Cromatografia de lichide pe coloană

Cromatografia – o tehnică de separare a amestecurilor, în componentele sale cu scopul de a

le analiza, identifica, purifica și /sau cuantifica. Cromatografia se bazează pe interacțiunea
diferențiată a doi sau mai mulți compuși de separat (numiți soluți) cu ajutorul a două faze
cromatografice: faza mobilă și faza staționară. Principalele avantaje pe care le prezintă
cromatografia ca metodă de separare sunt :
- Permite separarea, identificarea și dozarea cantitativă a componentelor unui amestec.
- Se poate aplica unui număr foarte mare de produse, practic orice compus organic/ bio-
organic poate fi separat printr-o metodă cromatografică - Sensibilitatea metodelor
cromatografice este extrem de ridicată. În același timp însă se pot aplica și la scară
preparativă.
- Durata analizei este redusă, comparativ cu alte metode de analiză ale amestecurilor
complexe.
Cromatografia de adsorbtie lichid-solid
Cromatografia lichid-solid (LSC), numita si cromatografie de adsorbtie, utilizeaza o
faza mobila lichida si o faza stationara solida formata dintr-o pulbere poroasa având
capacitate mare de adsorbtie si o suprafata specifica ce variaza într-un domeniu foarte larg,
între 50-1000 m2/g. Acest tip de cromatografie se bazeaza pe interactiunea moleculelor
solutului cu centrii activi aflati pe suprafata unui adsorbent solid care reprezinta faza
stationara. Adsorbentul se poate gasi fie într-o coloana (în cazul cromatografiei pe coloana)
fie pe suprafata unei placi (în cazul cromatografiei în strat subtire). Granulatia umpluturii
variaza pe un domeniu larg, de la 5 μm în cazul celor folositi în HPLC si pîna la mai mult de
100 μm în cazul celor folositi în cromatografia pe coloane clasice.
Cromatografia lichid-solid poate fi utilizata cu rezultate bune atât pentru separarea
compusilor polari cât si a celor nepolari si este folosita cu precadere în separarile cantitative
ale amestecurilor de substante organice, atunci când aceste amestecuri nu sunt foarte
complexe. În general, compusii care se pot separa cel mai bine prin tehnica LSC sunt cei care
au caracter neionic si sunt solubili în solventi organici. Compusii neionici solubili în apa se
separa mai bine prin cromatografie de lichide pe faza inversa sau cromatografie cu faze
chimic legate.
Din punct de vedere istoric, a fost prima tehnica cromatografica utilizata (Ţvet).
Faze stationare utilizate în cromatografia lichid-solid
În cromatografia LSC se folosesc drept faze stationare o serie de materiale
pulverulente, dintre care cele mai utilizate sunt alumina si silicagelul. În masura mai mica se
folosesc silicatul de magneziu, pamântul de diatomee, cât si o serie de alti adsorbenti: amidon,
inulina, fosfat de calciu, carbonat de calciu, hidroxid de calciu. Acestea din urma se utilizeaza
numai pentru cazuri speciale si deoarece se prezinta sub forma de pulberi fine trebuie
amestecate cu pamânt de diatomee pentru a permite trecerea fazei mobile.
Un anumit adsorbent poate manifesta variatii mari ale suprafetei specifice si ale
energiei superficiale în functie de metoda de preparare, modul de activare si gradul final de
dezactivare. Aceste diferente se vor regasi si în valorile parametrilor de retentie
cromatografici. Suprafata acestor adsorbenti este în general eterogena, prezentând activitati
diferite. Suprimarea pozitiilor active (mai ales în ce priveste formarea legaturilor de hidrogen,
dar si a centrilor acizi sau bazici) sau dezactivarea prin acoperirea selectiva a acestora duce la
cresterea capacitatii liniare de adsorbtie. În cele mai multe cazuri pentru dezactivare se
foloseste apa, deoarece s-a constatat ca cele mai bune rezultate se obtin când apa acopera în
monostrat 50-100% din suprafata solidului, ceea ce înseamna 0,04 g apa la 100 m2 suprafata
(sau 4-15% apa fata de cantitatea de adsorbent). Ca dezactivator se mai pot folosi alti compusi
puternic polari ca etilenglicolul sau glicerina.
Pentru obtinerea unui adsorbent de o anumita activitate reproductibila trebuie sa fie
parcurse urmatoarele etape:
- alegerea tipului de adsorbent;
- îndepartarea apei prin încalzire timp de 8-16 ore la aer (125-250ºC pentru
silicagel, 200-400ºC pentru alumina);
- adaugarea unei anumite cantitati de apa dupa racire, cu care se lasa timp de 8-16
ore pentru echilibrare.
Adsorbentii utilizati în cromatografia LSC se pot prezenta sub doua forme:
- granule poroase neregulate, numite faze stationare poroase. Ele au suprafete
specifice cuprinse între 100-400 m2/g si au o capacitate de încarcare cu proba de
0,5-1 mg/g.
- sfere solide compacte acoperite cu un strat de adsorbent poros, care se numesc
faze stationare superficial poroase sau peliculare. Ele au suprafete specifice mult
mai mici decât adsorbentii porosi, cuprinse între 5-15 m2/g si pot fi încarcate cu
proba la un raport de 0,1 mg/g adsorbent, deci cantitatea de proba pe care o pot
separa va fi mult mai mica. Eficienta de separare a adsorbentilor superficial porosi
este însa mult mai mare.
Alumina se poate obtine în functie de temperatura de preparare si activare în mai
multe forme. Daca activarea se face la temperatura mai mica de 700ºC se obtine alumina γ, în
amestec cu alte forme. Daca activarea se face la o temperatura mai mare decât 1000ºC, se
obtine alumina α inactiva. Sorturile de alumina cromatografica au în general suprafete
specifice cuprinse intre 100-200 m2/g. Diametrul particulelor sortimentelor comerciale de
alumina este cuprins între 50-200 μm (70-290 mesh). Aceste dimensiuni permit o asezare
uniforma a umpluturii în coloana, atingerea unui debit rezonabil de faza mobila sub influenta
doar a gravitatii si atingerea rapida a echilibrelor de distributie ale solutilor între adsorbent si
faza mobila.
Alumina normala contine si diferite cantitati de apa, fie provenita din forma hidratata a
aluminei, fie sub forma de apa adsorbita. În ce priveste structura poroasa, s-a observat ca ea
contine un sistem de macropori de forma cilindrica având un diametru de 27 Å, la care se
adauga pori neregulati cu diametre mai mari.
Activitatea de adsorbtie a aluminei depinde se sortimentul realizat. Exista trei forme de baza
de alumina, bazica (pH 10), neutra (pH 7) si acida (pH 4) si este importanta folosirea tipului
corect într-o anumita aplicatie din cauza unui posibil efect catalitic. Astfel, alumina bazica
poate cataliza hidroliza unor esteri, iar cea acida dehidrogenarea unor alcooli, în special a
celor tertiari. Activitatea tuturor celor trei forme de alumina este clasificata în cinci grade
(scala Brockmann), pe baza continutului de apa. Gradul I, cel mai activ, se obtine prin
activare la 300-400ºC timp de mai multe ore, iar celelalte grade prin adaugare de diverse
proportii de apa, dupa racire: 3-4% (gradul II), 5-7% (gradul III), 9-11% (gradul IV),
respectiv 15-19% (gradul V). Faptul ca gradul I este cel mai activ înseamna ca va retine cel
mai puternic compusii polari.
Silicagelul reprezinta adsorbentul cel mai mult utilizat. Ca structura chimica, este un
produs de policondensare al acidului ortosilicic. Silicagelul cromatografic se obtine la pH 7,
adica în forma neutra. si acest adsorbent se poate obtine în diferite grade, în conformitate cu
continutul sau de apa. Gradul I se obtine prin încalzire la 250ºC timp de mai multe ore, iar
celelalte prin adaugarea unor cantitati diferite de apa dupa racire: 5% (gradul II), 15% (gradul
III), 25% (gradul IV) si 38% (gradul V). În cazul sortimentelor cu continut ridicat de apa se
formeaza un film consistent de apa la suprafata adsorbentului, deci aceste separari pot fi
considerate mai curând pe baza de repartitie decât de adsorbtie.
Silicatul de magneziu si Florisilul. Silicatul de magneziu are o activitate de adsorbtie mai
mare decât alumina, fiind utilizata pentru separarea unor anumite clase de substante, cum ar fi
lipidele. Florisilul este un silicat de magneziu si sodiu cu suprafata specifica de 300 m 2/g, iar
ca activitate de adsorbtie se situeaza între silicagel si alumina. Prezinta însa si fenomen de
chemosorbtie, motiv pentru care utilizarea sa este mai limitata.
Carbunele a reprezentat cel mai popular adsorbent la începuturile cromatografiei, însa
la ora aceasta nu prea mai este utilizat.
Dezvoltarea cromatografiei de înalta performanta a determinat realizarea unor
adsorbenti cu particule având diametre mai mici de 30μm. Au existat în aceasta directie doua
tendinte:
- obtinerea unor adsorbenti porosi cu diametrul în jur de 5 μm;
- obtinerea unor adsorbenti superficial porosi cu diametrul în jur de 30 μm si având
un strat superficial poros cu grosimea de 1-2 μm.
La ora actuala adsorbentii porosi sunt utilizati cu precadere. În cromatografia lichid-
solid clasica diametrul particulelor este de pâna la 100 μm, în timp ce în cromatografia în strat
subtire clasica, granulatia suportului este cuprinsa între 10-40 μm, utilizându-se ca suport în
general silicagel si alumina.
Câteva exemple de adsorbenti pe baza de silicagel poros accesibili comercial, utilizati în mod
curent în LSC sunt: Lichrospher (Merck), Porasil (Waters).

Faze mobile utilizate în cromatografia lichid-solid

În cromatografia LSC se utilizeaza un mare numar de faze mobile lichide, cât si

amestecuri ale acestora de compozitie fixa sau compozitie variabila în timp. În cromatografia
de lichide, faza mobila poarta numele de eluent, iar procesul de antrenare a solutului prin
coloana de catre faza mobila se numeste elutie. Pentru o separare buna, în special în cazul
componentelor cu polaritati mult diferite, trebuie utilizata o faza mobila a carei putere de
elutie creste. Aceasta putere de elutie este influentata de trei factori:

- interactiunile dintre moleculele eluentului si moleculele solutului;

- interactiunile dintre moleculele fazei mobile adsorbite si moleculele de solut aflate

în faza mobila adsorbita;

- interactiunile dintre moleculele de faza mobila adsorbite si adsorbent.

Rolul solventilor în LSC este foarte important, deoarece ei sunt în competitie cu

moleculele solutului pentru centrii activi polari ai adsorbentului. Cu cât interactiunile dintre
faza mobila si faza stationara sunt mai puternice, cu atât adsorbtia solutului va fi mai slaba si
invers. Chiar de la începuturile cromatografiei de adsorbtie s-a constatat ca în cazul
adsorbentilor polari solventii nepolari (de exemplu hidrocarburile alifatice saturate sau
halogenate) sunt eluenti slabi în comparatie cu solventii polari (alcooli, acizi).

Puritatea solventilor este un aspect foarte important în LSC, deoarece prezenta apei
sau a altor compusi polari poate afecta mult performantele coloanei, iar eventuala prezenta a
unor compusi care absorb în UV este nedorita atunci când se folosesc detectoare în UV.
 Marimea caracteristica pe baza careia se poate stabili faza mobila care trebuie utilizata
pentru o anumita separare în conditiile unui adsorbent dat este taria eluentului, care se
defineste ca fiind energia de adsorbtie a moleculelor eluentului pe unitatea de suprafata a
adsorbentului. Tariile relative, notate cu ε0, au fost determinate pentru o serie de solventi pe
diferiti adsorbenti, considerând ca referinta pentanul. În cazul unor amestecuri de eluenti,
tariile acestora se pot calcula în functie de fractiile molare si tariile solventilor ce constituie
amestecul.

Clasificarea solventilor în functie de taria legaturii lor cu adsorbentul se face în serii

eluotrope, care pot fi utilizate pentru gasirea unui eluent cu o tarie potrivita pentru realizarea
unei anumite separari. Este însa indicat sa se faca si o testare a eluentului ales si acest lucru se
poate face mai rapid prin cromatografie in strat subtire decât prin cromatografie pe coloana.
Seria eluotropa reprezinta o serie de solventi cu putere de elutie crescatoare. În cazul
adsorbentilor nepolari, taria eluentului se datoreste existentei unor interactiuni nespecifice de
tip Van der Waals si creste aproximativ cu masa moleculara a eluentului. Astfel, pentru
carbune activ, seria eluotropa în ordinea cresterii puterii de elutie este: apa, metanol, etanol,
acetona, propanol, eter etilic, butanol, acetat de etil, hexan. În cazul adsorbentilor polari, taria
eluentului creste odata cu polaritatea solventului, deci aproximativ invers decât la adsorbentii
nepolari. Exista serii eluotrope formate din amestecuri de mai multi solventi de polaritati
diferite, care pot fi folosite pentru a realiza serii de eluenti de o anumita tarie.

Tehnica cromatografiei lichid-solid pe coloana

Cromatografia de adsorbtie este potrivita mai ales pentru separarea compusilor cu mase
moleculare medii, polari si nepolari dar fara sarcini electrice.
Cromatografia de lichid-solid se poate realiza prin trei tehnici posibile:
- cromatografie lichid-solid clasica, pe coloana;
- cromatografie în strat subtire;
- cromatografie lichid-solid de înalta performanta.
Dintre acestea, cromatografia lichid-solid pe coloana se utilizeaza practic numai în scopuri
preparative, în timp ce cea de înalta performanta se utilizeaza mai ales în scop analitic, dar si
preparativ.
Pentru a testa posibilitatea separarii unui amestec de compusi prin cromatografie lichid-solid
este indicata cromatografia în strat subtire. În acest scop se foloseste adsorbentul care se
preconizeaza a se utiliza în separarea LSC (alumina sau silicagel în majoritatea cazurilor) si
prin TLC se poate stabili eluentul sau sistemul de eluenti cel mai potrivit. Pentru realizarea
unei separari corespunzatoare sunt importante natura adsorbentului, dimensiunile sale,
dimensiunile coloanei si viteza de elutie.
Coloanele utilizate în LSC sunt confectionate în general din sticla, având lungimea cuprinsa
între 10-90 cm si diametrul interior între 1-5 cm. Raportul dintre lungimea si diametrul
coloanei trebuie sa fie in intervalul 10-20. Aceste coloane pot fi prevazute cu slifuri la ambele
capete, pentru a permite atasarea unei pâlnii de separare pe post de rezervor de solvent în
partea superioara, respectiv a unui vas de tip Büchner în partea inferioara pentru colectarea
fractiunilor eluate (Figura 4.6).
Figura 4.6. Coloana utilizata pentru cromatografia lichid-solid
Tehnica cromatografiei LSC pe coloana consta din trei etape principale:
- umplerea si pregatirea coloanei;
- încarcarea probei;
- elutia componentelor probei.
Umplerea coloanei se poate face prin doua tehnici: uscata si umeda. Tehnica umplerii uscate
se utilizeaza mai putin, deoarece necesita cantitati mai mari de adsorbent. Pentru a realiza
separari cu o coloana umpluta prin tehnica umeda, este necesara o cantitate de adsorbent de
20-50 de ori mai mare fata de cantitatea de proba care va fi supusa separarii. Daca
componentele separate au polaritate apropiata, acest raport trebuie marit la 100-200.
Diametrul particulelor de adsorbent utilizate în separarile LSC este cuprins între 0,05-0,5 mm.
Particule mai mici duc la o viteza de curgere mult prea redusa prin coloana, în timp ce
particule mai mari determina o separare necorespunzatoare. Viteza optima de elutie depinde
de multi factori, cum este natura si diametrul particulelor de adsorbent, lungimea coloanei si
natura compusilor care trebuie separati. Pentru a realiza umplerea prin tehnica umeda, se
realizeaza o suspensie de o parte adsorbent la cinci parti faza mobila si aceasta suspensie este
introdusa în coloana. Coloana trebuie sa fie uscata si sa aiba în partea inferioara un opritor din
sticla sinterizata, vata de sticla sau nisip, cât si un robinet pentru se a putea regla debitul de
elutie. În timpul umplerii coloana trebuie sa se gaseasca în pozitie verticala, iar introducerea
suspensiei este dirijata cu ajutorul unei baghete de sticla pentru ca asezarea ei în coloana sa fie
uniforma. Dupa introducerea primei portiuni de suspensie, se deschide robinetul pentru
evacuarea solventului cu viteza mica si numai dupa aceea se adauga urmatoare portiune.
Aceasta adaugare trebuie efectuata înainte ca portiunea precedenta sa se fi asezat complet,
altfel umplutura se va aseza în straturi. De asemenea, nu este permis ca nivelul lichidului sa
scada sub nivelul stratului de adorbent, acesta trebuind sa se gaseasca permanent în lichid.
Dupa umplere, coloana nu are voie sa prezinte goluri, canale, crapaturi sau alte neuniformitati.
Dupa terminarea umplerii, peste partea superioara a stratului de adsorbent se pune în general
un disc de hâtrie de filtru cu diametrul egal cu diametrul interior al coloanei sau un strat de
nisip de 0,5 cm grosime, pentru a preveni dislocarea sa în momentul introducerii probei. Apoi
se scurge solventul din coloana pâna când nivelul lichidului ajunge chiar deasupra nivelului
umpluturii. În acest moment coloana este pregatita pentru utilizare.
Introducerea probei (Figura 4.7) se face prin aplicarea ei în partea superioara a coloanei, cel
mai bine cu ajutorul unei pipete Pasteur. Proba trebuie sa se gaseasca într-un volum minim de
solvent, de preferinta acelasi cu cel folosit pentru eluare. Pentru o coloana de 40 cm lungime
si 2 cm diametru volumul ideal de solutie de proba este de 1-2 ml. Dupa aplicarea probei se
deschide robinetul de la partea inferioara a coloanei si proba este lasata sa intre complet în
adsorbent. Apoi cu un volum cât mai mic de solvent se spala peretii coloanei si aceasta
portiune de solvent este de asemenea lasata sa intre în adsorbent. Intrarea completa a probei în
stratul de adsorbent înainte de începerea elutiei este necesara pentru a preveni diluarea probei.
Apoi coloana se umple complet cu eluent si în partea sa superioara se ataseaza rezervorul de
eluent. Dupa începerea eluarii, fluxul de solvent prin coloana nu mai este permis sa fie oprit,
deoarece ar duce la dispersia excesiva a componentelor.

Figura 4.7. Introducerea probei în coloana LSC: (a) nivelul solventului se gaseste chiar
deasupra nivelului umpluturii; (b) aplicarea probei; (c) intrarea probei în adsorbent; (d)
spalarea peretilor coloanei cu solvent; (e) intrarea acestei solutii în adsorbent; (f) umplerea
coloanei cu eluent.
Uneori proba nu este complet solubila în solventul sau amestecul de solventi folosit pentru
eluare, dar se dizolva într-un solvent mai polar. Nu este permisa introducerea unei probe
incomplet dizolvate, dar nici dizolvate într-un alt solvent mai polar, deoarece ar duce la
separari necorespunzatoare. În aceste situatii se recomanda dizolvarea probei în solventul mai
polar, adaugarea la aceasta solutie a unei cantitati de adsorbent de 2-10 ori mai mare decât
greutatea probei si evaporarea solventului (la un evaporator rotativ) astfel ca proba sa ramâna
adsorbita. Acest material se introduce apoi în partea superioara a coloanei si va fi desorbita în
timpul trecerii eluentului.
Elutia componentelor se poate realiza în trei moduri:
- Elutie izocratica, cu un singur eluent sau cu un amestec de eluenti de compozitie
constanta;
- Elutie în trepte, utilizând o serie eluotropa de solventi cu putere de elutie
crescatoare sau o serie eluotropa de amestecuri de doi solventi, având în general
valori ε0 apropiate, pentru separari mai fine.
- Elutie cu gradient, utilizând un amestec de doi solventi a carui compozitie este
modificata continuu în timpul elutiei.
În cazul în care adsorbentul este polar, alumina sau silicagel, componentele nepolare vor avea
o interctiune mai slaba cu adsorbentul si vor elua primele. Elutia izocratica este recomandata
mai ales atunci când se urmareste separarea unei componente nepolare dintr-un amestec cu
altele mai polare. În acest caz se foloseste un eluent cu polaritate apropiata de cea a
componentei urmarite, care va elua doar compusul respectiv, ceilalti compusi, mai polari,
ramânând adsorbiti în partea superioara a coloanei.
Daca dupa eluarea componentei sau componentelor mai putin polare vrem sa eluam si
componentele mai polare, avem nevoie de un eluent cu tarie mai mare. O asemenea elutie se
poate face în trepte, folosind o serie eluotropa de polaritate crescatoare. Nu se recomanda o
variatie prea brusca a compozitiei fazei mobile, mai ales daca se face o trecere de la solventi
aprotici la solventi protici. Astfel, daca se face trecerea de la pentan la toluen, aceasta se face
secvential cu amestecuri de 10%, 50% si 70% toluen în pentan, iar în cazul trecerii de la
acetona la metanol numarul treptelor trebuie sa fie mai mare, de exemplu 1, 2, 5, 10, 20, 30,
40, 70 si în final 100% metanol.
Eluarea cu gradient este utilizata atunci când se urmareste schimbarea compozitiei eluentului
într-o maniera constanta si uniforma, nu abrupta decât în cazul elutiei în trepte. Acest tip de
elutie se poate realiza utilizând doua rezervoare, unul continând solventul mai polar iar
celalalt pe cel nepolar (Figura 4.8). Solventul mai polar trece, cu debitul F1, într-o camera de
amestecare în care se gaseste solventul mai putin polar. Din aceasta camera, are loc trecerea
amestecului de solventi în coloana, cu debitul F2. Se pot genera diferiti gradienti prin variatia
celor doua debite. Prin utilizare elutiei cu gradient, se pot separa într-o singura analiza
compusi cu polaritati mult diferite.
Regula cea mai importanta în cromatografia de adsorbtie lichid-solid este ca polaritatea (taria)
fazei mobile este fie mentinuta constanta în timpul analizei (în cazul elutiei izocratice) fie este
crescatoare, dar niciodata ea nu este descrescatoare.

Figura 4.8. Realizarea gradientului de faza mobila

Detectarea componentelor separate în coloana se poate face prin diferite metode. Pentru
aceasta, se colecteaza în general fractiuni de volume egale, manual sau utilizând un colector
de fractiuni. Aceste fractiuni se analizeaza prin cromatografie în strat subtire, cromatografie
de gaze sau spectrofotometrie în UV, apoi fractiunile cu compozitie identica se reunesc si se
supun evaporarii pentru indepartarea solventului. Aceasta evaporare se face în general la un
evaporator rotativ de vid. Exista si posibilitatea utilizarii unor detectoare UV-VIS automate
care se conecteaza la iesirea din coloana si permit monitorizarea componentelor eluate, cu
conditia ca acestea sa absoarba în domeniul UV sau vizibil, iar eluentul utilizat sa nu aiba
absorbtie (Figura 4.9).
Figura 4.9. Detectarea si colectarea fractiunilor eluate