Metode imunochimice

ANTIGEN-ANTICORP
Curs 7
Imunochimia

Disciplina de granita
a imunologiei si biochimiei
studiaza substantele şi procesele chimice
ce participa la reactiile imunologice
 Imunochimie
 Termenul a fost introdus de chimistul suedez
 Arrhenius (1907).
 studiul cu privire la reactiile chimice care se
produc în organismul uman si animal, dupa
imunizare
 Fondatorul este P. Ehrlich.
 a introdus metode cantitative în studiul
reactiilor antigen-anticorp
 si a elaborat o teorie generala asupra
recunoasterii imune (teoria catenelor laterale
sau a receptorilor).
 Dupa 1950 s-a dezvoltat spectaculos,
 descoperirilor din domeniul biochimiei,
 utilizarii unor metode fizico-chimice de analiza
a macromoleculelor si aplicarea la domeniul
Imunologiei.
 S-a nascut un set de metode, puse în slujba
analizei moleculelor implicate în functia
imunitara.
 Domeniul analiza imunochimica si
utilizeaza
 metode care deriva din îmbinarea tehnicilor
fizico-chimice cu cele imunologice
 Imunochimia este deservita de:
 metoda imunodifuziei,
 imunofluorescentei,
 RIA- Radioimmune Assay,
 ELISA – Enzime Linked Immune Sorbant
Assay,
 dializa la echilibru.
 studiile de Imunochimie au propus noi metode
de tratament,
 bazate pe interactiunea unor molecule cu rol de
vehicul
 pentru anticorpi, cu receptorii unor celule tinta
 Imunogenetica studiaza determinismul
 genetic al raspunsului imun:
 mecanismele genetice care asigura diversitatea
anticorpilor si a antigenelor de histocompatibilitate.
 Imunohematologia s-a nascut odata cu
stabilirea diferentelor antigenice ale eritrocitelor
umane si cu precizarea grupelor sanguine
 K. Landsteiner, 1901 s-a stabilit existenta
unor
 diferente fine între diferite tipuri de eritrocite si,
 descoperirea factorului Rh si a rolului sau în
patologia sarcinii.
 Imunologia medicala
 s-a dezvoltat în trei directii:
1. directia profilactica,
 orientata spre descoperirea

 si producerea unor noi vaccinuri,

 capabile sa creeze o stare de rezistenta.

 Ea se preocupa, de schemele de vaccinare,

 de posibilitatea asocierii diferitelor vaccinuri

 si de posibilitatea stimularii raspunsului

 imun cu ajutorul adjuvantilor;

2. directia terapeutica
 studiaza posibilitatea obtinerii serurilor

imune.
 Ele contin anticorpi

 se administreaza organismelor care

 prezinta riscul îmbolnavirii prin infectii;

3. directia diagnosticului
 studiaza posibilitatea identificarii agentilor

etiologici ai diverselor maladii infectioase,

 cu ajutorul reactantilor imunologici (seruri
imune si antigene).
Imunopatologia
 studiaza fenomenele imunitare în relatie cu
diferitemaladii.
 In multe situatii patologice,
 raspunsul imun (activarea functiei imunitare)
are efecte defavorabile,
 prejudiciante asupra organismului.
 Antigenul,
Ag: Def

 Ag este orice substanta de origine exogena

care
 patrunde in organism si induce formarea de
aticorpi
 sau dupa reactia cu un receptor specific de
pe celulele clone T sau B.
Antigenul de origine exogena
 -poate avea origine
 -bacteriana
 -parazitologica
 -extracelulara
 -intracelulara
Antigenul de origine endogena
 autoantigene – Orice organism normal
elaboreaza o gama mare de Ag self-
propriu, acestea sunt limitate sau
sechestrate de bariere specifice deci nu au
contact cu Sistemul Imun (SI).
 Ruperea acestor bariere duce la eliberarea
Ag si pot aparea raspunsuri immune. Aceasta
reprezinta baza bolilor autoimmune.
 -Ag tumorale (neo Ag)
 reprezentate pe suprafata celulelor
canceroase
 si sunt recunoscute de SI in fuctie de
distributia lor.
-Supravegherea imunologica
 -Ag Virale
 Colonizeaza celulele somatice include
properietatiile genomului si diferite proteine se
resintetizeaza ca niste Ag self.
 Orice contact sar solda obligatoriu cu RI dar nu
toate antigenele declanseaza RI.
 Orice Contact cu Ag
 nu neaparat duce la un raspuns imun
 aceste Ag se numesc Haptogene (Hpt)
 Tolerogenele sunt Ag cu proprietati inhibitori
a RI (raspuns imun) asteptat
 si stimuleaza celelulele T supresoare.
 Modelul general de structura a
unui antigen
 O molecula antigenica este alcatuita din doua
componente;
 - componenta purtator (“carrier”),
 care corespunde celei mai mari parti a
moleculei:
 gruparile determinante de specificitate sau
epitopi,
 localizate pe suprafata componentei purtator
 si formate din secvente specifice de
 monomeri.
 Epitopii
 prin secventa proprie a monomerilor
 si prin configuratia spatiala specifica,
 confera individualitate chimica si
 specificitate antigenica moleculei nonself.
 Gruparile determinante de specificitate sunt
echivalentii moleculari si functionali ai
haptenei.
EPITOPI

 Sunt regiunile imunologic active ale

antigenelor

 Paratop=structura corespondenta sau

receptorul de antigen al imunoglobulinei

 Numarul epitopilor prezenti pe o molecula de

antigen va determina valenta antigenului
CLASIFICAREA EPITOPILOR:

 EPITOPI SECVENTIALI = reprezentati de un

segment continuu de AA dintr-un lant
polipeptidic si sunt dependenti de structura
primara a proteinei.
 EPITOPI CONFORMATIONALI = sunt formati
din AA care in structura primara se afla la
distanta intr-un lant polipeptidic sau sunt situati
pe lanturi diferite si sunt adusi unul langa celalalt
prin plierea lanturilor in cadrul structurii
secundare dau tertiare a proteinelor.
 CLASIFICAREA
ANTIGENELOR:

In functie de tipul raspunsului imun:

Ag timo-independente – nu necsita
prezenta limfocitului T
Ag timo-dependente – necsita prezenta
limfocitului T
TIPURI DE ANTIGENE

T-independente

• Polizaharide
• Proprietăţi
– Structură polimerică
– Activare policlonală
a celulelor B
• Yes -Type 1 (TI-1)
• No - Type 2 (TI-2)
– Rezistente la
degradare
• Exemple
– Polizaharide şi lipopolizaharide pneumococice
– Flagella
TIPURI DE ANTIGENE

T-dependente

• Proteine
• Structura

• Exemple
– Proteine microbiene
– Proteine non-self sau self alterate
CLASIFICAREA ANTIGENELOR:

In functie de natura chimica:

Glucide
Lipide
Proteine
Acizi nucleici
Compusi sintetici
 HAPTENA
= o substanţă străină cu masa moleculară suficient de
redusă ca să nu poată produce răspuns imun
• Pentru a produce răspuns imun trebuie să se lege de
un carrier - prin cuplare cu haptena → imunogena

– Exemplu: Medicamentele = haptene, fiind suficient de

mici ca să nu fie recunoscute ca fiind străine de organism.
Uneori, acestea se pot lega de exemplu de eritrocite şi
devin imunogene.
 IMUNOGLOBULINELE
(ANTICORPII)
 a fost demonstrata de Behring si Kitasato
(1890),
 în serul animalelor imunizate experimental cu toxina
tetanica.
 Heidelberger (1930) a purificat anticorpii din ser
 si a evidentiat ca apartin fractiei proteice.
 Tiselius si Kabat (1938) au demonstrat
 experimental ca,
 functia de anticorp este asociata cu fractia gama a
proteinelor serice
 si le-au dat denumirea de gamaglobuline.
 Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline.
 Exista si alte globuline cu functie de anticorp,
 si gamaglobuline care nu au activitate de
anticorp (de exemplu, proteinele patologice
Bence-Jones).
 Anticorpii sunt imunoglobuline care se
sintetizeaza în organism dupa patrunderea
unui antigen
 au proprietatea de a se cupla specific
 cu antigenul inductor
 si de a-i anihila actiunea nociva.
 Termenul de “anticorp” în acceptiunea sa
actuala, a fost folosit de Ehrlich (1891)
 Anticorpii formeaza 20% din totalul
proteinelor plasmatice,
 dar se gasesc si în lichidele extravasculare,
în secretiile exocrine (saliva, lapte,
 lacrimi)
 si ca molecule receptor de anti-gen pe
suprafata limfo-citelor B.
 Structura moleculei de
imunoglobulina, Ig
 s-a stabilit prin analiza proteinelor omogene
secretate de plasmocitoame,
 cu metodologii
 complexe:
 biochimice,
 analitice,
 cristalografia prin difractie cu raze X.
 Unitatea structurala, Ig este monomerul.
 este o unitate tetrapeptidica, formata prin
asocierea a doua
 lanturi grele , de circa 450 de aminoacizi
 Si o greutate moleculara cuprinsa între 50-76
kD
 si doua lanturi usoare (L,
 fiecare având circa 216 aminoacizi
 si o greutate moleculara de 25 kD.
 Cele 4 catene polipeptidice sunt legate prin
punti S-S si se rasucesc în spirala - atât unul
fata de altul, dar si fiecare separat – fata de
propria-i axa,
 În functie de secventa aminoacizilor,
 fiecare lant polipeptidic este alcatuit din doua
regiuni distincte:
 a) regiunea constanta (C ) corespunde
jumatatii C-terminale a
 celor 4 catene polipeptidice.
 Are o secventa relativ uniforma a
 aminoacizilor si asigura unitatea structurala si
functionala a moleculei de Ig;
 b) regiunea variabila (V) cuprinde o secventa de
circa 110
 Se disting
 3 categorii de punti S-S:
 - legaturi intercatenare H-H sau L-H, ale unui
monomer.
 Legaturile
 L-L s-au descris la IgA2 si la proteinele Bence-
Jones, care sunt dimeri
 de lanturi L;
 - legaturi intracatenare, care determina structura
tertiara a fiecarui lant polipeptidic.
 - legaturi intercatenare, între lanturile H ce apartin
Anticorp
 STRUCTURA

 2 lanţuri grele
(Heavy)
 2 lanţuri uşoare
(Light)
 Punţi disulfidice
 Între lanţuri
 În cadrul lanţului
Imunochimia
Reactivii imunochimici sunt produse biologice
(Ac, Ag, C, hematii)
ce se utilizează pentru determinări calitative
sau/si cantitative de
Ag sau Ac
Tehnici:
Fizico-chimice: - precizie
- acuratete
Imunologice: - sensibiliate
- specficitate
 Reacţia Ag-Ac
Este determinată de
interacţiunea specifică
dintre
epitopii antigenului şi
paratopii anticorpilor

Intervin legături
o de hidrogen

o electrostatice

o forţe Van der Waals

o hidrofobe
 Afinitatea
unui Ac pentru un Ag specific

Depinde de:
- intensitatea forţelor de
legătură a complexului
Ag-Ac
- complementaritatea
sterică dintre paratop şi
epitop

REACTIA Ag-Ac este:

- exoterma
- specifică
- reversibilă
 Aviditatea
unui Ac pentru un Ag specific

Reprezintă
rapiditatea apariţiei manifestării
reacţiei Ag-Ac (precipitare, aglutinare)
Depinde de
 constanta de asociere
 valenţa Ac
 numărul de epitopi
 temperatură, pH,
 forţa ionică a mediului
Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit
“specific”
Reacţia Ag-Ac

 Are o mare putere de rezoluţie

 Selectivitatea fiecărei reacţii nu este absolută
 Necesită obţinerea unui semnal secundar
pentru a fi detectabilă
 Prezintă un domeniu de aplicare extrem de
larg
Reactii Ag-Ac

 Seroidentificare: detectarea şi dozarea Ag (component

necunoscut)(medicamente,hormoni peptidici, antigene
virale sau bacteriene) cu:
- Ac monoclonali
- Ac policlonali

 Serodiagnostic: detectarea şi titrarea Ac din serul

bolnavilor (component necunoscut) faţă de un Ag specific
cunoscut
 REACTIILE DE PRECIPITARE

Ag = macromolecula solubila

Se produc in:
 mediu lichid
 solid
Pot fi:
 Calitative
 Cantitative
Sunt:
 reactii specifice
 putin sensibile
 necesita cantitati importante de anticorpi
Precipitarea
 Formarea unei retele tridimensionale
de Ag reunite prin Ac
 Condiţiile de formare a reţelei de precipitare:
- Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi)
- Ag sa fie multivalent
Precipitarea maxima
corespunde cu zona de echivalenţă
(Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraţie)
ce permite precipitarea tuturor
moleculelor de Ac cu Ag corespunzator
În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formează
Precipitarea in mediu lichid

Precipitare inelara:
- tuburi
- capilare

Reactia de precipitare inelara (depistarea antigenelor microbiene):

prot.M streptococi, Ag.termostabil antrax (reactia Ascoli)
Precipitarea in mediu lichid
Reacţia de floculare (tehnica Ramon)
- Calitativa

- Cantitativa
 Se efectuează diluţia succesivă a serului imun
la care se adauga cantităţi egale de Ag
 Se întroduc probele în termostat
 Periodic se examinează pentru depistarea tubului în care
apare precipitatul iniţial (zona de echivalenţă)
 Utilizare: determinarea cantitativa de toxină, antitoxină
sau anatoxină,VDRL
Reacţia de floculare

TUBURI GODEURI
Reacţia de floculare

V.D.R.L. (Veneral Disease Research Laboratory)

Precipitarea in mediu solid

Difuzia în gel

 Difuzia simplă
 Difuzia dublă
 Difuzia combinată cu
migrarea în câmp electric

Se utilizează gel de agar sau agaroză

(concentraţie de 0,8-1,6 g %)
Imunodifuzia radială simplă
 Precipitarea in mediu solid
Imunodifuzia radială simplă
(Mancini, Carbonara, Heremans;1965)
IDRS

Aplicaţii (cantitativ): IgG, IgA, IgM, C3,

alfa-1 antitripsină, siderofilină,
proteina C-reactivă (CRP)
Precipitarea in mediu solid
Imunodifuzia dublă ( Elek, Ouchterlony; 1948 )
DD

Aplicaţii (calitativ) : proteinele Bence-Jones

(kappa şi lambda), crioglobuline
Imunodifuzia dublă

Testul Elek
(toxinogeneza la C.diphteriae)
 Difuzia combinată cu
migrarea electroforetică

Imunoelectroforeza (IEF)
Grabar şi Williams (1953)
Scheidegge (1955)
Imunoelectroforeza
bidimensională cantitativă
Ressler (1960), Laurell (1965),
Clarke şi Freeman (1968)
Imunoelectroforeza
 Difuzia combinată cu
migrarea electroforetică
Contraimunelectroforeza (CIEF)
Bussard (1959)
CIEF
CIEF
 Difuzia combinată cu
migrarea electroforetică
Electroimunodifuzia (EID)
Laurell (1965)