Virusologie

Definiie: Virusologia (inframicrobiologia) tiina care studiaz virusurile

(inframicrobii) i afeciunile provocate de acetia.

Virion = virus = corpuscul elementar = corpuscul viral

unitatea viral, morfofuncional, complet, intact, infecioas, cu diametrul cuprins ntre

18-400 nm, capabil s infecteze bacterii, plante, animale, omul

Se gsesc extracelular:

nainte de a infecta celula gazd

dup ce s-au asamblat i au fost eliberai din celula n care s-au multiplicat

VIRUS VEGETATIV particula viral aflat n celul, deficitar n unele aspecte ale
replicrii,lipsit de capsid.

PROVIRUS genom viral integrat n cromozomul celulei gazd, multiplicndu-se

sincron cu acesta
Caracteristici generale ale virusurilor pe scurt
Marimea 25 nm (picornavirus) pana la 250-350 nm (smallpox virus). Comparativ,
puterea de rezolutie a microrcopului fotonic este de: 300 nm, iar bacteriile au dimensiuni de
ordinul a 5005000 nm.

Genomul este format din ADN sau ARN putind sa fie dublucatenar sau monocatenar.

Structura Virusurile sunt complexe de proteine codificarte dee genele virale si acizi
nucleici cateva au si elemente codificate de celulel gazda ca membrane si tARN

Reproducerea are loc numai in celule vii. Virusurile pastreaza informatia necesara in
acizii nucleici informatiile privind acizii nucleici si a sintezei proteice inclusiv aunor enzime

Antibioticele. Virusurile nu sunt afectate de antibiotice dar pot sa fie inhibate de

interferon si de diferiti agenti chemoterapeutici
Dimensiunea
-18 30 nm (Parvoviridae, Picornaviridae)
-18 30 nm (Parvoviridae, Picornaviridae)
-40 80 nm rotavirus, virusul rubeolos, virusul hepatitei B, virusul hepatitei C
-90 200 nm virusul herpetic, virusul rujeolos, virusul respirator sinciial, virusul rabic
-300 - 450 nm (Poxviridae) virusul Variolic
-peste 900 nm lungime, diametru 80 nm (Filoviridae)

Metodele de msurare a dimensiunii virionilor sunt:

ultrafiltrarea care este o filtrare prin membrane de colodiu cu pori de mrime

cunoscut,

observarea la ME n comparaie cu particule de referin, de dimensiuni

standard (particule de latex),

ultracentrifugarea datorit corelaiei ntre rata de sedimentare i dimensiunea

virionilor.

Modele structurale
-Virusuri cu simetrie rotationala (cubica sunt icosaedre adica poliedre cu 20 de fete in forma
de triunghiuri echilaterale). Numarul de capsomere pe viron variaza de la 32 la 252 si depinde de
numarul de capsomere (doua sau sase) ce formeaza o margine a triunghiului echilateral.

Capsomerele dintrun virion pot sa difere ca morfologie proprietsti antigenice si biologice. Aceste
virusuri pot sa cristalizeze.
Simetrie-elicoidala. Simetria elicoidala este prezenta atunci cnd o ax a capsidei este mai
lunga dect celelalte.Acidul nucleic si proteinele capsidei sunt strns legate, n care proteina este
strns infasurata n jurul genomului. Acest complex ARN-proteine este cunoscut sub numele de
nucleocapsida, .
Simetrie complexa. Modele structurale complexe se gsesc la bacteriofagi i virusul variolei.
Bacteriofagi T, de exemplu, au un cap icosahedric care conine ADN-ul i o coad tubulara prin
care ADN-ul este injectat n celula gazd.
Materialul genetic viral
Acidul nucleic al tuturor virusurilor ADN, cu excepia parvovirusurilor, este dublucatenar
(hepadnavirusurile au ADN parial dublucatenar cnd nu sunt in timpul replicrii).

Acidul nucleic al tuturor virusurilor ARN, cu excepia reovirusurilor, este monocatenar.

n cazul virusurilor ARN, genomul conine acid nucleic care poate fi cu polaritate pozitiva
(+), caz n care poate aciona direct ca ARNm (mesager) n interiorul celulei infectate, sau poate
fi cu polaritate (-), caz n care trebuie transcris de o enzima asociat virusului, ARN-transcriptaza,
ntr-un ARN cu polaritate (+) = imaginea in oglinda.

Conine ntreaga informaie genetic necesar replicrii

Asigur infectivitatea viral

Este capabil de autoreplicare n absena celorlali constitueni virali

Excepie ARN viral izolat, m.c., sens negativ (virusuri cu genom divizat orthomyxovirus

Mrimea genomului viral se coreleaz cu mrimea capsidei sau anvelopei. Astfel

virusurile mari au un genom de dimensiuni mari care conine cteva sute de gene i codific un
numr relativ mare de proteine (poxvirusurile, herpesvirusurile, etc) virusurile mici au un genom
de dimensiuni reduse care conine doar 3 sau 4 gene i codific un numr mic de proteine
Capsida

Capsida este un invelis al virusului format din proteine structurale codificate de acesta
care acoper acidul nucleic i este mai mult sau mai puin strns asociat cu aceasta.Combinaia a
acestor dou componente este numita de cele mai multe ori nucleocapsida, mai ales dac acestea
sunt strns asociate ca i n myxoviruses.Capsida este alctuit din subuniti, capsomere, al cror
numr variaz, dar este specific i constant pentru fiecare dintre speciile virale. Acestea sunt
structuri sferice sau cilindrice compuse din mai multe polipeptide.Capsida protejeaz acidul
nucleic de degradare.n toate, cu excepia virusurilor ncapsulate, este responsabila pentru fixarea
virusilor de celula gazda, i determin antigenitatea specifica virala.
Aspect of capsomere architecture of helical virus

1. Capsidele cu simetrie icosaedric au 20 de fee triunghiulare, 30 de muchii si 12

vrfuri, de unde aspectul aparent de sfer.

Fiecare din capsomerele situate n cele 12 vrfuri se nvecineaz cu cte 5 capsomere i se

numesc pentone. Celelalte capsomere situate pe cele 20 de fee sau pe cele 30 de muchii se
nvecineaza cu cte 6 capsomere i se numesc hexone.

Mrimea capsidei icosaedrice este dat de numarul hexonelor inserate de-a lungul
muchiilor si feelor dintre pentone.

Exemplu:

*virusuri ARN

-capsida parvovirusurilor cuprinde 32 capsomere

-capsida herpesvirusurilor cuprinde 162 capsomere

-capsida adenovirusurilor cuprinde 252 capsomere
*virusuri ADN
-capsida calicivirusurilor cuprinde 32 capsomere
*caz particular: reovirusurile care prezinta o capsida dubl, formata din 2 structuri
icosaedrice.

2. Capsidele cu simetrie helicoidal - capsomerele se aranjeaz n jurul spiralei de acid

nucleic, formnd o suprafa cilindric flexibil sau rigid.

Majoritatea virusurilor cu simetrie helicoidal poseda o anvelop extern, aspectul

extern al virionului fiind de:*sfer (v. gripale,v. paragripale) *cartu sau glon (v. rabic)
*filamentoas (v. Marburg).

3. Capsidele cu simetrie binar (icosaedric-helicoidal) sunt prezente la bacteriofagii

cu coad contractil (virusurile bacteriilor) la care capul cuprinde nucleocapsida cu simetrie
icosaedric iar coada are simetrie helical.

4. Virusuri cu organizare complex. Arhitectura complex este specific virusurilor cu

genom mare (poxvirusuri).

Virionul conine nucleoidul format din ADN nconjurat de o membran intern

omogen i flancat de dou mase ovoide numite corpi laterali. Nucleoidul mpreun cu corpii
laterali sunt nconjurai de o membran extern format din tubuli dispui aleator.
Invelisul

Invelisul, ce inconjoara capsida la cateva familli de virusuri, este totdeauna dependenta de

membranele celulare ale gazdei (nucleara, plasmatica, si uneori a reticuluilui endoplasmatic).
Virusurile cu invelis nu se adsorb la celula cu capsida cu cu anvelopa. Indepartarea acesteia cu
solventi organici si detergenti (sensibilitate la eter).

Pe suprafaa acestei membrane se gsesc formaiuni specifice virale, codificate de

virus:

1. spiculi (peplomere) de natur glicoproteic. Au funcia de adsorbie i penetrare n

celula gazd.

Exemple:

*hemaglutinina (HA) = rol n ataarea virusurilor la celula gazd ; confer virusurilor

proprietatea de a liza hematiile diverselor specii animale

*neuraminidaza (N) = faciliteaz parunderea virusurilor n celul

2. factori de fuziune. Se gasesc sub forma inactiv (FO) iar sub aciunea proteazelor
celulei gazd se scindeaz genernd forme active (F1,F2). Au funcia de iniiere a infeciei.

3. proteina M (matrix) cptuete faa intern a anvelopei (frecvent la virusurile ARN cu

polaritate negativ).
Funciile nveliului:

a) asigur ataarea virusurilor anvelopate (nvelite) la celula gazd

b) de protectie - Rolul protector al nveliului viral este anihilat de tratamentul cu solveni

lipidici (eter, cloroform, sruri biliare), rezultnd inactivarea particulei virale. Permite clasificarea
virusurilor in:

-eter-sensibile = virusurile nvelite

-eter-rezistente = virusurile nenvelite

Alte componente

Enzime diferite. Viruii necesit o serie de enzime diferite pentru funcionarea genomului
i realizarea infeciei. n mai multe specii de virus enzimele sunt o component a particulei
virale, de exemplu neuraminidaza necesara pentru invazie si eliberarea de myxovirusuri. Alte
exemple includ polimerazele acizilor nucleici cum ar fi polimerazele ARN-dependente de ARN
antisens n virusi, ADN-polimeraze n virusul variolei si ARN-polimerazei dependente de ADN
("revers transcriptaza"), in hepatita B, virusuri i retrovirusurilor
Hemaglutinin. Unii virui (mai presus de toate myxovirusii i izolat paramixovirusuri)
sunt capabile de aglutinare a eritrocitelor umane si a diferitelor animale. Acesti virui poart o
proteina de suprafata numita hemaglutinina, in envelopa lor care le permite s fac acest lucru.
Fenomenul de hemaglutinare poate fi utilizat la studiile cantitative pentru testarea prezentei
virusurilor sau prin testul de inhibare a hemglutininei pentru identificarea virusului si a
anticorpilor. n termeni biologici, hemaglutinina joac un rol decisiv n adsorbie i in penetrarea
virusului n celula gazd.
Taxonomia virusurilor

Comitetul Internaional pentru Taxonomie de virusi (ICTV) recunoatecirca 1.550 specii

de virus (20), dar aproximativ 30.000 de tulpini de virus si izolates sunt urmrite de virusologi n
diferite domenii ale biologiei i a dezvoltat o baz de date de virusi inca din 1991.
Unii oameni de stiinta cred ca trebuie infiintat un nou regn nou, denumit Vira, asta nseamn c
lumea vie va avea 7 reguri (Archaea, Eubacteria, Protista, Animalia, Mycota, Plantae i Vira).
Aceasta este o idee bun, s se gseasc o poziie taxonomic clara pentru virusuri, care sunt att
de diferite de toate celelalte organisme vii din lume.

Van Regenmortel enumer urmtoarele caractere pentru discriminri ntre specii de virus:
Corelarea cu secventa genomului
spectrul de gazde naturale

tropismul pentru celule i esuturi

patogenitate i citopatologie
modul de transmitere
proprietile fizico-chimice ale virionilor
proprieti antigenice ale proteinelor virale
Taxonomia virusurilor

Viruii sunt clasificati deci si in functie de natura genomului lor

virusuri cu ARN monocatenar de polaritate pozitiva si negativa

virusuri ARN dublu-catenar

virusuri ADN monocatenar i dublu-catenar;

virui ce utilizeaza revers transcriptaza pentru replicare (ARN: ADN-ul i

Retroviridae: Hepadnaviridae).

Denumirea cuprinde deci dup cum urmeaz: (---- viridae familie virus), subfamilia
virinae (----) (---- de tip virus).

Denumirea virala respecta normele internationale (n limba englez i n caractere

cursive, de exemplu: Un enterovirus uman sau virusul polio, iar in paranteze drepte
abrevierea oficiala de exemplu, [HEV-A] sau [PV].
Forme i dimensiuni ale virusurilor din familii care includ virusuri ale diferitelor animale,
zoonotici, precum i ageni patogeni umani. Dimensiunea virionilor este respectata la scara dar
structura lor este reprezentata schematic unele, fiind prezentate in sectiune.

Aici nu sunt figurati bacteriofagii

Caracteristici virusuri

Caracteristici de baz structurale, cum ar fi tipul genomului, forma virus i site-ul de

replicare, n general, mprtesc aceleai caracteristici, printre speciile de virus n cadrul
aceleiai familii.
n prezent, exist 20 de familii de virusuri care infecteaz oamenii. Exist dou virusuri
suplimentare (Hepatita D i hepatita de tip E), care nu au fost nc atribuite unei familii, dar sunt
n mod clar distincte de alte familii care infecteaza oamenii.
Exist ase familii de virusuri ADN: trei sunt non anvelopate (adenoviruses,
parvovirusul i poliomavirus) i trei sunt anvelopate (Hepadnavirus, Herpesvirus i Poxvirus).
Toate familiile care nu au invelis au nucleocapsida icosahedrica
Exist apte unice familii de virusuri ARN cu polaritate pozitiva : trei non anvelopate
(Astrovirus, calicivirusul i Picornavirus) i patru anvelopate (Coronovirus, Flavivirus,
Retrovirus i Togavirus). Toate familiile care nu au invelis au nucleocapsida icosahedrica.

Exist ase familii de virusuri ARN cu polaritate negativa: Arenavidae, Bunyaviridae,

Filoviridae, Orthomyxoviridae, Paramixoviridae i Rhabdoviridae. Toate cele anvelopate au cu
nucleocapsida elicoidala.
Exist o familie cu un ARN dublu catenar -Reoviridae.
Printre familiile ce infecteaza omul exist o serie de caracteristici care ar putea ajuta medicii i
microbiologii clinici / virusologi.
Ca o regul virusurile cu ADN, n cadrul replicarii are loc in nucleul celular in timp ce virusurile
cu ARN se replica n citoplasma. Excepiile sunt cunoscute de la aceast regul: poxvirusurile
(virusuri ADN) se replica n citoplasma i orthomyxovirule i virusul hepatitei D (virusuri ARN)
se replica interiorul nucleului.

Patru familii au genomul segmentat : Bunyaviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae i

Reoviridae . Toate sunt virusuri ARN.

Trei familii sunt transmise prin artropode: Bunyaviridae, Flaviviridae i Togaviridae.

Toate sunt virusuri ARN.
Diferite tipuri de virusuri

i. virusuri helicale nean- velopate : au capsomere asezate helicoidal in jurul acizilor

nucelici Exemplu: Tobacco Mosaic Virus

Iii. Virusuri cu simetrie helicoidala dar cu anvelopa

Exemple: Paramyxovirus
Diferite tipuri de virusi

ii. Virusi polyhedrale neanvelopate

( sau icosaedrice): capsidele formeaza forme geometrice cu laturi plate (i.e., faces) si
colturi. Example: Reovirus, Adenovirus (in image), si Picornavirus

Iv. Virusi anvelopati poliedrici : se observa anvelopa care inconjura capsida de morfologie
poliedrica exemple Herpesvirus (in image) si Togavirus
Virusuri cu morfologie complexa reprezinta o combinatie de structuri . Exemplu:

bacteriofagii.

Cilcul vital al virusurilor

Replicarea virusurilor parcurge urmatoarele secvene:

1. recunoasterea celulei gazd

2. adsorbia (ataarea ) virusului de celula gazd
3. penetrarea (ptrunderea) virusului n celula gazd
4. decapsidarea virusului
5. sinteza macromolecular
a) biosinteza ARNm precoce i a proteinelor precoce = proteine-enzime
b) replicarea genomului viral
c) biosinteza ARNm tardiv i a proteinelor tardive = proteine structurale
6. eliberarea virionilor progeni din celula gazd

Influenta factorilor de mediu asupra virusurilor

Factori fizici

Temperatura: actiunea acesteia depinde de tipul de virus, prezena substanelor

protectoare 18-25C
-sensibile: v.rujeolos, v.gripal etc., moderat sensibile: v.Ebola, v.Marburg, v.Epstein-Barr
etc.rezistente: v.coxsackie, v.variolic etc -56-100C in 30 minute inactivarea majoritii
virusurilor Temperatura si umiditatea: -fierberea (100C) cteva minute VHA, v.rabic 30
minute VHB -autoclavarea:121C, 1 atm, 30 minute toate virusurile Temperatura scazuta
conserv virusurile -4C (refrigerare) cteva sptmni enterovirusuri doi ani v.rabic n
fragmente de nevrax -20C (congelare) insuficient pt pstrarea v.gripale, v.respirator siciial
-70C (congelare) / pstrare n azot lichid la -190C prezervarea infectivitii pt ani de zile

Radiatii ionizante

-aciune direct: pe acizi nucleici i proteine virale si indirect: ionizarea mediului

nconjurtor producere de compui toxici
-radiaii electromagnetice (X, gamma),radiaii corpusculare ( i ),inactiveaz
virusurile

Ultrasunete vibraii peste 20 kHz/sec folosite pt:eliberarea virusurilor din celule

obinerea unor substructuri virale omogenizarea suspensiilor virale etc.
Factori chimici

pH sub 5 and peste 9 deterioreaz infectivitatea, stabile la pH extrem acid 3

enterovirusuri, alcalin 9 v.gripal B

ageni chimici
-oxidani 1%, oxidri n proteinele virale peroxid de hidrogen (H2O2) 3-6%, inactivare
virus, agent antiseptizant Ozon dezinfecia apei, f.scump, puin utilizat, permanganat de potasiu
1%
-halogeni/compui halogenai
-Clorul tratarea apei potabile

hipoclorit de calciu / hipoclorit de sodiu 10%, deterioreaz acizii nucleici virali,

dezinfectani antivirali universali

Cloramina 2-5%, 20%detergeni

-detergenti

Sintetici afecteaz virusuri cu peplos (dezoxicolat de Na, dodecilsulfat de Na, Tween 80

Cationici aciune virulicid + aciune spumant (sruri de amoniu cuaternar 20%, clorura
de benzolcarmin pt. tegumente mucturi de animale 1% inactivare v.rabic)
Factori biologici

Lizozim efect virulicid v.gripal n secreiile nazale, lacrimale, salivare

6

suc gastric aciune virulicid prin pH-ul acid enzime proteolitice: tripsin, pepsin
Bil inactiveaz virusurile cu pelos

Metode de diagnostic in laborator

Tipuri de diagnostic

1. Diagnosticul indirect: serologie virala

Pentru diagnosticul unei infectii curente este important s se analizeze dou prelevate
consecutive cel putin la un inteval de 10-15 zile pentru a observa o schimbare semnificativ a
concentratiei anticorpilor.
- Prezenta IgM cel mai adesea este un semn de infecie recenta; IgG-persist pe
termen lung.
Atunci cnd o persoan este gasita serologic pozitiva pentru prima dat pentru HIV i VHC, este
obligatorie a face verificari printr-o a doua serie de analize (serologie i Western Blot).

prelevatele:
in principal se preleveaza ser care este apoi trimis la laborator.

Alte fluide biologice: lichid cefalorahidian (LCR), lichid amniotic, lichidul pleural, lavaj
bronhoalveolar, lichid alveolar (LBA).

Probele de snge se preleveaza in n tub uscat i tub cu geloza pentru serologie: sngele
este centrifugat i alicote din acest centrifugat este utilizat pentru realizarea testelor serologice
prescrise.
Tehnici utilizate :
Metoda ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) cel mai des folosita

Alte reactii serologice mai traditionale , ca reactia de fixare a complementului

Teste rapide (dar cu sensibilitate variabila)

Teste de confirmare HIV (western blot) si HVC (immunoblot) : diferite proteine ale
virusului sunt prezente separat pe membrana ce servesc ca suport de reactie. Aceste teste permit
precizarea contra caror proteine virale sunt produsi anticorpii
Principiul Reactiei ELISA

Se formeaza o reactie antigen anticorp serul se presupune a contine anticorpii cautati ce

reactioneaza la reactivii antigeni comerciali adsorbiti pe un suport de plastic (placi cu 96 de
godeuri)

Detectarea complexului anticorp antigen prin fixarea unui anticorp anti imunoglobulina
umana marcata obtinuta comercial - de ctre o enzim (Immunoassay enzime) sau molecula
marcata fluorescent (imunofluorescenta)
Teste serologice rapide

Test serologic HIV-1 si 2 rapid : acest tip de test este util in cazul unui accident de
expunere la sangele contaminat daca serul pacientului este pozitiv tratamentul anti retro viral se
incepe imediat
Western blot

Indicatie: punerea in evidenta a unui contact mai recent la o persoana infectata cu virus
mai recent sau chiar mai putin recent .

Avantaje:

posibilitatea automatizarii

Obtinerea de rezultate in maxim 4 ore sau in ziua urmatoare

sensibilitate ridicat,

specificitate excelenta (ELISA)

7

cel mai sensibil la unii pacieni: copii i immunodeprimati .

Interpretarea delicata uneori. Exemplu: pentru toate Herpesviridae (HHV, CMV, EBV S),
IgM pot fi prezente sau nu nu la reactivare.
2. Diagnostic direct
Probe din prelevate

Calitatea eantionului determin rezultatul. Exist trei situaii

Probele nu au nevoie de mediul de transport pentru a aduce proba la laborator n-un tub
steril uscat fecale, urin, LCR lichide de eantionare diferite n-un tub care conine EDTA probe
de sange pentru separarea celulelor mononucleare din sngele respectiv (pentru determinarea
CMV, EBV, HIV).

Probele prelevate cu un tampon steril scufundate n mediul de transport de pilda exudat

din gat, vezicule, conjunctive iar livrarea trebuie facuta in decurs de 4 ore la laborator (pentru a
pstra antigenitatea, infeciozitatea si calitatea de acizi nucleici) pn la 4C prin incadrarea
eprubetei in punga de gheata (pentru a preveni dezvoltarea bacteriilor)

Probe de snge total la temperatura camerei - pentru examene de Biologie molecular: se

adauga EDTA la tub + + + (fr heparin, care este un inhibitor al PCR)

Dispozitiv Smear (tamponul este dispus pe lama de sticl de ctre laborant): si lasat sa se
usuce la temperatura camerei
Exemple de probe: lichid cefalorahidian, lavaj bronhoalveolar, scaun, un tampon steril de
transport i de mediu lichid
Metode rapide de diagnostic direct
Aceste metode permit obtinerea unui rezultat in numai cateva ore.
Tehnici:

Imunoaglutinarea specifica a virusurilor pe o lamela de sticla de un (cu un anticorp contra

antigen=proteine virale) dintr-o proba de tesut sau de celule sanguine mononucleate isolate in
laborator .

Alte metode : aglutinare pe particule latex sensibile

Metod: ELISA pentru tipul de antigeni cu detectie automatizata utilizand kituri de

enzim de detection si imunodozarea antigenica rapida.

Indicaii: Permite identificarea rapida specifica si ajuta la inceperea tratametnului cat mai
repede : se foloseste in detectia (HHV), a infeciilor respiratorii (gripa, virusul sinciial respirator,
parainfluenza virus, adenovirus) a diareei infantile (rotavirus, Adenovirus) si cercetarea cazurilor
subclinice in cazul CMV la pacienii immunodeprimati .
Test de aglutinare pentru Rotavirus in proba de scaun

Probele de scaun , suspendate in solutie tampon sunt puse in prezenta unor particule de
latex sensibile la antigenul viral . Aici rezultatul este negativ. In caz contrar, masurile de igiena
impuse permit limitarea extensiei epidemiei de gastroenterita printre bebelusii din spital
Metode imunologice

Imunofluorescenta specifica a HHV pe un frotiu vaginal : celulele infectate prezinta o

fluorescenta galben verzuie drept care se va face o nastere prin cezariana pentru a evita infectarea
noului nascut.
Metode imunologice

Antigenemia pp65 a CMV positiva : leucocitele marcate prin anticorpi fluorescenti

(fluorescenta galben-verzui) contin o fosfoproteina de 65kD a CMV. Pacientul cu grefa renala va
beneficia de un tratsment contra CMV, chiar fara semne clinice (tratament preventiv).

Metode de diagnostic direct pe cultura

Virusurile sunt parazite obligatorii in celule ele sunt cultivate pe celule eucariote intretinute in
laborator sub forma de linii celulare continue sau semicontinue

Diferitele etape de diagnostic prin cultura virala sunt:

1.nsmnarea unei linii de celule cu proba patologica.

2. Examinarea direct zilnic: detectarea efectului citopatic (CPE), la microscopul optic

inversat.

3. Dac exista ECP: se coloreaza celulele se face frotiu pentru detectarea incluziuni virale
i alterarile citoplasmatice i nucleare la microscopul optic.

4. marcarea imunologica specifica a virusului si citirea pe lame microscopice a

rezultatului cu microscopie optica sau fluorescenta
Culturi de celule
Prin comparatie, efectul citopatic caracteristic al unei culturi celulare infestata cu
enterovirus se observa incluziunile citoplasmatice si nucleul dens impins la periferia celulei
Cultivarea pe oua embrinate de gaina

Virusurile se pot izola si pe oua embrionate de gaina desi acum se renunta la aceasta
emtoda in favoarea cultivarii pe culturi de celule
Metode de diagnostic molecular
Pentru simplitate, trei metode principale domina de analizele de rutin:

hibridizarea molecular i variantele sale (hibridizare cu amplificarea semnalului i

bDNA, hibridizare pentru detectia mutaiilor n genomul viral),

amplificarea unei genei, sau PCR,

i secvenierea nucleotidelor.

Aplicaiile cantitative devin de asemenea curente

Hibridizare: detectarea direct a ADN sau ARN pe diferite suporturi (tuburi, plci, membrane)
Principiul de hibridizare molecular:

1 - Formarea unui hibrid de acid nucleic viral (ADN sau ARN) / cu sonda specifica pentru
genomului viral cutat, pe diverse suporturi : membrana, microplaca, tub

2 Detectare immunoenzimatica a moleculelor hibride prin anticorpii de anti-acid nucleic

dublu catenar, sau marcajul sondei i apoi detectarea colorimetrica, fluorescenta sau
chimioluminiscenta
Hibridizare cu amplificare de semnal

- Principiul ADNului ramificat: esantioanele de acid nucleic viral sunt adsorbite pe un

suport cu sonde ADN ramificat la care hibridizeaza sonde de relevare.

Molecule luminescente sunt asociate sondelor moleculare de relevatie semnalul

fluorescent fiind proportional cu numarul de molecule de acid nucleic viral adsorbit Utilizarea
simultan a mai multe sonde ramificate complementare la diferite regiuni ale genomului viral
int, permite detectarea virusurilor foarte variabil dpdv genetic (HIV, HCV). Numrul mare de
molecule luminescente implicate permite o scadere a limitei de detecie, fr risc de contaminare
(fara amplificare a acizilor nucleici, n contrast cu tehnica PCR).
Hibridizare pe membrana si pe chipuri

Principiul diferitelor metode:

1) sonde de hibridizare moleculara fixate pe un suport specific pentru a detecta un virus

mutant
2) dtectia imuno-enzimatica.
Sondele sunt prezente pe benzi iar antigenele sunt fizate pe aceste benzi de imunoblot ex :
gnotiparea HVC, mutatii ale HVB).

Microcipurile permit detectarea nmutatiilor virusurilor. Un mare numar de sonde asezate

ordonat in forma de sir pe suporturi de siliciu sticla etc reprezinta o combinare de tehnic
informatice si moleculare. O aplicatie este detectia mutaiilor la HIV asociata cu resistenta la
medicatia retrovirala.
Amplificare genica
Acizii nuleici extrasi dintr-o proba prin absorbie lor pe particule de siliciu incartcate pozitiv si
elutie urmatsa de amplificare genica saiu PCR permite recopierea unei portiuni limitate de
genom viral pentru amplificarea genica se detecteaza acizii nucleici amplificati pe gel de agaroza
sau hibridizare moleculara post PCR

Secventiere nucleotidica

Metoda Sanger este folosita pentru secvenierea de rutin.

Aceasta este un PCR, n care vom aduga dideoxynucleotides (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP), etichetate cu un fluorocrom la amestecul de reacie, ca de obicei.

Polimeraza ADN-ul sintetizeaz folosindu-se, n mod aleatoriu, fie deoxynucleotide sau

dideoxynucleotide. Fiecare dat cnd un dideoxynucleotid este ncorporat n lanul de ADN,
alungirea lanul se oprete, deoarece aceste molecule nu permit legtura fosfodiester urmtoare.
Secvena de reacie, astfel, duce la producerea de fragmente de ADN de toate dimensiunile
disponibile (de exemplu, un fragment de ADN de 200 de nucleotide copiate 1 la 200). Aparatul
permite detectarea automat a fluorocromilor din aceste fragmente de ADN separate prin
electroforeza capilara pe gel de acrilamid vertical sau n capilare umplute cu polimer de siliciu
Cuantificare (estimare cantitativa)

Diferite truse de PCR comercializate se bazeaza pe acest principiu . Un etalon este

introdus in prelevatele de analizat, inaintea extractiei acizilor nucleici (etalon intern). Acest etalon
este un acid nucleic a carui extremitati sunt identice cu secventa virusului salbatic Acest lucru
permite s foloseasc aceeai pereche de primeri. Prin contra, ntre capetele la care hibridizeaz
grunduri, secvena de nucleotide difer de cea de-slbatic de tip virus, care se pot distinge dou
produse PCR sau prin electroforez (diferite dimensiuni) sau prin hibridizare dup PCR (sonde
specifice diferite)
PCR in timp real

Metoda PCR in timp real masoara cantitatea de molecule de ADN produse in timpul
debutului fazei exponentiale a reactiei

In mod schematic ADN ul produs in timpul PCR este cuantificat prin incorporarea unei
molecule fluorescente sau a hibridizarii cu doua sonde specifice moleculare ce emit o
fliuorescenta speciala

Aparatele sunt echipate pentru lectura continua in timp real a fluorescentei emise
Metode de diagnostic molecular

10

Indicatiii asupra metodelor de diagnostic molecular :

Tehnici calitative : pentru demostrarea prezentei unui virus in particular unui virus in
special cand nu este cultivabil (HVC), sau care lichidul biologic nu este adecvat pentru cultura
(LCR).
Tehnici cantitative : pentru pacientii sub tratament antiviral (HIV, HVC, CMV, HVB).

Secventiere : detectarea mutatiilor nucleotidice

- asociere cu rezistenta la antivirale (HIV, HVB),
- caracteristici ale genotipurilor de virus (HVC, HVB).
Interesante pentru ca :sunt sensibile si pot sa fie automatizate
Limite :
exista riscuri de contaminare pentru tehnica PCR.
nu se poate stabili caracterul infectios al virusului detectat.
Caracterizarea fenoticipa a tulpinii nu este posibila.
Costurile sunt inca destul de mari.

11