Tehnici de extractie a nematodelor

A. Introducere

Nematodele sunt, în general, animale mici, incolore, nesegmentate (au corpul bilateral
simetric, cilindric, filiform, cu cele 2 extremități ascuțite), cu aspect de vierme la care ochii
(apendicele, sistemul circulator și respirator) lipsesc, însă prezintă sistemele excretor,
digestiv, reproducator și nervos foarte bine dezvoltate (SNC posedă ganglioni grupați în jurul
unui inel perienteric, cordoanele nervoase fiind intraepidermice).
Nematodele trăiesc practic în orice mediu care sprijină viața și se găsesc în apă dulce, în
apă sărată, în orice tip de sol, dar și ca paraziți interni ai animalelor și
plantelor.
Cel mai simplu mod de a izola nematode de materialul gazdă este prin scufundarea
eșantionului în apă și selectarea nematodelor la un microscop. Totuși, aceasta este o muncă
obositoare și laborioasă și se poate face doar cu probe foarte mici. Din acest motiv,
majoritatea metodelor de extracție sunt indirecte, folosind o serie de proprietăți pentru a
separa nematode de mediul din care provin. Luând în considerare resursele materiale și
tehnicile din laboratorul nostru, doar tehnica pâlniei Baermann se poate aplica. Extracția sub
aburi Seinhorst este inclusă doar ca opțiune.

B. Tehnica de extracție a aburilor Seinhorst / Mistifier

Această tehnică a fost descrisă inițial de Seinhorst (1950) și este utilizată pentru
extragerea nematodelor mobile. Acesta constă în principiu dintr-o pâlnie Baermann sau o
farfurie Oostenbrink plasată într-o ceață sau vapori de apa pentru a evita epuizarea
oxigenului. Ceața(vaporii de apă) este produsă prin duze de pulverizare peste planta de
analizat sau prin duze care se pulverizează în sus, astfel încât picăturile să cadă într-o curbă
moale pe plantă. Seva și produșii de descompunere toxici ale materialului vegetal sunt
spălate prin revărsarea pâlniei care permite perioade de extracție de până la 6 săptămâni.

Zona de aplicabilitate: este utilizată pentru extragerea nematodelor din sol, limanul râului,
gunoiul de grajd, stratul de frunze (litieră) și alte substraturi care pot conține nematode și
pot fi spălate într-o suspensie.

Principiul: utilizează mobilitatea nematodelor și extrage decantatul suspensiei.

Materiale necesare:

 Cuțit, foarfece sau blender;

 Aparat cu pulverizator;
 pâlnie Baermann sau farfurie Oostenbrink;
 Suporturi (site, coșuri de sârmă) cu picioare;
 sită cu deschidere de 20 sau 25 μm;

1
 Proceduri

1. Puneți 100 g semințe pe un strat de tifon, într-o sită cu 60 ochiuri (Fig.1).

2. Puneți sita în interiorul unei pâlnii, a cărei tijă (picior) atinge fundul unui pahar de
250 ml.
3. Stropiți semințele cu o ceață fină continuă de apă de la robinet, la o viteză de 4L /
oră. Încălzirea apei la 20O°C îmbunătățește extracția, în special pentru acele larve de
sub testa semințelor.
4. După 48 de ore de pulverizare, scoateți paharul și lăsați extractul să se stabilizeze
pentru 5 ore, apoi decantați cu atenție, lăsând 40-50 ml de extract la fundul
paharului.
5. Turnați acest extract (care conține larve) într-o farfurie de numărat și examinați la
microscop la o măride de aproximativ 25 X.
6. Măsurați lungimea a cel puțin 15 masculi și 15 femele pentru identificare
Figura 5.

Figura 5. Aparat de extracție de ceață Seinhorst pentru analiza nematodului în părți ale
plantei și în sol. A: ceață de apă, B: bucată de plantă sau sol, C: tifon, D: sită, E: pâlnie și F:
pahar.

2
 C. Tehnica Baermann

Această metodă de extracție a nematodelor mobile a fost introdusă de Baermann (1917)

folosind o pâlnie.

Zona de aplicailitate: pâlnia Baermann este utilizată pentru extragerea nematodelor active
din planta-material și sol. Mărimea eșantionului depinde de diametrul pâlniei și de tipul
materialului. Dacă extracția este din sol, suspensia finală este murdară.

Principiul: Metoda utilizează mobilitatea nematodului. Dacă materialul vegetal (infectat) este
plasat în apa, nematodele se târăsc din material și se scufundă.

Materiale necesare:

 Cuțit, foarfece sau blender;

 Filtru de lapte din lână/bumbac sau un echivalent (de exemplu: tifon, hârtie de filtru,
prosop de hârtie);
 Pâlniu din sticlă cu o bucată de tub moale de polietilenă atașat la piciorul pâlniei și
închis cu un arc sau cu șurub. Panta recomandată a pâlniei este de aprox. 30 °;
 Stativ pentru a susține pâlnia;
 Suport, cum ar fi sita de plastic sau coșul de sârmă cu o deschidere suficient de mare
pentru a permite trecerea nematodelor (adică 250 μm);
 Sită cu deschidere de 20 sau 25 μm;
 Pahar de sticlă de 100 ml;
 Stereomicroscop, microscop inversat sau microscop optic;
 Diapozitiv de numărare;
 Apă curate;
 Lame pentru microscop.

3
 PROCEDURI

1. Puneți un strat subțire (1-2 cm) de sol, țesut vegetal tăiat în bucăți mici sau semințe pe un
tifon într-o sită de 40 sau 60 ochiuri (Fig. 2).
2. Scufundați sita în apa de la robinet într-un vas superficial. Sita trebuie sprijinită astfel încât
să stea la 1 cm deasupra fundului vasului.
3. După 24 de ore, scoateți sita, turnați apa din vas într-un cilindru de sticlă și
permiteți stabilirea timp de 5 ore. Apoi strecurați cu grijă lăsând 50 ml de nematod
concentrat suspensie în partea inferioară a cilindrului.

4. Turnați această suspensie într-un vas de cercetat și examinați la microscop la aproximativ

25 X mărire.

Figura 6. Aparat de tip pâlnie Baermann de extracție a nematodelor

4
 TESTAREA PATOGENITĂȚII

Pentru a testa patogenitatea, speciile de plante sensibile sunt cultivate în condiții controlate
și inoculat cu un organism patogen suspectat. Testele de patogenitate pot oferi informații
pentru:

A. Confirmați un organism izolat ca agent patogen al plantelor folosind postulatele lui Koch
B. Determinați limita gazdei a unui agent patogen
C. Măsurați virulența diferitelor izolate ale unui agent patogen
Pentru că varitățile de plante pot diferi semnificativ în sensibilitate, este important să se
utilizeze același cultivar(varietate) din care a fost izolat agentul patogen la alegerea
plantelor sănătoase pentru a fi inoculate pentru un test de patogenitate pentru a
confirma postulatele lui Koch. Nivelurile ridicate de umiditate facilitează infecția
și răspândirea multor boli. Pulverizări de ceață sau camere umede (făcute din acoperirea
vasului cu pungi de plastic)poate crea un mediu umed și crește semnificativ rata de
succes a patogenității testelor. Ghivecele în camerele umede sau cu pungi din plastic
acoperite nu trebuie așezate în lumina directă a soarelui.

PAȘI PENTRU REALIZAREA POSTULATELOR LUI KOCH

A. Descrieți simptomele exprimate de plantele de cultură bolnave.

B. Izolați agentul patogen suspectat - aceleași culturi ar trebui izolate de plante cu
simptome similare.
C. Obțineți o cultură pură și utilizați-o pentru a inocula material vegetal sănătos.
D. Observați simptomele exprimate de plantele inoculate - simptomele ar trebui să fie
la fel ca cele observate inițial la plantele de cultură.
E. Reizolează agentul patogen de materialul nou bolnav - cultura ar trebui să fie
la fel ca cultura originală purificată.

CONTROL POZITIV Izolat necunoscut CONTROL NEGATIV

(Patogen cunoscut)
5
 Apă
INOCUL

INTRODUCERE ÎN APĂ

Incubare în camera umedă

Interpretarea simptomelor

Reizolarea și identificarea
agentului patogen

Figura 7. Pași generali în testele de patogenitate (postulatul lui Koch)