METODE DE INSAMANTARE

Tehnici de insamantare in medii lichide:

a. Insamantarea cu ansa bacteriologica:
Parcurge urmatoarele etape:
- Se pregatesc pe masa toate materialele necesare ( ansa bucla, recipientul
cu produs microbian, stativul cu eprubeta continand mediul de cultura
lichid steril);
- Se tine ansa cu primele 3 degete ale mainii drepte si se sterilizeaza prin
incalzire in flacara pana la incandescenta
- Se ia cu mana stanga recipientul cu produsul de insamantat( eprubeta,
balon, placa Petri etc.)
- Se introduce ansa in recipient fara a atinge gatul sau marginile acestuia, se
incarca bucla cu o mica cantitate de produs si apoi se scoate din recipient
- Se pune recipientul cu produs in stativ sau pe masa
- Se ia in mana stanga eprubeta cu mediul de cultura lichid
- Se scoate dopul de vata al eprubetei si se tine cu ultimele 2 degete ale
mainii drepte
- Se flambeaza gatul eprubetei
- Se introduce ansa in eprubeta avand grija sa nu se atinga gatul acesteia
- Se descarca produsul in mediu prin atingerea ansei in lichid
- Se scoate ansa cu grija fara a atinge gatul eprubetei
- Se flambeaza gatul eprubetei
- Se pune dopul de vata
- Se aseaza eprubeta in stativ
- Se sterilizeaza ansa
- Eprubeta cu mediul lichid insanantat se incubeaza in thermostat, la 37C, 24-
48 h
OBS! Daca recipientul cu produsul insamantat are gura stramba este necesara
flambarea acestuia inainte si dupa incarcarea ansei daca are gura larga ( placa
Petri), se deplaseaza anterior lasandu-se capacul, cu marginea in sus, pe masa.

1
 b. Insamantarea cu tamponul:
Se desfasoara urmatoarele secvente:
- Se pregateste pe masa stativul in care se afla eprubeta cu mediul lichid
steril care va fi insamantat
- Cu mana dreapta se recolteaza extemporaneu ( chiar in momentul
premergator insamantarii) produsul de la bolnav cu ajutorul unui tampon
steril sau acesta este scos din tubul protector in care a fost transportat (
daca recoltarea s-a realizat in afara laboratorului)
- In mana stanga se tine eprubeta cu mediul lichid
- Se scoate dopul de vata cu ultimele 2 degete de la mana dreapta, in
celalalte 3 aflandu-se tamponul
- Apoi se flmabeaza gura eprubetei, prin rotirea acesteia in flacara becului
Bunsen
- Se introduce tamponul in mediul lichid din eprubeta
- Se fixeaza tamponul cu ajutorul dopului de vata
- Se aseaza eprubeta in pozitie vertical, intr-un stativ
- Eprubeta, cu nr de inregistrare al probei, notat cu ajutorul creionuluide scris
pe sticla, se introduce in thermostat, la 37C, 24 h
Tehnici de insamantare pe medii sterile:
a. Insamantarea pe un mediu solid turnat in placi Petri:
Se pot folosi pentru insamantare:
 Ansa bacterilogica
 Tamponul
 Pipetele ( pipeta gradata, pipeta Pasteur)
Insamantarea cu ansa bacterilogica:
Este utilizata pentru insamantarea unor produse bacteriologice sau pentru
trecerea unor culture bacteriene de pe un mediu de cultura pe altul.
Pentru realizarea acestui tip de insamantare tr parcuse urmatoarele etape:
- Se pregatesc pe masa materialele necesare care sunt placile Petri cu mediu
solid, ansa bacteriologica, recipientul cu produsul de insamantat

2
OBS! Placile cu mediul solid trebuie sa fie perfect uscate( sa nu existe picaturi pe
suprafata mediului) de aceea acestea sunt tinute o anumita perioada de timp in
thermostat, acoperite partial cu capacul
- Cu mana dreapta se sterilizeaza ansa prin incalzire pana la incandescenta in
flacara
- Cu mana stanga se ia recipientul ( placa Petri, eprubeta, flacon etc) care
contine produsul de insamantat
- In situatia in care produsul de insamantat se afla intr-un recipient de sticla
cu gura stramta, inainte de prelevarea materialului se scoate dopul de vata
cu ultimele doua degete ale mainii drepte si se executa operatia de
flambare a gurii recipientului , dupa care se incarca ansa cu o mica cantitate
de produs ( prelevat de la bolnav sau cultura de pe un mediu), se scoate cu
grija si se flambeaza cu grija gatul recipientului care este inchis, in final, cu
dopul de vata; daca recipientul cu produsul de insamantat este o placa
Petri, aceasta trebuie deschisa cu mana stanga( capacul se lasa pe masa),
apoi se raceste ansa prin mentinerea cateva secunde in aer sau atingerea
mediului intr-o zona periferica si se preleveaza una sau mai multe colonii, in
final acoperindu-se placa cu capacul
- Cu mana stanga se scoate capul placii Petri cu mediul solid si se aseaza pe
masa
- Placa Petri se tine in palma stanga si se realizeaza disperia inoculului pe
toata suprafata mediului sau pe un sector, prin miscari in zig-zag, cu
ajutorul ansei avand grija cu bucla acesteia sa fie tinuta permanent in
pozitie orizontala ( pentru a nu taia mediul)
- Se lasa placa pe masa, acoperita cu capacul si se sterilieaza ansa
- Se asigura identitatea probei prin inscrierea unui numar pe dosul placii ( nu
pe dosul capacului) care corespunde celui inscris in registrul laboratorului
- Se aseaza placa rasturnata ( capacul se afla in partea inferioara pentru
evitarea caderii unor aventuale picaturi de condes pe mediu) in thermostat,
la 37C, 24h

3
 METODE DE OBTINERE A COLONIILOR BACTERIENE IZOLATE
Scopul activitatii desfasurate in laboratorul de bacteriologie este izolarea in
cultura pura ala gentului etiologic al infectiei, in vederea identificarii sale prin
tehnici specifice si testarii sesibilitatii la antibiotic. Pentru realizarea unei
culturi pure ( formata dintr-un sigur tip de germeni) este obligatory folosirea
unor procedee de obtinere a coloniilor isolate. Acestea pot si impartite in 2
mari categori:
Tehnici generale:
Sunt utilizate cand datele clinice si epidemiologice sunt prea sarace pentru a
orienta suspiciunile spre un anumit germen. Dintre acestea se pot enumera:
1. Metoda dilutiilor successive in medii lichide
Materiale necesare:
- 6-8 eprubete sterile
- Un recipient cu mediu steril lichid ( bullion de carne, apa peptonata)
- Pipete sterile
- Un recipient cu produsul cercetat
- 6-8 placi Petri cu mediu solid
Tehnica:
- Se aseaza intr-un stativ eprubetele, in care a fost introdusa aceeasi
cantitate de mediu lichid steril, acoperite cu un dop de vata de asemenea
steril.
- Se flambeaza pipeta si se incearca pe tegumentul fetei dorsale a mainii
stangi.
- Cu mana dreapta se ia pipeta si se introduce in recipientul cu produsul de
cercetat, de unde se aspira o anumita cantitate avand grija sa nu se ude
dopul de vata.
- Se ia prima eprubeta in mana stanga, se scoate dopul de vata si se
introduce pipeta cu produsul, lasand sa cada in mediul lichid o anumita
cantitate din acesta.
- Se acopera eprubeta cu dopul de vata dupa ce a fost flambat gatul acesteia.
- Se introduce pipeta in amestec sulfocromic.

4
 - Se roteste eprubeta intre palme pentru omogenizarea continutului.
- Se flambeaza o alta pipeta sterila si cu ajutorul ei se trece aceeasi cantitate
de suspensie bacteriana din prima eprubeta in cea de-a doua procedand ca
mai sus.
- Se acopera cea de-a doua eprubeta cu dopul de vata dupa flambarea gurii
acesteia.
- Se introduce pipeta in amestec sulfocromic.
- Se repeta procedura si pentru insamantarea celorlalte eprubete.
- Dupa diluarea progresiva a produsului prin procedeul descries anterior,
pentru obtinerea coloniilor izolate este necesar ca din fiecare tub sa se
insamanteze prin inundare, cu pipete diferite pentru fiecare eprubeta, o
mica cantitate de suspensie bacteriana pe medii solide turnate in placi Petri
(cate o placa pentru fiecare tub).
- Dupa incubare, pe mediile din ultimele placi Petri se pot observa colonii
izolate.

Diseminarea produsului pe un mediu solid turnat in placi Petri

Se poate realiza prin doua tehnici diferite care vor fi redate in continuare:
- Cu ansa bacteriologica (tehnica pentagonului)- cu ajutorul ansei incarcate
cu produs se traseaza cateva striuri paralele pe suprafata mediului din
placa, care vor constitui prima latura a unui pentagon, apoi se sterilizeaza
ansa, se traseaza o alta latura pornind din capatul primei (ansa se incarca cu
produsul descarcat pe prima latura), se sterilizeaza din nou ansa si se
procedeaza similar in continuare trasand laturi dar avand grija ca ultima sa
nu se intersecteze cu prima deoarece in aceasta zona produsul va ajunge in
cantitate mica si se vor obtine colonii izolate.
- Cu tamponul- acesta se descarca pe o raza a placii, apoi dispersia pe toata
suprafata acesteia se face cu o bagheta in forma de “L” sterila care este
asezata cu una din laturi pe linia de insamantare iar cu cealalta in pozitie
verticala imprimandu-i-se o miscare de rotatie sau cu ansa bacteriologica
sterilizata si racita care descrie striuri paralele.

5
Tehnici speciale
Acest grup de tehnici sunt utilizate cand, pe baza informatiilor clinic-
epidemiologice, exista suspiciunea implicarii patogenice a unui anumit germen si
se doreste izolarea acestuia dintr-un produs plurimicrobian. Se utilizeaza mai
multe tipuri de tehnici cum sunt:
Metode fizice:
1. Prelucrarea la cald a produsului patologic- se foloseste pentru izolarea in
cultura pura a unei bacterii sporulate (toate formele vegetative sunt
distruse de caldura si supravietuiesc numai sporii) si consta in incalzirea
produsului patologic, inainte de insamantare, la 80 grade C, timp de 30 de
minute.
2. Filtrarea produsului patologic- efectuata inainte de insamantare, metoda
are valoare redusa pentru diagnosticul bacteriologic dar este importanta
pentru cel virusologic deoarece permite separarea unor virusuri (au
dimensiuni mici si trec prin filtre) de bacteriile din produsul patologic.