II

1.Efectuarea unui frotiu din produs patologic

2. Efectuarea unui frotiu din cultura bacteriana

 Frotiuri din p.p. cu consistență lichidă sau din culturi în mediu de

cultură lichid 
 flambăm lama (o trecem de 2-3 ori prin flacăra becului Bunsen și o
așezăm cu partea flambată în sus pe stativul din trusa de colorație);
 sterilizăm ansa bacteriologică și așteptăm să se răcească;
 prelevăm aseptic p.p./cultura și depunem în centrul lamei;
 întindem prin mișcări de “hașurare”, pe axul lung al lamei p.p./cultura, în
strat cât mai subțire, fără a ne apropia de marginile lamei (scădem riscul
de contaminare);
 lăsăm lama să se usuce, pe un alt stativ, lângă becul de gaz;
 fixăm frotiul prin căldură (îl trecem prin flacără cu partea opusă de 3 ori);
 suntem gata să începem procesul de colorare.
4. 4. 2. Frotiurilor din p.p. cu consistență solidă sau din culturi în
mediu de cultură solid 
 flambăm lama (ca la 4. 4. 1.);
 depunem în centrul lamei o picătură de SSF sau AD;
 sterilizăm ansa bacteriologică și așteptăm să se răcească;
 prelevăm aseptic p.p./un fragment din colonie și depunem produsul în
picătura de fluid de pe lamă;
 folosim ansa pentru a omogeniza p.p./fragmentul din colonia de interes
foarte bine (în așa fel încât să rezulte o picătură tulbure omogen);
 întindem prin mișcări de “hașurare”, pe axul lung al lamei p.p., în strat cât
mai subțire, fără a ne apropia de marginile lamei;
 lăsăm frotiul să se usuce lângă flacără;
 fixăm frotiul prin căldură (îl trecem prin flacără cu partea opusă de 3 ori);
 suntem gata să începem procesul de colorare.

3.Colorarea frotiurilor fixate prin tehnica ALBASTRU DE METILEN

Examenul frotiului colorat cu albastru de metilen relevă informații

de bună calitate privind citologia frotiului Este o colorație de uz
general, fiind folosită alături de colorația Gram pentru a oferi o
imagine de ansamblu a frotiului.
 fixarea frotiului se face prin căldură
 acoperim frotiul cu soluție A.M., 3-4 minute; spălăm cu apă distilată;
 așezăm frotiul în stativ pentru uscare;
  examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.
Fiind o colorație simplă, în care se utilizează un singur colorant,
vom putea observa celule eucariote (epitelii pavimentoase, leucocite,
limfocite, etc.) cât și microorganisme (coci, bacili) colorați în albastru. 
4. Colorarea frotiurilor fixate prin tehnica GRAM

componentele necesare pentru efectuare colorației

 fucsină diluată
 amestec alcool-acetonă

Pașii care trebuie urmați pentru efectuarea colorației:

 fixarea frotiului se face prin căldură, trecând lama de 3 ori prin flacăra
becului Bunsen (cu partea opusă frotiului);
 acoperim frotiul cu violet de metil, 1-3 minute; scurgem colorantul;
 acoperim frotiul cu lugol (fixator), 1-3 minute; îndepărtăm lugolul;
 acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă, rapid, 7-8 secunde;
 spălăm insistent cu apă distilată;
 acoperim frotiul cu fucsina diluată pentru 1 minut; spălăm cu apă distilată;
 așezăm frotiul în stativ pentru uscare;
 examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.
Colorația Gram este cea care oferă informații privind structura
microorganismelor. Nucleul și citoplasma celulelor eucariote sunt
colorate în roșu
 celulele cu citoplasmă bogată roșu-pal și nucleu cu dimensiuni reduse, sunt
epitelii pavimentoase. 
 celulele cu citoplasmă relativ restrânsă, cu un nucleu de dimensiuni
considerabil mai mari, polilobate, cu multiple septuri fine, sunt leucocite.
Microorganismele sunt colorate, în funcție de structura lor:
 violet – bacterii Gram pozitive;
 roz-roșu – bacterii Gram negative.

Bacteri                 Gram pozitivi Gram negativi

i

coci stafilococi, streptococi, pneumococi meningococi,

gonococi

bacili b. cărbunos, b. tetanic, b. botulinic, bacilii enterobacterii

gangrenei gazoase

5. . Colorarea frotiurilor fixate prin tehnica ZIEHL NEELSEN

Este o colorație utilă în identificarea prezenței de bacili acid-alcool rezistenți (BAAR).
Componentele necesare pentru efectuare colorației:
 fucsină bazică nediluată
 amestec acid-alcool
Pașii care trebuie urmați pentru efectuarea colorației:
 punem frotiul uscat și fixat prin căldură pe un suport situat deasupra tăviței de
colorare; acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată;
 trecem becul de gaz aprins pe sub lamă, până la emiterea de vapori;  
 pe parcursul a 10 minute repetăm de 3 ori operația de încălzire a lamei până la
emiterea de vapori; adăugăm colorant, la nevoie;
 spălăm insistent cu apă distilată;
 adaugăm amestecul decolorant acid-alcool, 2-3 minute; spălăm cu apă distilată;
 recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut; spălăm cu apă distilată;
 așezăm frotiul în stativ pentru uscare;
 examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.
Microorganismele BAAR sunt roșii, în timp ce cele non-AAR sunt albastre.
Celulele eucariote sunt și ele colorate în albastru. 

6. INSAMANTAREA IN MEDIU LICHID

• -sterilizarea ansei bacteriologice
• -scoaterea dopului eprubetei cu pp cu degetul 5 de la mana dr.,
• -flambarea gurii eprubetei
• -incarcarea buclei ansei cu produs patologic (pp)
• -flambarea gurii eprubetei cu pp, punerea dopului prin rasucire, asezarea ei in stativ
• -scoaterea dopului eprubetei cu mediul lichid, flambarea gurii acesteia, descarcarea ansei
in mediul lichid, flambarea gurii eprubetei cu mediu, punerea dopului, asezarea ei in stativ
• -sterilizarea buclei ansei la baza flacarii, apoi oblic in flacara pt aducerea la incandescenta
a firului ansei si flambarea port-ansei
• -ansa se sterilizeaza obligatoriu inainte si dupa ce am lucrat cu ea.
• -mediul insamantat se pune in termostat pt dezvoltarea culturii.
7.INSAMANTARE PE GELOZA INCLINATA

• -Sterilizarea ansei bacteriologice (aducere la incandescenta a firului ansei si flambarea port-ansei),

• -Scoaterea dopului eprubetei cu pp cu degetul 5 de la mana dr., flambarea gurii eprubetei,
introducerea ansei sterile fara sa atingem peretii sau gura eprubetei, racirea in partea superioara a
pp, incarcarea buclei ansei cu pp, scoaterea ansei fara sa atingem gura sau peretii eprubetei,

• -flambarea gurii eprubetei cu pp, punerea dopului prin rasucire, asezarea eprubetei cu pp in stativ
• -scoaterea dopului eprubetei cu geloza inclinata, flambarea gurii acesteia, introducerea ansei
incarcate cu pp pana la baza tubului
 • -hasurarea unui traseu „in zig-zag” cu ansa pe suprafata gelozei inclinate de la baza spre gura,
flambarea gurii eprubetei insamantate si punerea ei in stativ ( ulterior la termostat pt dezvoltarea
culturii), si sterilizarea ansei bacteriologice la flacara ( bucla la baza, apoi firul, oblic, la incandescenta)

8.Insamantarea „in pentagon deschis” pornind de la un produs patologic (pp) adus in

laborator se desfasoara langa becul de gaz, in urmatoarele etape:

-sterilizarea ansei bacteriologice -luam eprubeta cu pp in mana stg., scoatem dopul cu

degetul 5 de la mana dr., flambam gura eprubetei, introducem ansa, racim in partea
superioara, incarcam din profunzime, scoatem ansa fara sa atingem peretii ca si la
introducere, flambam gura eprubetei, punem dopul prin rasucire,asezam eprubeta in stativ
-luam placa Petri cu mana stg., cu mediul spre podul palmei, cu degetul aratator stg.
Indepartam capacul pe masa si trasam cu bucla ansei prima latura a pentagonului deschis
prin cateva striuri paralele, din exterior catre interiorul placi
-inchidem placa si sterilizam ansa
-reluam procedura de sterilizare a ansei, apoi o racim pe mediul de cultura in centrul placii
- dupa ce am deschis capacul ca mai inainte
- -trasam a doua latura a pentagonului intersectand-o pe prima prin cateva striuri paralele
-sterilizam din nou ansa si procedam ca si pana acum trasand cinci laturi, dar fara sa atingem
ultima latura de prima,
-deci vom schita un pentagon deschis incarcand ansa o singura data si o sterilizam dupa
fiecare latura trasata
-placa se va pune la termostat si va fi examinata la 24-48 ore
-vom constata ca pe ultima latura s-au obtinut colonii izolate ceea ce ne va permite sa
repicam (insamantam) o astfel de colonie izolata si sa obtinem cultura pura = germeni cu
aceleasi caracteristici ceea ce va permite identificarea lor pe baza caracterelor morfologice,
de cultura, biochimice, antigenice, de patogenitate, dar si sensibilitatea la antibiotic

9.CITIREA SI INTERPRETAREA UNEI ANTIBIOGRAME DIFUZIMETRICE

Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer)
Reprezintă antibiograma difuzimetrică comună (8. 3. 1.) care a fost
standardizată.Este singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan
internaţional, rezultatele sunt reproductibile şi corelabile între laboratoare.
Elementele necesare standardizării sunt:
 Mediul. Cel mai frecvent se utilizează agar Mueller-Hinton; pH-ul mediului
este frecvent între 7,2-7,4 iar grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm.
 Inoculul. Se obține prin suspensionarea a 2-3 colonii izolate în soluție salină
fiziologică, urmărindu-se turbiditatea suspensiei. Turbiditatea poate fi apreciată
cu ajutorul unui dispozitiv portabil destinat sa măsoare turbiditatea suspensiilor
microbiene conform standardelor McFarland, (nefelometru), sau cu tuburi
etalon.
Se ajustează la 0,5 McFarland,adică trebuie să aibă o turbiditate
corespunzătoare standardului 0,5 McFarland) în multe dintre cazuri.
 Incubarea. Timpul de incubare în majoritatea cazurilor este 16-18 ore la 35-
37°C,în cazul germenilor pretenţioşi până la 20-24 de ore. Atmosfera de
incubare este în funcţie de specia bacteriană: în atmosfera obişnuită sau in
atmosferă de CO2(de ex.streptococi, neisserii.)
 Concentraţia de antibiotic. Discurile cu antibiotic conțin determinate de
substanță activă; dimensiunea lor este standard (6 mm diametru).
 Alegerea antibioticelor. Se aleg antibioticele care trebuie testate in funcţie de
specia bacteriană testată si în funcţie de localizarea infecţiei.
 Utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate.
 Interpretarea rezultatelor Sensibilitatea sau rezistența sunt apreciate prin
citirea diametrelor zonelor de inhibiţie. Aceste diametre se compară cu
diametre standard în funcţie de antibiotic, cantitatea de antibiotic din disc,
specia bacteriană testată. Rezultatul se raportează: sensibil (S), intermediar (I)
sau rezistent (R) la antibioticul testat. Nu se raportează diametrul citit, metoda
fiind calitativă. Rezultatele citirii pot fi influențate de lumina reflectată la citire,
de apariția coloniilor izolate, de prezenţa marginilor crenelate ale coloniilor etc.
Această metodă nu permite aprecieri cantitative

10. 2. Reacții de precipitare în inel

Punem în contact Ag și Ac astfel încât să nu se amestece. Reacția apare la limita
dintre Ag și Ac (inel de precipitare).
-reacția Ascoli utilizabilă pentru identificarea prezenței Ag cărbunos (din
Bacillus anthracis).
-Soluția de Ag se prepară din extract de organ (ex. splină) recoltat de la un
animal care a decedat cu suspiciunea de antrax(infecție generalizată cu Bacillus
anthracis).
-Reacția este una calitativă, prin care putem preciza doar prezența sau absența
Ag.
-Utilizăm 3 tuburi (1 pentru reacție și 2 tuburimartor
-. În primul tub martor pipetăm 0,5 ml ser anticărbunos și 0,5 ml soluție salină
fiziologică iar în al doilea tub martor pipetăm 0,5 ml ser normal de cal și 0,5 ml
soluție de Ag.
- În aceste două tuburi, nu trebuie să apară precipitare, scopul acestor martori
fiind verificarea reactanților.
- În tubul de reacție pipetăm întâi 0,5 ml din serul anticărbunos,urmând ca
soluția de antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, pe peretele
interior al tubului, în așa fel încât cele 2 soluții să nu se amestece.
- În cazulreacției pozitive (prezența Ag cărbunos în soluția Ag), după circa 2-5
minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un “inel” de precipitare

11. Aglutinarea în tuburi-R. WIDAL

Pentru diagnosticul serologic al febrelor enterice vom folosi seruri recoltate în
dinamică, la 7-10 zile „distanță”, Ag cunoscute (Ag O și Ag H), 4 șiruri de
eprubete(două șiruri pentru anti-O, două șiruri pentru anti-H (pentru că vom
lucra în cele două probe, în dinamică, pentru fiecare tip de Ac).
- Pentru fiecare șir de tuburi diluăm binar serul de cercetat. În final, pentru
fiecare șir avem: un tub martor (tampon pentru diluție +Ag, fără ser) și tuburi
cu serul diluat, de ex. 1/40, 1/80, 1/160 etc (un șir de tuburi pentru serul
recoltat de la pacient „astăzi” și altul „la 10 zile”, pentru titrarea Ac anti-O și
încă două șiruri pentru titrarea Ac anti-H).
- Incubăm cele 2 șiruri de tuburi cu Ag O timp de 20 ore la 52oC iar cele 2 șiruri
de tuburi cu Ag H le incubăm 2 ore la 52oC plus 10 minute la temperatura
camerei.
- Evaluarea o facem pentru fiecare tub în parte, începând de la diluțiile mari,
prin examinare și ușoară agitare, pentru a surprinde aglutinatele. Ultimul tub
care prezintă aglutinare vizibilă stabilește titrul reacției (pentru fiecare șir de
tuburi,în parte). Un titru care crește de 4 ori „în dinamică” stabilește
diagnosticul în mod cert.În cazul unor pacienți care se află în convalescență sau
în cazul persoanelor care ar putea fi purtători încercăm să stabilim titrul Ac
anti-Vi.

12. Reacția ASLO

Se poate utiliza în diagnosticul retrospectiv al unei infecții streptococice sau

pentruconfirmarea etiologiei bolilor poststreptococice; determinăm titrul Ac
anti streptolizină O(SLO).
Principiu
SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. Dacă în
serul pacientului există Ac anti-SLO, acțiunea hemolitică a SLO este
neutralizată. Prin diluții efectuate în tuburi, determinăm titrul ASLO (cea mai
bună tehnică este cea clasică!).
Tehnica de lucru
Utilizăm seruri de cercetat în pereche (recoltate la interval de 7-10 zile), SLO
liofilizată, sânge defibrinat de iepure, soluție salină izotonă, soluție de rivanol
0,3%, eprubete, pipete gradate foarte curate, baie de apă, centrifugă etc.
Respectăm cu strictețe indicațiile din protocolul de lucru (ex. omogenizăm
suspensia de hematii, diluăm serul 1/10 și repartizăm în tuburi; adăugăm o
cantitate constantă de SLO). Nu putem vizualiza rezultatul reacției în această
etapă. Este necesară a doua etapă (agităm tuburile, adăugăm suspensia de
hematii, agităm pentru omogenizare; incubăm 45 minute, la 37C,
centrifugăm; ținem tuburile la frigider, până a doua zi).
Interpretare
Prin respectarea protocolului, titrul potențial al Ac anti-SLO va fi 12, 50, 100,
125, 166, 250, 333 etc. Titrul reacției ASLO este dat de cea mai mare diluție de
ser la care lipsește complet hemoliza. În țara noastră se acceptă ca normal un
titru de 200(maxim 250) unități ASLO. Există și alte teste serologice care pot fi
utilizate (ex. Anti dexoribonucleotidaza B). S-a demonstrat că dinamica
serologiei (creșterea de patru ori a titrului între două determinări succesive)
este mai importantă decât valoarea absolută a titrului, înregistrându-se nivele
crescute (titru de >1900 unități ASLO) în absența simptomatologiei sau a
dovezii microbiologice a unei infecții cu streptococ beta hemolitic de grup A
timp de mai mult de 2 ani. De asemenea, există și situații în care, dinamica
ASLO este constantă, în absența simptomatologiei clinice.
13.fixarea complementului-R. Bordet Wasseman
Vom lua ca exemplu RFC Bordet-Wassermann (RBW). Aceasta este o metodă
calitativă de identificare a Ac împotriva T. pallidum (atenție, Ag este
nespecific!).
Principiu
Se inactivează C endogen (cel prezent în serul pacientului) deoarece poate
prezenta variații cantitative (ex. în lupus eritematos sistemic; unele infecții duc
la scăderea nivelului C; unele neoplazii determină nivele crescute ale C ). Se
adaugă C exogen (cantitate stabilită conform protocolului).
a.Dacă în serul de cercetat există Ac specifici, rezultă un complex Ag-Ac pe care
se fixează C (C nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul indicator
hematii-Ac anti-hematii, adăugat în a doua etapă).
b.Dacă în serul de cercetat nu există Ac specifici, nu se formează complex Ag-Ac
și C rămâne liber. După adăugarea sistemului indicator, dacă există C liber,
acesta se va lega de complexele Ag-Ac ai sistemului indicator și va conduce la
apariția hemolizei.
Tehnica de lucru
Utilizăm ser de cercetat, seruri de referință (martor pozitiv și negativ), Ag
cunoscut, C, sistemul hemolitic indicator, baie de apă pentru inactivarea
serului propriu (la 56C)etc.
În RBW folosim 2 eprubete cu diluții diferite ale serului pacientului și
eprubetele martor (sigur pozitiv, sigur negativ, martor pentru serul de cercetat,
martor pentru Ag, martor pentru C, martor pentru sistemul hemolitic); în
prima etapă punem în reacție serul de cercetat, C și Ag cunoscut; în a doua
etapă se introduce în reacție sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-
hematie).
Interpretare
Verificăm întâi rezultatele apărute pentru martori (ex. în tubul martor sigur
pozitiv nutrebuie să apară hemoliză).
Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză,
hematiile se depun formând un “buton” în partea inferioară a tubului (în serul
de cercetat există Ac). Pentru a stabili diagnosticul este obligatoriu ca un
rezultat pozitiv să fie confirmat prin reacții specifice (deoarece cardiolipina este
un Ag nespecific!).