COLORAREA

ÎN
MICROSCOPIA OPTICĂ
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

Colorarea are rolul de a face vizibile diferitele structuri celulare la microscopul fotonic. Prelucrate la grosimea
necesară observării la microscopul fotonic, celulele apar translucide; pentru a le putea observa se utilizează coloranţi
citologici. Aceştia sunt substanţe de natură organică, capabile să coloreze selectiv şi durabil diferitele structuri celulare,
conferindu-le culori specifice.
Pentru aceasta, un colorant are nevoie de:
- grupări atomice specifice ce conferă culoarea – grupări cromofore;
- grupări care permit o fixare permanentă a substanţei de colorat – grupări auxocrome (figura 1).
 Grupările cromofore, din punct de vedere chimic, sunt grupări aromatice, sau alte grupări ce conţin legături duble,
nesaturate, conjugate. Aceste grupări au proprietatea de a modifica fasciculul de lumină, absorbind radiaţii cu o anumită
lungime de undă; fasciculul reflectat va apărea colorat în culoarea complementară celei absorbite.
Un compus organic ce conţine grupări cromofore se numeşte şi “cromogen”. Un compus cromogen nu este
obligatoriu şi colorant, proprietatea de colorant fiind conferită şi de prezenţa simultană a grupărilor auxocrome.
 Grupările auxocrome sunt, din punct de vedere chimic, grupări simple fără duble legături, polare sau semipolare.
Principalii auxocromi sunt grupările hidroxil, amino, carboxil, cian, sulfonil. Ele permit ataşarea coloranţilor de substratul
celular prin stabilirea de legături chimice cu grupările acestuia.
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

Fig. 1. Reprezentare schematică a alcătuirii coloranţilor şi a modului

cum influenţează proprietăţile fasciculului luminos.
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

 Clasificarea coloranţilor
 Coloranţii se împart:
 După origine:  naturali  de origine animală (carminul) sau de origine vegetală
(hematoxilina)
  sintetici  majoritatea coloranţilor;
 După natura auxocromilor, ce determină şi comportamentul lor în soluţie, coloranţii se
împart în:
– Coloranţi acizi sau citoplasmatici – acei coloranţi care colorează componentele celulare
încărcate pozitiv. Exemple de coloranţi acizi: eozina, albastru de anilină, orange G (tabelul
1).
– Coloranţi bazici sau nucleari – care colorează componentele celulare încărcate negativ,
cei mai utilizaţi fiind hemalaunul, albastrul de metil, albastrul de toluidină;
– Coloranţi „neutri” – se obţin din soluţii apoase de coloranţi acizi şi bazici amestecaţi în
anumite proporţii (de exemplu eozinat de albastru de metilen şi eozinat de azur de
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

Coloranţi acizi culoarea Coloranţi bazici culoarea

Eozina roşu Hematoxilina Mayer violet

Fucsina acidă roşu Albastru de metilen albastru

Orange G portocaliu Albastru de toluidină albastru

Verde de lumină verde Verde de metil verde

Albastru de anilină albastru Pironina G roşu

Caracterul şi culoarea unor coloranţi.

 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

 Interacţiunea colorant – substrat celular

 Mecanismele fixării coloranţilor pe structurile celulare sau tisulare sunt complexe, realizându-se prin intermediul
unor factori fizici şi a unor mecanisme chimice în proporţii variabile.
 Mecanismele fizice sunt implicate în mică măsură în colorare şi sunt reprezentate în principal de absorbţia
coloranţilor în interiorul substratului. Un exemplu de colorare prin acest mecanism este colorarea lipidelor cu coloranţi
nepolari numiţi si lizocromi (Sudan III, Sudan black sau Oil red O) – aceştia sunt substanţe hidrofobe solubile la limită
în solvenţi polari. Când aceste soluţii de colorare vin în contact cu structurile celulare, are loc transferul coloranţilor în
lipidele tisulare ca urmare a solubilităţii preferenţiale a acestor coloranţi în lipide.
 Majoritatea reacţiilor de colorare sunt de natură chimică, proteinele reprezentând substratul molecular la nivelul
căruia se ataşează coloranţii. Proteinele sunt substanţe amfotere, având atât grupări acide cât şi bazice. La pH-ul
fiziologic, proteinele tisulare specifice pot prezenta încărcătură netă pozitivă sau negativă – ceea ce determină
afinitatea pentru coloranţi. Coloranţii formează legături ionice cu grupările încărcate ale proteinelor astfel:
  proteinele încărcate negativ la pH fiziologic vor fixa coloranţi bazici; structurile astfel colorate se numesc bazofile.
Exemple de structuri bazofile: acizii nucleici (conţin numeroase grupări fosfat) din nucleu, nucleol, ribozomi;
mucopolizaharidele din substanţa fundamentală a matricei extracelulare (conţin grupări carboxil şi sulfat).
 Lizo = soluţie, solubil (gr.); croma = culoare (gr.) – lizocromi = coloranţi solubili (în grăsimi)
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

  proteinele încărcate pozitiv vor fixa coloranţi acizi; structurile astfel colorate se
numesc acidofile (sau eozinofile când colorantul acid folosit este eozina). Exemple de
structuri acidofile: citoplasma, colagenul, keratina, hemoglobina şi proteinele din
celulele musculare. Acestea conţin în număr mare grupări amino şi derivaţi ai acestora.
 Odată legaţi de substrat, coloranţii conferă structurilor colorate propria culoare –
fenomen numit colorare ortocromatică. Există însă anumiţi coloranţi care, în contact cu
anumite structuri celulare, îşi pot altera uşor structura chimică. Acest fapt duce la
modificarea spectrului radiaţiilor absorbite şi, în consecinţă, a culorii care se observă.
Fenomenul prin care un colorant conferă unei anumite structuri celulare o culoare
diferită de culoarea sa se numeşte colorare metacromatică sau metacromazie. Cel mai
frecvent exemplu de folosire în practică a metacromaziei este colorarea în violet a
granulaţiilor mastocitelor cu albastru de toluidină.; alţi coloranţi care prezintă
proprietatea de a colora metacromatic structurile celulare sunt albastrul şi azurul de
metilen folosiţi la colorarea frotiurilor.
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

Clasificarea metodelor de colorare

Metodele de colorare se clasifică după următoarele criterii:
După numărul coloranţilor utilizaţi:
– simple când se foloseşte un singur colorant, de exemplu colorarea cu albastru de toluidină;
– combinate, când secţiunile se colorează succesiv cu doi sau mai mulţi coloranţi (dublă:
hematoxilină  eozină, triplă: hematoxilină  fuxină acidă  albastru de anilină, sau coloraţia
Masson) sunt folosite pentru colorarea în mod diferenţiat a diferitelor elemente ale unui ţesut.
După folosirea sau nu a adjuvanţilor:
– directe, atunci când colorantul se fixează prin simplul contact cu secţiunea (colorarea cu
eozină);
– indirecte sau prin mordansare când este necesară prezenţa unui mediator sau mordant
(alaunuri, iodul, sărurile de fier etc) care fixează colorantul de componentele celulare;
combinaţia dintre colorant şi mordant se numeşte lac.
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

După intensitatea colorării:

– progresive – se fac încercări succesive sub control microscopic până se ajunge la tenta de
culoare optimă a structurii celulare, după care se opreşte colorarea prin spălare;
– regresive – se face o supracolorare care prinde şi alte structuri celulare decât cele dorite,
după care excesul de colorant este îndepărtat prin substanţe decolorante sau diferenţiatori
(de exemplu la colorarea cu hematoxilină ferică Heindenhain, este necesară diferenţierea
cu alaun de fier amoniacal pentru a rămâne colorată numai cromatina nucleară).
După starea materialului:
– coloraţii vitale care se fac pe celule în stare vie prin utilizarea unor coloranţi vitali şi care
persistă numai atât timp cât supravieţuieşte celula; se utilizează pentru evidenţierea unor
organite celulare (de exemplu mitocondriile se colorează cu verde Janus B, iar aparatul
Golgi cu roşu neutru).
– coloraţii perrmanente care se execută la colorarea unor preparate permanente.
 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

Dupa structurile pe care le colorează:

– uzuale (de rutină) – evidenţiază structura generală a celulei, făcând posibilă observare formei, numărului celulelor,
morfologiei nucleilor, caracterul acidofil sau bazofil al citoplasmei. Exemple: coloraţia hematoxilină – eozină, coloraţiile
tricromice.
– specifice – evidenţiază specific anumiţi constituenţi sau structuri celulare, datorită legării anumitor coloranţi numai la
nivelul acestor structuri. Exemple: glicogenul este evidenţiat cu coloraţia PAS, ADN-ul cu coloraţia Feulgen, lipidele cu
Sudan, fibrele de reticulină cu impregnare argentică, fibrele de reticulină cu orceină, etc.

COLORAŢII FRECVENT UTILIZATE ÎN EVIDENŢIEREA STRUCTURILOR CELULARE

Coloraţii de rutină – vom prezenta trei coloraţii frecvent utilizate în demonstrarea de rutină a structurii
generale a celulelor:
Coloraţia hematoxilină – eozină;
Coloraţia tricromică Masson;
Coloraţia May-Grünwald – Giemsa pentru colorarea frotiurilor.
 COLORAȚII DE RUTINĂ

Coloraţia hematoxilină – eozină (HE)

Hematoxilina este un colorant natural extras din lemnul unor arbori din America
de Sud şi India. În stare naturală nu are proprietăţi colorante, ci numai după oxidarea
la hemateină, ea însăşi un colorant destul de slab. Cuplată cu diferite săruri metalice
(mordanţi) care asigură legarea de ţesuturi, este unul din cei mai buni coloranţi
nucleari.
Hematoxilina folosită în această coloraţie este de fapt un hemalaun (foloseşte
ca mordant o sare de aluminiu), numit şi hematoxilină Mayer de culoare violet.
Eozina este un colorant sintetic din clasa xantinelor. Cea mai frecvent utilizată
în combinaţie cu hematoxilina este eozina Y (yellowish = gălbuie), de culoare roşu-
portocaliu. Prezintă şi fluorescenţă, dar aplicaţiile sale ca şi colorant acid sunt mult
mai extinse decât cele ca fluorocrom.
 haimato = sange; xylon = lemn (gr.); hematoxilina a fost denumită astfel datorită
culorii roşu închis în stare naturală şi metodei de obţinere din lemn.
 COLORAȚII DE RUTINĂ

Nucleii albastru-violet Nucleii negru

Citoplasma mov
Nucleolii albastru

Fibrele musculare, hematiile roşu

Citoplasma roz

Ergastoplasma albastru

Colagen albastru
Colagen roz intens

Rezultatele colorării cu HE Rezultatele colorării cu Masson:

 COLORAȚII DE RUTINĂ

Secţiune prin mucoasa colecistului colorată cu hematoxilină – eozină. Secţiune prin muşchi striat colorată cu coloraţia Masson. Se observă nucleii negri,
Se observă celule cu nuclei violet de diferite intensităţi şi citoplasma roz . fibrele musculare roşii, fibrele de colagen albastre
 COLORAȚII DE RUTINĂ

 Coloraţia tricromică Masson

 Denumirea de coloraţie tricromică vine de la utilizarea a trei coloranţi pentru
evidenţierea diferitelor structuri tisulare (regulă nu totdeauna respectată de unele coloraţii
„tricromice”). În general este folosit un colorant bazic şi doi coloranţi acizi (sau mai mulţi)
care colorează diferenţiat structurile tisulare datorită fenomenului de competiţie.
 Colorantul nuclear (bazic) este primul folosit – în coloraţia Masson este, de regulă,
hematoxilina ferică Weigert, de culoare neagră. Se aplică apoi colorantul citoplasmatic –
fuxina acidă, care se fixează pe structurile acidofile. Prin folosirea unui poliacid (acidul
fosfomolibdenic) se desprinde fuxina de pe anumite structuri (fibre). Se aplică apoi al doilea
colorant acid – albastru de anilină, care va colora structurile decolorate de acid. In acest fel
se creează un contrast între structuri cu aceeaşi încărcare, care astfel pot fi diferenţiate.
 Tehnica de colorare: este o coloraţie combinată, triplă, regresivă în care se folosesc
succesiv un colorant bazic şi doi coloranţi acizi. fenomenul de competiţie apare atunci
când, la folosirea succesivă a doi coloranţi cu aceeaşi afinitate tisulară, primul este dislocuit
de pe anumite structuri dar rămâne fixat pe altele.
 COLORAȚII DE RUTINĂ

 Coloraţia May-Grünwald – Giemsa (MGG)

 Este o coloraţie folosită în studiul de rutină al elementelor figurate pe frotiul de sânge. Este o coloraţie panoptică
deoarece evidenţiază, pe lângă nucleii şi citoplasma acestor celule, şi elemente specifice cum sunt granulaţiile leucocitelor
granulare.
 Există numeroase variante ale acestei coloraţii, cunoscute sub numele de coloraţii Romanovski modificate. Cea
utilizată in prezent foloseşte două soluţii de colorare neutre:
– soluţia May-Grünwald;
– soluţia Giemsa.
 Soluţia May-Grünwald este un amestec de eozină şi albastru de metilen, care precipită în soluţie apoasă sub formă
de eozinat de albastru de metilen. Precipitatul se dizolvă apoi în alcool metilic pur, la care se adaugă glicerină neutră
pentru o mai bună stabilitate a soluţiei.
 Soluţia Giemsa se prepară în mod similar din eozină şi azur de metilen, cu exces de colorant bazic (azur de
metilen).
 Diluate în apă chiar înainte de folosire soluţiile devin ionizare şi coloranţii se vor fixa pe structurile celulare pentru
care au afinitate – eozina pe structurile încărcate pozitiv şi albastrul şi azurul de metilen pe cele încărcate negativ.
 Albastrul de metilen şi azurul de metilen sunt coloranţi bazici din clasa tiazinelor. Ca şi albastrul de toluidină, un alt
colorant din această clasă, ei prezintă proprietatea de metacromazie când vin în contact cu anumite structuri celulare (de
exemplu granulaţiile bazofilelor).
 COLORAȚII DE RUTINĂ

Nucleii violet – de diferite intensităţi în funcţie de tipul

de cromatină

Citoplasma eritrocitelor roz

Citoplasma bazofilă albastru deschis

Trombocitele albastru-violet

Granulaţiile neutrofile brun-violet

Granulaţiile bazofile albastru-violet închis

Granulaţiile acidofile roz intens

Rezultatele colorării cu MGG

 Colorații specifice
 Coloraţiile specifice permit evidenţierea anumitor substanţe sau a unor structuri celulare şi a
localizării lor intracelulare, diferenţiat faţă de restul componentelor celulare. Colorarea diferenţiată a
elementelor celulare pe baza proprietăţilor chimice specifice poartă numele de citochimie. În continuare
vom prezenta:
I. Evidenţierea unor compuşi chimici intracelulari: acizii nucleici, glucidele, lipidele;
II. Evidenţierea elementelor matricei extracelulare: substanţa fundamentală, fibrele de colagen, reticulină,
elastină;
III. Evidenţierea organitelor celulare: ergastopasma, aparatul Golgi, lizozomii, mitocondriile, neurofibrilele.
Evidenţierea compuşilor chimici intracelulari
 I.1. Evidenţierea acizilor nucleici
 Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt macromolecule încărcate negativ cu afinitate pentru coloranţii
bazici din coloraţiile de rutină. Există două metode mai frecvent utilizate pentru evidenţierea specifică a
acizilor nucleici: reacţia Feulgen care pune în evidenţă ADN-ul şi coloraţia verde de metil – pironină
care evidenţiază atât ADN-ul cât şi ARN-ul. Se folosesc preparate prin secţiuni fine fixate cu fixatori
alcoolici (de exemplu fixatorul Carnoy) pentru obţinerea unor rezultate optime.
 COLORAȚII SPECIFICE
 Reacţia Feulgen
 Se bazează pe hidroliza acidă a ADN-ului cu acid clorhidric diluat, cu formarea de grupări
aldehidice, urmată de colorarea cu reactivul Schiff pentru punerea în evidenţă a acestor grupări.
Pentru evidenţierea structurii generale a celulei se poate folosi o colorare de fond cu verde luminos.
 Tehnica este specifică pentru ADN (nu colorează şi ARN-ul); în plus, întrucât după tratarea cu
acid clorhidric singurele grupări aldehidice sunt cele provenite din ADN, reacţia Feulgen este şi o
reacţie cantitativă pentru ADN, cu ajutorul densitometriei putându-se măsura cantitatea de ADN din
celulă.
 Rezultatele coloraţiei: nucleii apar coloraţi în violet; celelalte componente celulare apar
necolorate (figura 3.6), sau verde deschis dacă s-a folosit colorarea de fond cu verde luminos.
 Reacţia Feulgen a stat la baza analizei cantitative a ADN corelată cu faza ciclului celular, găsindu-se
celule care aveau o cantitate dublă de ADN în interfază, deşi nucleii lor aveau acelaşi aspect. Acest
fapt a dus la împărţirea interfazei celulei în perioadele G 1, S şi G2 şi au putut fi identificate celulele în
care a avut loc sinteza de ADN în perioada S a interfazei, ca având cantitate dublă de ADN.
 COLORAȚII SPECIFICE

Hepatocite colorate prin reacţia Feulgen. Se observă nucleii Celule din acinii pancreatici colorate cu verde de metil – pironină.
coloraţi în violet şi depozite pigmentare. Se observă nucleii coloraţi verde albăstrui,
Structura generală apare necolorată. nucleolul roşcat şi citoplasma colorată în roşu.
 COLORAȚII SPECIFICE

Coloraţia verde de metil – pironină

Diferenţiază structurile care conţin ADN (nucleul) de cele care conţin ARN (ribozomii
şi nucleolul). Verdele de metil se fixează pe structura dublu-catenară a ADN-ului, pe care
îl colorează in verde albăstrui. Pironina se fixează pe ARN, datorită prezenţei regiunilor
monocatenare cu baze purinice şi pirimidinice libere. ARN-ul se colorează în roşu cu
pironina. Coloraţia dă rezultate mai bune pe celulele cu ribozomi abundenţi în citoplasmă
(de exemplu hepatocitele, celulele secretorii).
Rezultatele coloraţiei: nucleii – verde albăstrui, citoplasma – roz palid până la roşu,
nucleolul – roşu.
 COLORAȚII SPECIFICE

I.2. Evidenţierea glicogenului şi a glucidelor complexe

Glicogenul este forma de depozit a glucozei în celulele animale. Este abundent în celulele
hepatice şi în fibrele musculare striate. Pentru rezultate bune, piesele trebuie fixate în fixatori alcoolici
(fixatorii apoşi, cum este formolul, nu sunt indicaţi). Poate fi pus in evidenţă prin două tehnici mai
cunoscute:
Coloraţia cu carmin Best
Mecanismul prin care carminul se ataşează specific de glicogen nu este cunoscut. Se foloseşte
o soluţie apoasă de carmin şi, de regulă, o colorare de fond cu hematoxilină.
Rezultatele coloraţiei: depozitele de glicogen apar colorate in roşu (figura 3.8).
Coloraţia cu acid periodic – Schiff (PAS)
Coloraţia PAS pune în evidenţă grupările glicol învecinate în glucide.
Acidul periodic transformă aceste grupări în grupări aldehidice, care apoi sunt puse în evidenţă
cu reactivul Schiff. Se face o coloraţie de fond cu hematoxilină sau HE.
Rezultatele coloraţiei: granulele de glicogen apar colorate în roşu-violet (figura 3.9).
 COLORAȚII SPECIFICE

Hepatocite colorate cu carmin Best. Depozitele de glicogen din Hepatocite colorate cu PAS - hematoxilină. Depozitele de glicogen din citoplasmă apar
citoplasmă apar colorate în roşu. colorate în roşu- violet. Nucleii hepatocitelor apar coloraţi în violet.
 COLORAȚII SPECIFICE

Mucopolizaharidele sunt glucide complexe legate de proteine. Acestea,

împreună cu alte glicoproteine, se găsesc ataşate la suprafaţa celulei şi intră în
alcătuirea substanţei fundamentale a matricei extracelulare şi a membranelor
bazale. De asemenea, unele celule secretoare de mucus prezintă depozite
citoplasmatice de mucopolizaharide care sunt secretate în lumenul unor organe
(intestin, plămân).
Se pot evidenţia prin:
Colorate cu albastru alcian mucopolizaharidele şi glicoproteinele acide
apar colorate în albastru deschis, iar cu coloraţia PAS apar colorate în roşu
violet (figurile 3.10 şi 11) . Spre deosebise de albastru alcian, care este un colorant
bazic şi colorează glicoproteinele şi mucopolizaharidele acide, colorantul Sfhiff din
coloraţia PAS colorează şi structuri neutre cum sunt glicogenul şi glicocalixul de la
suprafaţa celulei.
 COLORAȚII SPECIFICE

Secţiune prin colon colorată cu albastru alcian. Secţiune prin colon colorată cu PAS – HE. Celulele caliciforme
Se observă numeroase celule secretante de mucus apar colorate în roşu-violet datorită depozitelor de mucus.
(celule caliciforme) cu depozite de mucus la polul apical. Se observă cum mucusul se elimină in lumen la polul apical.
Structura generală apare necolorată. Structura generală este colorată cu HE: nucleii în violet şi citoplasma în roz.
 COLORAȚII SPECIFICE

I.3. Evidenţierea lipidelor

Lipidele neutre, de depozit, pot fi evidenţiate la microscopul optic deoarece formează în citoplasmă
depozite de dimensiuni relativ mari. În adipocite, lipidele formează picături mari care ocupă toată citoplasmă
împingând nucleul la periferie; în alte tipuri de celule, de exemplu în hepatocite, sunt dispuse sub formă de
picături mici răspândite în citoplasmă.
Pe preparatele de rutină, incluse la parafină şi colorate HE, lipidele nu se pot pune în evidenţă. Pentru
evidenţierea lipidelor, preparatele trebuie secţionate la gheaţă, cu criotomul – nu se includ la parafină
deoarece solvenţii organici utilizaţi în tehnică solubilizează şi înlătură lipidele din piesă; de asemenea, datorită
proprietăţilor coloranţilor folosiţi (lizocromi, extrem de solubili in solvenţii organici), preparatele nu pot fi
montate cu medii anhidre care necesită deshidratare şi clarificare, ci se va folosi un mediu de montare apos
cum e gelatina.
Colorarea lipidelor se face cu lizocromi (coloranţi solubili in grăsimi). Mecanismul prin care aceşti
coloranţi se fixează pe lipide a fost prezentat anterior. Cei mai utilizaţi lizocromi sunt coloranţii Sudan
(Sudan III colorează lipidele în roşu portocaliu – figura 3.12, Sudan IV în roşu violet şi Sudan B în negru-
albăstrui).
Un alt agent care colorează lipidele este tetraoxidul de osmiu, care este şi un bun fixator al
lipidelor, interacţionând cu acizii graşi (figura 3.13).
 COLORAȚII SPECIFICE

Adipocite colorate cu Sudan III; se observă Ţesut adipos multilocular fixat şi colorat cu tetraoxid de osmiu.
depozite de grăsimi care ocupă toată Se observă depozite de lipide de dimensiuni mai mici răspândite
citoplasma, colorate în roşu portocaliu. în citoplasmă colorate în brun.
 COLORAȚII SPECIFICE

II. Evidenţierea componentelor matricei extracelulare

 Matricea extracelulară este alcătuită din substanţă fundamentală şi proteine fibroase care conferă ţesuturilor
rezistenţă la solicitările mecanice. Substanţa fundamentală este compusă in principal din mucopolizaharide, şi se
colorează cu coloranţii specifici pentru acestea (albastru alcian, PAS). Fibrele sunt colagenul (prezent în cantităţi
mari în piele, oase, ligamente şi tendoane), reticulina (un tip particular de colagen care formează stroma organelor
parenchimatoase) şi elastina (prezentă în derm, pereţii vaselor de sânge, plamân, ş.a.).
II.1. Evidenţierea fibrelor de colagen
Colagenul poate fi evidenţiat prin coloraţiile tricromice care colorează citoplasma celulelor şi fibrele musculare
diferit de fibrele de colagen. O astfel de coloraţie a fost prezentată anterior, la coloraţiile de rutină – coloraţia
Masson. Există numeroase coloraţii tricromice, majoritatea folosesc albastrul de anilină sau verdele luminos pentru
evidenţierea fibrelor de colagen.
Rezultatele unor coloraţii tricromice:
 Coloraţia Masson  colagenul apare colorat în albastru intens cu albastru de anilină (figurile 3.5 şi 14);
 Coloraţia Goldner – Szekely – colagenul apare colorat în verde cu verde luminos (figura 3.15);
 Coloraţia van Gieson – colagenul apare colorat în roşu cu fucsina acidă (figura 3.16).
 Mecanismul prin care colagenul apare colorat diferit de alte structuri acidofile este acelaşi pentru majoritatea
coloraţiilor tricromice, explicat prin fenomenul de competiţie între coloranţii acizi folosiţi, facilitată de diferenţierea cu
acid fosfotungstic (un polianion).
 COLORAȚII SPECIFICE

Secţiune prin piele colorată cu coloraţia tricromică Masson. Secţiune prin glanda sudoripară colorată cu coloraţia van Gieson.
Se observă celulele din epiderm cu nuclei negri si citoplasma Se observă nucleii coloraţi în brun, citoplasma celulelor în galben
violet, fibrele de colagen colorate în albastru şi fibrele şi colagenul în roşu.
musculare colorate în roşu.
 COLORAȚII SPECIFICE

II.2. Evidenţierea fibrelor de reticulină

Ca şi alte structuri din ţesuturi, fibrele de reticulină prezintă afinitate pentru sărurile
de argint, putând fi observate după colorarea secţiunilor cu astfel de săruri. Coloraţiile cu
argint (de regulă nitrat de argint) sunt reunite sub denumirea generică de impregnare
argentică.
Rezultatele coloraţiei: fibrele de reticulină apar colorate în negru; nucleii celulelor
apar coloraţi în gri palid, sau în violet dacă se foloseşte hematoxilina pentru colorarea de
fond (figura 3.17).
II.3. Evidenţierea fibrelor de elastină.
Elastina se poate observa pe preparatele colorate HE sub formă de fascicule
sinuoase colorate în roz. Fibrele de elastină se pot evidenţia specific cu orceină când
apar colorate în brun-roşcat sau cu rezorcină când se colorează în negru-
albăstrui(figura 3.18).
 COLORAȚII SPECIFICE

Secţiune prin splină colorată prin impregnare argentică.

Secţiune prin lobul urechii colorată cu orceină.
Se observă fibrele de reticulină colorate în negru.
Se observă ţesutul conjunctiv bogat în fibre elastice
Prin colorare de fond cu hematoxilină,
colorate în brun-roşcat.
nucleii celulelor apar coloraţi în violet.
 COLORAȚII SPECIFICE

. Evidenţierea organitelor celulare

III.1. Evidenţierea reticulului endoplasmic rugos (REr)
REr a fost identificat pe preparatele de microscopie optică sub formă de agregate bazofile în
citoplasma celulelor cu activitate metabolică intensă (hepatocite, celule secretorii, neuroni).
Aglomerările de REr au fost denumite diferit în funcţie de localizare (de exemplu în hepatocite se
numesc corpi Berg, în neuroni corpi Nissl sau corpi tigroizi) sau, în general, ergastoplasmă. Prezenţa
ribozomilor pe suprafaţa REr este motivul pentru bazofilia acestor structuri, care deci se vor colora cu
coloranţii bazici din coloraţiile de rutină.
O coloraţie specifică pentru evidenţierea REr este coloraţia cu violet de crezil prin
care se evidenţiază corpii Nissl în neuroni. Corpii Nissl apar coloraţi în violet ocupând toată
citoplasma, nucleul apare palid cu nucleol mare violet (figura 3.19).
 COLORAȚII SPECIFICE

Neuroni coloraţi cu violet de crezil. Se observă în citoplasmă

granulaţiile caracteristice denumite corpi Nissl colorate în
violet. Nucleul este palid cu nucleol proeminent.
 COLORAȚII SPECIFICE

III.2. Evidenţierea aparatului Golgi

Aparatul Golgi este bine reprezentat în celulele cu rol în secreţie. Este
alcătuit din cisterne membranoase care apar necolorate în coloraţiile de rutină,
cum ar fi HE.
Poate fi evidenţiat pe preparate vitale cu coloraţia cu roşu neutru, unde
apare ca regiuni citoplasmatice cu dimensiuni variabile colorate în roşu (figura
3.20).
Pe preparatele permanente poate fi evidenţiat cu tetraoxid de osmiu,
sau cu impregnare argentică, apărând colorat în negru (figura 3.21).
 COLORAȚII SPECIFICE

Neuroni coloraţi cu roşu neutru – coloraţie vitală pentru Neuroni coloraţi cu tetraoxid de osmiu în care se observă aparatul Golgi
aparatul Golgi. Acesta apare sub forba unor bine reprezentat sub formă de structuri citoplasmatice perinucleare colorate
zone colorate roşu intens perinucleare; nucleul apare palid. în negru brun.
 COLORAȚII SPECIFICE

III.3. Evidenţierea lizozomilor

 Lizozomii sunt organite sub limita de rezoliţie a microscopului fotonic.
Totuşi pot fi demonstraţi pe preparatele de microscopie optică prin
imunocitochimie – cu anticorpi marcaţi împotriva enzimelor lizozomale (de
exemplu fosfataza acidă, enzimă care se întâlneşte doar în lizozomi).
 O altă metodă este colorarea intravitală cu substanţe inerte care sunt
fagocitate de magrofagele din organe si înglobate în lizozomi. O astfel de
metodă este injectarea animalelor de experienţă cu tuş de India, şi apoi
sacrificarea lor şi efectuarea de preparate microscopice din ţesuturile bogate în
celule ale sistemului reticulo-histiocitar (de exemplu din ficat). Macrofagele
apar colorate în negru datorită acumulării în citoplasmă de lizozomi care au
înglobat tuş de India (figura 3.24).
 COLORAȚII SPECIFICE

III.4. Evidenţierea mitocondriilor

 Mitocondriile pot fi observate pe preparate vitale colorate cu verde Janus
unde apar sub formă de bastonaşe sau granulaţii fine colorate în negru verzui. Pe
preparatele permanente fixate cu agenţi oxidanţi cum ar fi tetraoxidul de osmiu şi
bicromatul de potasiu, şi colorate cu hematoxilină Heidenhein (un lac feric de
hematoxilină) se pot observa după diferenţiere, când majoritatea structurilor bazofile
se decolorează rămânând mitocondriile colorate în negru-brun (figurile 3.22, 23).
 O altă metodă de evidenţiere, larg folosită în practică, este cea citoenzimologică
când se apreciază activitatea unor enzime specifice mitocondriale, cuplată cu o
reacţie de culoare care pune în evidenţă localizarea şi numărul mitocondriilor în
celulă. Cel mai frecvent se foloseşte succinat-dehidrogenaza, metodă care a fost
amintită în capitolul introductiv.
 COLORAȚII SPECIFICE

Preparat din rinichi, colorat supravital cu verde Janus. Se observă Secţiune prin ficat, colorată cu hematoxilină ferică Heidenhein.
mitocondriile abundente în citoplasma nefrocitelor Se observă mitocondriile în citoplasmă, aglomerate sub formă de
sub formă de granulaţii fine colorate în negru-verzui. bastonaşe, colorate negru-brun. Nucleii hepatocitelor s-au decolorat
in urma diferenţierii.
 COLORAȚII SPECIFICE

III.5. Evidenţierea neurofibrilelor

Neurofibrilele sunt structuri din clasa filamentelor intermediare care intră în
alcătuirea neuronilor contribuind la menţinerea formei specifice a acestor celule.
Ele au fost puse în evidenţă pentru prima dată de Camillo Golgi prin metoda
cu impregnare argentică. Pe preparatele microscopice colorate cu nitrat de
argint neurofibrilele apar ca o reţea de filamente de culoare brună care se întretaie
unind corpii neuronali.

Preparat din ţesut nervos colorat cu impregnare argentică. Se observă

neurofibrilele, atât la nivelul corpului neuronal,
cât şi la nivelul prelungirilor neuronale, colorate în brun.