Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
folosirea coloranţilor
1
COLORAREA / IMPREGNAREA
3
COLORANTUL HISTOLOGIC
Substanţă colorată, de obicei de natură
organică, ce poate interacţiona cu
diferitele componente celulare,
permiţând astfel diferenţierea lor
optică
N.B. Nu toate substanţele colorate sunt
coloranţi!
4
COLORANŢII
(caracteristici chimice)
- grupări cromofore – purtătoare de culoare
- grupări auxocrome – capacitatea de a colora
(asigură interacţiunea cu substratul)
1. Ionizate (principale) – formează legături
electrochimice cu substratul
2. Neionizate (secundare) – formează legături de
hidrogen cu substratul (măreşte stabilitatea
interacţiunii colorantului cu substratul
5
CLASIFICAREA COLORANŢILOR
După provenienţă:
Naturali:
- vegetali: hematoxilina, safranina, orceina,
turnesolul
- animali: carminul
Sintetici: albastru de metil, eozina, acid picric,
fuxina
6
CLASIFICAREA COLORANŢILOR
După caracterele chimice:
Acizi (sunt de obicei săruri de acizi organici): ex. eozina
- gruparea auxocromă principală are sarcină (-)
- se ataşează pe un substrat morfologic cu sarcini (+)
Bazici: ex. hemalaun
- gruparea auxocromă principală încărcată electric (+)
- deci se va ataşa pe un substrat încărcat (-)
Neutri
- amestecuri de coloranţi bazici şi acizi într-o anumită
proporţie
- tetraoxid de osmiu
7
MECANISMUL COLORĂRII
8
MECANISMUL COLORĂRII
Colorantul bazic (ex. hemalaunul) leagă
substrat acid (acizii nucleici) din nucleu
colorându-l în nunaţe de albastru-închis
la violet
10
ETAPELE COLORĂRII
1. Deparafinarea
2. Hidratarea
3. Mordansarea (la nevoie)
4. Colorarea propriu-zisă
5. Spălarea
6. Deshidratarea
7. Clarificarea
11
METODE DE COLORARE
(clasificare)
1. În funcţie de momentul colorării
2. După numărul de coloranţi utilizaţi
3. După mecanism
4. După metoda de obţinere a coloraţiei
optime
5. În funcţie de raportul dintre rezultatul
colorării şi culoarea colorantului
12
1. Momentul colorării
Coloraţii vitale:
A: intravitale – colorantul vital este încorporat de
animal în timpul vieţii;
- substanţa colorată este încălzită la temperatura corpului, se injectează i.v.
sau intraperitoneal, operaţie care se repetă câteva zile. După sacrificarea
animalului se recoltează câteva piese care se expun la aer până ce apare
colorarea. Ea persistă numai atâta timp cât celulele supravieţuiesc in vitro.
Coloraţii permanente:
- pentru colorarea preparatelor permanente 13
1. Momentul colorării: Coloraţii vitale
Coloranţi vitali bazici: ex. – albastru de metilen,
roşu neutru, verde Janus;
În microscopia fotonică cu contrast de fază, mitocondriile
apar foarte net, în special după coloraţii supravitale cu verde
Janus, albastru de metil. Acestea se deplasează în masa
citoplasmatică, se deformează şi dau muguri laterali care se pot
detaşa.
REZULTATE
1. Nuclei – negru
2. Citoplasma – roşu – violet deschis
3. Fibrele de colagen – albastru intens 16
2. Număr de coloranți
a. colorații simple – folosesc un singur colorant
(ex. colorația Giemsa)
17
2. Număr de coloranți:
colorații simple- COLORAȚIE GIEMSA
Fibroblaste in cultura
18
2. Număr de coloranți:
colorații combinate- COLORAȚIE AZAN
-Trahee-
1. azocarmin C
2. albastru Heidenhein
(cu anilină şi orange G)
REZULTATE
Nuclei – roşu – viu
Citoplasma – roşu
Fibre de colagen – albastru deschis
Ţesut muscular striat – roşu , orange sau galben
19
3. Mecanismul colorării
- colorație directă:
asigurată de simpla interacţiune dintre colorant
şi substrat
- colorație indirectă:
necesită prezenţa unui mediator (MORDANT- ex
ac. tanic), între colorant şi substrat. Acesta
intermediază fixarea colorantului de
componentele celulare/tisulare.
20
4. Metoda de obţinere a
coloraţiei optime
- progresive – prin imersări succesive
până se ajunge la momentul optim de
colorare (ex. H.E.)
Foloseşte 2 coloranţi:
1. hemalaunul – colorant
bazic
2 . eozina – colorant acid
REZULTATE
nucleu: albastru – violet
citoplasma: roz – roşu
22
4. Metoda de obţinere a coloraţiei optime
colorații progresive colorații regresive
Colorație H.E. Colorație Nissl- corpii Nissl
se colorează în violet (SN)
23
5. Rezultatul colorării versus
culoarea colorantului
- ortocromatică – substratul se colorează
în aceeaşi culoare ca şi cea a colorantului
(majoritatea)
24
Colorație ortocromatică – VAN GIESON
(colorație tricromă) folosită în anatomia
patologică
1. hematoxilină ferică
2. acid picric
3. fuxină acidă
REZULTATE
1. Nucleii – negri
2. Citoplasma – galben
3. Fibrele de colagen – rou intens
25
METACROMAZIA
26
Colorație metacromatică –
ALBASTRU DE TOLUIDINĂ
granulaţiile din mastocite se colorează metacromatic
în roşu – violet
metacromazie
27
IMPREGNĂRILE METALICE
PRINCIPIU: precipitat de metal redus, după ce
se leagă în formă ionică pe diferitele elemente
din ţesuturi, evidenţiind structuri care în mod
obişnuit nu se colorează.
(cele mai folosite sunt impregnările cu săruri de
Ag, Au, Os, Hg)
29
COLORAŢII TOPOGRAFICE
- utilizate pentru evidențierea celulelor în
ansamblul țesutului
(cele prezentate pană acum)
COLORATII CITOLOGICE
- utilizate pentru evidențierea anumitor
organite / structuri celulare
30
METODA CAJAL DA FANO
evidenţierea complexului Golgi
REZULTATE
Nucleii: necoloraţi
Citoplasma – aurie
31
METODA REGAUD
(HEMATOXILINĂ FERICĂ)
- evidenţierea mitocondriilor
REZULTATE
Nucleii – necoloraţi
Nucleolul – gri
Mitocondriile –
granulaţii negre
32
METODA FROTIURILOR
se realizează întinderea celulelor în
monostrat, pe o lamă de sticlă
Pot fi examinate :
1. celulele sangvine
2. celulele epiteliale descuamate sau
exfoliate
3. sedimentele celulare
4. amprente de ţesuturi sau organe
parenchimatoase
33
Calitățile unui bun frotiu:
• subţire – cu un singur strat de celule
• întins uniform
• ambele margini pe lamă
• se termină în franjuri pe lamă (ocupând cca.
2/3 din lungimea acesteia)
• (la marginea liberă se scrie numele pacientului
sau un număr de ordine)
34
METODA PANOPTICĂ PAPPENHEIM
( M.G.G.) – colorație topografică
• pentru colorarea frotiului sangvin
recoltare
întindere (se folosesc două lame de sticlă)
- lama portobiect – cea pe
care se efectuează frotiul
- lama executoare – cu care
se întinde frotiul, prin glisare
la un unghi de 45
uscare (fixare fizică)
36
colorare - FROTIUL SANGVIN- coloraţie M.G.G.
Rezultate:
granulocite agranulocite
Nucleu: violet Nucleu: violet
Citoplasma – roz Citoplasma – albastru
Granulaţii:
- neutrofile : roşu-violet
- bazofile : albastru închis
spre negru
- eozinofile: roşu-portocaliu
37
HISTOCHIMIA – Modalitate de evidenţiere
specifică a unor biomolecule în ţesuturi
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR – permite evidenţierea:
- structurilor glucidice de pe proteine (glicoproteine,
proteoglicani) şi de pe lipide (glicolipide)
- polizaharidelor (glicogen)
39
HISTOCHIMIA LIPIDELOR
PRINCIPIU:
colorantul este mai solubil în lipide decât în propriul solvent,
acumulându-se în incluziunile lipidice
SUDANOFILIA
Coloranţi Sudan :
III – roşu-portocaliu
IV – roşu
B – negru
BB – albastru
• recoltarea
• secţionarea
42
Concluzii
Aţi luat cunoştinţă de numai o parte dintre
posibilităţile de studiere a celulelor la microscopul
optic prin folosirea coloranţilor
43