Utilitatea metodei Real

Time PCR în neoplazia

cutanată

Dr. Andrese Elena

 Alegerea temei
 4% consultații MM și 80% din decesele cauzate de o
afecțiune cutanată
 5 ani rata de supraviețuire post-diagnosticare
 MM se poate răspândi în orice organ și cauzează
decesul în mai puțin de un an de la recurență
 MM este a treia cauză de metastază cerebrală

www.cancer.org; www.melanoma.com
Alegerea blocurilor incluse la parafină
Prelucrarea țesutului
Reincluderea în parafină
 Purificarea ADN / probe parafinate

Kituri utilizate:
1. PureLink® Genomic DNA Kits / Life Science
2. ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System / Promega
3. Balck PREP FFPE DNA KIT / Analitik Jena
 Rezultate kit 1
 20 probe purificate cu valori ale ADN între “too
low” (4 probe) și 12.485 ng/µl;
 majoritatea (8 probe) au avut < 1 ng/µl.
 cantitățile de ADN purificate au fost foarte mici,
insuficiente pentru amplificare
Utilizarea nanodropului în laboratorul de biologie
moleculară
 Avantaje

 cantități mici de testat 0,5µL

 ușor de folosit- pipetă simplă
 nu necesită diluții
 rezultat în aproximativ 5 secunde
Etapele de lucru cu kitul Innu PREP FFPE DNA
KIT / Analitik Jena

Izolarea semi-automata a ADN cu ajutorul

particulelor magnetice
 Principiile testării quasa (quantitative allele specific amplification)
 quasa este o metodă foarte sensibilă de detecție a
mutațiilor ce se pot regăsi în cantități minime diferite
probe
 quasa se bazează pe o metodă proprie celor de la
Primerdesign ce utilizează primeri modificati, conditiile
ciclurilor modificate și un mastermix modificat
 în această metodă capătul 3’ terminal este astfel
conceput pentru a se lega de baza mutantă. In probele in
care mutația este prezentă, o amplificare eficientă va fi
reprezentată de detecția mutației (BRAF V600E) și
blocarea wild type-ului.
Thermal Profile Setup
braf_15.01.2015.mxp
Primeri modificați
Modificări
 Amplification Plots
Admin, Allele Discrimination - SNP's Real-Time, 01-14-2015, 16Hr 32Min.mxp
 Final Call Results
Admin, Allele Discrimination - SNP's Real-Time, 01-14-2015, 16Hr 32Min.mxp
 DIFERENȚE KIT-uri EXTRACTIE ADN

 Kit 1-PureLink (Invitrogen)-xilen

 Kit 2- ReliaPrep FFPE gDNA kit (Promega) – ulei
mineral
 Kit 3- nu necesită deparafinare, izolare automată a
ADN-ului
Rezultate kit 1
Rezultate kit 2
Rezultate kit 3
 Rezultate
 18/40
probe au amplificat pentru
BRAFV600E

Deparafinarea nu este conditie obligatorie

pentru extragerea ADN-ului de calitate!