In medicina veterinara, a avea mijloace biologice de diagnostic care sa fie usor de executat, sa fie reproductibile, sensibile, precoce si specifice,

constituie o necesitate de prim ordin. In general, metodele specifice de diagnostic de laborator in parazitoze, se clasifica asfel:

metode directe, care constau in identificarea si izolarea parazitului; metode indirecte, care cuprind reactiile serologice si alergice.

I. METODE DIRECTE 1. Examene coproparazitologice Metoda Willis Tehnica: 3-5g fecale se mojareaza cu o solutie suprasaturata de Na l, amestecul se strecoara intr-un pa!ar "illis astfel incat sa formeze la desc!iderea pa!arului un menisc convex, si se aseaza lama. #e lasa in repaus $%-3% minute apoi se aplica lamela pe lama si se examineaza la microscop cu obiectiv &%, $%. Indicatii: concentrarea sporoc!isturilor, ooc!isturilor, c!isturilor de sporozoare, oncosferelor, oualor de nematode '&(. Metoda Willis modificata Tehnica: In primul timp se efectueaza metoda "illis. In timpul al doilea, se indeparteaza $)3 din supernatant, iar peste sediment se aduga apa de robinet si se omogenizeaza. *ic!idul se trece in tuburi de centrifuga si se centrifug!eaza la &5%% rpm timp de $-3 minute. #e indeparteaza supernatantul si sin sediment se fac preparate intre lama si lamela. Indicatii: #e depisteaza in plus fata de metoda "illis formatiunile parazitare grele + oua de trematode, unele oncosfere, oua de acantocefali. Metoda sedimentarii active Tehnica: #e mojareaza 3-5g fecale cu apa de robinet apoi suspensia se strecoara in tuburi de centrifuga. #e centrifug!eaza la &5%% rpm timp de $-3 minute. #e indeparteaza supernatantul si din sediment se fac preparate intre lama si lamela. #e examineaza la microscop cu obiectiv &%. Indicatii: oua de trematode, oncosfere, oua de acantocefali. Metoda McMaster Principiu: ,lementele parazitare dispersate intr-o solutie suprasaturata de Na l, floteaza pe suprafata camerelor de numarat, unde vor fi numarate si exprimate per gram de fecale '-./(. Tehnica: In cilindrul cotat se introduce solutie suprasaturata de Na l pana la prima cotatie a pa!arelului 0c0aster, apoi cu o pensa se adauga fecalele, pana cand nivelul lic!idului ajunge la cotatia a doua '1 $g(. #e toarna continutul intr-un mojar, se mojareaza si se strecoara intrun pa!ar. #e omogenizeaza bine, apoi cu o pipeta se etaleaza doua camere ale lamei

0c0aster, astfel incat sa fie umplute complet si sa nu contina bule de aer. .entru flotarea elementelor parazitare, lamele se aseaza pe o suprafata orizontala, unde se mentin circa 5 minute, dupa care se trece la efectuarea numararii le microscop. Numararea elementelor parazitare se face separat pentru fiecare specie, urmarind liniatura retelei existente pe fiecare camera. Numarul de oua se inmulteste cu 5% si se obtine cifra -./. Indicatii: 2precierea intensitatii infestatiilor cu oua usoare de nematode, ooc!isturi, c!isturi de balantidium. Metoda Henri son Tehnica: #e intinde frotiul din fecale sau amprente din intestin, se usuca la temperatura camerei. #e fixeaza frotiul in alcool metilic 345 timp de $-5 minute, se coloreaza cu carbol fuxina $%-3% minute, se spala cu apa de robinet, diferentiere cu #-$67 'concentratie %,$5&%5(, timp de $%-4% secunde, spalare cu apa de robinet, recolorare cu verde malac!it 55, spalare, uscare. #e examineaza frotiurile cu obiectiv &%%, cu ulei de imersie. Indicatii: Identificarea lui r8ptosporidium spp. riptosporidiile sunt de 3-4 microni rosii, pe fundalul verde al frotiului. Metoda !lagg Tehnica: #e mojareaza &g fecale cu 3 ml solutie fixatoare 'alcool absolut, formol 395, glicerina, apa distilata(. #e filtreaza intr-un tub de centrifuga peste care se adauga & ml eter etilic, se omogenizeaza. #e centrifug!eaza & minut la &5%% rpm. :in sediment se adauga o picatura pe o lama peste care se adauga o picatura de solutie *;gol. Indicatii: Identificarea flagelatozelor digestive din genul /iardia. ". Metode larvo#elmintoscopice Metoda !aermann Tehnica: #e toarna apa usor incazita in aparatul <aermann 'sita, palnie, furtun, clema 0or!( peste proba de fecale '5-&%g(, astfel incat sa acopere complet masa de fecale. #e lasa in repaus $7 ore, interval in care larvele se desprind din masa de fecale si sedimneteaza. =ecoltarea se face pe o lama recuperand primele $-3 picaturi. ,xaminarea se poate face fara a aplica lamela daca lic!idul este clar sau cu lamela daca lic!idul contine reziduri. #e examineaza ci obiectiv &%. Indicatii: strongilatoze pulmonare la rumegatoare si carnivore. Metoda $a%da ,ste o metoda ce se preteaza la examenul coproscopic, la speciile de animale ce elimina crotine: oi, capre, iepuri. Tehnica: #e aseaza intr-o sticla de ceasornic 3-5 crotine, peste care se aduga apa calduta pana ce le acopera. #e lasa in repaus &5-$% minute, apoi cu o pensa se indeparteaza cu grija crotinele. #e examineaza continutul direct din sticla de ceasornic cu obiectiv &%.

Indicatii: In diagnosticul nematodozelor pulmonare 'dictiocauloza, protostrongilatoza, mulerioza(. &. Examen'l parazitologic al sangel'i + se face cu scopul evidentierii parazitilor extracelulari 'in plasma( sau intracelulari 'intraeritrocitari(. Examen'l sangel'i in stare proaspata #e poate face in doua moduri: in picatura strivita sau in picatura suspendata. Indicatii: 2mbele metode sunt recomandate pentru examinarea parazitilor extracelulari 'mobili( si mai exact pentru >r8panosoma la cabaline sau :irofilaria la canide, cabaline, bovine. ,xamenul sangelui in frotiuri fixate si colorate 0a8-/run?ald-/iemsa Indicatii: pentru evidentierea parazitilor intracelulari 'ex. <abesia, >!eilleria( sau a celor extracelulari 'ex. *esc!mania, >oxoplasma, 0icrofilaria, >r8panosoma(. oloratia 0a8-/run?ald-/iemsa: colorare cu solutie 0a8-/run?ald, 3 minute, cu numar cunoscut de picaturi; se aduga apa distilata neutra, & minut, cu acelasi numar de picaturi, apoi se indeparteaza. #e introduce frotiul in baie /iemsa timp de $%-3% minute. @rotiul se spala sub jet de apa redus, se usuca si se examineaza cu obiectiv de imersie '$(. (. Examen'l direct )ntre lama *i lamela+ se practica cu precadere in infectia experimentala, pentru controlul densitatii parazitilor din lic!idul ascitic, sau pentru controlul prezentei c!isturilor de la nivelul tesutului muscular sau al tesutului nervos. In mod obisnuit, din diverse produse patologice ca sange, sediment din * =, lic!id din camera anterioara a oc!iului, saliva, secretii oculare, punctat !epatic, splenic, muscular, ganglionar, sau din substanta cerebrala se pot efectua urmatoarele metode: ,. -roti' sa'.si amprenta de organe 'se coloreaza 0a8-/run?ald-/iemsa(; 4. #ectiuni !istologice 'se coloreaza 0a8-/run?ald-/iemsa(; /. 0ecti'ni #istologice 'se coloreaza 0a8-/run?ald-/iemsa(; 1. Inoc'lare intraperitoneala la soarece. 0etodele directe prezinta aceleasi avantaje ca si cele indirecte, la care se mai adauga dificultatile legate de timpul destul de lung pana la obtinerea unui rezultat 'in cazul inocularii la animal(, posibilitatile de confuzie cu alti germeni asemanatori, ca si faptul ca se pot obtine rezultate fals negative in cazurile in care parazitii sunt in numar mic in tesutul prelevat pentru examinare sau inoculare. .entru diagnosticul in viata s-au imaginat metode de imbogatire din preparatele bioptice. #e recurge in mod frecvent la izolarea parazitului la soareci. In acest caz este necesar a se avea in vedere posibilitatea unei infectii spontane inaparente a animalului si de aceea este

indicat a se asigura inainte de inoculare ca animalul este indemn, prin efectuarea unei reactii serologice. 2. Reactia de polimerizare in lant '.. .=. - pol8merase c!ain reaction(. :iagnosticul molecular consta in evidentierea prin te!nica . = a 2:N-ului parazitar, utilizandu-se ca primeri secvente de 2:N specifice. 0etoda a fost folosita cu succes pe sange periferic, lic!id cefalora!idian, lic!id amniotic, tesut cerebral, corp vitros, umoare apoasa, lavaj bron!oalveolar si urina '3(. 0etodele de extragere a 2:N-ului se bazeaza mai ales pe o fragilizare fizica sau c!imica a peretelui formatiunii parazitare. >ratamentele fizice sunt in general sonicarea, alternanta ing!et-dezg!et si agitarea cu perle de sticla. >ratamentele c!imice constau in incubarea ooc!isturilor in solutii enzimatice 'proteinaza A sau medii conventionale pentru dec!istarea sporozoitilor( sau cu compusi care perturba integritatea peretilor '!ipoclorit de sodiu, cetiltrimetil amoniu bromid(. 2ceasta prima etapa, obligatorie, este urmata printr-un timp de extractie si de purificare a 2:N-ului prin metode clasice. II. METODE I3DIRECTE 1. Im'noflorescenta indirecta 4I.-.I.5. =eactia de imunoflorescenta indirecta consta in decelarea anticorpilor anti-parazitul cercetat prin vizualizarea complexelor antigen-anticorp, cu ajutorul unei anti-imunoglobuline de specie cuplata cu o substanta fluorescenta '@I> (, atunci cand serul de cercetat este pus in contact cu antigenul. .rincipiul metodei: Barianta indirecta a imunofluorescentei are ca si principiu cuplarea anticorpului marcat fluorescent 'antiimunoglobulina de specie( cu anticorpul specific fata de antigen, si vizualizarea efectului fluorescent la microscopul prevazut cu lampa cu ultraviolete. Interpretarea rezultatelor: lamele se citesc la microscopul prevazut cu lampa CB; se considera pozitive probele in care toti tac!izoitii sunt fluorescenti pe toata suprafata lor si nu doar in zonele apicale; se considera ca reactii dubioase acele situatii in care polurile apicale ale tac!izoitilor prezinta fluorescenta, aceasta lipsind insa in restul invelisului tac!izoidal si reactii negative in absenta fluorescentei '@ig &(. -ig. 1 6 Im'noflorescenta indirecta 6 interpretarea rez'ltatelor ". Test'l de 7gl'tinare modificat 4M.7.T.5 0etoda 02> permite identificarea anticorpilor specifici de tipul Ig/ anti-parazitul de cercetat in serul tuturor speciilor de animale, intrucat nu presupune utilizarea unor anticorpi specifici marcati enzimatic. Interpretarea rezultatelor: citirea se face la o susa de lumina 'transluminator( pe camp intunecat. Bor fi considerate pozitive acele probe si dilutii la care antigenul este depus pe fundul godeului sub aspect umbeliform si ocupa cel putin 5%5 din fundul godeului; probele in care antigenul a sedimentat intr-un singur punct sub forma unui buton sunt considerate negative '@ig. $(.

-ig. " 6 Interpretarea rez'ltatelor M.7.T. &. Metoda im'noenzimatica E8I07 4Enz9me 8in ed Imm'no 0or:ent 7ssa95 2ceasta metoda poate fi definita ca o succesiune de reactii antigen-anticorp, ultima dintre acestea fiind relevata printr-o reactie enzimatica cu sc!imbarea culorii unui cromogen. 0etoda furnizeaza combinatia unica de sensibilitate, specificitate si aplicabilitate practica pentru detectia unor antigene sau a anticorpilor. ,ste utilizata in doua aplicatii majore: pentru detectia)confirmarea unui agent patogen sau pentru detectia)evaluarea statusului imun umoral 'prezenta anticorpilor, titrul acestora(. :ar aplicabilitatea te!nicii ,*I#2 nu se opreste aici, ea fiind utila in diverse situatii cum ar fii testarea postinfectioasa, postvaccinala sau dupa expunerea la un agent patogen. In functie de complexitatea variantei te!nice 'utilizarea de anticorpi monoclonali, anticorpi de captura, antigene recombinate, combinare cu te!nicii legate de acizii nucleici + !ibridizare cu sonde de competitie, amplificare prin . = etc(, exista teste tip ,*I#2 destinate evaluarii imunitatii mediate celular, dar acestea au o utilizare mai restransa. 0ajoritatea truselor ,*I#2 disponibile comercial si utilizate in laboratoarele de diagnostic sunt destinate evaluarii imunitatii umorale, iar in cadrul acesteia cel mai frecvent pentru detectia imunoglobulinelor din clasa Ig/ 'anticorpi serici, anticorpi maternali, anticorpi din galbenusul de ou(. 0etoda ,*I#2 cunoaste mai multe variante te!nice:

E8I07 ; varianta directa

2re ca scop identificarea)detectia antigenului sau anticorpului. 2ntigenul legat la placa recunoaste si fixeaza anticorpul cuplat cu enzima care descompune substratul specific,oxidDnd cromogenul care se coloreaza. Intensitatea acesteia se masoara la un spectrofotometru, la o lungime de unda adecvata cromogenului si se exprima in unitati densitate optica ':-(. 2ceasta varianta se utilizeaza ca test de control pentru antigenul de captusire 'daca se foloseste un conjugat standardizat( sau pentru controlul conjugatului 'daca se foloseste un antigen de captusire standard(. 2nticorpul legat la placa recunoaste si fixeaza anticorpul cuplat cu enzima, restul, desfasurDndu-se la fel. 2ceasta varianta se foloseste pentru controlul conjugatului imunoenzimatic.

E8I07 ; varianta indirecta

,ste una dintre cele mai utilizate variante te!nice si are ca scop identificarea)detectia anticorpilor. 2ntigenul legat la placa 'antigen de captura( recunoaste si fixeaza anticorpii din proba de cercetat. 2cestia, la rDndul lor, recunosc si fixeaza anticorpii anti-anticorpi cuplati cu enzima 'conjugatul imunoenzimatic( care descompune substratul specific producDnd oxidarea unui cromogen ce isi sc!imba culoarea. Intensitatea acesteia se masoara la un spectrofotometru, la

o lungime de unda adecvata cromogenului si se exprima in :-. En acest caz, exista o relatie directa intre cantitatea de anticorpi din proba si valoarea :

E8I07 ; varianta 0and<ic# 4capt'ra de antigen5

2re ca scop identificarea)detectia antigenelor. 2nticorpul legat la placa 'anticorp de captura( recunoaste si fixeaza antigenul din proba de cercetat. 2cesta, la randul lui, recunoaste si fixeaza un al doilea anticorp anti-antigen 'preparat pe alta specie( cuplat cu enzima 'conjugatul imunoenzimatic( care descompune substratul specific producand oxidarea unui cromogen ce isi va sc!imba culoarea. *a fel ca si in cazul metodelor precedente se citesc densitatile optice, valoarea lor avDnd o relatie directa cu cantitatea antigenului din proba.

E8I07 ; varianta D':l'6sand<ic# 4capt'ra de complex antigen6anticorp5

#copul acestei variante este detectia)identificarea antigenelor. 2nticorpul legat la placa recunoaste si fixeaza antigenul din proba de cercetat. 2cesta recunoaste si fixeaza un al doilea anticorp anti-antigen 'preparat pe alta specie( care la rDndul lui reactioneaza cu anticorpul anti al doilea anticorp cuplat cu enzima 'conjugat imunoenzimatic(. .rin descompunerea substratului specific se produce oxidarea unui cromogen ce isi sc!imba culoarea. itirea si interpretarea rezultatelor se face identic, mentinandu-se relatia directa intre cantitatea de antigen din proba si valoarea :-.

E8I07 de competitie

#copul te!nicii este identificarea)cuantificarea antigenelor)anticorpilor. 2ntigenul)anticorpul de testat intra in competitie cu un antigen)anticorp de referinta pentru recunoasterea si fixarea la reagentul de captura #e pot distinge trei modele:

.entru detectia anticorpilor cu antigen de referinta, in care anticorpul de captura si cel din proba de testat intra in competitie pentru legarea unui antigen de referi .entru detectia anticorpului, in care anticorpul din serul de cercetat intra in competitie cu anticorpi de referinta pentru legarea la antigenul de captura; .entru detectia antigenului, in care antigenul de testat intra in competitie cu un antigen de referinta pentru legarea la anticorpul de captura;

Interpretarea rezultatelor prin ,*I#2 de competitie se realizeaza diferit fata de variantele te!nice enuntate anterior. Intrucat conjugatul recunoaste numai reagentul de referinta, legarea reagentului de testat la cel de captura opreste dezvoltarea reactiei imunoenzimatice propriuzise. 2ceasta inseamna ca valorile :- vor fi mici la probele pozitive si mari la cele negative, deci semnalul inregistrat de spectrofotometru va fi invers proportional cu concentratia antticorpilor)antigenelor din proba de cercetat.

2ceasta te!nica se foloseste in diagnosticul bolilor infectioase si parazitare, precum si pentru detectia de micotoxine, vitamine, !ormoni, substante dopante '7(.