COLORAREA

Este etapa prin care se urmareste cresterea contrastului dintre diferitele

componente tisulare prin modificarea indicilor de refractie ai substratului
morfologic cu ajutorul colorantilor .
Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului utilizat si de tesutul pe
care dorim sa il examinam.
Substantele folosite pentru colorare se numesc coloranti.

COLORANTUL HISTOLOGIC

Este o substanta chimica colorata de obicei de natura organica care poate

intra in celula atasandu-se la nielul componentelor celulare si permitand astel
diferentierea lor optica.
Nu toate substantele colorate sunt coloranti.
In molecula unui colorant se pot identifica una sau mai multe
- grupari cromofore – purtatoare de culoare
- grupari auxocrome – capacitatea de a colora
Colorantii se fixeaza de substrat prin legaturi electrochimice si de hidrogen in
functie de gruparile auxocrome.
GRUPARILE AUXOCROME
1. Ionizate ( principale ) – formeaza legaturi electrochimice cu substratul
2. Neionizate ( secundare) – formeaza legaturi de hidrogen cu substratul.
Acest tip de legatura mareste stabilitatea colorantului.

CLASIFICAREA COLORANTILOR
1. Dupa natura lor
a. Naturali
i. vegetali : hematoxilina ,safranina , orceina , turnesolul
ii. animali :carminul
b. Sintetici : albastru de metil
2. Dupa caracterele chimice
a. Acizi – sunt de obicei saruri de acizi organici , unde gruparea
auxocroma principala este incarcata electric negativ. El se ataseaza
pe un substrat morfologic incarcat electric poziti
b. Bazici – gruparea auxocroma principala incarcata electric pozitiv ,
deci se a atasa pe un substrat morfologic negativ
c. Neutri – grupari auxocrome principale incarcate eletric pozitiv si
negativ , ei fiind solutii apoase de coloranti bazici si acizi intr-o
anumita proportie.
Din punct de vedere chimic celulele sunt alcatuite din :
1. apa
2. saruri minerale
3. glucide
4. lipide
5. proteine
Primele patru sunt fie indepartate in etapele care preced includerea la
parafina , fie hidrolizate. Pentru ca aceste substante sa fie pastrate in celula sunt
necesare fixari speciale care sa transforme aceste substante solubile in substante
insolubile. De exemplu tetraoxidul de osmiu insolubilizeaza lipidele.
Proteinele , desi sufera modificari conformationale in structura tertiara si
cuaternara in cursul etapelor care preced colorarea , ele nu sunt extrase
reprezentand astfel substratul molecular la nivelul carora se fixeaza colorantii
prin legaturi electrochimice si de hidrogen.
Proteinele sunt alcatuite din secvente de aminoacizi.
In functie de tipul gruparilor ionizabile din structura , proteinele sunt
1. acide
2. bazice
3. neutre
Cand pH mediului este identic cu punctul izoelectric al mediului respectiv
ambele grupari sunt ionizate.
In mediul acid ramane ionizata gruparea amino; in aceste conditii
proteinele se comporta ca baze avand afinitate pentru coloranti acizi, deci au
caracter acidofil. Majoritatea proteinelor citoplasmatice sunt bazice deci au
caracter acidofil colorandu-se cu coloranti acizi : de exemplu EOZINA care
coloreaza citoplasma in roz-rosu.
In mediu bazic ramane ionizata gruparea carboxil si proteinele se
comporta ca acizi avand afinitate pentru coloranti bazici deci au caracter
bazofil. Nucleul avand caracter bazofil se va colora cu coloranti bazici - ex.
Hemalaunul care coloreaza nucleul in albastru inchis- violet.

CONCLUZIE
In coloratiile histologice generale si in parte in coloratiile histologice
speciale substratul molecular al colorarii e reprezentat de proteinele de
constitutie care dupa natura lor si in functie de conditiile de colorare , pun la
dispozitia colorantului cationul amino ce fixeaza colorantii acizi cu grupari
auxocrome negative sau anionul carboxil ce fixeaza colorantii bazici cu grupari
auxocrome pozitive.
ETAPELE COLORARII
1. deparafinarea – pentru ca solutiile colorate fie apoase fie alcoolice nu
sunt suficient de penetrante pentru a fii utilizate pe sectiunile impregnate
la parafina. Se realizeaza cu solventi de tipul hidrocarburilor benzenice.
Pentru aceasta se trec preparatele prin 3 bai succesive de 2-5 min. in
functie de solubilitatea parafinei , de grosimea , de temperatura
preparatului
2. hidratare – eliminarea solventilor parafinei facand astfel posibila
colorarea. In acest scop se trece sectiunea prin 3 bai succesive fiecare cu
alcool etilic sau metilic in concentratii descrescande. Daca solutia de
colorare este apoasa se trece in continuare sectiunea in apa distilata.
3. mordansare (la nevoie)
4. colorarea propriu-zisa - se face cu solutii colorante apoase sau
alcoolice .
4. spalare – daca sectiunile trebuie sa fie montate intr-un mediu anhidru ,
pentru indepartarea excesului de colorant si se efectueaza cu apa distilata
5. deshidratare – obligatorie pentru majoritatea colorantilor histologici
deoarece acestia sunt diluati fie in apa fie in alcool diluat. Se realizeaza
cu alcool in concentratie crescanda.
6. clarificare - se face cu xilol fiind necesara pentru indepartarea alcoolului.

METODE DE COLORARE
1. Pot fi
a. Vitale - prin folosirea unui colorant vital care este incorporat de
animal in timpul vietii. Substanta colorata incalzita la temperatura
corpului se injecteaza i.v. sau intraperitoneal ,operatie care se
repeta cateva zile. Dupa sacrificarea animalului se recolteaza
cateva piese care se expun la aer pana ce apare colorarea. Ea
persista numai atata timp cat celulele supravietuiesc in vitro.
b. Permanente – pentru colorarea preparatelor permanente.
2. Dupa nr. de coloranti utilizati :
a. Simple – foloseste un singur colorant
b. Combinate (policroma) – se folosesc 2 sau mai multi coloranti
i. Succesiva
ii. Simultana ex . : hemalaun – eozina , van Gieson , azan
3. Dupa mecanism
a. directa – rezulta din simplu contact dintre colorant si substrat
b. indirecta – necesita prezenta unui mediator sau MORDANT , intre
colorant si substrat. Acesta fixeaza colorantul de componentele
celulare. Complexul format intre colorant si mordant se numeste
LAC.
 4.
a. progresive – prin incercari succesive sub control microscopic pana
se ajunge la momentul optim de colorare , aceasta oprindu-se prin
spalare
b. regresive - prin actiunea prelungita a colorantului pana la
obtinerea unei supracolorari , apoi se actioneaza cu un agent chimic
decolorant numit DIFERENTIATOR a carui actiune este oprita
prin spalare in momentul in care au ramas colorate numai
structurile pe care vrem sa le evidentiem.. aceasta metoda de
colorare nu este reversul precedentei . prin utilizarea
diferntiatorului se pot evidentia structuri care nu pot fii puse in
evidenta prin colorarea cu metoda precedenta. Aceasta se explica
prin faptul ca diferentiatorul este si mordant. Ex. Coloratia Nissl.
5. Poate fi:
a. Ortocromatica – substratul se coloreaza in aceeasi culoare ca si
cea a colorantului
b. Metacromatica - substratul se coloreaza in alta culoare ca cea a
colorantului

IMPREGNARI METALICE

Sub actiunea unor reductori se produce un fin precipitat de metal care se

depune pe diferitele elemente de tesuturi putand pune in evidenta structuri care
in mod obisnuit nu se coloreaza cu coloranti .
Metalul este pus in contact cu tesutul sub forma unor solutii saline .
Reducerea este datorata in parte actiunii proprii a tesutului , in parte actiunii
substantelor chimice reducatoare si sau agentilor fizici.
Metalele cele mai folosite sunt : Ag , Au , Os , Hg.

METODE DE IMPREGNARE METALICA

Prin reducerea sarii argentice de catre o componenta celulara si se obtine o
alta sare argentica care este apoi redusa la Ag metalic . sarea argentica este
redusa daca tesutul insusi contine o substanta cu proprietati reductoare puternice
. Acestea pot fii prezente in mod natural in tesut sau pot fii produse prin
tratamente chimice inainte ca sarea de Ag sa fie aplicata. Substantele biologice
care au astfel de proprietati sunt de tip fenolic.demonstrarea lor prin reactie de
impregnare argentica se numeste REACTIE ARGENTAFINA. depozitul de Ag
metalic poate fii format cu ajutorul unui agent reducator adaugat FORMALINA
. Ag. se depune pe un component organic particular al sectiunii numit
ARGIROFIL. aceasta este denumita REACTIE ARGIROFILA.
Aceasta metoda este folosita pentru evidentierea elementelor din tesutul
epitalial , conjunctiv si in cercetarea sistemului nervos.
 COLORATIA HEMALAUN EOZINA

Este coloratia histologica cea mai des utilizata in laboratoarele de histologie

si anatomo-patologie.
Utilizeaza 2 coloranti
1. hemalaunul – colorant bazic
2. eozina – colorant acid
HEMALAUNUL
Se obtine din hematoxilina , o substanta de natura vegetala si incolora
extrasa cu eter din scoarta unui arbore. Prin maturare se transforma in
HEMATEINA de culoare galben-rosietic , dar lipsita de capacitatea de a
colora. Aceasta este supusa procesului de mordansare cu ALAUN DE Fe si
se obtine HEMALAUNUL substanta colorata cu proprietati de colorant.
Acesta este un colorant bazic care coloreaza nucleul celulei deoarece se
combina cu radicalii fosfat acizi ai acizilor nucleici principalii constituenti
chimici nucleari.
TEHNICA COLORATIEI HEMALAUN EOZINA
Bateria de colorare contine
1. hemalaun
2. eozina
3. hidrocarburi benzenice
4. alcool
Acestea se folosesc in tratamentele pre- si post- colorare.
ETAPE
1. Deparafinarea – consta in dizolvarea parafinei cu solventi de tipul
hidrocarburilor benzenice de ex. xilol. Se trec preparatele prin 3 bai
succesive de 3 – 5 min. fiecare.
2. Hidratarea – consta in trecerea preparatului prin 3 bai succesive ce
contin alcool in concentratii descrescande. In practica , cand vrem sa
coloram in acelasi timp mai multe preparate , folosind aceeasi baterie de
colorare , lamele sunt introduse cu un decalaj ce se respecta pe tot
parcursul procesului. Daca solutia coloranta este apoasa se trece in
continuare sectiunea prin apa distilata
3. Colorarea
a. Prima data in hemalaun timp de 3 – 5 min , dupa care este spalat cu
apa pentru a intrerupe actiunea colorantului
b. Al doilea colorant – eozina – timp de 1 – 2 min , dupa care
sectiunea se spala pentru a indeparta excesul de colorant
4. Deshidratarea - cu alcool in concentratii crescande pana la alcool
absolut
5. Clarificarea – pentru indepartarea alcoolului , cu xilol
 6. Montarea – in balsam de Canada
REZULTATE
1. nuclei – albastru - violet
2. citoplasma – roz- rosu

COLORATIA HEMALAUN – EOZINA CU ALBASTRU DE METIL

Este o coloratie tricroma ce utilizeaza trei coloranti

1. hemalaun
2. eozina
3. albastru de metil
REZULTATE
1. Nuclei – violet
2. Citoplasma – albastru – cenusiu
3. Fibrele de colagen – albastru intens

COLORATIA VON GIESON

Este o coloratie tricroma ce foloseste trei coloranti

1. hematoxilina ferica
2. acidul picric
3. fuxina acida
REZULTATE
1. Nuclei – negri
2. Citoplasma – galben
3. Fb. de colagen – rosu intens

COLORATIA MASSON

Este o coloratie tricroma ce foloseste

1. hematoxilina ferica
2. solutia coloranta A ce contine fuxina acida
3. solutia coloranta B ce contine albastru de anilina
REZULTATE
1. Nuclei – negru
2. Citoplasma – rosu – violet deschis
3. Fb. de colagen – albastru intens
 COLORATIA MALLORY

Se utilizeaza :
1. fuxina acida
2. albastru Mallory ( contine albastru de anilina si orange G )
REZULTATE
1. Nuclei - rosu intens
2. Citoplasma – rosie
3. Fb. de colagen si reticulina – albastru
4. Tesut muscular neted – violet
5. Tesut muscular striat – rosu – portocaliu

COLORATIA AZAN

Se utilizeaza :
1. azocarmin C
2. albastru Heidenhein , cu anilina si orange G
REZULTATE
1. Nuclei – rosu – viu
2. Citoplasma – rosu
3. Fb. de colagen si reticulina – albastru deschis
4. Tesut muscular striat – rosu , orange sau galben

COLORATII CITOLOGICE

Sunt utilizate pentru evidentierea anumitor organite celulare

METODA CAJAL DA FANO

Utilizata pentru evidentierea complexului Golgi
REZULTATE
1. Nuclei – necolorati
2. Aparatul Golgi – retea perinucleara de culoare neagra
3. Citoplasma – aurie

METODA HEMATOXILINA FERICA REGAUD

Folosita pentru evidentierea mitocondriilor
REZULTATE
1. Nucleu – necolorat
2. Nucleol – negru
3. Mitocondrii – ca niste puncte negre
 TEHNICI DE EXAMINARE A TESUTULUI EPITELIAL
IMPREGNAREA ARGENTICA RANVIER

Este folosita pentru evidentierea interstitiului dintre celulele epiteliului din

seroase – limitele intercelulare apar net in culoarea neagra

TEHNICI SPECIALE DE EXAMINARE A TESUTULUI

CONJUNCTIV

COLORATIA CU ALBASTRU DE TOLUIDINA

Se evidentiaza granulatiile din mastocite prin coloratie metacromatica in rosu –
violet

METODE PENTRU EXAMINAREA FIBRELOR CONJUNCTIVE

1. Fibrele de reticulina – se examineaza folosind o metoda electiva -

IMPREGNAREA ARGENTICA – si apar colorate in negru
2. Fibrele elastice – se poate utiliza coloratia cu
a. Rezorcin fuxina - albastre
b. Orceina – cafeniu-roscat

TEHNICI SPECIALE PENTRU EXAMINAREA TESUTULUI

MUSCULAR
METODA HEIDENHEIN
Metoda are rezultate mai bune cand fibra este sectionata longitudinal , cand se
evidentiaza structura periodica a miofibrilelor. Se remarca alternanta de zone
clare si intunecate.
Cand fibra este sectionata transversal apare ca o formatiune punctiforma de
culoare neagra.
TEHNICI SPECIALE PENTRU EXAMINAREA TESUTULUI
NERVOS

1. Metoda Nissl – este o metoda regresiva , metacromatica si se foloseste

pentru evidentierea corpusculilor Nissl , care apar ca o retea punctiforma
violeta in toata citoplasma , iar nucleul – negru
REZULTATE
- imagine de ansamblu – albastru deschis
- nuclei – albastru palid cu periferia intens colorata
- nucleol – albastru-violet
2. Impregnarea argentica – este o metoda folosita pentru evidentierea
- neurofibrilelor – IMPREGNAREA RAMON Y CAJAL
- prelungirile nervoase – IMPREGNAREA ARGENTICA GOLGI
- microglia - IMPREGNAREA ARGENTICA RIO HORTEGA
3. Metoda cu acid osmic – pentru evidentierea tecii de mielina care va
aparea impregnata in negru
4. Metoda cu hematoxilina cromica floxina – este utilizata pentru
evidentierea granulelor de neurosecretie care apar sub forma unor
compusi bazofili colorati in albastru