Aspectul specific de cultivare i cretere a micoplasmelor pe medii artificiale n dependen de factori abiotici

Micoplasmele se cultiv n medii acelulare cu o anumit compoziie, n anumite condiii de temperatur, umeditate, pH, atmosfer etc. Unele specii pot fi cultivate n oul embrionat de gin i/sau n culturi celulare. n practic se folosesc mediile acelulare semisintetice sau chiar sintetice lichide, solide (cu agar) sau bifazice, deoarece acestea afer condiii optime pentru izolarea, subcultivarea i identificarea speciilor de micoplasme i permit o rapid difereniere a acestora de alte microorganisme. Compoziia diferitor medii este n funcie de necesarul n substane pentru cultivarea speciei respective. n primele investigaii pentru cultivarea micoplasmelor s-a folosit bulionul Martin obinuit suplimentat cu ser de cal. Ulterior au nceput s se utilizeze diferite extracte de esuturi animale ca mediu de baz. Astfel de mediu V.F. (viande-foie) a fost cultivat agentul pleuropneumoniei bovinelor. Primele tulpini T de la oameni cu uretrite negonococice au fost izolate pe un mediu preparat cu muchi cardiac bovin digerat prin tripsin. Pe mediul sanguin transparent au fost izolate o serie de tulpini de micoplasme de la oareci i obolani cu afeciuni cronice respiratorii i artrite. n mediul pe baz de infuzie de carne de pasre a fost izolat M. gallisepticum, iar n mediul Herdershee cu infuzie de cord se cultiv M. pneumoniae. Micoplasmele se cultiv bine i la suplimentarea mediului de baz cu extract de drojdie. S-a dovedit c, att sub form proaspt ct i desecat, drojdia poteneaz cultivarea majoritii speciilor de micoplasme i n special a M. pneumoniae i M. orale. Dei unele tulpini pot cultiva i fr adaosul de drojdie, n general se prefer adugarea acesteia n proporie de 10% la mediul de baz. Un alt element absolut necesar n prepararea mediilor pentru cultivarea micoplasmelor este serul sanguin de la diverse specii de animale.

Astfel serurile de cobai, viel sau bou sunt inferioare serurilor de iepure, oaie i cal i plasmei umane folosite n concentraii adecvate. Serul de porc d cele mai bune rezultate n cazul cultivrii unor specii de micoplasme de porc sau a unor tulpini aviare. Serul de curcan- n cultivarea unor tulpini umane. Teoretic, cel mai bun ser ar fi cel corespunztor speciei de animale de la care provine micoplasma respectiv cu condiia s fie lipsit de anticorpi. Unul din cele mai utilizate seruri este cel de cal. n anumite situaii, mediile obinuite sunt completate cu substane ca glucoz n proporie de 1%, uree n proporie de 0,05%, cistein- NCl n proporie de 0,5%, mucin gastric sau ADN-ARN- cte 25 mcg/ml etc., substane care mbogesc compoziia mediilor de cultivare prin aportul unor compui chimici necesari multiplicrii diferitelor specii de micoplasme. Dup mediul de fermentare a glucozei micoplasmele se mpart n: fermentative i nefermentative. n prima categorie se ncadreaz M. pneumoniae, M. fermentas, M. mycoides, Acholeplasma laidlawii i o serie de specii izolate de la psri (folosesc glucoza i o serie de alte hidrocarburi ca surs de carbon i de energie). Cel de-al doilea grup, de specii nefermentative, care cuprinde M. hominis, M. orale tip 1 i 2, M. salivarium, necesit o serie de aminoacizi pentru cultivare. Vitaminele sunt solicitate de majoritatea tulpinilor izolate de la om. Cele mai utilizate vitamine sunt acidul folic (vit. B9), pantotenatul (vit. B3), piridoxina (vit. B6) i tiamina (vit. B1). Ureaplasma este singura specie care hidrolizeaz ureea. Pentru favorizarea izolrii speciilor de micoplasme din produse ce pot fi infectate de diferite bacterii, la mediul de izolare se adaug acetatul de taliu, care este bacteriostatic pentru formele aerobe sporulate i germeni gram negativi fr a afecta cultivarea majoritii micoplasmelor. Excepie fac tulpinile de micoplasm care sunt sensibile la aciunea acetatului de thaliu. n practic acetatul de thaliu se utilizeaz n concentraie de 0,05%.

Tot n scopul inhibrii dezvoltrii diferitor bacterii, se folosete i penicilina care nu acioneaz asupra micoplasmelor. n scopul precizrii unor caractere specifice ale tulpinilor nou izolate care sa favorizeze identificarea s-a decis utilizarea unor substane ca rou fenol i albastru de metilen. Roul fenol adugat mediilor lichide n care se gsesc zaharuri evideniaz capacitatea fermentativ a unor tulpini prin trecerea de la culoarea rou spre galben (acedifierea mediului). n cazul cultivrii tulpinilor T, rou fenol evideniaz formarea de amoniu din uree prin trecerea de la culoarea galben spre rou (alcalinizarea mediului). Concentraia de rou fenol folosit n practic este de 0,002%. Albastru de metilen n concentraie de 0,2% inhib cultivarea tuturor speciilor de micoplasme izolate de la om cu excepia M. pneumoniae. Adugarea acestei substane n mediul lichid permite selectarea tulpinilor de M. pneumoniae. Cultivabilitatea micoplasmelor este condiionat de o serie de factori specifici fiecrei specii sau comuni tuturor micoplasmelor. Tabelul 3 remarc particularitile morfoculturale n dependen de mediu (lichid, solid) i aciunea parametrilor abiotici. Tabelul 3. Particularitile de cultivare a micoplasmelor pe medii artificiale n dependen de factorii abiotici
Caracteristici de cultivare Specia n mediu lichid M. fermentas Turbiditate slab sau tip ou mediul ochi, 7,6-8,0 27-40 7,6-8,0 30 Pe mediu solid Colonii rotunde de M. mycoides Acholeplasma laidlawii M. gallisepticum 7,6-8,0 37 PH mediului 7,8 t0C 27 i 40 Timp ul 3-4 zile 5-21 zile 5-21 zile 5-21 Ferment glucozei +

+ +

rmne M. gallinarium

centru dens, granular, 7,6-8,0 27-40

zile 5-21 zile 5-21 zile 2-3 zile 5-21 zile +

perfect

M. synoviae

limpede; nconjurat Ader pe de o zon suprafeele de sticl

7,6-8,0

27-40 27 i 40

M. hominis M. orale 1i 2

7,0

7,0 periferic mai puin 6,0

37

M. salivarium sau plastic dens Colonii , formnd pelicule i M. pneumoniae picturi lipsite de zona periferic, form granular ce confer un aspect de mur Colonii Ureaplasma urealyticum mrunte lipsite de zona periferic

37

2-3 zile

7-146,0-8,0 37 40 zile +

16 6,5 22-40 ore-24 zile -

Unul din cei mai importani factori pentru cultivarea micoplasmelor n mediile lichide sau solide este pH-ul. Majoritatea speciilor de micoplasm se cultiv la pH 7,6-8,0. Aa dar, pentru cultivarea M. pneumoniae pH-ul optim este ntre 6,0-8,0; pentru M. orale tip 1 i 2; i M. homonis este de 7,0, iar pentru M. salivarium

este de 6,0 ca i pentru tulpinile T care cultiv foarte bine i la pH 6,5, iar pentru M. fermentas este de 7,8. Pentru majoritatea speciilor umane de micoplasme temperatura optim de cultivare este de 37oC. Unele specii (M. hominis, M. fermentas) au putut fi cultivate la 27oC i 40oC, pe cnd altele pot crete de la 27oC pn la 40oC (M. synoiae, M. gallisepticum, M. gallinarium). A. laidlawii cultiv cel mai bine la 30oC. Tulpinile T pot crete de la 22oC pn la 40oC. Dup timpul de cultivare se atest diferene ntre unele specii de micoplasme. Astfel M. pneumoniae se deosebete de toate celelalte specii de micoplasme prin caracterul lent de cretere, ce variaz ntre 7-14-40 zile. Pe cnd tulpinile T prezint o cretere mult mai rapid, atingnd valoarea maxim dup aproximativ 16 ore-2-4 zile. Celelalte specii de micoplasme au perioade de cretere variabile: de la 2-34 zile pn la 5-21 zile. Conform perioadei lungi de incubare toate substraturile solide vor fi meninute dup inoculare n camere umede pentru a se evita uscarea mediilor respective. Un rol important l are compoziia atmosferei n care sunt incubate culturile. Astfel, majoritatea speciilor cultiv mult mai bine n condiiile n care concentraia de O2 este redus i cea de CO2 crescut. De obicei, se utilizeaz o compoziie atmosferic de 95% N2+ 5% CO2, mai rar incubaia se face n condiii de anaerobioz +5-10% CO2 sau vacuum. Cultivarea micoplasmelor n mediu lichid produce de obicei o turbiditate slab a mediului. n unele cazuri mediul poate rmne totui perfect limpede dei tulpina inoculats-a multiplicat.

Unele specii de micoplasme cultivate n mediu lichid au capacitatea de a adera pe pereii de sticl sau plastic ai vaselor de cultur i de a forma colonii sau plaje de cultur pe aceste suprafee(pelicule i picturi) Pe mediul solid n mod obinuit coloniile de micoplasme sunt rotunde i prezint un centru dens, granular, nconjurat de o zon periferic mai puin dens; este colonia de tip ou ochi. Dar coloniile unor specii au un aspect atipic. Astfel, coloniile de M. pneumoniae sunt lipsite de zona periferic, forma granular conferindu-le un aspect de mur. O morfologie aparte prezint i coloniile tulpinilor T, care pe lng dimensiunea redus, pot fi lipsite i de zona periferic. De asemenea, atipice se prezint i coloniile de M. hyopneumoniae care nu au centrul dens. Coloniile au mrimi nre 10-20 nm(tulpinileT) i 600 nm n diametru. Unele colonii izolate ating pn la 1mm n diametru i pot fi observate cu ochiul liber. Micoplasmele pot fi cultivate i n oul embrionat de gin sau n culturi celulare. Oul embrionat de gin permite multiplicarea unui numr mare de specii de micoplasme, ntre care i a M. pneumoniae, care se multiplic n special la nivelul epiteliului bronic fr a determina moarte embrionului. Se recomand folosirea oulor embrionate n vrsta de 12-13 zile i calea de inoculare intravitelin. Dup 6 zile de la inoculare, oule se sacrific i se recolteaz pulmonul i traheea embrionului. Culturile celulare s-au dovedit frecvent infectate cu diferite specii de micoplasme. Capacitatea lor de a susine multiplicarea acestor microorganisme a fost folosit pentru izolarea i cultivarea unor micoplasme. Rezultatele ncercrilor de izolare a micoplasmelor n culturi celulare au fost deseori pozitive. Astfel, chiar M. pneumoniae a fost izolat pentru prima oar n culturi celulare, iar M. fermentans este frecvent izolat pe aceste substrate.