Nelson, 1995].
CCl3 atacă legăturile duble ale acizilor graşi polinesaturaŃi membranari pe
care reticulul endoplasmic, ca şi alte formaŃiuni subcelulare, îi conŃin din belşug,
provocând lipoperoxidarea acestora cu consecinŃe foarte grave pentru
funcŃionalitatea celulelor. Radicalul liber CCl3 foarte reactiv atacă şi modifică
proteinele hepatice, mai întâi la nivelul microzomilor, locul formării sale, apoi şi la
nivelul mitocondriilor şi membranei plasmatice, inducând peroxidarea acestor
structuri celulare. În acest fel rezultă hidroxialcani difuzibili care pot şi ei să
reacŃioneze cu grupările tiol din proteine şi să cauzeze leziuni hepatice
semnificative. CCl3 poate reacŃiona cu O2 formând triclormetil-peroxil (CCl3OO-),
un radical liber la fel de reactiv care poate induce peroxidarea lipidelor
membranare şi alchilarea unor macromolecule celulare. MetaboliŃii reactivi formaŃi
prin bioactivarea CCl4 se leagă şi de ADN nuclear, ceea ce explică carcinogenitatea
şi mutagenitatea provocate de acest xenobiotic [Brent şi Rumack, 1993; Raucy şi
col., 1993; Rusu şi col., 2005].
Modificările hepatotoxice induse de CCl4 se realizează in vivo şi in vitro în
cursul unei cascade de modificări biochimice şi structurale care include, într-o
ordine relativ cronologică, lipoperoxidarea, inhibarea sintezelor proteice şi scăderea
numărului polizomilor hepatici, atât prin alterarea ARNm cât şi prin reducerea
fixării ribozomilor pe acesta, inactivarea sau reducerea activităŃii unor enzime,
dezechilibrarea homeostaziei Ca2+, creşterea permeabilităŃii membranelor celulare,
hepatocitoliza prin necroze şi apoptoză [Brent şi Rumack, 1993], activarea unor
factori implicaŃi în procesul de fibrozare [Poli, 2000].

7
 Sub acŃiunea CCl4 se produc modificări hepatice infrastructurale mai întâi
în reticulul endoplasmic, apoi la nivel mitocondrial, membranar şi difuz celular
câteva ore mai târziu. Mitocondriile suferă rarefierea matricei şi lezări ale cristelor
prin dezagregare şi umflare, ca o consecinŃă a jugulării resurselor energetice
celulare. Membrana celulară şi sistemul de endomembrane sunt lezate în cursul
lipoperoxidării prin distrugerea permeabilităŃii lor selective, cu consecinŃe grave
pentru celule. La nivelul membranei lizozomale, aceste alterări permit vărsarea în
citoplasmă a hidrolazelor, care sunt o cauză majoră a fenomenului de necrobioză.
În ultimă instanŃă, celulele intoxicate cu CCl4 se umflă, formând aşa-numitele
„celule balon”, concomitent cu distrugerea integrităŃii membranei celulare şi a
pătrunderii în celulă a fosfolipazei A. Rezultă creşterea nivelului lizofosfatidelor
care desăvârşesc distrugerea celulară [Rusu şi col., 2005].
Modificările lezionale care apar în ficatul intoxicat cu CCl4 au o gradaŃie a
gravităŃii: de la distrofia clară la degenerescenŃa grasă, care sunt relativ reversibile,
până la necroza hepatică punctuală sau difuză. Aceste leziuni apar în primul rând ca
o consecinŃă directă a acŃiunii toxice a CCl4 şi a radicalilor săi liberi, dar pot fi
cauzate şi indirect de fenomenele hipoxice care o însoŃesc. Elementele definitorii
ale acestui proces lezional al parenchimului hepatic sunt, în ordinea importanŃei,
balonizarea celulară, necrozele şi steatoza extinsă [Rusu şi col., 2005]. Ca răspuns
la distrugerea celulelor parenchimale, celulele Ito pot fi stimulate să elibereze
proteine ale matricei extracelulare, ceea ce contribuie la dezvoltarea fibrogenezei
hepatice, mediată parŃial şi de celulele Kupffer care produc o cantitate mare de
citokine [Poli, 2000].
Experimentele efectuate in vivo şi in vitro pe mamiferele de laborator au
arătat că hepatotoxicitatea CCl4 este zonală, efectele sale nocive manifestându-se
diferenŃiat în funcŃie de topografia acinului [Jungermann, 1992]. Hepatocitele cu
cel mai avansat grad de afectare sunt cele din zonele acinare III, apoi cele din
zonele II învecinate, fapt semnalat şi în cazul cirozei umane [Tanikawa, 1968],
zone în care s-au constatat o producŃie crescută de citocrom P-450 şi un nivel
scăzut de glutation redus. Pe de altă parte, în zonele acinare I, mai puŃin afectate de
CCl4, există o concentraŃie mai mare de enzime de protecŃie celulară împotriva
radicalilor liberi reactivi. Producerea leziunilor hepatice în zone preferenŃiale se
datorează unei rezistenŃe minime a acestor zone, denumite din acest motiv de către
Rusu şi col. [2005] „linii de fractură”. Această teorie originală a autorilor citaŃi se
bazează pe rezultatele practice observate în numeroase experimente realizate de-a
lungul mai multor ani de cercetări. Liniile de fractură se suprapun peste zonele III
şi II din structura acinară a ficatului şi corespund zonelor clasice hepatice peri-
centrolobulare, predestinate să fie aşa, datorită unui complex de factori.
Deşi xenobioticul sau radicalii săi liberi penetrează tot ficatul, de obicei
determină leziuni specifice zonale, afectând cu predilecŃie şi anumite organite
celulare. Hepatectomia chimică [Rusu, 1997] declanşează un proces de refacere
hepatică, care nu diferă mult de cea apărută după hepatectomia chirurgicală. Un rol
important în refacerea Ńesutului hepatic îl are zona acinară I, caracterizată printr-un
proces foarte activ de diviziuni celulare. Hepatocitele nou formate vor înlocui

8
arhitectura aberantă a leziunilor cu una mai mult sau mai puŃin normală. Dacă se
depăşesc însă anumite limite legate de doza sau de durata administrării
xenobioticului, hepatectomia chimică se transformă într-un proces ireversibil spre
exitus [Chanda şi Mehendale, 1996; Rusu şi col., 2005].
În condiŃiile unei toxicoze induse de xenobiotice, ficatul are două căi
importante de a-şi reface homeostazia dezechilibrată: mecanismul hormetic, care
răspunde la substanŃa hepatotoxică prin reacŃii biochimice complexe şi regenerarea
hepatică, care se bazează pe diviziunea celulară ca mecanism de compensare a
distrugerii arhitecturii tisulare sub acŃiunea toxicului.

Metode şi tehnici experimentale

Prin metodele de histologie clasică celulele pot fi vizualizate la microscopul

optic pe baza proprietăŃilor tinctoriale. Fragmentele de ficat şi rinichi, cu o grosime
de cel mult 5 mm, au fost prelucrate printr-o succesiune riguroasă de operaŃiuni în
vederea examinării structurii tisulare. Cuburile de Ńesut au fost introduse timp de 24
de ore în soluŃia fixatoare Bouin şi apoi spălate cu alcool de 70° şi deshidratate cu
alcool absolut. Piesele fixate au fost infiltrate cu parafină topită la 56°C, în etuvă.
După solidificare, blocurile de parafină au fost modelate şi apoi secŃionate la
microtomul de tip Reichert, obŃinându-se secŃiuni cu grosimea de 5 µm. SecŃiunile
au fost etalate şi lipite pe lame de sticlă cu albumină Mayer. După deparafinare cu
hidrocarburi benzenice şi hidratare cu alcool 70° şi apă distilată, secŃiunile au fost
colorate cu hematoxilină-eozină şi apoi deshidratate cu alcool absolut şi clarificate
cu xilen. SecŃiunile colorate au fost montate între lamă şi lamelă cu balsam de
Canada, uscate şi etichetate. Preparatele obŃinute au fost examinate la microscopul
optic şi memorizate la computer [Mureşan şi col., 1976].
Tehnicile de histochimie permit identificarea la microscop a diferiŃilor
constituenŃi chimici ai celulelor, păstrând integritatea structurală tisulară.
Fragmentele de ficat, de maxim 1 mm grosime, au fost prelucrate până la stadiul de
secŃiuni adecvate identificării şi localizării lipidelor totale. Vizualizarea acestor
substanŃe, în preparatul microscopic, s-a realizat printr-o reacŃie histochimică
specifică. Probele de ficat, congelate la -196°C prin imersare în azot lichid, au fost
secŃionate la criotomul Shandon AS, obŃinându-se secŃiuni cu o grosime de 7 µm.
După etalare şi lipire pe lame de sticlă, secŃiunile au fost colorate cu o soluŃie
saturată de Sudan negru, montate în mediu hidrosolubil, examinate imediat la
microscopul optic şi fotografiate digital [Mureşan şi col., 1976].
Tehnicile histoenzimatice pot identifica activitatea unei enzime în
Ńesuturile supuse observaŃiei microscopice. În acest scop, fragmentele de ficat şi
rinichi cu o grosime mai mică de 1 mm, au fost congelate în azot lichid la
temperatura de -196°C şi secŃionate la criotomul de tip Shandon AS, la o grosime
de 7 µm. SecŃiunile nefixate au fost aplicate pe lame şi acoperite cu medii de
incubare specifice, în vederea vizualizării la microscop a produşilor cromofori sau
cromogeni rezultaŃi prin activitatea enzimelor celulare. A fost determinată
activitatea următoarelor enzime:

9
 - lactatdehidrogenaza (LDH) conform metodei Hess, Scarpelli, Pearse
(1971). S-a utilizat ca substrat lactat de sodiu în tampon fosfat pH 7,8 şi
NAD+, iar pentru vizualizarea produsului o sare de tetrazoliu. Incubarea s-a
făcut timp de 10 minute la 37°C. Locurile tisulare cu activitate enzimatică
se evidenŃiază printr-o coloraŃie albastră-indigo.
- succinatdehidrogenaza (SDH) prin metoda Nachlas, Lison (1960),
utilizând ca substrat succinat de sodiu în tampon fosfat pH 7,4 şi pentru
vizualizare o sare de tetrazoliu. Timpul de incubare a fost de 60 de minute
la 37°C. Locurile tisulare cu activitate enzimatică se evidenŃiază sub forma
unei coloraŃii albastre-violacee.
- glutamatdehidrogenaza (GtDH) conform metodei Hess, Scarpelli, Pearse
(1971), folosind ca substrat L-glutamat de sodiu şi NAD+, iar pentru
vizualizare o sare de tetrazoliu. Incubarea a durat 30 de minute la 37°C. În
locurile tisulare cu activitate enzimatică apare o coloraŃie violacee.
- citocromoxidaza (CyOx) conform metodei Burstone, pentru cuplarea
oxidativă folosindu-se un amestec format din N-fenil-p-fenildiamină şi un
derivat naftolic, iar pentru chelarea produsului de condensare o sare de
cobalt. În locurile cu activitate enzimatică se obŃine o coloraŃie albastră-
verzuie.
- adenozintrifosfataza (ATP-aza) prin metoda Wachstein-Meisel, utilizând
ATP-ul ca substrat şi azotatul de plumb pentru obŃinerea unui precipitat
colorat. Activitatea enzimatică este vizualizată în Ńesut datorită coloraŃiei
brun-negre a sulfurii de plumb rezultate.
- glucozo-6-fosfataza (G6P-aza) prin metoda Wachstein-Meisel, utilizând
glucozo-6-fosfatul ca substrat şi o sare de plumb pentru obŃinerea unui
precipitat colorat. Activitatea enzimatică este evidenŃiată în Ńesut datorită
coloraŃiei brun-aurii a produsului rezultat [Mureşan şi col., 1976].
Prin metodele de biochimie se pot izola şi determina substanŃe celulare pe
baza naturii lor chimice. Serul sangvin, obŃinut din sângele proaspăt de şobolan, a
fost supus analizei biochimice în scopul determinării activităŃii transaminazelor.
Activitatea glutamat-piruvat-transferazei (GPT) şi a glutamat-oxalacetat-
transferazei (GOT) a fost determinată prin dozarea acidului piruvic format într-o
oră, într-un mililitru de ser sangvin, conform metodei Reitmann şi Frankel [1957].
Serul sangvin a fost incubat cu substratul specific, alanina pentru GPT şi acidul
aspartic pentru GOT, la 37°C, timp de 30 de minute pentru GPT şi 60 de minute
pentru GOT. Cetoacidul rezultat a reacŃionat cu 2,4-dinitrofenilhidrazina adăugată
în mediul de reacŃie şi a format un compus roşu, care a fost determinat prin citirea
extincŃiei la spectrofotocolorimetrul Spekol, la 635 nm. Pe baza curbei de etalonare
s-a calculat apoi cantitatea de piruvat, exprimată în µg/ml ser sangvin/h.
Rezultatele au fost exprimate în medie ±ES şi prelucrate biostatistic,
conform metodelor uzuale după Snedecor şi Cochran [1978]. Modificările
parametrilor studiaŃi faŃă de valorile obŃinute la martorii corespunzători au fost
evaluate pe baza testului „t” al lui Student, valorile aberante fiind eliminate după

10
criteriul Chauvenet. Pragul semnificaŃiei statistice a modificărilor a fost considerat
la p=0,05 şi prin urmare diferenŃele la p<0,05 semnificative.
Analiza imaginilor electronomicroscopice ale Ńesuturilor dă informaŃii
despre ultrastructura şi funcŃia intimă a celulelor. Pentru examinarea la microscopul
electronic de transmisie, fragmentele de organe, recoltate sub formă de cuburi cu
latura de 0,5 mm, au fost imediat prefixate în soluŃie de glutaraldehidă 2,7% în
tampon fosfat 0,1M pH 7,2 timp de 1,5 ore la 4°C şi apoi spălate în tampon fosfat
0,15M pH 7,2. Postfixarea pieselor s-a făcut în soluŃie de acid osmic 2% în tampon
fosfat 0,15M pH 7,4 timp de o oră la 4°C şi apoi au fost spălate în tampon fosfat
0,15M pH 7,2. Piesele deshidratate în acetonă, au fost incluse în răşina poliesterică
Vestopal 310, polimerizarea făcându-se în etuvă la temperatura de 60°C, timp de 3
zile. Blocurile formate au fost modelate şi apoi secŃionate la un ultramicrotom tip
Leica UC6, la grosimea de 70 nm. SecŃiunile de culoare aurie au fost preluate pe
grile electrolitice şi dublu contrastate cu soluŃii de acetat de uranil şi citrat de plumb
în scopul creşterii capacităŃii de împrăştiere diferenŃiată a electronilor de către
materialul biologic. SecŃiunile ultrafine au fost examinate la un microscop
electronic de tip Jeol JEM 1010. Imaginile mărite şi proiectate pe ecranul
microscopului au fost alese şi înregistrate digital cu ajutorul unei camere video
CCD Mega View III şi procesate ulterior pe calculator [Hayat, 2000; Pavelka şi
Roth, 2005].

Organizarea
experimentelor

Tipul experimentelor

Am realizat două experimente de tip acut, fiecare având o durată de 6 zile.

Animalele de experienŃă

Am folosit şobolani albi din rasa Wistar, masculi, adulŃi, având aproximativ
acceaşi greutate. În primul experiment am lucrat cu animale senescente, în vârstă
de peste 12 luni şi cu o greutate medie de 224±20 g, în timp ce în al doilea
experiment am folosit şobolani tineri, în vârstă de 2 luni şi cu o greutate medie de
150±15 g.
Pentru creşterea şi întreŃinerea şobolanilor au fost asigurate condiŃii
zooigienice standardizate: interval de lumină/întuneric de 12 ore, umiditate relativă
a aerului de 60%, temperatură constantă de 20±2°C, regim alimentar echilibrat în
proteine, glucide, lipide şi vitamine, administrat sub formă de concentrate şi apă ad
libitum.

11
 Loturile de experienŃă

Şobolanii au fost împărŃiŃi în mai multe loturi, în funcŃie de obiectivele

urmărite în cadrul fiecărui experiment. Au fost organizate următoarele loturi:
- lotul martor (M) alcătuit din 8 şobolani;
- lotul intoxicat cu CCl4 (C) alcătuit din 8 şobolani;
- lotul intoxicat cu CCl4 şi tratat cu extract de Chelidonium majus (CCh)
alcătuit din 10 şobolani;
- lotul intoxicat cu CCl4 şi tratat cu extract de Berberis vulgaris (CB) alcătuit
din 10 şobolani;
- lotul la care s-a administrat extract de Chelidonium majus (Ch) alcătuit din
8 şobolani;
- lotul la care s-a administrat extract de Berberis vulgaris (B) alcătuit din 8
şobolani.
MenŃionăm că loturile M, C, CCh şi CB sunt comune ambelor experimente,
în timp ce loturile Ch şi B au fost organizate doar în al doilea experiment.

SubstanŃele administrate

Pe toată durata de 6 zile a fiecărui experiment au fost administrate

şobolanilor, în fiecare dimineaŃă, substanŃa placebo, substanŃa hepatotoxică şi cele
două extracte vegetale supuse cercetării.
Uleiul de floarea soarelui a fost administrat şobolanilor din lotul martor
(M) pentru obŃinerea efectului placebo. De asemenea, el a fost utilizat şi pentru
diluarea corespunzătoare a CCl4 administrată şobolanilor din loturile intoxicate (C,
CCh, CB).
Tetraclorura de carbon (CCl4) a fost administrată şobolanilor din loturile
C, CCh, CB pentru inducerea intoxicaŃiei hepatice acute. Doza de CCl4 folosită în
fiecare experiment a fost obŃinută prin diluare cu ulei de floarea soarelui.
Extractul fluid de Chelidonium majus, standardizat la un conŃinut de
0,25% alcaloizi totali exprimaŃi în chelidonină [Tămaş şi Oniga, 2001], a fost
administrat şobolanilor intoxicaŃi experimental din lotul CCh pentru cercetarea
potenŃialului său hepatoprotector, la un interval de 30 de minute după administrarea
CCl4. De asemenea, el a fost administrat şi şobolanilor neintoxicaŃi din lotul Ch în
vederea stabilirii inocuităŃii sale asupra ficatului şi rinichilor. Înainte de
administrare, extractul de Chelidonium majus a fost încălzit pe baie de apă pentru
evaporarea alcoolului şi reluat în ser fiziologic.
Extractul fluid de Berberis vulgaris, standardizat la un conŃinut de 1%
alcaloizi totali exprimaŃi în berberină [Tămaş şi Oniga, 2001], a fost administrat
şobolanilor intoxicaŃi experimental din lotul CB pentru cercetarea potenŃialului său
hepatoprotector, la un interval de 30 de minute după administrarea CCl4. De
asemenea, el a fost administrat şi şobolanilor neintoxicaŃi din lotul B în vederea
stabilirii inocuităŃii sale asupra ficatului şi rinichilor. Înainte de administrare,

12
extractul de Berberis vulgaris a fost încălzit pe baie de apă pentru evaporarea
alcoolului şi reluat în ser fiziologic.

Dozele administrate

SubstanŃe administrate Primul experiment Al doilea experiment

ulei de floarea soarelui 0,2 ml 0,2 ml
CCl4 0,1 ml 0,05 ml
extract de 1,5 ml 1,5 ml
Chelidonium majus soluŃie apoasă 4,2% soluŃie apoasă 20%
extract de 1,5 ml 1,5 ml
Berberis vulgaris soluŃie apoasă 4,2% soluŃie apoasă 20%

Înainte de administrare CCl4 a fost amestecată cu uleiul de floarea soarelui.

În primul experiment, s-a realizat o diluŃie de 1:2, fiecare şobolan din loturile C,
CCh şi CB primind câte 0,3 ml amestec /100 g greutate corporală. În al doilea
experiment, s-a realizat o diluŃie de 1:4, fiecare şobolan din loturile C, CCh şi CB
primind câte 0,25 ml amestec /100 g greutate corporală.
MenŃionăm că soluŃia mumă de extracte vegetale standardizate a fost diluată
cu apă distilată până la concentraŃia prevăzută în fiecare experiment. Doza de
extract vegetal administrat şobolanilor s-a calculat prin extrapolarea dozei zilnice
indicate la om [Tămaş şi Oniga, 2001], Ńinând cont şi de faptul că metabolismul
şobolanilor este de 5-6 ori mai intens decât cel al omului. De asemenea, s-a luat în
calcul şi diluŃia extractului vegetal.

Calea de administrare

Toate substanŃele folosite în experiment au fost administrate şobolanilor

prin gavaj intragastric, dimineaŃa pe nemâncate. În acest scop, şobolanului
contenŃionat i s-a deschis gura cu ajutorul unui căluş perforat, prin a cărui orificiu
s-a introdus sonda intragastrică. La capătul exterior al sondei s-a ataşat o seringă, al
cărei conŃinut a fost pompat prin faringe şi esofag până în stomacul animalului.

Recoltarea probelor

Şobolanii au fost inaniŃiaŃi timp de 16 ore, anesteziaŃi cu eter etilic şi apoi

sacrificaŃi prin secŃionare cervicală, cu ajutorul unei ghilotine. Sângele şi
fragmentele de ficat şi rinichi au fost prelevate în primele secunde de la
sacrificarea animalelor, pentru a preîntâmpina alterările structurale şi biochimice
postmortem.
Probele biologice au fost prelucrate apoi prin metode şi tehnici specifice
analizelor experimentale histologice, histochimice, histoenzimatice, biochimice şi
electronomicroscopice [Reitmann şi Frankel, 1957; Mureşan şi col., 1976;
Snedecor şi Cochran, 1978; Ghergariu şi col., 2000; Hayat, 2000].

13
 Rezultate şi discuŃii

InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de Chelidonium

majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor senescenŃi intoxicaŃi cu
CCl4 (experimentul I)

Analizele experimentale arată încă de la nivel macroscopic că ficatul

şobolanilor din lotul intoxicat cu CCl4 a fost grav afectat. Această constatare este
întregită de analiza histologică şi histochimică care demonstrează existenŃa
leziunilor toxice hepatice. Se remarcă la lotul C mai ales balonizarea celulară şi
necrozele centrolobulare, dar şi unele aspecte inflamatorii, precum şi creşterea
masivă a cantităŃii de lipide în hepatocite, intoxicaŃia cu CCl4 determinând o
adevărată steatoză hepatică, dispusă preferenŃial în zonele centrolobulare. Steatoza
este foarte bine exprimată la nivelul „septelor disecante” [Rusu, 1997; Rusu şi col.,
2005], realizate în parenchimul hepatic de celulele balonizate şi necrotice,
participând la formarea acestora, dar este prezentă şi în celulele hepatice restante
din jurul septelor.
Pe terenul biologic profund alterat de administarea CCl4 se constată
diminuarea activităŃii enzimelor cercetate la nivelul ficatului prin tehnici
histoenzimatice. Cauzele scăderii activităŃii acestor enzime la şobolanii din lotul
intoxicat sunt cel puŃin două. Pe de o parte, distrugerea unor zone extinse de
parenchim hepatic, ca urmare a steatozei, distrofiei, balonizării şi necrozării
celulelor, reduce sau anulează capacitatea metabolică a ficatului. Pe de altă parte,
radicalul liber CCl3, format în urma metabolizării hepatice a CCl4, are o acŃiune
directă de inhibare totală sau parŃială a activităŃii enzimatice, inclusiv în Ńesutul
hepatic restant şi funcŃional [Brent şi Rumack, 1993]. Unele enzime sunt mai
sensibile la acŃiunea unor xenobiotice, devenind markeri pentru anumite tipuri de
intoxicaŃii, aşa cum sunt considerate LDH, SDH şi G6P-aza în cazul
hepatotoxicozei induse de CCl4 [Rusu şi col., 2005]. Remarcăm afectarea
heterogenă a activităŃii enzimatice, în conformitate cu structura acinului hepatic,
regiunile cele mai agresate fiind zonele acinare III şi II.
Transaminazele serice, în special GPT, au o semnificaŃie aparte pentru
efectele unor toxice hepatice. De obicei, creşterea nivelului acestor enzime în sânge
este consecinŃa unor modificări ale permeabilităŃii membranelor celulare [Cucuianu
şi col., 1998]. De asemenea, eliberarea de transaminaze în sânge se poate datora şi
unor procese de hepatocitoliză indusă experimental. Prin urmare, GOT şi GPT pot
fi considerate enzime marker ale necrozelor hepatice care se produc sub acŃiunea
unor substanŃe toxice, cum este de exemplu CCl4 [Teschke şi col., 1993; Rusu şi
col., 2005]. Creşterea masivă, semnificativă din punct de vedere statistic (p<0,001),
a concentraŃiei GPT şi GOT în sângele şobolanilor intoxicaŃi cu CCl4 este o dovadă
a existenŃei unui fenomen de distrucŃie celulară şi poate fi corelată cu necrozele
observate în preparatele microscopice. Nivelul crescut al GPT, enzimă prezentă
numai în citosol, sugerează lezarea plasmalemei celulelor hepatice, în timp ce

14
creşterea înregistrată de GOT, enzimă prezentă în citosol dar şi în matricea
mitocondriilor, indică alterarea profundă, la nivel subcelular, a hepatocitelor
[Teschke şi col., 1993; Cucuianu şi col., 1998].
Modificările structurale şi metabolice observate în Ńesutul hepatic prelevat
de la şobolanii intoxicaŃi cu CCl4, precum şi de la cei trataŃi cu extractele vegetale
cercetate sunt confirmate de analiza electronomicroscopică a secŃiunilor ultrafine
obŃinute din ficatul animalelor de experienŃă. Gravitatea leziunilor ultrastructurale
depinde de poziŃia celulelor în lobulul hepatic, cele mai afectate de acŃiunea CCl4
fiind hepatocitele din zonele centrolobulare, care suferă modificări ireversibile.
Acest fapt a fost semnalat şi în cazul cirozei umane [Tanikawa, 1968], precum şi în
intoxicaŃia hepatică indusă la şobolan sau la puiul de găină [Rusu şi col., 2005] în
urma administrării de nitrozamine. Producerea leziunilor în aceste zone cu
rezistenŃă minimă la acŃiunea toxică a CCl4 se datorează irigării insuficiente cu
oxigen şi nutrienŃi, prezenŃei aparatului enzimatic specializat pentru metabolizarea
xenobioticelor [Orlandi şi Yezequel, 1972], precum şi ratei reduse a diviziunilor
celulare [Lee şi col., 1998; Rusu şi col., 2005].
Rezultatele experimentului nostru arată de asemenea că, administrarea
extractelor fluide de Chelidonium majus, respectiv de Berberis vulgaris are efecte
pozitive asupra şobolanilor intoxicaŃi cu CCl4 : mortalitatea animalelor mai scăzută,
aspectul macroscopic şi microscopic al ficatului mai puŃin lezat, steatoza mai
redusă, activitatea enzimatică ameliorată. Nu au fost observate totuşi efecte
benefice ale acŃiunii acestor extracte vegetale în privinŃa nivelului transaminazelor
serice, ceea ce arată că, în condiŃiile experimentului nostru, administrarea
extractului vegetal de Chelidonium majus, respectiv a celui de Berberis vulgaris nu
interferează cu aspectele precizate mai sus. De altfel, fenomenul de necroză
reprezintă doar un aspect al tabloului polimorf ce caracterizează instalarea
leziunilor la nivel hepatic, consecutiv toxicozei cu CCl4. Alte aspecte ale acestui
tablou sunt influenŃate pozitiv de extractele vegetale studiate, ceea ce justifică
utilizarea lor în afecŃiunile hepatice.
Considerăm că influenŃa benefică a celor două extracte vegetale, susŃinută
de observaŃiile histologice, histochimice, histoenzimatice şi electronomicroscopice
din cadrul experimentului nostru, se bazează pe sistemele de protecŃie endogenă şi
depinde de capacitatea de regenerare a Ńesutului hepatic. Deficitul de celule
hepatice dobândit sub acŃiunea toxică a CCl4 poate fi compensat printr-un
mecanism care implică diviziunea celulară [Rusu şi col., 2005]. Activitatea
proliferativă a ficatului durează până la finele perioadei de creştere, respectiv 60 de
zile la şobolan [Lee şi col., 1998], însă, consecutiv unor agresiuni xenobiotice
însoŃite de distrugeri hepatice însemnate, poate să înceapă un proces activ de
diviziune celulară [Chanda şi Mehendale, 1996], care constituie premizele refacerii
tisulare. Odată cu înaintarea în vârstă a organismului scade atât numărul
hepatocitelor care intră în diviziune, cât şi capacitatea acestora de a neutraliza şi
înlătura efectele radicalilor liberi, consecinŃa fiind o sensibilitate crescută la
hepatotoxine [Rusu şi col., 2005].

15
 În consecinŃă, rata crescută a mortalităŃii animalelor intoxicate cu CCl4
(50% în cazul lotului C şi 30% în cazul loturilor CCh şi CB) este cauzată în primul
rând de vârsta înaintată a şobolanilor folosiŃi în experiment şi secundar de doza
hepatotoxicului şi a extractelor vegetale administrate. Datorită capacităŃii reduse de
regenerare a ficatului la animalele senescente, o parte din şobolanii intoxicaŃi cu
CCl4 au murit în decursul experimentului, iar cei care au supravieŃuit au prezentat
alterări structural-funcŃionale hepatice şi după tratamentul cu extractele vegetale
testate.

InfluenŃa hepatoprotectoare a extractelor vegetale de Chelidonium

majus şi Berberis vulgaris asupra şobolanilor tineri intoxicaŃi cu CCl4
(experimentul II)

Pentru a avea o imagine cât mai exactă asupra influenŃei hepatoprotectoare

a extractelor fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris la şobolani, s-a
impus organizarea unui al doilea experiment, în care am folosit animale
postpubere, în vârstă de 60 de zile. De asemenea, am considerat deosebit de utilă în
acest sens modificarea dozelor substanŃelor administrate animalelor de experienŃă,
în vederea stabilirii corelaŃiei doză - acŃiune biologică, atât în cazul CCl4, cât mai
ales în cazul celor două remedii vegetale cercetate. Astfel, doza de CCl4 a fost
redusă la jumătate faŃă de cea utilizată în primul experiment, iar doza de extracte
vegetale a fost mărită de aproape cinci ori faŃă de cea utilizată în primul
experiment, prin concentrarea soluŃiei administrate.
Rezultatele analizelor efectuate arată că în condiŃiile unei intoxicaŃii
hepatice mai puŃin dure cu CCl4 apar leziuni tipice, însă moderat exprimate,
cauzele fiind două. În primul rând, am folosit şobolani tineri, cu o capacitate
crescută de regenerare a ficatului şi în consecinŃă, cu o rezistenŃă mai mare la
acŃiunea hepatotoxică a CCl4 [Rusu şi col., 2005], iar în al doilea rând, am
administrat o doză înjumătăŃită de CCl4. Pe fondul acestei hepatectomii chimice
atenuate, extractele fluide de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris au avut un
puternic efect de protecŃie hepatică, dovedit atât de supravieŃuirea totală a
şobolanilor, cât şi de analizele microscopice pe care le-am efectuat. De altfel,
aceste rezultate sunt în concordanŃă şi cu doza mult mai mare de extracte vegetale
utilizată în acest experiment.
În stadiul actual al cercetărilor noastre este dificil să susŃinem care sunt
mecanismele prin care cele două extracte vegetale acŃionează. Totuşi, pe baza unor
date bibliografice considerăm că sunt implicate principiile active nealcaloidice,
care protejează împotriva acŃiunii radicalilor liberi şi astfel pot preveni efectele
nocive ale CCl4. Aceşti compuşi aparŃin la numeroase specii chimice (vitamine,
carotene, fenoli, polifenoli, flavonoide, saponine etc.) şi sunt denumiŃi cu un
termen cuprinzător, chemopreventori [Stavric, 1993]. Cu toate că mecanismele de
acŃiune ale chemopreventorilor sunt complexe şi heterogene, capacitatea lor
antioxidantă are un rol semnificativ în efectele hepatoprotectoare, fiind din acest
motiv incluşi în prima linie de apărare celulară împotriva xenobioticelor [Cadenas,

16
1995]. La nivel intracelular, aceste substanŃe active reprezintă adevărate capcane
pentru grupările electrofile ale radicalilor liberi pe care astfel îi neutralizează. De
asemenea, sunt capabile să reducă activitatea enzimelor implicate în formarea
radicalilor liberi, precum şi să crească activitatea enzimelor responsabile de
detoxifierea radicalilor liberi [Stavric, 1993].
Date recente au arătat implicarea unor vitamine antioxidante în
neutralizarea radicalilor liberi [Ahmad, 1995]. β-carotenul, cel mai puternic
antioxidant dintre provitaminele A, este prezent în cantitate mare în toate organele
plantei Chelidonium majus [Stănescu şi col., 2002]. Studiile experimentale
efectuate in vivo [Rusu şi col., 2005] şi in vitro [Garcia-Gasca şi col., 1998] au
arătat că acest principiu activ de origine vegetală are efect hepatoprotector, reuşind
să neutralizeze radicalii liberi produşi în urma bioactivării diferitelor xenobiotice.
Acidul ascorbic, aflat în frunzele de Chelidonium majus în concentraŃie maximă în
perioada înfloririi [Stănescu şi col., 2002], este destul de reactiv pentru a intercepta
oxidanŃii în fază apoasă, înainte ca aceştia să poată ataca lipidele [Ahmad, 1995].
O altă categorie de principii active vegetale capabile să reducă stress-ul
oxidativ indus experimental este reprezentată de fenoli [Skottova şi col., 2004]. Se
presupune că fenolii şi polifenolii, identificaŃi în cantitate crescută în Berberis
vulgaris [Hegnauer, 1964], cresc capacitatea de detoxificare a celulelor deoarece
activează glutation-S-transferaza care catalizează conjugarea radicalilor liberi cu
forma redusă a glutationului [Hayes şi col., 2005]. Flavonoizii prezenŃi în cele două
plante [Hegnauer, 1964; Stănescu şi col., 2002] au de asemenea proprietăŃi
antioxidante. Ei pot proteja celulele prin neutralizarea radicalilor liberi, creşterea
concentraŃiei intracelulare a glutationului redus, blocarea canalelor de calciu şi
inhibarea pătrunderii acestui ion în celule. Se pare că stimulează sinteza de ARNr şi
astfel facilitează regenerarea hepatocitelor. La nivelul membranelor celulare,
protejează unele enzime importante, blochează receptorii pentru xenobiotice şi
favorizează refacerea porŃiunilor membranare lezate [Rusu şi col., 2005]. DerivaŃii
flavonici reduc hepatotoxicitatea indusă de CCl4 întrucât pot forma în celule
sisteme de oxido-reducere care echilibrează mecanismele endogene de protecŃie
împotriva radicalilor reactivi [Stănescu şi col., 2002].

InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris

asupra ficatului şobolanilor tineri (experimentul II)

Se ştie că substanŃele medicamentoase pătrunse în organism sunt supuse

unor procese metabolice de degradare enzimatică, principalul organ implicat în
detoxificarea acestora fiind ficatul. În acelaşi timp, datorită funcŃiei sale, ficatul
este puternic afectat de prezenŃa substanŃelor active şi toxice în organism [Rusu şi
col., 2005]. Pe baza acestor considerente, precum şi pentru aprofundarea datelor
ştiinŃifice legate de impactul pe care cele două produse fitoterapeutice îl au asupra
ficatului, am decis organizarea, în cadrul celui de al doilea experiment, a unui lot
de şobolani la care să se administreze numai extractul de Chelidonium majus şi a
altui lot la care să se administreze numai extractul de Berberis vulgaris.

17
 Analizele experimentale arată că, în condiŃiile administrării unor doze mari
de extracte vegetale, ficatul şobolanilor prezintă un aspect foarte asemănător din
punct de vedere structural, ultrastructural şi metabolic cu cel descris la şobolanii
lotului martor. MenŃionăm că în cazul animalelor cărora li s-a administrat doar
extractul vegetal nu s-au efectuat analize biochimice, deoarece cercetările
anterioare au arătat că extractele de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris nu
influenŃează nivelul transaminazelor serice.

InfluenŃa extractelor vegetale de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris

asupra rinichilor şobolanilor tineri (experimentul II)

SubstanŃele active sunt supuse în organism unui proces de epurare, fiind

mai întâi metabolizate la nivelul ficatului şi apoi eliminate, mai ales prin excreŃie
renală. Frecvent, substanŃele exogene produc diferite reacŃii adverse la nivelul
organului de eliminare. Datorită acestui fapt, în cadrul celui de al doilea
experiment, o altă direcŃie de cercetare a urmărit prin mijloace histologice,
histoenzimatice şi electronomicroscopice impactul produs de cele două extracte
vegetale la nivelul rinichilor animalelor de experienŃă.
Partea cea mai vulnerabilă a nefronului este considerată tubul contort
proximal, care poate fi lezat de metaboliŃii eliminaŃi din organism [Pavelka şi Roth,
2005; Rusu şi col., 2005]. Rezultatele noastre experimentale arată că structura,
ultrastructura şi metabolismul nefrocitelor tubilor proximali sunt normale la
şobolanii la care au fost administrate doze crescute din extractele vegetale
cercetate.

Concluzii finale

1. Rezultatele noastre descriu un tablou complex structural, ultrastructural şi

metabolic al acŃiunii CCl4 la nivelul ficatului de şobolan, dovedind reuşita
toxicozei indusă experimental.
2. IntoxicaŃia hepatică acută determinată de CCl4 a fost folosită ca model
experimental pentru studierea efectelor extractelor vegetale de Chelidonium
majus şi Berberis vulgaris asupra ficatului de şobolan. S-a utilizat în acest scop
o gamă complexă de analize experimentale bazate pe metode şi tehnici
histologice, histochimice, histoenzimatice, biochimice şi electrono-
microscopice.
3. Analizele experimentale efectuate de noi demonstrează influenŃa
hepatoprotectoare a extractelor fluide standardizate de Chelidonium majus şi
Berberis vulgaris. Administrarea acestor produse vegetale la şobolanii
intoxicaŃi cu CCl4 a determinat următoarele rezultate pozitive: mortalitatea
animalelor mai scăzută în primul experiment şi supravieŃuirea totală în cel de al

18
 doilea, aspectul macroscopic şi microscopic al ficatului mai puŃin lezat, steatoza
redusă, activitatea enzimatică ameliorată.
4. Efectele benefice ale celor două remedii fitoterapeutice se realizează prin
capacitatea acestora de a neutraliza radicalul liber CCl3 rezultat în urma
biotransformării hepatice a CCl4 şi de a exercita astfel o protecŃie la nivelul
metabolismului, ultrastructurii şi structurii ficatului.
5. Considerăm că în acest mecanism de protecŃie hepatică un rol decisiv îl are
componenta nealcaloidică a fitocomplexului extras din produsele vegetale
Chelidonii herba şi Berberidis cortex. AcŃiunea constatată la nivelul structurilor
şi funcŃiilor celulare şi subcelulare hepatice este determinată de caroten şi
acidul cafeic, în cazul extractului de Chelidonium majus şi de compuşii fenolici
şi polifenolici, în cazul extractului de Berberis vulgaris.
6. Comparând efectele celor două extracte vegetale administrate şobolanilor
intoxicaŃi cu CCl4, rezultatele ambelor noastre experimente arată că influenŃa
hepatoprotectoare este mai evidentă în cazul extractului fluid de Chelidonium
majus.
7. În primul experiment, efectele benefice ale celor două extracte vegetale au fost
mai estompate, ca o consecinŃă mai ales a reactivităŃii mai mici a şobolanilor
senescenŃi. În cel de al doilea experiment, efectele benefice ale extractelor
vegetale au fost mai evidente sub aspect macroscopic şi microscopic, fiind
favorizate în primul rând de capacitatea regenerativă crescută a şobolanilor
tineri, precum şi de hepatectomia atenuată, indusă de doza mai mică de toxic
administrată.
8. Cele două remedii fitoterapeutice, administrate şobolanilor neintoxicaŃi, sunt
metabolizate cu uşurinŃă la nivelul hepatocitelor, fără să inducă modificări
negative în ficatul şi rinichii animalelor de experienŃă.
9. Rezultatele obŃinute de noi reprezintă o contribuŃie originală în ceea ce priveşte
influenŃa hepatoprotectoare şi mecanismul de acŃiune la nivel celular şi
subcelular a extractelor bioactive de Chelidonium majus şi Berberis vulgaris.
10. Concluziile acestor experimente lărgesc sfera utilizării fitoterapeutice a celor
două extracte fluide şi pot fi utile pentru practica medicală, care la ora actuală
se orientează tot mai mult spre remediile naturale.

Bibliografie selectivă

Din cele 212 titluri citate în teză:

1. Ahmad, S., 1995, Oxidative stress and antioxidant defenses în biology, Ed.
Chapman & Hall, New York
2. Brent, J.A., Rumack, B.H., 1993, Role of free radicals in toxic hepatic
injury, Clin. Toxic., 31, (1), 139-171

19
3. Cadenas, E., 1995, Mechanisms of oxygen activation and reactive oxygen
species detoxification, Oxidative stress and antioxidant defenses in biology,
Ed. by Ahmad S., Chapman & Hall, New York, 1-46
4. Chanda, S., Mehendale, H.M., 1996, Hepatic cell division and tissue
repair: a key to survival after liver injury, Mol. Med. Today, Feb., 82-89
5. Cucuianu, M., Crîsnic, I., Pleşca-Manea, L., 1998, Biochimie clinică –
Fundamentare fiziopatologică, Ed. Dacia, Cluj-Napoca
6. Faroon, O., De Rosa, C.T., Smith, L. et al., 1994, Carbon tetrachloride:
Health effects toxicokinetics, human exposure and environmental fate,
Toxicol. Indust. Health, 10 (1), 4-20
7. Garcia-Gasca, T., Fatell, S., Villa-Trevino, S., Gonzales de Mejia, E., 1998,
Effect of carotenoids against genotoxicity of diethylnitrosamine on rat
hepatocytes, Toxicology in vitro, 12, 691-698
8. Ghergariu, S., Pop, A., Kadar, L., Spînu, M., 2000, Manual de laborator
clinic veterinar, Ed. All Educational, Bucureşti, 261-266
9. Hayat, M.A., 2000, Principles and techniques of electron microscopy,
Biological applications, 4th Ed., Cambridge University Press, Cambridge
10. Hayes, J.D., Flanagan, J.U., Jowsey, I.R., 2005, Glutathione transferases,
Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 45, 51-88
11. Hegnauer, R., 1964, Chemataxonomie der Pflanzen buch III, Brickhäuser
Verlag, Basel, Stuttgart, 240-253
12. Jungerman, K., 1992, Zonal liver cell heterogenicity, Enzyme, 46, 5-7
13. Lee, V.M., Cameron, R.G., Archer, M.C., 1998, Zonal location of
compensatory hepatocyte profileration following chemically induced
hepatotoxicity in rats and humans, Toxic. Path., 26, 621-627
14. Mogoş, G., Sitcai, E., 1998, Toxicologie clinică, 1, Ed. Medic., Bucureşti
15. Mureşan, E., Bogdan, A.T., Gaboreanu, M., Baba, A.I., 1976, Tehnici de
histochimie normală şi patologică, Ed. Ceres, Bucureşti
16. Nelson, S.D., 1995, Mechanism of the formation and disposition of reactive
metabolites that can cause acute liver injury, Drug Metab. Rev., 27 (1-2),
147-177
17. Orlandi, F., Yezequel, A.M., 1972, Liver and drugs, Acad. Press, London,
New York, 145-192
18. Pavelka, M., Roth, J., 2005, Functional ultrastructure. An atlas of tissue
biology and pathology, Ed. Springer, Wien, New York
19. Poli, G., 2000, Pathogenesis of liver fibrosis: role of oxidative stress, Mol.
Asp. Med., 21, 49-98
20. Popovici, I., Lupuleasa, D., 2001, Tehnologie farmaceutică, 1, Ed. a 2-a,
Ed. Polirom, Iaşi
21. Rappaport, A.M., 1958, The structural and functional unit of the human
liver (liver acinus), Anat. Rec., 130, 637-686
22. Raucy, J.L., Kraner, J.C., Lasker, J., 1993, Bioactivation of halogenated
hydrocarbons by cythocrome P450 2E1, Crit. Rev. Toxicol., 23 (1), 1-20

20
23. Reitmann, S., Frankel, S., 1957, A colorimetric method for the
determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic
transaminases, Amerc. J. Clin. Pathol., 28, 56-63
24. Rusu, M.A., 1997, Hepatectomia chimică model alternativ pentru studierea
regenerării hepatice, Bul. Soc. Nat. Cel., 25, 28
25. Rusu, M.A., Crăciun, C., Rusu, M.L., Puică, C., 2005, Xenobiotice şi
radicali liberi cu tropism hepatic: hepatectomia chimică: studii
experimentale, Eikon, Cluj-Napoca, 252
26. Ryan, D.E., Iida, S., Wood, A.W., 1984, Characterization of three highly
purified cytochromes P450 from hepatic microsomes of adult male rats, J.
Biol. Chem., 259, 1239-1250
27. Skottova, N., Kazdova, L., Oliyarnyk, O., Vecera, R., Sobolova, L.,
Ulrichova, J., 2004, Phenolics-rich extracts from Silybum marianum and
Prunella vulgaris reduce a high-sucrose diet induced oxidative stress in
hereditary hypertriglyceridemic rats, Pharmacol. Res., 50, 123-130
28. Snedecor, G., Cochran, W., 1978, Statistical methods, 6th Ed., The Iowa
State Univ. Press, Ames, Iowa
29. Stavric, B., 1993, Antimutagens and anticarcinogens in foods, Fd. Chem.
Toxic., 32 (1), 79-90
30. Stănescu, U., Miron, A., Hăncianu, M., Aprotosoaie, C., 2002, Bazele
farmaceutice, farmacologice şi chimice ale fitoterapiei, I-II, Ed. UMF Gr.
T. Popa, Iaşi
31. Tanikawa, K., 1968, Ultrastructural aspects of the liver and its disorders,
Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, Igaku Shoin Ltd., Tokyo
32. Tămaş, M., Oniga, I., 2001, Produse fitoterapeutice româneşti, ediŃia a 2-a,
UMF Iuliu HaŃieganu, Cluj-Napoca
33. Teschke R., Vierke, R., Goldermann, L., 1993, Carbon tetrachloride levels
and serum activities of liver enzymes fallowing acute CCl4 intoxication,
Toxicol. Lett., 17, 175-180
34. ***1993, Farmacopeea Română EdiŃia a X-a, Ed. Med., Bucureşti

21