PRELUCRAREA

PRELEVATELOR PATOLOGICE
TEHNICI DE INSAMANTARE
PENTRU IZOLAREA SI
IDENTIFICAREA BACTERIILOR

CATEDRA DE MICROBIOLOGIE
LP5
• Insamantarea prelevatelor patologice, in
functie de natura lor, se realizeaza:
• direct
sau
• dupa o prealabila prelucrare
(concentrare, decontaminare,
omogenizare, inactivarea unor substante
antimicrobiene)
• Prelevatele omogene, fluide – sange,
exsudate seroase prelevate pe
anticoagulant, puroi
• Prelevatele emulsionabile - materii fecale

- se pot insamanta direct

CONCENTRAREA PROBELOR

• Centrifugare – probele fluide

• Omogenizare - sputa
DECONTAMINAREA PROBELOR
• Spalare in solutie salina izotona – utila
pentru:
• sputa muco – purulenta,
• portiunile muco – sangvinolente din scaun
• Tratarea cu NaOH:
• decontamineaza probele pentru izolarea
micobacteriilor
• fluidifica si omogenizeaza sputa
OMOGENIZAREA PROBELOR

• Omogenizarea sputei pentru izolarea

bacteriilor neacido – alcoolo – rezistente:
• se realizeaza cu N – acetil – cisteina.

• Omogenizarea tesuturilor:
• se realizeaza prin mojarare in tub Griffith
 TEHNICI DE INSAMANTARE

1. Epuizarea inoculului cu ansa pe placi

cu mediu agarizat si obtinerea culturilor
pure necesare identificarii
- initial, este necesara “uscarea placilor”, prin
mentinerea placilor ~ 30 min. la 37°C, cu capacul
Intredeschis – pentru evaporarea condensului de pe
suprafata mediului
TEHNICI DE INSAMANTARE
Epuizarea inoculului

- pe placile cu medii agarizate neselective, uzuala

este izolarea prin epuizare semicantitativa a
inoculului in 4 cadrane, cu arderea ansei cand
schimbam directia striurilor de insamantare.
- metoda permite aproximarea relativa a cresterii.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Epuizarea inoculului
- pentru izolari pe medii selective, cantitatea
de inocul trebuie sa fie mai mare, iar epuizarea
mai putin drastica.
- initial, se etaleaza in aria A una sau mai multe
anse cu inocul ori inocul prelevat pe tampon.
- epuizam apoi inoculul, fara sterilizari
intermediare ale ansei, prin 3 serii de striuri: B,
C, D.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Epuizarea inoculului

- cantitatea de fluid prelevata in ansa difera cu

pozitia de scufundare si retragere a ansei:
 cantitate minima si constanta - la scufundarea si
retragerea verticala

 cantitate maxima – la scufundare cat mai oblica

si retragerea ansei prin “smulgere” din fluid
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Epuizarea inoculului

• Cultura pura – acea cultura formata din

descendentii unei singure colonii rezultate
dupa o epuizare a materialului microbian,
care duce la cresterea sub forma de
colonii bine izolate pe un mediu neselectiv.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Epuizarea inoculului

• Ideal, ar fi ca asemenea crestere sa

porneasca de la indivizi izolati.
• Practic ea porneste de la unitati
formatoare de colonii (UFC) –
poate indivizi,
poate o mica grupare de organisme
asemanatoare.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
2. Insamantarea in medii lichide se face:
- direct cu seringa de prelevare
(hemoculturi)
- cu pipeta (sedimentul LCR)
- cu ansa incarcata cu prelevat patologic
monomicrobian ori cultura pura
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Insamantarea in medii lichide

• inclina tubul si descarca ansa pe peretele

tubului

• cand readucem tubul la pozitia verticala,

inoculul ajunge submers si difuzeaza in
mediu.
 TEHNICI DE INSAMANTARE

3. Izolarea bacteriilor sporulate de cele

nesporulate pe baza termorezistentei
sporilor.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Izolarea bacteriilor sporulate

• Mentine in baia de apa la 80 °C, timp de

10 min., produsul microbian suspensionat
in solutie salina izotona, apoi epuizeaza
suspensia pe o placa cu mediu agarizat.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
4. Insamantarea cu ansa a mediilor
solidificate in panta.
Indicatii:
- mentinerea pe durata limitata (cateva
zile / 1 - 2 saptamani) a culturilor pure
(ex.: tulpini de identificat, tulpini de
referinta)
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Insamantarea cu ansa a mediilor
solidificate in panta
- preleva cu ansa inocul din mai multe colonii ale
culturii purificate pe placa cu mediu agarizat.
- depune inoculul in partea inferioara a pantei,
imediat deasupra apei de condens si retrage
ansa spre partea superioara a pantei descriind
miscari in “S” pe suprafata mediului.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Insamantarea cu ansa a mediilor
solidificate in panta

• izolarea in cultura pura a tulpinilor de Proteus

din prelevate contaminate.
• descarca o ansa din prelevatul patologic strict in
apa de condens a tubului.
• incubeaza tubul in pozitie verticala.
• singura, cultura de Proteus va invada prin
“catarare” suprafata pantei de mediu.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
5. Insamantarea cu firul drept a coloanei de
agar nutritiv moale.
Indicatii:
- testarea mobilitatii bacteriilor
- conservarea pe durate mai lungi (1 – 6
luni) a tulpinilor bacteriene
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Insamantarea cu firul drept a
coloanei de agar nutritiv moale
• incarca firul cu inocul din cultura pura si inteapa
central coloana de agar nutritiv pana aproape de
fundul tubului.
• la testarea mobilitatii retrage acul cat mai exact
pe acelasi traiect pentru a evita dilacerari
suplimentare ale mediului in care cresterea
poate da impresia falsa de mobilitate a bacteriei.
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Insamantarea cu firul drept a
mediilor solidificate in coloana si
panta.

6. Insamantarea cu firul drept a mediilor

solidificate in coloana si panta.

Indicatii:
- testarea unor activitati biochimice
 TEHNICI DE INSAMANTARE
Insamantarea cu firul drept a
mediilor solidificate in coloana si
panta.

• Incarca firul cu inocul din cultura pura si

procedeaza mai intai la insamantarea prin
intepare a coloanei, apoi retrage acul,
insamanteaza prin miscari in “S” pana in
partea sa superioara.
 TEHNICI DE INSAMANTARE

7. Insamantarea uroculturilor se realizeaza

cu ansa calibrata de 10 µl. pentru a estima
semicantitativ concentratia bacteriana / ml.
urina