1.

Recoltarea produselor normal sterile:

Produsele normal sterile sunt: sânge, urină, LCR, bilă, exudatele seroaselor (lichid pleural,
lichid peritoneal, lichid sinovial).
A. Sângele:
Se recoltează pentru realizarea hemoculturii (evidenţierea bacteriilor din sânge).
Indicaţii: sindroame febrile fără cauză precizată, infecţii bacteriene, septicemie şi
endocardită.
Momentul recoltării: prelevările trebuie făcute înaintea tratamentului antimicrobian, iar
hemoculturile trebuie recoltate conform evoluţiei predictive a curbei febrile sau în
momentul apariţiei frisoanelor.
Numărul şi volumul prelevărilor:
- 3 prelevări/24 ore
- în bolile cu descărcare bacteriemică continuă (ex. endocardite subacute) sunt suficiente 2
prelevări/24 ore
- pentru adult sunt necesari 20-30 ml sânge/prelevare
- la nou-născuţi, sugari şi copii mici, concentraţia realizată de bacterii în sânge fiind
semnificativ mai mare, sunt suficienţi 1-3 ml sânge/prelevare.
Zone de puncţie:
- electiv: venele de la plică cotului sau, la nou-născuţi şi sugari, venele jugulare
- alternativ: venele antebraţului sau dorsale ale mâinii.
Procedura de prelevare:
- recoltarea se realizează la adăpost de curenţi de aer
- persoana care recoltează va purta mască
- pacientul se aşază în decubitus dorsal
- persoana care recoltează îşi va decontamina mâinile prin spălare îngrijită cu apă şi săpun,
urmată de uscare cu prosop curat
- se aplică garoul la cca 10 cm proximal de zona puncţiei şi se strânge pentru a aprecia, prin
palpare, dimensiunea şi elasticitatea venei de puncţionat.
B. Lichidul cefalorahidian (LCR):
Indicaţii: meningite, meningoencefalite, infectării SNC.
Prelevarea: este de competenţa specialiştilor infectionişti, neurologi, neurochirurgi. Se face
prin rahicenteză: lombară L4-L5, sau ventriculară (suboccipitală).
Puncţia lombară: bolnavul este aşezat în decubit lateral, pielea bolnavului se
dezinfectează. Medicul se spală pe mâini, şi apoi işi pune manuşi sterile. După aproximativ 2
minute, timp necesar acţiunii de dezinfecţie, se face puncţia prin pătrunderea în spaţiul
intervertebral L4-L5. Se colectează 5-10 ml de LCR în 2-3 tuburi, dintre care unul este
obligatoriu steril pentru examen microbiologic.
Puncţia suboccipitală: se menţine capul bolnavului mult flectat înainte. Se pătrunde
cu acul perpendicular pe tegument.
C. Urina:
Evidenţierea microorganismelor din urină este denumită urocultură. Aceasta se recomandă
a fi recoltată de la pacienţii cu suspiciuni de infecţii ale aparatului renal, tuberculoză.
Metoda uzuală recomandată pentru recoltarea acestui produs patologic este cea a jetului
întrerupt (mijlociu): după toaleta exterioară a organelor genitale, se recoltează porţiunea din
mijloc a micţiunii; prima porţiune a jetului este aruncată, şi fară a se întrerupe jetul de urină,
se recoltează cca 10-20 ml de urină în recipient steril, închis ermetic cu capac.
D. Bila
Se recoltează pentru examinări bacteriologice (bilicultură) cu sonda Einhorn sterilizată,
metoda recoltării purtând numele de tubaj duodenal. Se recoltează lichidul în 3 recipiente:
- primul lichid = bila A (bilă coledociană) – 10-30ml
- după 15-25min = bila B (bilă veziculară) – 100-200ml
- lichidul care se scurge în continuare = bila C (bilă hepatică)
E. Exudatele seroaselor (lichid pleural, lichid peritoneal, lichid sinovial)
Se recoltează după asepsie locală prin puncţie în partea declivă a regiunii.

2. Recoltarea produselor normal contaminate:

Produsele normal contaminate sunt: exudatul faringian, materiile fecale, sputa, puroi,
secreţii (oculare, auriculare, uretrale, vaginale).
A. Exudatul faringian:
Se recoltează cu tamponul de exudat faringian steril.
Indicaţii: diagnosticul faringitelor şi anginelor bacteriene, fungice şi virale.
Tehnica de prelucrare: exudatul faringian se prelevă înainte sau după 3-4 ore de la toaleta
gurii ori ingestia de alimente, înaintea administrării de antibiotice. Se aşază pacientul pe
scaun, cu faţa spre sursa de lumină, gâtul în uşoară extensie dorsală; se şterge cu tamponul
ferm, dar nu brutal, amigdalele şi peretele posterior al faringelui, vizând în special orice zonă
inflamată, ulcerată sau cu depozite purulente. Atât la introducerea, cât şi la scoaterea
tamponului din faringe se evită atingerea de baza limbii sau de palatul moale. Se reintroduce
tamponul în tubul protector etichetat.
B. Sputa:
Sputa este un produs provenit din căile aeriene pulmonare care se recoltează în afecţiuni
pulmonare (pneumonii, bronhopneumonii, tuberculoză).
Tehnica de recoltare: sputa se recoltează de preferinţă dimineaţa. În infecţiile acute este
suficientă o cantitate de 1-2 ml de sputa. La copii mici, care înghit sputa, se efectuează
recoltarea prin sondaj gastric.
C. Materiile fecale:
În cazul coproculturii, se urmăreşte evidenţierea agentului patogen din fecale. Coprocultura
se recomandă în infecţiile intestinale: salmoneloze, holeră şi parazitoze. Prelevarea se face
direct din rect sau din scaunul emis spontan.
Direct din rect se efectuează cu sonda Nelaton sau cu tamponul rectal care vor fi
umectate cu soluţie salină şi introduse prin rotare lentă intrarectal, iar în cazul sondei i se
ataşează o seringă cu care se fac 1-2 aspiraţii.
Din scaunul emis spontan se efectuează cu ajutorul tamponului sau a linguriţei
coprorecultorului vizând zonele reprezentative: mucus, puroi, sânge.
! Prelucrarea probei TREBUIE făcută imediat sau maxim în 2 ore.
D. Secreţia uretrală:
Indicaţii: uretrită gonococică, negonococică, postgonococică.
Recoltare: se face cu tamponul steril la cel puţin 2 ore de la micţiune
E. Secreţia vaginală:
Indicaţii: leucoree
Recoltare: se recoltează secreţia acumulată în fundul de sac vaginal cu ajutorul unei valve şi
se recoltează pe 3 tampoane: 𝑡1 = diagnostic bacteriologic
𝑡2 = diagnostic parazitologic
𝑡3 = diagnostic micologic

3.Metode de sterilizare prin căldură uscată:

A. Flambarea = trecerea prin flacăra becului de gaz a obiectului care conţine germeni
microbieni
- mecanism: carbonizare
- utilizare: anse bacteriologice, pipete Pasteur, recipiente (tuburi, baloane),
lame de sticlă
B. Sterilizare cu aer supraîncălzit în etuvă:
- la 180 ⁰C timp de o oră, iar pentru obiectele mai voluminoase timpul creşte peste o oră
- utilizare: sticlărie de laborator, instrumente metalice, obiecte de porţelan.

4. Medii de cultură folosite în laboratorul de microbiologie:

= substraturi nutritive care asigură creşterea şi multiplicarea microorganismelor în condiţii
artificiale.
Clasificare:
A. după consistenţă: - medii lichide: apă peptonată, bullion
- medii solide: geloză
B. după provenienţă: - medii naturale: cartof, lapte
- medii artificiale: carne, drojdie
- medii sintetice: aminoacizi, săruri
- medii semisintetice
C. după provenienţă şi mod de utilizare:
▪ Medii simple: - medii lichide
- medii solide
▪ Medii complexe = medii cu adaos de lichide organice (sânge, ser) sau zaharuri
(glucoză, lactoză) la mediile simple pentru cultivarea speciilor mai
pretenţioase
- mediul geloză-sânge: evidenţiază hemoliza caracteristică speciilor
(stafilococi, streptococi, pneumococi)
- mediul geloză-chocolat: izolarea gonococilor şi meningococilor.

5. Etapele diagnosticului de laborator într-o infecţie bacteriană:

Diagnosticul de laborator al infecţiilor bacteriene are ca scop final identificarea tulpinilor
bacteriene izolate din produsele biclogice ale pacientului.
I. Recoltarea şi prelucrarea produselor patologice
II. Diagnosticul bacteriologic parcurge 3 etape:
➢ 1. diagnosticul de orientare – se face pe baza caracterelor morfologice ale coloniilor
şi pe baza examenului direct al preparatului proaspăt şi al frotiului fixat şi colorat.
➢ 2. diagnosticul de specie – se face pe baza caracterelor biochimice proprii fiecărei
specii bacteriene
➢ 3. diagnosticul imunologic – cuprinde o serie de teste de imunitate umorală şi
celulară

III. Diagnosticul serologic

6. Coloraţia Gram:
- este o coloraţie dublă
Principiu: evidenţiază forma, gruparea şi afinitatea tinctorială a bacteriilor
- bacteriile se împart în:
➢ bacterii Gram pozitive:
 - au perete gros, dar simplu care rezistă la decolorarea cu alcool-acetonă şi
păstrează culoarea primului colorant-violet
- reprezentanţi: genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus.
➢ bacterii Gram negative:
- au perete subţire, dar complex (prezintă fosfolipide) ce favorizează
pătrunderea decolorantului şi păstrează culoarea celui de al doilea
colorant-roşu
- reprezentanţi: genurile Neisseria (meningococ, gonococ), familia
Enterobacteriaceae.

7. Coloraţia Ziehl-Nielsen:
- este o coloraţie dublă, care evidenţiază bacteriile acido-alcoolo-rezistente (bacilul
tuberculozei-bacilul Koch, bacilul leprei).
Principiu: aceşti bacili au în structura peretelui substanţe lipidice care se colorează greu (cu
colorant puternic, în anumite condiţii), dar odată coloraţi nu-şi pierd culoarea şi rămân
coloraţi în roşu. Celelalte microorganisme şi elemente celulare, se decolorează, iar după
colorarea cu al doilea colorant devin albastre.

8. Caractere de cultură ale bacteriilor pe medii lichide:

1. Turbiditatea/tulburarea mediului:
- omogenă = în toată masa mediului (stafilococ, Salmonella)
- neomogenă = sub forma unui depozit grunjos pe pereţii şi în porţiunea inferioară a
eprubetei, iar în cele 2⁄3 superioare ale eprubetei este limpede (streptococ
β-hemolitic)
- depozit floconos la fund, dar clar în rest (bacilul antraxului)
2. Aspecte la suprafaţa mediului:
- formarea de văl subţire (vibrion holeric)
- formarea unei pelicule fine (Proteus)
- formarea unei membrane groase, rugoase (bacilul tuberculos)
- formarea unei membrane uscate, “scuamoase” (Bacillus subtillis)
- formarea unui inel aderent (tulpini de E.coli)
3. Culoarea:
- apare o culoare diferită de cea a mediului neînsămânţat
- bacteriile eliberează pigmenţi hidrosolubili: flouresceină, melanină, piocianină
- verde-albăstrui (Pseudomonas aeruginosa)
4. Miros:
- aromat, de flori de tei (Pseudomonas)
- fecaloid (E.coli)
- putred (Proteus)
- corn ars (bacilul tetanic)

9. Caractere de cultură ale bacteriilor pe medii solide:

Individ iniţial multiplicare colonie (elementul caracteristic al multiplicării bacteriene în
mediul solid)
1. Dimensiuni:
- mici, cu zonă de hemoliză mare (streptococ)
- mari, cu zonă de hemoliză mică (stafilococ)
2. Formă:
- rotunde
- ovalare
- lenticulare
- filamentoase
3. Suprafaţă:
- netedă (tulpini proaspăt izolate)
- rugoasă (tulpini în vitro)
- bombate (E.coli)
- mamelonate (bacilul Koch)
- aplatizate (Pseudomonas)
4. Consistenţă:
- friabile (bacilul tuberculos)
- mucoase (streptococ β-hemolitic)
5. Contur (margini):
- circular, regulat, întreg (majoritatea germenilor)
- încreţit (bacilul difteric)
-ondulat (Proteus)
6. Transparenţă:
- hipertransparente
- transparente
- semi-transparente
- opace
7. Aderenţa la mediu:
- neaderente: la încercarea de a le recolta cu ansa, coloniile se detaşează uşor (streptococ)
- aderente (bacilul piocianic)
8. Culoarea:
- prin pigment propriu: - alb (stafilococ alb)
- galben-auriu (stafilococ aureu)
- galben-citrin (stafilococ citrin)
- prin virarea culorii la indicatorul din mediu
9. Mirosul:
- aromat, de flori de tei (Pseudomonas)
- fecaloid (E.coli)
- putred (Proteus)
- corn ars
10. Hemoliza:
- completă de tip β (streptococ β-hemolitic)
- parţială, de tip α (streptococ α-hemolitic)
- de tip α-prim (streptococ de grup B)
- absenţa hemolizei de tip γ (streptococii nehemolitici)
- de tip cald-rece, incompletă la 37⁰C, devenind completă la 4⁰C (stafilococ)

! Avem 2 mari categorii de colonii:

A. forma “S”: contur circular, suprafaţă bombată, netedă (bacterii patogene)
B. forma “R”: contur încreţit, suprafaţă turtită, rugoasă (bacterii nepatogene)

10. Caractere biochimice (mediu politrop TSI):

TSI = trei zaharuri cu fier
- este pus într-un tub în care se toarnă mediul solid în poziţie înclinată
- mediul conţine: agar, colorant indicator (roşu-fenol), 1% lactoză, 1% zaharoză, 0,1%
glucoză, sulfat feros (sursa de fier)
Proprietăţi biochimice:
- fermentarea glucozei → culoare galbenă în coloană şi se aşază inferior în eprubetă
- fermentarea lactozei şi zaharozei → culoare galbenă în pantă şi se aşază superior în
eprubetă
- producţie de hidrogen sulfurat → culoare neagră
- producţie de gaz → bule sub coloană
→ fisuri în coloană

11. Caractere biochimice (mediu politrop MIU):

MIU = mobilitate, indol, uree
- este un mediu solid turnat în poziţie dreaptă
Proprietăţi biochimice:
- mobilitatea bacteriană: - bacterii imobile → se vede linia de însămânţare
- bacterii mobile → mediul devine tulbure
- producţie de indol: - dacă reacţia este pozitivă cu indolul → culoarea roşie
- dacă reacţia este negativă cu indolul → culoarea galbenă
- hidroliza ureei: - mediul conţine uree şi indicator de culoare
- dacă bacteriile hidrolizează ureea → amoniac → pH-ul creşte → indicatorul
devine roşu
- dacă bacteriile nu hidrolizează ureea → nu se formează amoniac → pH-ul
nu creşte → indicatorul devine galben

12. Caractere de patogenitate ale bacteriilor:

Patogenitatea bacteriană = capacitatea unor bacterii de a produce boală exprimată prin 2
proprietăţi: virulenţă şi toxinogeneză
A. în vitro
1. Patogenitatea stafilococilor:
a. Testul pigmentogenezei:
- stafilococii pot fi: - aurei (patogeni 80-90%)
- albi (patogeni 20 %)
- citrini (nepatogeni)
b. Testul hemolizei:
- stafilococii formează colonii de dimensiuni medii şi mari, iar cei patogeni cu zonă de
hemoliză au diametrul mai mic decât diametrul coloniei
- la stafilococul aureu există 4 tipuri de hemolizine: α, δ (patogene pentru om), β, γ.
c. Testul fermentării manitei:
- stafilococii patogeni fermentează manita → acid lactic → indicator galben
- stafilococii nepatogeni nu fermentează manita → indicator roşu
d. Testul coagulării plasmei:
- evidenţiază producerea de coagulază; aceasta alături de fibrinoliză şi hialuronidază
constituie o enzimă legată de patogenitatea germenului (virulenţă).
- prin producerea de coagulază, stafilococul se înconjoară cu un strat de fibrină împotriva
fagocitozei.
e. Testul fibrinolizinei:
- evidenţiază producerea de fibrinoliză
- stafilococii patogeni determină liza fibrinei
2. Patogenitatea bacilului difteric:
- bacilul difteric produce o toxină puternică cu proprietăţi toxice (letală, necrozantă,
citopatogenă)
- toxinogeneza bacilului difteric se efectuează prin testul Elek (test de imunoprecipitare) şi se
urmăreşte apariţia liniei de precipitare toxină-antitoxină.
3. Patogenitatea bacilului Clostridium perfringens:
- este cel mai răspândit germen anaerob
- produce alfa-toxină (lecitinază) a cărui toxinogeneză se evidenţiează pe geloză glucozată cu
gălbenuş de ou (mediu Nagler).
B. în vivo
a. Determinarea patogeniţăţii tulpinilor de stafilococ:
- evidenţiat la iepure prin efectul dermonecrotic (inocularea intradermica) şi efectul letal
(inocularea intravenoasă).
b. Determinarea patogeniţăţii tulpinilor de bacil difteric:
- evidenţiat pe cobai prin inoculare subcutanată, producând intoxicaţie difterică: edem
gelatinos, lichid seros in pleură.
c. Determinarea patogenităţii tulpinilor de pnreumococ:
- evidenţiat la şoareci prin inoculare intraperitoneală, producând septicemie.
d. Determinarea patogenităţii tulpinilor de Shigella (testul Sereny):
- evidenţiat pe iepure sau cobai prin inoculare sub pleoapa ochiului, producând o congestie
conjunctivală, secretie mucopurulentă urmată de opacifierea corneei.
13. Caractere antigenice ale bacteriilor:
Identificarea antigenică se bazează pe reacţii Ag-Ac, în care antigenul (bacteria izolată din
produsul patologic) şi anticorpii specifici din serul imun standard se pun în contact pentru a
identifica bacteria izolată.
1. Reacţia de aglutinare:
Principiu: antigenul particulat reacţionează cu anticorpii specifici formând complexe imune
Ag-Ac care devin vizibile prin formarea grunjilor de aglutinare.
- poate fi: - de tip O (somatică) → grunji mici care nu se desfac prin agitare
- de tip H (flagelară) → grunji mari care se desfac prin agitare
- dacă reacţia este pozitivă → apar grunjii de aglutinare
- dacă reacţia este negativă → lichidul rămâne lactescent
- exemple de utilizare: Salmonella, E.coli, Shigella
- alte tipuri: - coaglutinarea
- latex-aglutinarea
2. Reacţia de precipitare:
Principiu: un antigen solubil formează cu anticorpul un complex insolubil, rezultatul putând
avea loc fie în: mediul lichid (reacţia de precipitare inelară pentru identificarea steptococilor)
sau în mediul gelificat (imunodifuzia pentru identificarea bacilului difteric).
3. Reacţia de fixare a complementului:
- se foloseşte în infecţiile bacteriene şi virale
- dacă reacţia este pozitivă: - se formează complexul Ag-Ac
- complementul reacţionează asupra complexului
- hematiile se depun la fundul eprubetei → nu avem hemoliză
- dacă reacţia este negativă: - nu se formează complexul Ag-Ac
- complementul reacţionează asupra hematiilor → hemoliză
- poate fi: - calitativă: stabileşte dacă avem sau nu Ac
- cantitativă: stabileşte câţi Ac avem
4. Reacţia cu imunofluorescenţă:
- poate fi: - directă
- indirectă
▪ directă: un antigen necunoscut se cuplează cu o substanţă fluorescentă prin care se
formează complexe galben-strălucitoare (reacţie pozitivă)
 ▪ indirectă: I preparatul care conţine antigenul de identificat se tratează cu ser imun
standard → un complex Ag-Ac nefluorescent (reacţie pozitivă)
II preparatul care conţine complexul Ag-Ac nefluorescent se tratează cu ser
antiglobulinic fluorescent → complex Ag-Ac intens fluorescent

14. Lizotipia:
= identificarea unor specii bacteriene (stafilococ sau Salmonella) în funcţie de sensibilitatea
lor faţă de un bacteriofag
Bacteriofagii = virusuri care parazitează bacteriile
- pot fi: - fagi litici-virulenţi
- fagi temperaţi
Lizotipurile = tipuri de bacterii care sunt lizate de anumite tulpini de bacteriofagi
- determinarea acestora are importanţă epidemiologică pentru stabilirea filiaţiei
cazurilor într-un episod epidemic în focar
Principiu: mediul solid însămânţat cu o cultură bacteriană tânără primeşte picături de
suspensie fagică → se produc zone clare lipsite de creşterea microbiană.

15. Antibiograma – metode calitative, interpretare

Antibiograma serveşte la: - determinarea sensibilităţii unui germen la antibiotice
- supravegherea epidemiologică a rezistenţei bacteriene
▪ Metoda difuzimetrică – antibiograma standard:
Principiu: pe suprafaţa unei geloze nutritive turnată într-o cutie Petri şi însămânţată cu
suspensie bacteriană de testat, se depun microcomprimate de hârtie de filtru
îmbibate cu antibiotice eliberate într-o cantitate fixă. De la nivelul discului,
antibioticul difuzează în geloză, concentraţia sa scăzând pe măsura depărtării de
sursă. După incubare, fiecare disc e înconjurat de o zonă de inhibiţie a creşterii
bacteriene: multiplicarea bacteriilor se opreşte acolo unde există în geloză o
cantitate de antibiotic egală cu CMI (concentraţia minimă inhibitoare).

16. Antibiograma – metode cantitative, interpretare

▪ 1. Determinarea concentraţiei minime inhibitoare (CMI):
CMI = corespunde concentraţiei minime de antibiotic care inhibă creşterea unui germen în
24 de ore
- este parametrul cel mai folosit pentru aprecierea efectului unui antibiotic
- determină efectul bacteriostatic al unui antibiotic

Principiu: o încărcătură bacteriană (inocul) se pune în contact cu concentraţii crescânde de

antibiotic → diluţii
A. Pe mediul lichid: – inoculul bacterian se distribuie în tuburi care conţin bulion Mueller-
Hinton cu antibioticul în concentraţii crescânde. După incubare, CMI e
indicată de tubul cu cea mai mică concentraţie de antibiotic la care
creşterea bacteriană nu mai e vizibilă
B. Pe mediul solid: - inoculul bacterian e însămânţat în mediul gelozat în plăci Petri, pe care e
incorporat antibioticul. După incubare, CMI e determinată prin inhibarea
creşterii pe mediul care conţine concentraţia cea mai mică de antibiotic
- un germen poate fi la acţiunea unui antibiotic: - S (sensibil)
- R (rezistent)
- I (intermediar)
S → CMI e inferioară faţă de concentraţia sangvină obţinută după o doză
R → CMI e prea mare pentru a putea fi atinsă fără doze toxice
I → CMI nu poate fi atinsă de către antibioterapie standard, doar prin doze mari
▪ 2. Determinarea activităţii bactericide (CMB):
= cea mai slabă concentraţie de antibiotic care omoară o proporţie definită de bacterii într-
un interval de timp şi condiţii precise

- se poate determina concentraţia minimă bacteriană (CMB) = concentraţia cea mai mică de
antibiotic care după o
incubare de 18h la 37⁰C,
omoară cel puţin 99,9% din
bacteriile inoculului.