Curs 6.

Virusologie generala
si moleculara.
Universitatea de Vest Vasile Goldi Arad
Facultatea de Medicina, Farmacie si
Medicina dentara
Dr.biol. Sergiu Fendrihan

Virusologie

Definiie: Virusologia (inframicrobiologia) tiina care

studiaz virusurile (inframicrobii) i afeciunile provocate de
acetia.
Virionul = virus = corpuscul elementar = corpuscul viral, este
unitatea viral, morfofuncional, complet, intact,
infecioas, cu diametrul cuprins ntre 18-400 nm, capabil s
infecteze bacterii, plante, animale, omul
Se gsesc extracelular:
nainte de a infecta celula gazd
dup ce s-au asamblat i au fost eliberai din celula n care sau multiplicat
Virusul vegetativ particula viral aflat n celul, deficitar
n unele aspecte ale replicrii,lipsit de capsid.
Provirusul genom viral integrat n cromozomul celulei
gazd, multiplicndu-se sincron cu acesta

Caracteristici generale ale virusurilor pe

scurt

Marimea 25 nm (picornavirus) pana la 250-350 nm (smallpox

virus). Comparativ, puterea de rezolutie a microrcopului fotonic este
de: 300 nm, iar bacteriile au dimensiuni de ordinul a 5005000 nm.
Genomul este format din ADN sau ARN putand sa fie dublucatenar
sau monocatenar.
Structura Virusurile sunt asocieri de proteine codificate de genele
virale si acizi nucleici cateva au si elemente care tin de celulele
gazda ca membrane si ARNt
Reproducerea are loc numai in celule vii. Virusurile pastreaza
informatia necesara in acizii nucleici informatiile privind acizii
nucleici si a sintezei proteice inclusiv a unor enzime
Antibioticele. Virusurile nu sunt afectate de antibiotice dar pot sa
fie inhibate de interferon si de diferiti agenti chemoterapeutici
(Kayser&Thieme Medical microbiological atlas, 2005)

Dimensiunea
-18 30 nm (Parvoviridae, Picornaviridae)
-18 30 nm (Parvoviridae, Picornaviridae)
-40 80 nm rotavirus, virusul rubeolos, virusul hepatitei B, virusul hepatitei
C
-90 200 nm virusul herpetic, virusul rujeolos, virusul respirator sinciial,
virusul rabic
-300 - 450 nm (Poxviridae) virusul Variolic
-peste 900 nm lungime, diametru 80 nm (Filoviridae)
Metodele de msurare a dimensiunii virionilor sunt:

ultrafiltrarea care este o filtrare prin membrane de colodiu cu pori de

mrime cunoscut,

observarea la ME n comparaie cu particule de referin, de

dimensiuni standard (particule de latex),

ultracentrifugarea datorit corelaiei ntre rata de sedimentare i

dimensiunea virionilor.

Structura generala a virusului

Structura generala
Modele structurale
-Virusuri cu simetrie rotationala (cubica sunt icosaedre adica poliedre cu 20 de fete in forma de
triunghiuri echilaterale). Numarul de capsomere pe viron variaza de la 32 la 252 si depinde de
numarul de capsomere (doua sau sase) ce formeaza o margine a triunghiului echilateral.
Capsomerele dintrun virion pot sa difere ca morfologie proprietsti antigenice si biologice. Aceste
virusuri pot sa cristalizeze.
Simetrie-elicoidala. Simetria elicoidala este prezenta atunci cnd o ax a capsidei este mai lunga
dect celelalte.Acidul nucleic si proteinele capsidei sunt strns legate, n care proteina este
strns infasurata n jurul genomului. Acest complex ARN-proteine este cunoscut sub numele de
nucleocapsida, .
Simetrie complexa. Modele structurale complexe se gsesc la bacteriofagi i virusul variolei.
Bacteriofagi T, de exemplu, au un cap icosahedric care conine ADN-ul i o coad tubulara prin
care ADN-ul este injectat n celula gazd.

Materialul genetic viral

Acidul nucleic
-virusuri ADN,
-dublucatenar liniar
circular
-monocatenar exceptie
Virusuri ARN,
- -monocatenar.
- -excepia reovirusurilor
ARN, genomul poate fi
-polaritate pozitiva (+), caz n care poate aciona direct ca ARNm (mesager)
-poate fi cu polaritate (-), caz n care trebuie transcris de o enzima asociat
virusului, ARN-transcriptaza, ntr-un ARN cu polaritate (+) = imaginea in
oglinda.
Conine ntreaga informaie genetic necesar replicrii
Asigur infectivitatea viral
Este capabil de autoreplicare n absena celorlali constitueni virali
Mrimea genomului viral se coreleaz cu mrimea capsidei sau anvelopei.
Astfelvirusurile mari au un genom de dimensiuni mari care conine cteva sute de
gene i codific un numr relativ mare de proteine (poxvirusurile, herpesvirusurile,
etc) virusurile mici au un genom de dimensiuni reduse care conine doar 3 sau 4
gene i codific un numr mic de proteine

Capsida

Capsida este un invelis al virusului format din proteine structurale

codificate de acesta care acoper acidul nucleic i este mai mult sau
mai puin strns asociat cu aceasta.
Combinaia a acestor dou componente este numita de cele mai
multe ori nucleocapsida, mai ales dac acestea sunt strns asociate
ca la myxovirusuri.
Capsida este alctuit din subuniti, capsomere, al cror numr
variaz, dar este specific i constant pentru fiecare dintre speciile
virale. Acestea sunt structuri sferice sau cilindrice compuse din mai
multe polipeptide.
Capsida
protejeaz acidul nucleic de degradare
fixarea virusilor de celula gazda, i
determin antigenitatea specifica virala.

Aspect al arhitecturii unui

virus cu simetrie helicala

Structura elicoidala rigida a virusului mozaicului

tutunului.
subuniti distincte de proteine cu greutate
moleculara de 17400-Da (protomere), constituie
un helix, cu o structura repetata de 6,9 nm (49
subunitati pe trei ture). Fiecare la rndul su,
conine o serie de subuniti (16-1/3), care au o
grosime de 2,3 nm.
ARN-ul (2x1O6 Da) se transform int-un sandwich
intern ntre proteine adiacente ale capsidei,
formnd o spirala de ARN cu aceasi pasi, 8 nm n
diametru,
2130 protomere acopera si protejeaza ARN-ului
virionului. Virusul complet este de 300 nm lungime
i 18 nm in diametru, cu o cavitate cilindrica cu un
diametru de 4 nm.
(De la Mattern CFT: Simetria n arhitectura
virusului n Nayak DP (ed): Molecular Biology of
Animal Viruses. Marcel Dekker, New York, 1977,
as modified from Caspar DLD: Adv Protein Chem,
18:37,1963, cu permisiune.)

1. Capsidele cu simetrie icosaedric au 20 de fee triunghiulare, 30

de muchii si 12 vrfuri, de unde aspectul aparent de sfer.
Fiecare din capsomerele situate n cele 12 vrfuri se nvecineaz cu
cte 5 capsomere i se numesc pentone. Celelalte capsomere
situate pe cele 20 de fee sau pe cele 30 de muchii se nvecineaza
cu cte 6 capsomere i se numesc hexone.
Mrimea capsidei icosaedrice este dat de numarul hexonelor
inserate de-a lungul muchiilor si feelor dintre pentone.
Exemplu:
virusuri ARN
-capsida parvovirusurilor cuprinde 32 capsomere
-capsida herpesvirusurilor cuprinde 162 capsomere
-capsida adenovirusurilor cuprinde 252 capsomere
virusuri ADN
-capsida calicivirusurilor cuprinde 32 capsomere
caz particular: reovirusurile care prezinta o capsida dubl, formata din
2 structuri icosaedrice.

2. Capsidele cu simetrie helicoidal - capsomerele se aranjeaz n

jurul spiralei de acid nucleic, formnd o suprafa cilindric flexibil
sau rigid.
Majoritatea virusurilor cu simetrie helicoidal poseda o
anvelop extern, aspectul extern al virionului fiind de:*sfer (v.
gripale,v. paragripale) *cartu sau glon (v. rabic) *filamentoas (v.
Marburg).
3. Capsidele cu simetrie binar (icosaedric-helicoidal) sunt
prezente la bacteriofagii cu coad contractil (virusurile bacteriilor) la
care capul cuprinde nucleocapsida cu simetrie icosaedric iar coada
are simetrie helical.
4. Virusuri cu organizare complex. Arhitectura complex este
specific virusurilor cu genom mare (poxvirusuri).
Virionul conine nucleoidul format din ADN nconjurat de o
membran intern omogen i flancat de dou mase ovoide numite
corpi laterali. Nucleoidul mpreun cu corpii laterali sunt nconjurai
de o membran extern format din tubuli dispui aleator.

Anvelopa (peplos)

Peplosul , ce inconjoara capsida este prezent la cateva familli de virusuri,

este totdeauna dependenta de membranele celulare ale gazdei (nucleara,
plasmatica, si uneori a reticuluilui endoplasmatic).
Virusurile cu anvelopa nu se adsorb la celula cu capsida ci cu anvelopa.
Indepartarea acesteia cu solventi organici si detergenti (sensibilitate la
eter) duce la afectarea acesteia si imposibilitatea de a se lega.
Pe suprafaa acestei membrane se gsesc formaiuni specifice virale,
codificate de virus:
1. spiculi (peplomere) de natur glicoproteic. Au funcia de adsorbie i
penetrare n celula gazd.
Exemple:
hemaglutinina (HA) = rol n ataarea virusurilor la celula gazd ;
confer virusurilor proprietatea de a liza hematiile diverselor specii animale
neuraminidaza (N) = faciliteaz parunderea virusurilor n celul
2. factori de fuziune. Se gasesc sub forma inactiv (FO) iar sub aciunea
proteazelor celulei gazd se scindeaz genernd forme active (F1,F2). Au
funcia de iniiere a infeciei.
3. proteina M (matrix) cptuete faa intern a anvelopei (frecvent la
virusurile ARN cu polaritate negativ).

Alte componente

Enzime. Viruii necesit o serie de enzime diferite pentru funcionarea

genomului i realizarea infeciei.
n mai multe specii de virus enzimele sunt o component a particulei virale,
de exemplu neuraminidaza necesara pentru invazie si eliberarea de
myxovirusuri.
Alte exemple includ polimerazele acizilor nucleici cum ar fi polimerazele
ARN-dependente de ARN antisens (-) n virusi, ADN-polimeraze n virusul
variolei si ARN-polimerazei dependente de ADN ("revers transcriptaza"), in
virusul hepatitei B, virusuri i retrovirusurilor
Hemaglutinin. Unii virui (mai presus de toate myxovirusii i izolat
paramixovirusuri) sunt capabile de aglutinare a eritrocitelor umane si a
diferitelor animale.
Acesti virui poart o proteina de suprafata numita hemaglutinina, in
envelopa lor care le permite s fac acest lucru.
Fenomenul de hemaglutinare poate fi utilizat la studiile cantitative pentru
testarea prezentei virusurilor sau prin testul de inhibare a hemglutininei
pentru identificarea virusului si a anticorpilor.
n termeni biologici, hemaglutinina joac un rol decisiv n adsorbie i in
penetrarea virusului n celula gazd.

Taxonomia virusurilor
Comitetul

Internaional pentru Taxonomie de

virusi (ICTV) recunoatecirca 1.550 specii de
virus (20), dar aproximativ 30.000 de tulpini de
virus sunt urmrite de virusologi n diferite care
au dezvoltat o baz de date de virusi inca din
1991.
Unii oameni de stiinta cred ca trebuie infiintat un
nou regn nou, denumit Vira, asta nseamn c
lumea vie va avea 7 reguri (Archaea, Eubacteria,
Protista, Animalia, Mycota, Plantae i Vira).
Aceasta este o idee bun, s se gseasc o
poziie taxonomic clara pentru virusuri, care sunt
att de diferite de toate celelalte organisme vii din
lume.

Criteria of viral taxonomy

Van

Regenmortel enumer urmtoarele

caractere pentru discriminri ntre specii de
virus:
Corelarea cu secventa genomului
spectrul de gazde naturale
tropismul pentru celule i esuturi
patogenitate i citopatologie
modul de transmitere
proprietile fizico-chimice ale virionilor
proprieti antigenice ale proteinelor virale

Taxonomia virusurilor

Viruii sunt clasificati deci si in functie de natura genomului lor

virusuri cu ARN monocatenar de polaritate pozitiva si negativa
virusuri ARN dublu-catenar
virusuri ADN monocatenar i dublu-catenar;
virui ce utilizeaza revers transcriptaza pentru replicare (ARN: ADNul i Retroviridae: Hepadnaviridae).

Denumirea cuprinde deci dup cum urmeaz: (---- viridae familie

virus), subfamilia virinae (----) (---- de tip virus).

Denumirea virala respecta normele internationale (n limba englez

i n caractere cursive, de exemplu: Un enterovirus uman sau virusul
polio, iar in paranteze drepte abrevierea oficiala de exemplu, [HEVA] sau [PV].

Virus forms
and taxonomy
Forme i dimensiuni ale
virusurilor din familii
care includ virusuri ale
diferitelor animale,
zoonotici, precum i
ageni patogeni umani.
Dimensiunea virionilor
este respectata la scara
dar structura lor este
reprezentata schematic
unele, fiind prezentate
in sectiune.
Aici nu sunt figurati
bacteriofagii

Taxonomia virusurilor
Iata o clasificare a virursurilor conform cu continutul lor in ADN, ARN forma si alte
caracteristici ce sunt prezentate sintetic in schema

Caracteristici virusuri (Virusuri ADN)

exist 20 de familii de virusuri care infecteaz oamenii.

Exist dou virusuri suplimentare (Hepatita D i hepatita
de tip E), care nu au fost nc atribuite unei familii, dar
sunt n mod clar distincte de alte familii care infecteaza
oamenii.
virusuri ADN: ase familii
-trei non anvelopate (adenoviruses, parvovirusul i
poliomavirus)
-trei sunt anvelopate (Hepadnavirus, Herpesvirus i
Poxvirus). Toate familiile care nu au invelis au
nucleocapsida icosahedrica

Taxonomia virusurilor (Virusuri ARN)

virusuri ARN cu polaritate pozitiva 7 familii:
-trei non anvelopate (Astrovirus, calicivirusul i Picornavirus) i
-patru anvelopate (Coronovirus, Flavivirus, Retrovirus i Togavirus).
Toate familiile care nu au invelis au nucleocapsida icosahedrica.
virusuri ARN cu polaritate negativa: sase familii
Arenavidae, Bunyaviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae,
Paramixoviridae i Rhabdoviridae. Toate cele anvelopate au cu
nucleocapsida elicoidala.

Virusuri cu ARN dublu catenar o familie-Reoviridae.

Virusuri cu genomul segmentat patru familii : Bunyaviridae,

Orthomyxoviridae, Arenaviridae i Reoviridae .
Ca o regul virusurile cu ADN, n cadrul replicarii are loc in nucleul celular in
timp ce virusurile cu ARN se replica n citoplasma. Excepiile sunt cunoscute
de la aceast regul: poxvirusurile (virusuri ADN) se replica n citoplasma i
orthomyxovirule i virusul hepatitei D (virusuri ARN) se replica interiorul
nucleului.
trei familii sunt transmise prin artropode: Bunyaviridae, Flaviviridae i
Togaviridae.

Diferite tipuri de virusuri

I. virusuri helicale neanvelopate : au capsomere
asezate helicoidal in jurul
acizilor nucleici
Exemplu: virusul mozaicului
tutunului.
III. Virusuri cu simetrie
helicoidala cu anvelopa
Exemple: Paramyxovirus

Diferite tipuri de virusi

II. Virusi simetrie poliedrica

sau icosaedrice neanvelopate
capsidele formeaza forme
geometrice cu fete si colturi.
Exemple: Reovirus,
Adenovirus (in image), si
Picornavirus
IV. Virusi poliedrici anvelopati :
se observa anvelopa care
inconjura capsida de
morfologie poliedrica exemple
Herpesvirus (in imagine) si
Togavirus

 Virusuri

cu
morfologie binara
reprezinta o
combinatie de
structuri .
Exemplu:
bacteriofagii.

Ciclul vital al virusurilor

Replicarea virusurilor parcurge urmatoarele secvene:

1. recunoasterea celulei gazd
2. adsorbia (ataarea ) virusului de celula gazd
3. penetrarea (ptrunderea) virusului n celula gazd
4. decapsidarea virusului
5. sinteza macromolecular
a) biosinteza ARNm precoce i a proteinelor precoce
= proteine-enzime
b) replicarea genomului viral
c) biosinteza ARNm tardiv i a proteinelor tardive =
proteine structurale
6. eliberarea virionilor progeni din celula gazd

Ciclul vital al virusurilor

Influenta factorilor de mediu asupra

virusurilor
Factori fizici
Temperatura: actiunea acesteia depinde de tipul de virus, prezena substanelor
protectoare 18-25C
-sensibile: v.rujeolos, v.gripal etc., moderat sensibile: v.Ebola, v.Marburg, v.EpsteinBarr etc.rezistente: v.coxsackie, v.variolic etc -56-100C in 30 minute
inactivarea majoritii virusurilor Temperatura si umiditatea: -fierberea (100C)
cteva minute VHA, v.rabic 30 minute VHB -autoclavarea:121C, 1 atm, 30
minute toate virusurile Temperatura scazuta conserv virusurile -4C
(refrigerare) cteva sptmni enterovirusuri doi ani v.rabic n fragmente de
nevrax -20C (congelare) insuficient pt pstrarea v.gripale, v.respirator siciial
-70C (congelare) / pstrare n azot lichid la -190C prezervarea infectivitii pt
ani de zile
Radiatii ionizante
-aciune direct: pe acizi nucleici i proteine virale si indirect: ionizarea mediului
nconjurtor producere de compui toxici
-radiaii electromagnetice (X, gamma),radiaii corpusculare ( i ),inactiveaz
virusurile
Ultrasunete vibraii peste 20 kHz/sec folosite pt:eliberarea virusurilor din celule
obinerea unor substructuri virale omogenizarea suspensiilor virale etc.

Influenta factorilor de mediu si a metodelor de

desinfectie asupra virusurilor
Factori chimici
pH sub 5 and peste 9 deterioreaz infectivitatea, stabile la pH extrem acid 3 enterovirusuri,
alcalin 9 v.gripal B
ageni chimici
-oxidani 1%, oxidri n proteinele virale peroxid de hidrogen (H2O2) 3-6%, inactivare virus,
agent antiseptizant Ozon dezinfecia apei, f.scump, puin utilizat, permanganat de potasiu 1%
-halogeni/compui halogenai
-Clorul tratarea apei potabile
hipoclorit de calciu / hipoclorit de sodiu 10%, deterioreaz acizii nucleici virali,
dezinfectani antivirali universali
Cloramina 2-5%, 20%detergeni
-detergenti
Sintetici afecteaz virusuri cu peplos (dezoxicolat de Na, dodecilsulfat de Na, Tween 80
Cationici aciune virulicid + aciune spumant (sruri de amoniu cuaternar 20%, clorura
de benzolcarmin pt. tegumente mucturi de animale 1% inactivare v.rabic)
Factori biologici

Lizozim efect virulicid v.gripal n secreiile nazale, lacrimale, salivare

suc gastric aciune virulicid prin pH-ul acid enzime proteolitice: tripsin, pepsin
Bil inactiveaz virusurile cu pelos

Metode de diagnostic in laborator

Tipuri de diagnostic
1. Diagnosticul indirect: serologie virala
Pentru diagnosticul unei infectii curente este important s se analizeze dou
prelevate consecutive cel putin la un inteval de 10-15 zile pentru a observa
o schimbare semnificativ a concentratiei anticorpilor.
- Prezenta IgM cel mai adesea este un semn de infecie recenta; IgG
-persist pe termen lung.
Atunci cnd o persoan este gasita serologic pozitiva pentru prima dat
pentru HIV i VHC, este obligatorie a face verificari printr-o a doua serie de
analize (serologie i Western Blot).
prelevatele:
in principal se preleveaza ser care este apoi trimis la laborator.

Alte fluide biologice: lichid cefalorahidian (LCR), lichid amniotic, lichidul

pleural, lavaj bronhoalveolar, lichid alveolar (LBA).

Probele de snge se preleveaza in n tub uscat i tub cu geloza pentru

serologie: sngele este centrifugat i alicote din acest centrifugat este
utilizat pentru realizarea testelor serologice prescrise.

1.2. Tehnici utilizate :

Metoda ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

cel mai des folosita
Alte reactii serologice mai traditionale , ca reactia de
fixare a complementului

Teste rapide (dar cu sensibilitate variabila)

Teste de confirmare HIV (western blot) si HVC

(immunoblot) : diferite proteine ale virusului sunt
prezente separat pe membrana ce servesc ca suport de
reactie. Aceste teste permit precizarea contra caror
proteine virale sunt produsi anticorpii

Metode de detectie

1.3. Principiul Reactiei ELISA

Se formeaza o reactie antigen anticorp

serul se presupune a contine
anticorpii cautati ce reactioneaza la
reactivii antigeni comerciali adsorbiti pe
un suport de plastic (placi cu 96 de
godeuri)

Detectarea complexului anticorp

antigen prin fixarea unui anticorp anti
imunoglobulina umana marcata
obtinuta comercial - de ctre o enzim
(Immunoassay enzime) sau molecula
marcata fluorescent
imunofluorescenta)

Metode de laborator
Sistem ELISA cu distributie
automata si citirea placilor si o
placa Elisa 96 de godeuri

Teste serologice rapide

Test

serologic HIV-1 si 2 rapid : acest tip de

test este util in cazul unui accident de
expunere la sangele contaminat daca serul
pacientului este pozitiv tratamentul anti retro
viral se incepe imediat

Western blot

Benzile de western blot la sfarsitul

reactiei : o banda colorata apare
daca serul testat contine anticorpii ce
recunosc antigenul adsorbit in locul
respectiv.

Indicatie: punerea in evidenta a

unui contact mai recent la o
persoana infectata cu virus mai
recent sau chiar mai putin
recent .
Avantaje:
posibilitatea automatizarii
Obtinerea de rezultate in maxim
4 ore sau in ziua urmatoare
sensibilitate ridicat,
specificitate excelenta (ELISA)
cel mai sensibil la unii pacieni:
copii i immunodeprimati .
Interpretarea delicata uneori.
Exemplu: pentru toate
Herpesviridae (HHV, CMV, EBV
S), IgM pot fi prezente sau nu
nu la reactivare.

2. Diagnostic direct

2.1. Probe din prelevate

Calitatea eantionului determin rezultatul. Exist trei situaii
Probele nu au nevoie de mediul de transport pentru a aduce proba la laborator n-un
tub steril uscat fecale, urin, LCR lichide de eantionare diferite n-un tub care conine
EDTA probe de sange pentru separarea celulelor mononucleare din sngele respectiv
(pentru determinarea CMV, EBV, HIV).

Probele prelevate cu un tampon steril scufundate n mediul de transport de pilda

exudat din gat, vezicule, conjunctive iar livrarea trebuie facuta in decurs de 4 ore la
laborator (pentru a pstra antigenitatea, infeciozitatea si calitatea de acizi nucleici)
pn la 4C prin incadrarea eprubetei in punga de gheata (pentru a preveni
dezvoltarea bacteriilor)

Probe de snge total la temperatura camerei - pentru examene de Biologie molecular:

se adauga EDTA la tub + + + (fr heparin, care este un inhibitor al PCR)

Dispozitiv Smear (tamponul este dispus pe lama de sticl de ctre laborant): si lasat sa
se usuce la temperatura camerei
Exemple de probe: lichid cefalorahidian, lavaj bronhoalveolar, scaun, un tampon steril
de transport i de mediu lichid

2.2. Metode rapide de diagnostic direct

Aceste metode permit obtinerea unui rezultat in numai cateva ore.

Tehnici:
Imunoaglutinarea specifica a virusurilor pe o lamela de sticla de un
(cu un anticorp contra antigen=proteine virale) dintr-o proba de tesut
sau de celule sanguine mononucleate isolate in laborator .
Alte metode : aglutinare pe particule latex sensibile
Metod: ELISA pentru tipul de antigeni cu detectie automatizata
utilizand kituri de enzim de detection si imunodozarea antigenica
rapida.
Indicaii: Permite identificarea rapida specifica si ajuta la inceperea
tratametnului cat mai repede : se foloseste in detectia (HHV), a
infeciilor respiratorii (gripa, virusul sinciial respirator, parainfluenza
virus, adenovirus) a diareei infantile (rotavirus, Adenovirus) si
cercetarea cazurilor subclinice in cazul CMV la pacienii
immunodeprimati .

Test de aglutinare pentru Rotavirus in proba de

scaun

Probele de scaun , suspendate

in solutie tampon sunt puse in
prezenta unor particule de
latex sensibile la antigenul viral
. Aici rezultatul este negativ. In
caz contrar, masurile de igiena
impuse permit limitarea
extensiei epidemiei de
gastroenterita printre bebelusii
din spital

Metode imunologice
Imunofluorescenta

specifica a HHV
pe un frotiu
vaginal : celulele
infectate prezinta
o fluorescenta
galben verzuie.

Metode imunologice

Antigenemia pp65 a
CMV pozitiva :
leucocitele marcate
prin anticorpi
fluorescenti
(fluorescenta galbenverzui) contin o
fosfoproteina de 65kD
a CMV.
Pacientul cu grefa
renala va beneficia de
un tratsment contra
CMV, chiar fara semne
clinice (tratament
preventiv).

Avantajele metodelor immunologice:

se obtine rapid un rezultat : 20 minute la 4
ore
Limite :
lipsa de sensibilitate . Un rezultat negativ
nu exclude diagnosticul
Imunofluorescenta : citirea la microscop
depinde de experienta observatorului

3.3. Metode de diagnostic direct pe cultura

Virusurile sunt parazite obligatorii in celule ele sunt

cultivate pe celule eucariote intretinute in laborator sub
forma de linii celulare continue sau semicontinue
Diferitele etape de diagnostic prin cultura virala sunt:
1.nsmnarea unei linii de celule cu proba patologica.
2. Examinarea direct zilnic: detectarea efectului
citopatic (CPE), la microscopul optic inversat.
3. Dac exista ECP: se coloreaza celulele se face frotiu
pentru detectarea incluziuni virale i alterarile
citoplasmatice i nucleare la microscopul optic.
4. marcarea imunologica specifica a virusului si citirea pe
lame microscopice a rezultatului cu microscopie optica
sau fluorescenta

Culturi de
celule
Prin comparatie, efectul
citopatic caracteristic al
unei culturi celulare
infestata cu enterovirus se
observa incluziunile
citoplasmatice si nucleul
dens impins la periferia
celulei

indicatii: Izolarea unui virus intr-o proba

biologica
Pentru a dovedi infeciozitatea virusului.
Caracterizarea fenotipul unei tulpini (rezistena la
anti-virale, de exemplu).
Beneficii: Buna sensibilitate. Cultura rmne de
referin n raport cu care toate metodele noi sunt
comparate. Este esenial s se asigure susele
initiale, folosite de exemplu n dezvoltarea de
vaccinuri (de exemplu, vaccinul antigripal se
fabrica in fiecare an). Costul acestei metode este
rezonabil
Limitri: timp de a obine rezultatul obinuit: 48
de ore la 10 zile.
Subiectivitatea citirilor : depinde de experiena
de observator .e specializate.

Cultivarea pe oua embrionate de gaina

Virusurile

se pot
izola si pe oua
embrionate de
gaina desi acum
se renunta la
aceasta metoda
in favoarea
cultivarii pe
culturi de celule

2.4.Metode de diagnostic molecular

pentru

simplitate, trei metode principale domina

de analizele de rutin:
-hibridizarea molecular i variantele sale
(hibridizare cu amplificarea semnalului i bDNA,
hibridizare pentru detectia mutaiilor n genomul
viral),
-amplificarea unei genei, sau PCR,
-secvenierea nucleotidelor.
Aplicaiile cantitative devin de asemenea curente

Metode de diagnostic molecular

Hibridizare: detectarea direct a ADN sau ARN pe

diferite suporturi (tuburi, plci, membrane) Principiul
de hibridizare molecular:
1 - Formarea unui hibrid de acid nucleic viral (ADN
sau ARN) / cu sonda specifica pentru genomului viral
cutat, pe diverse suporturi : membrana,
microplaca, tub
2 Detectare immunoenzimatica a moleculelor
hibride prin anticorpii de anti-acid nucleic dublu
catenar, sau marcajul sondei i apoi detectarea
colorimetrica, fluorescenta sau chimioluminiscenta

Hibridizare cu amplificare de semnal

- Principiul ADNului hibridizat: esantioanele de acid nucleic viral sunt

adsorbite pe un suport cu sonde ADN ramificat la care hibridizeaza sonde
de relevare.
Molecule luminescente sunt asociate sondelor moleculare de relevatie
semnalul fluorescent fiind proportional cu numarul de molecule de acid
nucleic viral adsorbit
Utilizarea simultan a mai multe sonde ramificate complementare la diferite
regiuni ale genomului viral int, permite detectarea virusurilor foarte variabil
dpdv genetic (HIV, HCV). Numrul mare de molecule luminescente
implicate permite o scadere a limitei de detecie, fr risc de contaminare
(fara amplificare a acizilor nucleici, n contrast cu tehnica PCR).

Hibridizare pe membrana si pe chipuri

Principiul diferitelor metode:

1) sonde de hibridizare moleculara
fixate pe un suport specific pentru a
detecta un virus mutant
2) dtectia imuno-enzimatica.
Sondele sunt prezente pe benzi iar
antigenele sunt fizate pe aceste
benzi de imunoblot ex : gnotiparea
HVC, mutatii ale HVB).
Microcipurile permit detectarea
nmutatiilor virusurilor. Un mare
numar de sonde asezate ordonat in
forma de sir pe suporturi de siliciu
sticla etc reprezinta o combinare de
tehnic informatice si moleculare. O
aplicatie este detectia mutaiilor la
HIV asociata cu resistenta la
medicatia retrovirala.

Genotiparea HVC prin hibridizare pe

membran dup PCR, benzile sunt
interpretate cu ajutorul unui model furnizat de
productor. n acest caz, pacientul are o VHC
genotip 1, subtipul B, mult mai uor rezistente
la anti-VHC.

3.4.3. Amplificare genica

Acizii nuleici extrasi dintro proba prin absorbie
lor pe particule de
siliciu incartcate pozitiv
si elutie urmata de
amplificare genica sau
PCR permite
recopierea unei
portiuni limitate de
genom viral pentru
amplificarea genica se
detecteaza acizii
nucleici amplificati pe
gel de agaroza sau
hibridizare moleculara
post PCR

.4.4. Secventiere nucleotidica

Metoda Sanger este folosita pentru secvenierea de
rutin.
Aceasta este un PCR, n care vom aduga
dideoxynucleotides (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP), etichetate cu un fluorocrom la amestecul
de reacie, ca de obicei.
Polimeraza ADN-ul sintetizeaz folosindu-se, n
mod aleatoriu, fie deoxynucleotide sau
dideoxynucleotide. Fiecare dat cnd un
dideoxynucleotid este ncorporat n lanul de ADN,
alungirea lanul se oprete, deoarece aceste
molecule nu permit legtura fosfodiester urmtoare.
Secvena de reacie, astfel, duce la producerea de
fragmente de ADN de toate dimensiunile disponibile
(de exemplu, un fragment de ADN de 200 de
nucleotide copiate 1 la 200). Aparatul permite
detectarea automat a fluorocromilor din aceste
fragmente de ADN separate prin electroforeza
capilara pe gel de acrilamid vertical sau n capilare
umplute cu polimer de siliciu

3.4.5. Cuantificare (estimare cantitativa)

Diferite truse de PCR

comercializate se bazeaza pe acest
principiu . Un etalon este introdus in
prelevatele de analizat, inaintea
extractiei acizilor nucleici (etalon
intern). Acest etalon este un acid
nucleic a carui extremitati sunt
identice cu secventa virusului
salbatic Acest lucru permite s
foloseasc aceeai pereche de
primeri. Prin contra, ntre capetele
la care hibridizeaz grunduri,
secvena de nucleotide difer de
cea de-slbatic de tip virus, care se
pot distinge dou produse PCR sau
prin electroforez (diferite
dimensiuni) sau prin hibridizare
dup PCR (sonde specifice diferite)
,

 PCR in timp real

Curbe de cantificare a EBV in

sangele total prin PCR in timp real :
curbele de mai sus ilustreaza
amplificarea ADN de la martorii
pozitivi la diferite concentratii (curba
etalon externa).

Metoda PCR in timp real

masoara cantitatea de molecule
de ADN produse in timpul
debutului fazei exponentiale a
reactiei
In mod schematic ADN ul produs
in timpul PCR este cuantificat prin
incorporarea unei molecule
fluorescente sau a hibridizarii cu
doua sonde specifice moleculare
ce emit o fliuorescenta speciala
Aparatele sunt echipate pentru
lectura continua in timp real a
fluorescentei emise

Metode de diagnostic molecular

Indicatiii asupra metodelor de diagnostic molecular :

Tehnici calitative : pentru demostrarea prezentei unui virus in

particular unui virus in special cand nu este cultivabil (HVC), sau care
lichidul biologic nu este adecvat pentru cultura (LCR).
Tehnici cantitative : pentru pacientii sub tratament antiviral (HIV, HVC,
CMV, HVB).
Secventiere : detectarea mutatiilor nucleotidice
- asociere cu rezistenta la antivirale (HIV, HVB),
- caracteristici ale genotipurilor de virus (HVC, HVB).
Interesante pentru ca :sunt sensibile si pot sa fie automatizate
Limite :
exista riscuri de contaminare pentru tehnica PCR.
nu se poate stabili caracterul infectios al virusului detectat.
Caracterizarea fenoticipa a tulpinii nu este posibila.
Costurile sunt inca destul de mari.

Referinte
Allain Philippon, Paris Universite V, site microbes-edu.org
http://basic.shsmu.edu.cn/kejian/microbiologie/www.microbeedu.org/etudiant/etudiants.html
Kaiser Color Atlas of medical Microbiology Thieme, 2005