Metoda PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Coordonator stiintific: Barbova Natalia, conf.

univ.
A elaborat: Vasilieva Irina
• Metoda a fost dezvoltată în
condiții de laborator de
biochimistul Kary Mullis in
1983.
• In 1985 apare prima publicatie
in jurnalul “Science” de catre
Cetus Corparation
• In 1986 se foloseste Taq polimeraza
• In 1990 are loc amplificarea ADN-ului cu
ajutorul colorantului fluorescent ceea ce
devine fundamentul real time, kinetic PCR
• In 1991 apare RT-PCR
• In1993 Karry Mullis a primit Premiul Nobel in
Chimie
 PCR
Este o metoda pe larg folosita pentru a amplifica
un anumit segment de ADN/ARN, cu ajutorul
enzimei ADN- polimerazei si identificat de
agarosa gel electroforeza.
 Tipuri de PCR
• Multiplex PCR
• PCR in cuib (nested)
• LCR (Ligase chain reaction)
• SDA (Stand displacement amplification)
• PCR in regimul timpului real
• PCR digital
Majoritatea metodelor PCR se bazeaza pe ciclul
termic. Consta in expunerea reagentilor la cicluri
repetate de incalzire si racire pentru a permite
efectuarea diferitor reactii.
 Componentele PCR
• ADN matrita
• ADN polimeraza, polimeraza Taq, deoarece ramine
intacta in etapa denaturarii ADN-ului
• 2 ADN primeri
• Dezoxinucleotidtrifosfati
• Solutie tampon
• Cationi bivaleti, de obicei Magnesiu sau Mangan
• Adaosuri suplimentare care optimizeaza procesul
de polimeraza
• Pfu ADN polimeraza (Pyrococcus furiosus) la
fel se foloseste pentru fidelitate inalta
(acuratetea de a adauga nucleotide
complimentare)
PCR folososte 2 reactivi principali:
- Primeri (reprezinta fragmente de ADN)
- ADN polimeraza
La baza metodei PCR este procesul de sinteza in
vitro a unui anumit segment din catena ADN,
sub actiunea enzimei ADN dependente, Taq-
polimeraza care exercita citirea si consecutiv
legarea nucleotidelor, complementare cu catena
ADN matrita (materna) si formarea catenei noi
de ADN (fiica).
Cu cit mai mari sunt dimensiunile
amorselor/primerilor, cu atit mai inalta este
specificitatea cu care ele se hibridizeaza cu
segemntul ADN. Lungimea amorselor este de
20-30 nucleotide
Aproape toate metode PCR folosesc o ADN
polimeraza stabila la caldura, cum ar fi
polimeraza Taq, o enzima izolata din bacteria
termofila, Thermus aquaticus. Înainte de utilizare
a polimerazei Taq, ADN-polimeraza trebuia
adăugată manual în fiecare ciclu, ceea ce era un
proces obositor și costisitor.
• Reactia se
efectuiaza
intr-un volum
de 10-200
microL intr-un
epinderf in
ciclul termal.
 Etapele metodei PCR
• Initiere. Etapa necesara pentru ADN
polimeraza care se activeaza la temperaturi
inalte. Camera unde se petrece reactia se
incalzeste pina la 96 °C timp 1-10 min.
• Denaturare. Camera reactiei se incalzeste
pina la 94-98 °C timp de 10-20 min.Astfel se
rup legaturile de H dintre bazele azotate si se
formeaza 2 molecule de ADN monocatenar
• La temperaturi mai joase are loc denaturarea
incompleta. La temperaturi mai ridicate si timp
mai indelungat are loc inactivarea enzimatica
• Hibridizare. In aceasta etapa temperatura
coboara pina la 50-65 °C timp de 20-40 s,
permitind atasarea celor 2 primeri la fiecare
dintre catena monocatenara. In timpul acestei
etape polimeraza se leaga de primer si
formeaza ADN.
• Extindere/Alungire. Temperatura depinde de
ADN polimeraza utilizata, de ex. Taq
polimeraza functioneaza la 75-80 °C. In
aceasta etapa ADN polimeraza sintetizeaza o
noua catena de ADN.
• Alungirea finala. Etapa este obtionala, se
efectuiaza la temperatura de 70-74 °C
(majoritatea polimerazelor functioneaza la
temperaturile date) timp de 5-15 min. Se
verifica daca ADN monocaternar este alungit.

• Mentinere finala. Camera se raceste pina la 4-

15 °C pentru un timp nedeterminat. Are loc
depozitarea pe termen scurt a produselor PCR.
Ciclul se repeta 25-35 de ori
• In practica, PCR-ul poate esua din cauza
sensibilitatii sau contaminarii cu ADN strain.
• Pentru amplificarea simultana a 2 sau mai
multe secvente ADN-tinta, pe larg se utilizeaza
multiplex PCR. Este un proces de
coamplificare a citorva matrite ADN.
• Pentru idenetificarea ARN se aplica metoda
RT-PCR. Reverstranscriptaza in prima etapa
formeaza fragmentele monocaternare de ADN
pe ARN- matrita.
• De regula RT se izoleaza din virusuri
 Avantajele metodei PCR
Parametrii Caracterizarea
Sensibilitate inalta Metoda se bazeaza pe principiul
exponential de acumulare a produsului
amplificat, pentru identificare este
suficienta prezenta in proba testata a unui
numar limitat de agenti
Specificitatea inalta Bazata pe identificarea secventeloor de
material genetic unicale pentru
microorganism, ce determina
particularitatile de clasa, toxicitate si alte
particularitati specifice ale agentului
patogen
Timp scurt de efectuare 2-6 ore
Material biologic Agentul patogen poate fi identificat in
orice lichid biologic al organismului uman
si asemenea in materialele obtinute in
urma biopsiei
 Domenii de utilizare a metodei PCR
Medicina
• Depistarea mutatiilor genetice
• Monitorizarea genelor in terapia genetica

Criminalistica
• Test de paternitate
• Depistarea criminalului din
milioane de oameni
• Amprentarea genetica
Studii si genetica
• Compararea genomului la 2 organisme in
studii genomice
• Analize filogenetice
• Harta genetica
• Analiza expresiei
genetice
• Genotiparea
soarecelor
Biologia moleculara si antropologie
Se foloseste pentru identificarea oamenilor
necunoscuti pe timp de razboi
Depistarea bacteriilor si virusilor
 Bibliografia
• Wikipedia
• PubMed
• Khan Academy
Multumesc