Studiul celulelor prin folosirea coloranilor

COLORAREA / IMPREGNAREA

- etap critic n realizarea preparatului microscopic permanent pentru MO

- n ME, etapa corespunztoare: contrastarea (citrat de plumb i acetat de uranil)

COLORAREA

Etapa prin care se urmrete creterea contrastului dintre diferitele componente

celulare/tisulare prin capacitatea substratelor morfologice (proteine, acizi nucleici, alte macromolecule)
de a lega difereniat colorani

Metoda de colorare depinde de natura fixatorului utilizat i de esutul pe care dorim s l examinm

COLORANTUL HISTOLOGIC

Substan colorat, de obicei de natur organic, ce poate interaciona cu diferitele componente

celulare, permind astfel diferenierea lor optic

N.B. Nu toate substanele colorate sunt colorani!

COLORANII
(caracteristici chimice)

grupri cromofore purttoare de culoare

grupri auxocrome capacitatea de a colora (asigur interaciunea cu substratul)

Ionizate (principale) formeaz legturi electrochimice cu substratul

Neionizate (secundare) formeaz legturi de hidrogen cu substratul (mrete stabilitatea interaciunii

colorantului cu substratul

CLASIFICAREA COLORANILOR

Dup provenien:

Naturali:

- vegetali: hematoxilina, safranina, orceina, turnesolul

- animali: carminul
Sintetici: albastru de metil, eozina, acid picric, fuxina

CLASIFICAREA COLORANILOR

MECANISMUL COLORRII

Fixarea coloranilor, prin gruprile auxocrome,

de componente biochimice din celule/esuturi

(gruprile funcionale din proteine, din acizi nucleici, din structuri glucidice oligo-, poli-zaharide)

MECANISMUL COLORRII

Colorantul bazic (ex. hemalaunul) leag substrat acid (acizii nucleici) din nucleu colorndu-l n nunae
de albastru-nchis la violet

Colorantul acid (ex. eozina) leag substrat bazic (proteinele) din citoplasm care va aprea, de regul,
colorat n roz/rou

Evidenierea componentelor celulare (hemalaun-eozin)

ETAPELE COLORRII

METODE DE COLORARE
(clasificare)

1. n funcie de momentul colorrii

Dup numrul de colorani utilizai

Dup mecanism

Dup metoda de obinere a coloraiei optime

n funcie de raportul dintre rezultatul colorrii i culoarea colorantului

1. Momentul colorrii

1. Momentul colorrii: Coloraii vitale

Colorani vitali bazici: ex. albastru de metilen, rou neutru, verde Janus;

n microscopia fotonic cu contrast de faz, mitocondriile apar foarte net, n special dup
coloraii supravitale cu verde Janus, albastru de metil. Acestea se deplaseaz n masa citoplasmatic, se
deformeaz i dau muguri laterali care se pot detaa.
Colorani vitali acizi: ex. albastru de tripan, albastru de pirol, carmin litinat.

- coloreaz specific organite, sunt reinui doar n anumite celule, histiocite, unde se acumuleaz n
citoplasm sub form de granule de colorant.

- realizeaz numai coloraii intravitale, punnd n eviden o funcie celular

1. Momentul colorrii: Coloraii vitale

-verde Janus B-

- albastru de tripan-

1. Momentul colorrii:
coloraii permanente: COLORAIA MASSON (coloraie tricrom )

1. hematoxilin feric

2. soluia colorant A

(cu fuxin acid)

3. soluia colorant B

(cu albastru de anilin)

REZULTATE

1. Nuclei negru

2. Citoplasma rou violet deschis

3. Fibrele de colagen albastru intens

2. Numr de colorani

a. coloraii simple folosesc un singur colorant (ex. coloraia Giemsa)

b. coloraii combinate (policrome) folosesc 2 sau mai muli colorani

 i. Succesiv ex. hemalaun - eozin

ii. Simultan ex. azan (coloraie tricrom)

2. Numr de colorani:
coloraii simple- COLORAIE GIEMSA

Fibroblaste in cultura

2. Numr de colorani:
coloraii combinate- COLORAIE AZAN

-Trahee-

1. azocarmin C

2. albastru Heidenhein

(cu anilin i orange G)

REZULTATE

Nuclei rou viu

Citoplasma rou

Fibre de colagen albastru deschis

esut muscular striat rou , orange sau galben

3. Mecanismul colorrii

coloraie direct:

asigurat de simpla interaciune dintre colorant i substrat

coloraie indirect:

necesit prezena unui mediator (MORDANT- ex ac. tanic), ntre colorant i substrat. Acesta
intermediaz fixarea colorantului de componentele celulare/tisulare.
4. Metoda de obinere a coloraiei optime

- progresive prin imersri succesive pn se ajunge la momentul optim de colorare (ex. H.E.)

- regresive prin aciunea prelungit a colorantului, pn la obinerea unei supracolorri, apoi se

acioneaz cu un agent chimic decolorant (difereniator): ex. coloraia Nissl

coloraie progresiva:
COLORAIA HEMALAUN-EOZIN (HE)
cea mai utilizat coloraie

Folosete 2 colorani:

1. hemalaunul colorant bazic

2 . eozina colorant acid

REZULTATE

nucleu: albastru violet

citoplasma: roz rou

4. Metoda de obinere a coloraiei optime

coloraii progresive coloraii regresive

Coloraie H.E.

Coloraie Nissl- corpii Nissl se coloreaz n violet (SN)

5. Rezultatul colorrii versus culoarea colorantului

- ortocromatic substratul se coloreaz n aceeai culoare ca i cea a colorantului (majoritatea)

- metacromatic substratul se coloreaz n alt culoare dect cea a colorantului

(ex. albastru de toluidin)

Coloraie ortocromatic VAN GIESON
(coloraie tricrom) folosit n anatomia
patologic

1. hematoxilin feric

2. acid picric

3. fuxin acid

REZULTATE

1. Nucleii negri

2. Citoplasma galben

3. Fibrele de colagen rou intens

METACROMAZIA

Capacitatea unui substrat de a se colora ntr-o alt culoare dect cea a colorantului

PRINCIPIU:

existena unor grupri funcionale plasate regulat, la o distan suficient de mic una de alta

colorantul se dispune ordonat i foarte aproape molecul de molecul permind reaezri ale
electronilor la alte nivele energetice i absorbia de alte lungimi de und din spectrul vizibil

Coloraie metacromatic
ALBASTRU DE TOLUIDIN

granulaiile din mastocite se coloreaz metacromatic

n rou violet
Metacromazie

IMPREGNRILE METALICE

PRINCIPIU: precipitat de metal redus, dup ce se leag n form ionic pe diferitele elemente din
esuturi, evideniind structuri care n mod obinuit nu se coloreaz.

(cele mai folosite sunt impregnrile cu sruri de Ag, Au, Os, Hg)

IMPREGNAREA ARGENTIC folosit pentru evidenierea elementelor din esutul epitelial sau
conjunctiv i n studierea sistemului nervos (structurile vizate apar brun-negre)

IMPREGNARE ARGENTIC

Fibrele de reticulin

apar colorate n negru

Evidenierea prelungirilor neuronale n negru

COLORAII TOPOGRAFICE
- utilizate pentru evidenierea celulelor n ansamblul esutului
(cele prezentate pan acum)

COLORATII CITOLOGICE

- utilizate pentru evidenierea anumitor organite / structuri celulare

METODA CAJAL DA FANO
evidenierea complexului Golgi

REZULTATE

Nucleii: necolorai

Aparatul Golgi reea perinuclear de culoare neagr

Citoplasma aurie

METODA REGAUD
(HEMATOXILIN FERIC)
- evidenierea mitocondriilor

REZULTATE

Nucleii necolorai

Nucleolul gri

Mitocondriile granulaii negre

METODA FROTIURILOR
se realizeaz ntinderea celulelor n monostrat, pe o lam de sticl

Pot fi examinate :

celulele sangvine

celulele epiteliale descuamate sau exfoliate

sedimentele celulare

amprente de esuturi sau organe parenchimatoase

Calitile unui bun frotiu:

subire cu un singur strat de celule

ntins uniform

ambele margini pe lam

se termin n franjuri pe lam (ocupnd cca. 2/3 din lungimea acesteia)

(la marginea liber se scrie numele pacientului sau un numr de ordine)

METODA PANOPTIC PAPPENHEIM ( M.G.G.) coloraie topografic

pentru colorarea frotiului sangvin

soluia May-Grnwald conine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat n amestec de alcool

metilic i glicerin neutr

soluia Giemsa conine EOZINAT DE

AZUR DE METILEN solubilizat n

amestec de alcool metilic i glicerin neutr

Paii executrii unui frotiu sangvin

recoltare

ntindere (se folosesc dou lame de sticl)

- lama portobiect cea pe

care se efectueaz frotiul

- lama executoare cu care

se ntinde frotiul, prin glisare

la un unghi de 45

uscare (fixare fizic)

colorare - FROTIUL SANGVIN- coloraie M.G.G.

Rezultate:
granulocite agranulocite

Nucleu: violet Nucleu: violet

Citoplasma roz

Granulaii:

- neutrofile : rou-violet
- bazofile : albastru nchis spre negru
- eozinofile: rou-portocaliu

Citoplasma albastru

HISTOCHIMIA Modalitate de evideniere specific a unor biomolecule n esuturi

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR permite evidenierea:

- structurilor glucidice de pe proteine (glicoproteine, proteoglicani) i de pe lipide (glicolipide)

- polizaharidelor (glicogen)

N.B. Mono- sau di-zaharidele nu se pot evidenia deoarece sunt solubile i se pierd n timpul pregtirii
probelor

METODA PAS (periodic acid-Schiff)

METODA CU CARMIN AMONIACAL BEST

BAZOFILIA (pentru cele ncrcate negativ)

METACROMAZIA

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR

METODA PAS evidenierea glicoproteinelor

(celule caliciforme din mucoasa intestinal)

CARMIN AMONIACAL BEST

evidenierea glicogenului

(celule hepatice)

HISTOCHIMIA LIPIDELOR

PRINCIPIU:
colorantul este mai solubil n lipide dect n propriul solvent, acumulndu-se n incluziunile lipidice

SUDANOFILIA

Colorani Sudan :

III rou-portocaliu

IV rou

B negru

BB albastru

celule adipoase n mezenter

HISTOENZIMOLOGIA: evideniaz localizarea enzimelor pe baza activitii lor

ETAPELE OBINERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC

recoltarea

fixarea prin congelarea rapid la temperaturi foarte joase

secionarea

incubarea cu substratul ntr-un mediu care ofer enzimei condiii ct mai

apropiate de cele n vivo.

montarea se realizeaz n mediu hidrosolubil glicerin sau sirop Apathy

HISTOENZIMOLOGIE

METODA PEARSE: evideniaz dehidrogenazele

(succinatdehidrogenaza- SDH
enzima marker a mitocondriilor)

- celule musculare striate-

METODA GMRY: captur fosfat de plumb (incolor) care se transform n sulfur de plumb (neagr)
evid. activitii fosfatazelor

-pol apical al nefrocitelor -

Concluzii

Ai luat cunotin de numai o parte dintre posibilitile de studiere a celulelor la microscopul optic prin
folosirea coloranilor

Metodele sunt specifice histologiei i citologiei