• Examenul microscopic direct al produselor patologice recent recoltate poate

orienta diagnosticul către o infecţie fungică şi uneori poate chiar oferi indicii
importante privind etiologia acesteia prin evidenţierea unor formaţiuni sau
elemente caracteristice.
• El este obligatoriu pentru orice tip de prelevat cu excepţia sângelui şi are valoare
diagnostică intrinsecă deoarece permite confirmarea rapidă a suspiciunii de
infecţie micotică şi informarea timpurie a clinicianului, cu mult timp înainte de
pozitivarea culturii.
• Se efectuează pe prelevate în stare proaspătă, cu sau fără colorare prealabil ă
(Giemsa etc.): lavaj bronhoalveolar (după centrifugare), biopsii (frotiuri prin
amprentă), spută (după tratare cu N-acetil-cisteină), hemoculturi, prelevate
superficiale – cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale, auriculare.
• Examenul microscopic al fungilor urmărește:
 Aspectul hifelor miceliene-septate sau nu;
 Aspectul miceliului-difuz, gros, pigmentat, incolor;
• Prezența și tipul sporilor sexuati-zigospori, ascospori
 prezența corpurilor de fructificație asexuată (tipul și aspectul
conidioforilor și a sporangioforilor, modalitatea de dispunere,
 prezența și tipul unor structure particulare:rizoizi, stoloni,
scleroți.
Pentru studiul morfologiei microscopice a fungilor obținiți în urma inoculării
pe medii de cultură specific se utilizează mai multe tehnici, în funcție de tipul
acestora:
- levuri: frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, etc.)
- sau preparate proaspete (lama-lamelă) cu albastru cotton lactofenol
- preparate obținute prin tehnica scotch.

Examenul microscopic permite evidențierea caracterelor și a structurilor invizibile

cu ochiul liber și are următoarele etape:
Prelevarea;
Montarea;
Secționarea;
Colorarea.

1. Prelevare De pe substrat Detașare fragment de miceliu cu

material acul spatulat
Din cultură

Examinare la microscop Lamă sticlă + lichid de

Obectiv uscat-6x, 10x, 20x, 40x montare+lamelă
2. Montarea presupune includerea materialului fungic în soluții de montare
(Ex. Lactofenol, apă)
3. Secționarea este utilă în studiul ciupercilor fitopatogene și acelor
macroscopice
4. Colorarea se realizează cu ajutorul agenților de colorare a citoplasmei și a
peretului celular:
•Bleu-cotton-albastru de anilină
•Lacto-fucsină
•Fucsină acidă
•Bleu-cotton în acid lactic.
Produsele patologice pentru care există suspiciunea că ar conţine fungi se pot
examina microscopic prin una dintre următoarele forme:
- preparat extemporaneu între lamă şi lamelă, cu soluţie 20% KOH (scuame,
fragmente unghiale, secreţii linguale, vaginale); sensibilitatea metodei este relativ
scăzută, depinzând de abilitatea şi experienţa anterioară a examinatorului. În acest
scop, se omogenizează pe o lamă de microscopie volume egale din materialul
patologic şi soluţia clarificantă, după care se acoperă cu o lamelă, astfel încât să se
evite formarea bulelor de aer. Decelarea formaţiunilor fungice în prelevate este
mult ameliorată dacă la soluţia clarificantă se adaugă un colorant – negru clorazol,
cerneală Parker sau o substanţă fluorescentă cu afinitate pentru glicanul din
peretele fungilor (Blankophor, Calcofluor – în proporţie de 0,1%). Utilizarea
substanţelor fluorescente incumbă examinarea preparatului la un microscop cu
fluorescenţă.
- preparat extemporaneu cu soluţie 20% KOH + substanţă fluorescentă sau frotiu
colorat cu aceeaşi substanţă fluorescentă (Calcofluor, Blankophor etc.); este metoda
optimă de detecţie a fungilor în prelevate datorită unei sensibilităţi şi specificit ăţi
excelente, dar necesită microscopie în lumină ultravioletă. Câteva fragmente din
prelevatul recoltat de la pacient se
depun pe o lamă de sticlă, într-o picătură de lichid clarificant (soluţie 10-20% KOH
cu adaos de calcofluor 0,1%) care prin „digerarea” keratinei şi a celulelor somatice va
permite observarea la microscop a diverselor formaţiuni caracteristice fungilor.
După un contact de cca. 10-15 minute (eventual mai îndelungat în cazul fragmentelor
unghiale), lama se acoperă cu o lamelă şi se examinează la microscop, cu obiectivele
10, 20 şi 40, după caz. Acţiunea lichidului clarificant poate fi intensificat ă prin
încălzirea lamei la flacăra unui bec de gaz, fără însă a-l aduce la fierbere. În general,
lama se poate examina când opacitatea preparatului s-a diminuat vizibil.
- frotiu colorat Gram: pune cu uşurinţă în evidenţă filamentele, pseudohifele,
artrosporii şi blastosporii de dimensiuni mari, însă este inadecvată pentru detec ţia
celulelor levurice de dimensiuni mici – de exemplu, Candida glabrata
- frotiu pregătit pentru imunofluorescenţă prin tratare cu anticorpi monoclonali cupla ţi
cu markeri fluorescenţi (în special pentru detecţia Pneumocystis jiroveci în
prelevatele respiratorii)
- preparat extemporaneu colorat cu tuş de India: pune în evidenţă levurile capsulate
din genul Cryptococcus, în sedimentul LCR, urinar, etc.
- preparat extemporaneu cu bandă adezivă, colorat cu albastru de metilen în
lactofenol: metodă expeditivă de diagnostic tip „one-step” a leziunilor de Pityriazis
versicolor
- frotiuri obţinute prin etalare sau amprentă (pornind de la prelevate ca aspiratul
bronşic, LBA sau biopsiile) care apoi se colorează Musto sau cu calcofluor şi se
examinează în vederea decelării aspectelor particulare care ar pleda pentru o
zygomicoză, aspergiloză etc
Elementele morfologice identificabile prin examen microscopic direct sunt levurile
(burjeonate sau nu, intra- sau extracelulare, cu sau fără capsulă), fragmentele hifale,
septate sau nu, uneori ramificate, celulele fumagoide - celule cu aspect muriform,
melanizate, de 4-12 μm diametru, septate longitudinal şi transversal, granulele
(numite şi scleroţi - elemente sferice, dure, de cca. 1 mm diametru, formate la nivelul
micetoamelor prin întreţeserea densă a hifelor), rar structurile de fructificare ale unor
fungi filamentoşi.

Coloraţia cu lactofenol şi albastru de anilină (Lactophenol Cotton

Blue
Scop
Metodă destinată colorării şi evidenţierii prin microscopie a fungilor din unele
prelevate clinice şi culturi.

Echipamente
Lame şi lamele de microscopie, curate şi degresate, ansă de îns ămân ţare, m ănu şi de
protecţie, pahar Berzelius, pâlnie, hârtie de filtru, agitator magnetic.

Reactivi
Lactofenol cu albastru de anilină
Mod de lucru
1. Se etalează pe o lamă microscopică, curat ă și degresat ă o cantitate suficient ă de prob ă;
2. Se adaugă 1-2 picături soluţie de lactofenol şi albastru de anilin ă;
3. Se omogenizează uşor;
4. Se acoperă cu o lamelă şi se examineaz ă la microscop cu obiectiv uscat 10x, 20x, 40x.

Rezultatul colorării
Fungii – albastru-închis

Coloraţia Gram
Scop
Identificarea fungilor prin examenul microscopic al frotiurilor executate din diverse lichide
biologice.

Fixator
Metanol absolut

Echipamente

Lame de sticlă pentru microscopie (25/75 mm) cu un cap ăt mat, pipete Pasteur, anse de
însămâţare microbiologică, ace de inoculare, recipiente pentru depozitarea de de şeuri biologice
Mod de lucru
1. Frotiurile pot fi fixate prin încălzire sau cu metanol;
2. Frotiurile se pot usca în aer sau se menţin pe o platină încălzitoare electric ă, la
60ºC, până la uscare:
3. Dacă frotiurile sunt uscate în aer se vor trece de dou ă sau trei ori printr-o flac ăr ă.
Pentru a evita denaturarea frotiului, acesta nu se supraîncălzeşte.
4. Se lasă lama să se răcescă înainte de colorare;
5. Fixarea cu metanol previne liza eritrocitelor. De asemenea, fixarea cu metanol este
recomandată pentru toate prelevatele clinice lichide, în special pentru urină, deoarece
previne spălarea probelor în timpul colorării. Metanolul se stochează în sticle brune
cu dop etanş. O cantitate de lucru poate fi păstrată în recipien ţi de plastic, dac ă
aceasta se înlocuieşte la fiecare 2 săptămâni. Pentru fixare, se adaugă câteva picături
de metanol pe lamă, se lasă în contact timp de 1 minut, apoi se vars ă şi se las ă lama
să se usuce la aer;
6. Se inundă frotiul astfel fixat, cu soluţie de cristal violet. Se las ă în contact 60
secunde;
7. Se varsă soluţia de cristal violet şi se clăteşte lama u şor cu ap ă de robinet.
8. Se clăteşte apoi cu soluţie Lugol, timp de 3 secunde;
9. Se inundă frotiul cu soluţie Lugol şi se lasă în contact 30 secunde;
10. Se spală cu apă de robinet;
11. Se toarnă soluţie alcool-acetonă peste frotiu, într-un cap ăt al lamei, oblic, pân ă
când soluţia care se scurge la capatul opus devine clar ă. Timpul de decolorare
variază în funcţie de grosimea frotiului (în general 8-10 secunde);
12. Se spală cu apă de robinet;
13. Se inundă lama cu soluţie de safranină 0,4 %, timp de 30 secunde;
14. Se îndepărtează colorantul (safranină 0,4%) cu un jet de ap ă de robinet ;
15. Se usucă lama în aer, în poziţie verticală, iar apoi se şterge reversul acesteia cu
un şerveţel îmbibat în alcool sau acetone.

Rezultatul colorării
Fungii sunt Gram-pozitivi, deci se vor colora în violet.

Reactivi
Soluţia de cristal violet
Soluţia iod-iodurată Gram (soluţia Lugol)
Soluţia de alcool-acetonă
Safranină O 0,4 %
Coloraţia May-Grunwald-Giemsa (MGG)
Scop
Este o coloraţie de elecţie pentru depistarea intramacrofagică a formei levurice
aparţinând speciei Histoplasma capsulatum var. capsulatum.
Fixator
Metanol absolut
Echipamente
Lame şi lamele pentru microscopie, curate şi degresate, sticlărie de laborator,
hârtie de filtru.
Reactivi
Soluţia de colorare I (May- Grünwald)
Soluţia de colorare II (Giemsa)
Soluţia tampon Sörensen pH 6,8
Mod de lucru
1. Se fixează frotiurile în metanol absolut, timp de 30 secunde;
2. Se îndepărtează metanolul;
3. Se aplică soluţia de colorare I proaspăt diluat ă 1:1 cu solu ţie tampon, timp de 5
minute (lama va fi poziţionată orizontal sau introdus ă într-un pahar);
4. Se transferă lamele fără spălare prealabil ă în solu ţia de colorare II diluat ă recent cu 9 p ăr ţi
de soluţie tampon, pentru 10-15 minute;
5. Se imersează lamele în soluţie tampon pentru îndep ărtarea colorantului;
6. Se spală lamele cu apă de robinet din abunden ţă;
7. Se transferă într-un pahar cu apă pentru 2-5 minute;
8. Se usucă apoi într-o poziţie oblică. Nu se usucă prin ştergere;
9. Se poate monta o lamelă, însă nu este neapărat necesar.
Rezultatul colorării
Fungii – nuanţe de roz, albastru, violet

Coloraţia Musto
Scop
Punerea în evidenţă a elementelor fungice prin examenul microscopic al frotiurilor
Echipamente
Lame şi lamele pentru microscopie, curate şi degresate, sticlărie de laborator, plită
electrică, vase din sticlă Pyrex
Reactivi
Metenamină
Acid cromic 5%
Borax 5%
Bisulfit de sodiu 1%
Clorură de aur 0,2%
Tiosulfat de sodiu 2 %
Verde luminos 1%
Mod de lucru
1. Fixarea: se încălzeşte acidul cromic 5% pân ă la 65ºC pe o plit ă electric ă şi apoi se
imersează imediat lamele timp de 1 minut;
2. Clătire de două ori în apă distilată ;
3. Se introduc preparatele în bisulfitul de sodiu, timp de 1 minut;
4. Se clătesc lamele în apă distilată
5. Impregnarea argentică: soluţia de lucru se transfer ă într-un vas de sticl ă Pyrex şi apoi se
imersează lamele. Se încălzeşte rapid la 90-95ºC timp de 2-3 minute: solu ţia î şi schimb ă
culoarea de la cenuşiu la negru, iar lamele devin maro;
6. Clătire de trei ori în apă distilat ă;
7. Lamele se introduc în clorură de aur 0,2% timp de 1 minut;
8. Clătire cu apă distilată;
9. Imersare în tiosulfat de sodiu, timp de 1 minut;
10. Clătire cu apă distilată;
11. Contra-colorarea cu verde luminos, timp de 1 minut;
12. Clătire cu apă de robinet, timp de 2 minute;
13. Deshidratare în etanol 95% câteva secunde, apoi în alcool absolut, de dou ă ori
timp de câteva secunde;
14. Se introduc lamele în xilen sau metil-ciclohexan câteva secunde, pentru clarificare;
15. Se montează lamele în Eurik.
Rezultatul colorării
Fungii – culoare brun-negriciosă
Fondul – verde
 Fig. 1. Frotiu secreţie vaginală; col. Fig.2. Frotiu măduvă osoasă hematogenă;
Gram, x 400 Col. May-Grunwald-Giemsa, x 400

Fig. 4. Preparat extemporaneu

Fig.3. Frotiu hemocultură; cu
necolorat, x 900. bandă adezivă; lactofenol cu
Preparatul extemporaneu cu lactofenol şi albastru de anilină (levuri)
•Este o metodă mai rar utilizată pentru studierea morfologiei levurilor, îns ă este uneori
preferată pentru expeditivitatea sa, mai ales în cazul levurilor din primoculturi.
•În acest scop, pe o lamă de microscopie curat ă şi degresat ă, se depune o pic ătur ă de lactofenol
cu albastru de anilină în care se va suspensiona apoi cu mi şc ări cât mai fine, cu ajutorul unei
anse microbiologice, o mică porţiune din colonia levuric ă de studiat.
•Suspensia astfel obţinută se acoperă cu o lamelă şi se examineaz ă la microscop (x10, x20,
x40, x100 – după caz). Pentru reuşita preparatului, este important ă cantitatea de material
biologic prelevat din colonie; aceasta trebuie s ă fie cat mai redus ă, astfel încât densitatea
suspensiei obţinute să fie mică.
Preparatul extemporaneu cu lactofenol şi albastru de anilină (fungi filamentoşi)
Se obţine parcurgând următoarele etape:
- se depune o picătură de lactofenol pe o lam ă de microscopie, curat ă şi degresat ă;
- se prelevează cu ajutorul unui ac sau al unei microspatule metalice un fragment de
dimensiuni milimetrice din colonia de examinat, se etaleaz ă în pic ătura de lactofenol şi se
dilacerează cu mişcări fine miceliul, utilizând dou ă ace;
- se acoperă cu o lamelă curată, se preseaz ă, se înc ălze şte u şor la flac ăr ă pentru a obţine un
film cât mai fin de lactofenol şi a elimina eventualele bule de gaz;
- se examinează la microscop, folosind succesiv obiectivele x10, x20, x40, eventual x100;
- în cazul în care se doreşte păstrarea preparatului în lamotec ă, pentru conservarea sa, acesta se
poate luta.
Preparatul extemporaneu cu bandă adezivă (tip scotch)
În acest caz, prelevarea structurilor fungice de la nivelul coloniilor se face cu ajutorul unui
fragment de bandă adezivă transparentă (tip scotch), cu dimensiuni de 1,0-1,5 x 2,5-3,0
cm, cu care se amprentează marginea coloniei. Acest fragment de band ă adeziv ă se lipe şte
apoi pe o lamă pe care s-a etalat în prealabil o pic ătur ă de lactofenol.Op ţional, peste band ă
se pot etala o nouă picătură de lactofenol şi apoi o lamel ă, în vederea amelior ării
vizibilităţii la examinarea microscopic ă ulterioar ă. În cazul coloniilor care sporuleaz ă
intens (Aspergillus spp., Penicillium spp. etc.) se recomandă pregătirea a 2-3 preparate cu
bandă adezivă din acelaşi loc – prima va fixa sporii, iar urm ătoarele vor recolta
conidioforii, astfel încât prin examinarea ulterioar ă s ă fie surprinse toate aspectele utile
încadrării taxonomice.

Fig.5. Obţinerea preparatului

extemporaneu cu bandă adezivă
O altă variantă a tehnicii presupune etalarea fragmentului de band ă adeziv ă pe o lamel ă cu o
picătură de lactofenol, adăugarea peste aceasta a unei alte pic ături de colorant şi apoi a lamei
de microscopie. Preparatul se roteşte apoi cu 180° pentru a-l aduce în pozi ţia de examinare.
Prin acest procedeu, claritatea imaginii este maxim ă datorit ă faptului c ă între ochiul
examinatorului şi structurile fungice se interpune doar lamela, nu şi banda scotch ca în
tehnicile anterioare.

Lutarea preparatelor extemporanee

Etanşarea sau lutarea preparatelor este necesar ă pentru a evita evaporarea lichidului de
montare. Suprafeţele lamei şi lamelei, pe care se aplic ă substan ţele de etan şare, trebuie s ă
fie perfect uscate şi curate. Substanţele folosite la etan şare nu trebuie s ă reac ţioneze cu
lichidul de montare, să fie impermeabile, elastice, persisente şi s ă adere de suprafa ţa sticlei.

Răşinile naturale
Se pot folosi pentru lutare colofoniul, guma arabic ă, şerlacul, balsamul de Canada.

Lacul pentru unghii este cel mai utilizat la etanşarea preparatelor deoarece se usuc ă repede
şi se manipulează uşor. Se îndepărtează excesul de lichid de montare de pe lamă şi lamelă,
prin ştergere cu un fragment de hârtie de filtru. Cu un penson se aplică un strat subţire de
lac peste marginea lamelei şi suprafa ţa lamei din imediata apropiere a acesteia. Se las ă s ă
se usuce, apoi se poate stoca.
Fig.6. Lutarea preparatelor extemporanee
Bibliografie selectivă
1. Bazgan O (1999) - Diagnostic de laborator şi igiena alimentelor de origine animală; Ed. Moldogrup;
Iaşi.
2. Buiuc D, Neguţ M (1999) - Tratat de microbiologie clinică; Ed. Medicală; Bucureşti.
3. Coman I, Mareş M (2000) - Micologie medicală aplicată; Ed. Junimea; Iaşi.
4. Constantinescu O (1974) - Metode şi tehnici în micologie; Ed. Ceres; Bucureşti.
5. Golăescu M (1997) - Diagnosticul şi tratamentul micozelor interne ; Ed. Viaţa Medicală Românească;
Bucureşti.
6. Harris J (2000) - Safe, low-distortion tape touch method for fungal mounts; J Clin Microbiol;
38(12):4683-4684.
7. Hoog G S de, Guarro J, Gené J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical fungi; 2nd edition;
Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.
8. Mareș M (2007)-Tehnici de laborator în micologia medicală, Editura Pim, Iași.