Biochimie s2 Toate LP

Laborator 2 Medicină
Glucide. Teste calitative de identificare a glucozei si corpilor cetonici.

Glicemia: valoare normală, semnificaţie diagnostică. Dozarea glucozei.
Teste de evaluare a tulburărilor metabolismului glucidic
Obiective:
- Definirea termenului de glicemie şi cunoaşterea valorilor normale, interpretarea variaţiilor
fiziologice şi patologice;
- Cunoaşterea principalelor metode de diagnosticare şi monitorizare a tulburărilor
metabolismului glucidic;
- Însuşirea principalelor metode de dozare a glucozei serice precum şi a metodelor de
determinare a glucidelor urinare.
Glucidele, numite şi hidraţi de carbon sau carbohidraţi sunt alcătuite din trei elemente
chimice minerale: carbon, hidrogen şi oxigen şi au ca rol principal acela de a furniza energie
organismului necesară pentru desfăşurarea activităţilor zilnice. De asemenea glucidele prezintă şi
un rol plastic în organism deoarece intră în structura unor hormoni, antigene (antigenele de grup
sanguin din sistemul ABO), anticorpi, a celulelor, ţesuturilor , factorilor de coagulare a sângelui
precum şi în componenţa determinanţilor complexului major de histocompatibilitate HLA.
După origine glucidele se clasifică în glucide de origine vegetală (fructoza, zaharoza, amidonul,
galactoza, celuloza) şi glucide de origine animală (glicogenul).
Glucoza reprezintă cel mai important monozaharid din sânge. Alimentele cu cel mai mare
conţinut în glucoză sunt strugurii şi mierea, iar fructele cele mai dulci precum piersicile, perele,
pepenii conţin cantităţi mai mari de fructoză decât de glucoză. În organism glucoza se formează
prin procesul de glicogeneză (formarea glucozei pe seama unor glucide sau datorită unor resturi
de carbohidraţi) şi prin procesul de gliconeogeneză (reprezintă formarea glucozei datorită unor
substanţe neglucidice: glicerol, aminoacizi).
În practica medicală glucoza se foloseşte ca soluţie apoasă perfuzabilă de diferite
concentraţii: 5%, 10%, 20% şi sub formă de fiole cu soluţie apoasă injectabilă de glucoză 33% şi
40%. Cel mai frecvent se folosesc soluţiile de glucoza 5% pentru diluarea unor medicamente,
pentru hidratare sau ca suport energetic.
Nivelul plasmatic al glucozei în sânge este reglat de doi hormoni secretaţi de pancreas care
au acţiune antagonistă şi anume insulina (efect hipoglicemiant, favorizând pătrunderea glucozei
în celule), şi glucagonul (efect hiperglicemiant prin accelerarea proceselor de metabolizare
hepatică). Pe lângă aceştia mai sunt şi alţi hormoni care intervin în metabolismul glucozei
reprezentaţi de: ACTH-ul, glucocorticoizii, adrenalina, tiroxina.
Glicemia este analiza care desemnează concentraţia de glucoză din sânge ce poate varia în
funcţie de obezitate, stres, alcool sau unele medicamente.
Valoarea normală a glicemiei variază între 60-110 mg/dl.
1
Când valoarea glicemiei scade sub 60 mg/dl se instalează hipoglicemia, iar dacă creşte
peste 110 mg/dl apare hiperglicemia.
Valoarea glicemiei între 100-125 mg/dl = prediabet.
În diabetul zaharat glicemia depăşeşte valoarea de 126 mg/dl. Glicemia bazală normală nu
exclude diabetul zaharat.
Determinarea se face fie în sângele venos (glicemie venoasă) recoltat într-un vacutainer
fără anticoagulant cu/fără gel separator care apoi este centrifugat la 3000 rot/min timp de 10
minute într-un interval care să nu depăşeaşcă 2h de la momentul recoltării, sau din sângele capilar
prin înţeparea vârfului degetului (glicemie capilară), citirea făcându-se cu un autoanalizor numit
glucometru. Valorile obţinute astfel pot diferi de cele din sângele venos (glicemia capilară are
valori cu 10% mai mari faţă de glicemia venoasă).
Este necesar ca aceste glucometre să fie verificate şi calibrate periodic de către o persoană
responsabilă cu service-ul aparatului astfel încât valorile să fie cât mai precise.
Variaţii fiziologice:
Hiperglicemii fiziologice: febră, după mese (hiperglicemii postprandiale), hipoxie, în caz de
inhalare de narcotice, acetona sau cloroform, stres, şoc emotional, traume psihice, antidepresive,
diuretice.
Hipoglicemii fiziologice: postul alimentar, sarcină, contraceptivele orale, repaus la pat,
eritromicină, insulină sau propanolol.
Variaţii patologice:
Hiperglicemii: Hipoglicemii:
- diabet zaharat - insulinom
- boala Cushing - boala Addison
- adenom hipofizar - hipopituitarism
- gigantism/acromegalie - hipotiroidism
- infarct de miocard - malabsorbţie
- AVC, convulsii - galactozemie
- neoplasm de pancreas - boli comsumptive - neoplazii
Metodele de dozare a glucozei serice sunt metode colorimetrice, metode enzimatice şi metode de
oxido-reducere.
Metodele colorimetrice sunt tehnici folosite pentru a determina concentraţia compuşilor

coloraţi în soluţie prin măsurarea absorbanţei la o lungime specifică de undă.
Metoda de dozare cu o-toluidina - prin condensarea glucozei cu o-toluidina va rezulta un compus
colorat în verde a cărui intensitate se poate determina prin colorimetrare.
Metoda de dozare cu antrona - glucoza în reacţie cu acidul sulfuric va forma hidroximetilfurfurol,
care va reacţiona cu antrona ducând la formarea unui compus de culoare galben-roşiatică, reacţie
ce are loc la o lungime de undă de 620 nm.
Metode enzimatice
2
Metoda cu hexochinaza pentru determinarea glucozei
Această metodă enzimatică se bazează pe metoda lui Slein care foloseşte două enzime:
hexokinaza şi glucozo-6-fosfat dehidrogenaza.
Principiu metodei. Glucoza este fosforilată de adenozin trifosfat (ATP) în prezenţa hexokinazei
formându-se glucozo-6-fosfat care este oxidat în prezenţa enzimei glucozo 6-fosfat
dehidrogenaza realizând reducerea lui NADP+ la NADPH şi H+. Reacţia are loc la o lungime de
undă cuprinsă între 340-410 nm.
CH2OH CH2OPO 3H2

O O
H H H H
H hexokinazã H
H + ATP + ADP
OH OH H
HO OH HO OH
H OH
H OH
glucozã glucozo-6-fosfat
CH2OPO3H2 CH2OPO3H2
O O
H H glucozo-6-fosfat H
H + NADP
+ dehidrogenaza H
OH O + NADPH + H+
H OH H
HO OH HO
H OH H OH
glucozo-6-fosfat 6-fosfogluconat
Valori de referinţă: 74- 106 mg/dL (4.1-5.9 mmol/L)

Metoda cu glucozoxidaza
Principiul metodei. Glucoza este determinată după oxidarea enzimatică în prezenţa
glucozoxidazei cu formare de peroxid de hidrogen care reacţionează cu fenol şi 4-
aminoantipirină, reactie catalizată de peroxidază ducând la formarea unui complex chinonic roşu.
CH2OH COOH
O O
H H H
H glucozoxidazã H
OH H + O2 O + H2O 2
OH H
HO OH HO
H OH H OH
glucozã gluconolactonã
peroxidazã
2H2O2 + 4 aminoantipirina + fenol chinoniminã rosie + 4H2O
Valori de referinţă:
Copii şi adulţi: 70- 105 mg/dL (3,89-5,83 mmol/L)
Reactivi:
- reactiv de lucru: fosfat 70 mmol/l, fenol 5 mmol/l, glucozoxidaza ˃10 U/ml, peroxidaza ˃1
U/ml, 4-aminoantipirina 0,4 mmol/l, pH 7,5;
3
- standard glucoză 100 mg/dl.
Mod de lucru:
Se aduc reactivii la temperatura camerei şi se pipetează conform tabelului:
Probă Standard Blanc
Probă 10 μl - -
Standard de glucoză - 10 μl -
Reactiv de lucru 1 ml 1 ml 1 ml
Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 370C.

Se citeşte absorbanţa probei şi a standardului faţă de blanc la λ = 500 nm şi se calculează
concentraţia de glucoză din proba de analizat conform formulei:
( A 2 – A 1 ) prob ă
Cprobă = Aprobă/Astandard x Cstandard
( A 2 – A 1) standard
Când determinarea se realizează pe plasmă, anticoagulanţii folosiţi pot fi: heparina, EDTA, oxalat
sau fluorură. Serul sau plasma trebuie separate prompt de eritrocite pentru a prevenii glicoliza.
Glucoza este stabilă în probele de ser sau plasmă 5 zile la 2-8 0C.
Metode de oxido-reducere a glucidelor

Reacţia Seliwanoff
Principiu: Această reacţie are ca scop diferenţierea cetozelor de aldoze, fiind mai specifică
cetozelor când în urma reacţiei se obţin produşi coloraţi în roşu faţă de aldoze când se obţin
produşi coloraţi în roz deschis. În urma reacţiei cu rezorcina monozaharidele formează produşii
de condensare coloraţi, reacţia având loc în prezenţa HCl concentrat.
HO OH HO OH HO O OH
+ H - 2H2O
H
CH
O
li
CH O
Q CH2OH
O CH2OH
Reactivi:- reactiv Seliwanoff

- 1 m l soluţie de fructoză, 1 ml soluţie de glucoză
Modul de lucru:
I eprubetă a II-a eprubetă
1 ml soluţie fructoză 1 ml soluţie glucoză
2 ml reactiv Seliwanoff 2 ml reactiv Seliwanoff
se încălzesc probele până la fierbere şi apoi se răcesc
4
coloraţie roşie coloraţie roz slab
5
- pozitivã
- pozitivã 4. Reactia Bial

f (pentoze)
- pozitivã
('l - negativã 5. Reactia f
f
- pozitivã (monozaharid) (fructozã)
(glucid reducãtor) 3. Reactia (hexoze) ol
Seliwanoff - negativã
Barfoed (glucozã)
l
- incolor
(monozaharid, 2. Reactia I - maltosazonã
Fehling - negativã 4,,. Reactia de formare a osazonelor
dizaharid, .J
\ - lactosazonã
' (dizaharid)
solutie fãrã glucid)
, - pozitivã - zaharozã
- negativã 3 . Hidrolizã 4,. Reactia Benedict
(glucid nereducãtor) acidã - negativã - solutie fãrã glucid
1. Reactia
cu iod
- rosu-brun J
- clar (dextrine)
l
- opalescent (glicogen)
- albastru
(amidon)
Identificarea glucidelor
6
Reactia Fehling
Principiu: Zaharurile cu caracter reducător modifică culoarea albastră a soluţiei de hidroxid de
cupru cu obţinerea unui precipitat de oxid cupros de culoare roşu-cărămiziu.
Soluţia Fehling se prepară în laborator înainte de utilizare din două soluţii separate Fehling A şi
Fehling B. Fehling A este o soluţie de culoare albastră de sulfat de cupru (II) cu acid sulfuric în
timp ce Fehling B este o soluție de tartrat de sodiu și potasiu şi hidroxid de sodiu.
CuSO 4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO 4
COOK O- COO -
I
H - C- OH C O O - C- H 2 Na+
Cu(OH)2 + 2 I ►
H C OH Cu
~ / I
HO C H 2 K+
H- C- OH
H - C- O ~
'
I I
COONa O C
I -
COO O-
CH2OH COOH
O O
H H H H
H H + Cu2O + 2H2O
+ 2Cu(OH)2
OH H OH H
HO OH HO OH
H OH H OH
Se amestecă cele două soluţii Fehling A şi B în cantităţi egale pentru a obţine soluţia Fehling
finală pregătindu-se o cantitate de reactiv suficientă pentru câteva zile. Înainte de utilizare se
verifică reactivul astfel încât să nu se reducă de la sine prin fierberea unei eprubete cu 2 - 3 ml de
soluţie lucru.
Mod de lucru:
Într-o eprubetă ce conţine 2-3 ml reactiv Fehling se pipetează 2-3 ml urină ce a fost
centrifugată înainte, amestecul fiind încălzit la flacără timp de 1-3 min. Eprubeta cu urină care nu
conţine glucoză rămâne colorată albastru închis, iar eprubeta care conţine glucoză culoarea
virează din verde, în galben, apoi în roşu cărămiziu în funcţie de conţinutul de glucoză al urinei.
Există situaţii când urina conţine pe lânga glucoză şi proteine ducând la un rezultat eronat, iar în
acest caz urina se tratează în prealabil cu reactiv Courtonne.
Reactia Nylander
Principiu: Datorită grupării carbonil, glucidele cu proprietăţi reducătoare transformă azotatul de
bismut într-un compus de culoare neagră, bismut metalic.
Reactivi:
- Reactivul Nylander;
- Soluţii 2% de glucoză, lactoză, fructoză.
Mod de lucru:
7
Într-o eprubetă care conţine 1 ml soluţie glucidică se pipetează 1 ml reactiv Nylander.
Amestecul se încălzeşte agitând continuu până la fierbere cu apariţia unui precipitat negru-brun.
Reactia Barfoed
Principiu: Această reacţie permite diferenţierea între monozaharidele şi dizaharidele reducătoare
datorită caracterului slab acid al reactivului Barfoed care reduce numai monozaharidele.
Mod de lucru:
Amestecul rezultat din adăugarea într-o eprubetă a 1 ml soluţie probă şi 2 ml soluţie
reactiv Barfoed se fierbe 1 minut iar apoi se lasă la răcit. Dacă proba conţine monozaharide va
rezulta un precipitat roşu-caramiziu.
Testul Bial
Este o reacţie caracteristică pentozelor, acestea transformându-se în furfural care reacţionează cu
orcinolul în prezenţa ionului feric formând un precipitat de culoare verde.
Mod de lucru:
Într-o eprubetă se introduc 5 ml soluţie Bial cu 3 ml soluţie de pentoze, amestec ce se
încălzeşte la flacără până la formarea bulelor la suprafaţa amestecului, după care amestecul se
răceste sub jet de apă.
Reacţia Molisch
Principiu: Prin reacţia monozaharidelor cu acidului sulfuric concentrat rezultă un produs numit
furfurol (hidroximetil furfurol) care formează produşi de culoare violetă prin reacţia cu α-
naftolul. Toate glucidele dau la cald această reacţie.
OH
OH
H
R CH
R CH O + -H2O O
O
H
OH
OH
Reactivi: - reactivul Molisch

- H2SO4 conc.
- soluţie de glucoză 1%
Mod de lucru:
Se pipetează într-o eprubetă 1 ml soluţie de glucoză 1%, 1-2 picături soluţie de alfa-naftol
şi câteva picături soluţie de H2SO4 concentrat având grijă să inclinăm uşor peretele eprubetei cu
formarea unui inel violet la suprafaţa de contact a celor două lichide.
Reacţia cu acidul picric
8
Principiu: Acidul picramic de culoare brun-roşie se formează prin reducerea unei grupări nitro a
acidului picric de către glucidele reducătoare.
NO 2 NH2
HO
O 2N
D [] D
acid picric
NO2
OH-
HO
O 2N
acid picramic
NO 2
Reactivi: - acid picric 0,5%

- glucoză 1%
- NaOH 10%
Mod de lucru:
Se adaugă într-o eprubetă următoarele: 1 ml soluţie de glucoză, 2 ml acid picric şi 1 ml
NaOH. Amestecul se încălzeşte agitând continuu până ce apare o coloraţie roşie-brună.
Teste de evaluare a tulburărilor metabolismului glucidic
Pe lângă determinarea glicemiei mai există o serie de alte teste pentru precizarea
tulburărilor metabolismului glucidic care ne oferă informaţii despre un dezechilibru al
homeostaziei glucozei pe o perioadă mai mare de timp:
- testul oral de toleranţă la glucoză
- determinarea glucozei urinare
- testul de toleranţă la glucoză de 3 ore
- determinarea hemoglobinei glicozilate
- determinarea corpilor cetonici şi a proteinelor urinare
Testul oral de toleranţă la glucoză sau hiperglicemia provocată explorează toleranţa la
glucide şi este indicat atunci când există suspiciune de diabet zaharat cu valori ale glicemiei la
limita superioară a normalului sau puţin peste, când există un risc crescut de a face diabet
(obezitate, antecedente heredo-colaterale de diabet zaharat, când o femeie naşte un făt macrosom
cu o greutate ce depaşeşte 4000 gr, pacient cu hipertensiune arterială şi trigliceride crescute) sau
orice altă situaţie care ridică suspiciunea de diabet zaharat. Testul de toleranţă la glucoză este
contraindicat când absorbţia glucidelor este afectată: intervenţii chirurgicale pe stomac, rezenţie
de intestin, sindrom de malabsorbţie, infarct de miocard, diabet manifest. Înainte de efectuarea
testului pacientul trebuie să aibă un regim alimentar normal în ultimele 3 zile evitându-se
consumul de alcool, cafea, tutun şi efortul fizic.
Efectuarea testului:
- se recoltează o probă de sânge venos dimineaţa pe nemâncate;
- se administrează 75 g de glucoză dizolvată în apă în decurs de 5 minute;
- se recoltează o nouă probă de sânge la 120 min;
- la indicaţia medicului se pot recolta mai multe probe: 30, 60, 90, 120 şi la 180 min;
9
- pacientul este monitorizat pe toata durata testului deoarece pot apare semne şi simptome de
hipo/hiperglicemie, nervozitate, slăbiciune.
Interpretarea rezultatelor:
- dacă la 120 min valoarea glicemiei este <140 mg/dl cu glicemia bazală <110 mg/dl pacientul nu
are diabet;
- pacient cu intoleranţă la glucoză dacă la 120 min glicemia este între 140-199 mg/dl cu glicemia
bazală sub 126 mg/dl;
- diabet zaharat dacă glicemia la 120 min > 200 mg/dl cu glicemia bazală > 126 mg/dl
Pacienţii cu intoleranţă la glucoză datorită valorilor glucozei peste limitele normale au fost
încadraţi ca având prediabet. Aceşti pacienţi mai pot avea şi hipertensiune arterială, obezitate (în
special abdominală), dislipidemie şi au un risc crescut de a dezvolta diabet şi boli cardio-
vasculare.
Urina unui pacient sănătos conţine cantităţi mici de glucoză ce nu poate fi dozată prin
metodele uzuale, dar, în diabetul zaharat nivelul glicemiei depaşeşte pragul de 180 mg/dl cu
eliminarea glucozei în urină în cantitate dozabilă (glucozuria). Glucozuria se determină fie
cantitativ în urină recoltată în 24 ore, fie calitativ cu ajutorul unor stripuri care îşi modifică
culoarea atunci când sunt introduse în urina ce conţine glucoza. Glicozuria apare în diabetul
zaharat, la unele femei însărcinate, pacienţii cu gastrectomie, hipertiroidism, leziuni hepatice şi
intracraniene.
Testul de toleranţă la glucoză de 3 ore este indicat în situaţiile când se obţin valori
anormale la testul de screening al diabetului gestaţional. Diabetul gestaţional este un alt tip de
diabet în care apar valori crescute ale glicemiei la femeia însărcinată anterior sănătoasă. Se
recomandă determinarea valorilor glicemiei pe tot parcursul sarcinii şi mai ales în ultimul
trimestru, iar pentru excluderea diabetului gestaţional efectuarea unui test de toleranţă la 3h în
săptămânile 24-28 de sarcină. După naştere afecţiunea este reversibilă cu încadrarea glicemiei
mamei în limitele normale. Mamele care la naştere au născut feţi macrosomi cu o greutate de
peste 4 kg au un risc crescut de a dezvolta diabet zaharat.
Hemoglobina glicozilată (Hb A1c) este un test care permite evaluarea şi monitorizarea
statusului glicemic pe termen lung a pacienţilor cu diabet zaharat, oferind informaţii despre
media glicemiilor din ultimele 3 luni. Hemoglobina glicozilata A1 sau hemoglobina normală de
adult are trei fracţiuni: HbA1a, HbA1b, HbA1c (este şi cea mai importantă fracţiune
reprezentând aprox. 80% din A1) şi rezultă prin reacţia de ataşare non-enzimatică continuă şi
ireversibilă a glucozei la molecula de hemoglobină. Hemoglobina glicozilată oferă informaţii
asupra riscului de a dezvolta complicaţii ale diabetului zaharat (micro- şi macrovasculare) şi
poate evalua cea mai eficientă metodă de tratament. Se recomandă efectuarea testului la interval
de 3-4 luni pentru pacienţii cu diabet zaharat de tip I şi la 6 luni pentru cei cu diabet zaharat tip
II.
Valoarea normală este între 4,5% şi 6% (din hemoglobina totală). O valoare între 6% şi
6,4% este prediabet, iar peste 6,5% vorbim de diabet putând apare valori chiar de 20% în cazul
unui control metabolic deficitar. Valoarea de 7% reprezintă un control glicemic adecvat pentru
10
pacientul cu diabet. Acest test este influenţat de anumite afecţiuni legate de hemoglobina totală
cum ar fi: hemoglobinopatii, anemii hemolitice, anemii feriprive, posttransfuzional, intoxicaţia
cu plumb, gamapatii monoclonale, precum şi datorită unor medicamente.
Corpii cetonici (acetona, acidul betahidroxibutiric şi acidul acetil acetic) sunt produşi în
organism în absenţa insulinei şi determină starea de cetoacidoză cu scăderea pH sângelui sub
7,35, iar prezenţa acestora în urina, transpiraţie sau aerul expirat determină apariţia unui miros
caracteristic de oţet sau mere fermentate. În mod normal se găsesc în urină într-o cantitate foarte
mică ceea ce face imposibilă detectarea lor la examenul sumar de urină. Prezenţa corpilor
cetonici în urină este dată de diabetul zaharat, infecţii microbiene, după vărsături prelungite,
toxicoza gravidică, în inaniţie sau casexii.
11
Lipide II
Dozarea colesterolului total şi a HDL-colesterolului.
Determinarea LDL-colesterolului.
Obiective:
- Definirea termenului de lipide şi cunoaşterea principalelor proprietăţi ale acestora;
- Definirea lipoproteinelor şi descrierea fiecărei clase de lipoproteine;
- Interpretarea valorilor lipidelor şi lipoproteinelor în funcţie de riscul aterosclerotic;
- Definirea dislipidemiilor şi exemplificarea principalelor tipuri de dislipidemii;
- Cunoaşterea principalelor metode de dozare ale lipidelor, colesterolului (inclusiv a
fracţiunilor acestuia), triacilglicerolilor şi interpretarea variaţiilor fiziologice şi patologice
ale acestora
Colesterolul este un lipid amfipatic component al particulelor de lipoproteine plasmatice

şi component structural al membranelor plasmatice celulare. Aproximativ jumătate din
colesterolul din organism este sintetizat, în timp ce cealaltă jumătate este absorbită din alimente.
O parte din colesterol este excretat în lichidul biliar. Transformarea colesterolului în săruri biliare
ajută la digestia şi solubilizarea lipidelor. Transportul colesterolului de către VLDL în circulaţie
spre ţesuturi joacă un rol important în formarea membranelor celulare şi în biosinteza hormonilor
steroizi.
Dozarea colesterolului total şi liber
Principiu:
Metoda presupune extragerea colesterolului liber din ser cu etanol şi precipitarea
ulterioară a acestuia cu digitonină. Colesterolul esterificat se obţine prin diferenţa dintre valoarea
colesterolului total şi cea a colesterolului liber.
Reactivi:
- 2,5 g FeCl3x6H2O în 100 ml H3PO4 85%;
- reactivul de culoare: 4 ml soluţie de clorură ferică în 50 ml H2SO4 concentrat;
- soluţie de digitonină 1% (1g digitonină în 50 ml etanol 95% şi completat la 100 ml cu
apă bidistilată) care se poate păstra la întuneric timp de 6 luni;
- standard de colesterol (200 mg/dl).
Dozarea colesterolului total
Mod de lucru:
Ser 0,1 ml - -
Standard de colesterol - 0,1 ml -
Apă bidistilată - - 0,1 ml
Acid acetic glacial 6 ml 6 ml 6 ml
1
Reactiv de culoare 4 ml 4 ml 4 ml
Se citesc absorbanţele probei şi standardului după 10 minute la λ = 550 nm în cuva de 1
cm faţă de blanc şi se calculează valoarea colesterolului total plasmatic după următoarea
formulă:
mg% colesterol total = (AP/AS) x conc. standard
Dozarea colesterolului liber
Mod de lucru:
Ser 0,1 ml - -
Acetonă-95% etanol (1:1,v/v) 1 ml - -
Sol. digitonină 1 ml 1 ml 1 ml
Se agită, se lasă în repaus 10 minute şi se centrifughează la 3000 rpm timp de 5 minute.
Se aruncă supernatantul şi se usucă precipitatul timp de 5 minute în curent de N2. Reziduul se
resuspendă în 4 ml acetonă, apoi se vortexează. Se centrifughează, se decantează supernatantul şi
se usucă precipitatul timp de 5 minute.
Precipitat + + -
CH3COOH glacial 6 ml 6 ml 6 ml
Reactiv de culoare 4 ml 4 ml
După 10 minute se citeşte absorbanţa probei la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc.

Calcul:
mg% colesterol liber = (AP/AS) x conc. standard
mg% colesterol esterificat = mg% colesterol total - mg% colesterol liber
Valori normale: reprezintă 60-80% din valoarea colesterolului total. Astfel, raportul colesterol
esterificat/colesterol total se încadrează în mod normal în intervalul 0,60-0,80. Acest raport este
scăzut în afecţiuni hepatice grave (comă hepatică) şi este util în diagnosticul şi diferenţierea
icterelor:
- normal în icterele obstructive;
- moderat scăzut în icterele catarale;
- scăzut în icterele parenchimatoase grave.
Dozarea colesterolului total din ser se mai poate realiza şi utilizând metoda enzimatică.
Principiu:
Esterii de colesterol sunt hidrolizaţi în prezenţa colesterol - esterazei cu eliberarea
colesterolului şi a acizilor graşi. Colesterolul rezultat suferă o reacţie de oxidare în prezenţa
colesterol oxidazei cu formarea 4-Δ colestenonei şi apă oxigenată. Apa oxigenată reacţionează cu
2
fenolul şi 4-amino antipirina în prezenţa peroxidazei formând un compus chinonic colorat în
roşu, măsurabil la spectrofotometru.
Reacţiile care au loc sunt următoarele:
O O
colesterol-esterazã
R- C-OH
+ H2O HO
+
li
R- C-O
Esteri de colesterol Colesterol Acizi graşi
colesterol-oxidazã
HO
+ O2 O
+ H2O2
Colesterol 4-Δ Colestenona
peroxidazã
2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirină Chinonimină (culoare roşie) + 4H2O
Reactivi:
- reactivul de lucru conţine în soluţie tampon de pH 7,0: colesterol esterază ˃ 0,2 U/ml,
colesterol oxidază ˃ 0,1 U/ml, peroxidază ˃ 0,8 U/ml, fenol 28 mmol/l, 4-amino-antipirină 0,5
mmol/l;
- standard de colesterol 200 mg/dl (5,18 mmol/l)
Mod de lucru:
Standard de colesterol - 10 μl -
Ser 10 μl - -
Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei (16-25oC) sau 5 minute la 370C.

concentraţia de colesterol din proba de analizat conform formulei:
Când determinarea se realizează pe plasmă, anticoagulanţii folosiţi pot fi: heparina, EDTA,
oxalat sau fluorură. Colesterolul este stabil în probele de ser sau plasmă 7 zile la 2-8 0C.
3
Nivelul colesterolului seric se corelează cu variaţiile fiziologice ale lipemiei: vârsta,
sexul, rasa, alimentaţia, echilibrul neuro-endocrin, profesia reprezentând factori care pot
influenţa valorile acestuia.
Hipercolesterolemiile pot apărea în: hipercolesterolemie esenţială, hiperlipemie esenţială,
hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom nefrotic (nefroze lipoidice), ateroscleroză,
intoxicaţii cu fosfor, CCl4, alcool, morfină, icter mecanic, pancreatite, alcoolism.
Hipocolesterolemiile pot apărea în:
 afecţiuni genetice precum: analfalipoproteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia;
 hepatite acute, hepatite cronice şi ciroze decompensate (numai colesterolul esterificat -
prin deficit al enzimelor implicate în acest proces), hipertiroidism;
 infecţii bacteriene: pneumonie, tuberculoză, difterie, lepră;
 hemopatii severe: leucemii.
Colesterolemia este influenţată în mare măsură de colesterolul endogen şi în mai mică
măsură de cel de origine exogenă.
Evaluarea nivelelor HDL-colesterolului şi LDL-colesterolului este importantă în infarctul
miocardic. Pentru persoanele cu hipercolesterolemie este foarte importantă determinarea HDL-
colesterolului, care conferă protecţie împotriva riscului cardio-vascular, nivelul scăzut de HDL,
eventual coroborat cu nivele crescute ale trigliceridelor serice indicând un risc crescut
coronarian.
Determinarea LDL-colesterolului este importantă la pacienţii:
a) tineri cu boli vasculare;
b) cu xantoame;
c) cu hipercolesterolemie secundară.
Determinarea nivelului trigligeridelor serice este important la pacienţii:
a) cu nivel scăzut al HDL-colesterolului;
b) cu hipertrigliceridemie secundară;
c) cu ocluzie a arterelor periferice.
Lipide şi lipoproteine care influenţează riscul aterosclerotic.

Riscul aterosclerotic este:
normal uşor crescut crescut
Colesterol total < 220 220 – 260 > 260
Trigliceride < 150 150 - 200 > 200
LDL-colesterol < 150 150 - 190 > 190
HDL-colesterol bărbaţi > 55 35 - 55 < 35
HDL-colesterol femei > 65 45 - 65 < 45
Valorile sunt în mg/dl.
4
Se determină colesterolul total, HDL-colesterolul şi triacilglicerolii. Fracţiunile
plasmatice VLDL şi LDL precipită în prezenţa ionilor de Ca/Mg/Mn şi polianioni/polianioni
sulfaţi. După centrifugare se determină HDL-colesterolul în supernatant.
Determinarea nivelului seric al HDL- colesterolului

Separarea HDL
Fracţiunile VLDL şi LDL-colesterol şi chilomicronii din proba de analizat precipită în
prezenţa acidului fosfotungstic şi al MgCl2. După centrifugare conţinutul în HDL - colesterol al
supernatantului va fi determinat spectrofotometric după reacţiile de mai jos:
Esteri de colesterol + H2O Colesterol + Acizi graşi
colesterol-oxidazã
Colesterol + ½ O2+ H2O Colestenona + H2O2
peroxidazã
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + Diclorfenilsulfonat Chinonimina + 4H2O
Reactivi:
- soluţie 2 M MgCl2;
- reactiv de precipitare: 32 g/l acid fosfotungstic: 0,4 mmol/l MgCl2 4:1;
- plasma sau ser.
Mod de lucru:
Peste 500 μl plasmă se adaugă 50 μl reactiv de precipitare; se agită probele şi se
centrifugheză la 10000 rpm 15 minute la 40C; după centrifugare în supernatant rămâne numai
HDL, iar colesterolul conţinut în acesta se determină prin metoda enzimatică.
Calcularea concentraţiei de LDL-colesterol

Calcularea conţinutului de LDL-colesterol din probele de analizat se face după
următoarea ecuaţie:
LDL-colesterol = Colesterol total - (HDL-colesterol + trigliceride/5)
Observaţie: ecuaţia de mai sus nu se poate aplica pentru probele pacienţilor care au o
concentraţie de trigliceride ≥ 400 mg/dl sau pentru pacienţii cu hiperlipoproteinemie de tip I şi
III! Determinarea LDL-colesterolului poate fi efectuată la pH 5.12 (precipitarea izoelectrică cu
heparină)
5
Laboratoarele 3 si 4 Medicina
Lipide. Dozarea trigliceridelor. Lipidograma. Diagnosticul de laborator al dislipidemiilor.

Dozarea colesterolului total şi a HDL-colesterolului.
Determinarea LDL-colesterolului.
Obiective:
- Definirea termenului de lipide şi cunoaşterea principalelor proprietăţi ale acestora;
- Definirea lipoproteinelor şi descrierea fiecărei clase de lipoproteine;
- Interpretarea valorilor lipidelor şi lipoproteinelor în funcţie de riscul aterosclerotic;
- Definirea dislipidemiilor şi exemplificarea principalelor tipuri de dislipidemii;
- Cunoaşterea principalelor metode de dozare ale lipidelor, colesterolului (inclusiv a
fracţiunilor acestuia), triacilglicerolilor şi interpretarea variaţiilor fiziologice şi patologice
ale acestora
Lipidele (din cuvântul grecesc lipos = grăsime) sunt compuși chimici heterogenici
insolubili în apă, dar solubili în solvenți organici nepolari cum ar fi: hexan, cloroform etc. Lipidele,
care apar plante și animale ca și componente structurale și de rezervă, sunt anhidre datorită naturii
nepolare și furnizează o cantitate de energie mai mare decât carbohidrații care sunt puternic
hidratați datorită naturii polare.
Prezența lipidelor în dietă contribuie considerabil la gust – induc răspunsuri olfactive şi contribuie
la textura alimentelor – şi de asemenea furnizează acizii grași esențiali ce nu pot fi sintetizați în
organismul uman, dar sunt necesari pentru creștere și dezvoltare. Lipidele joacă un rol foarte
important în absorbția efectivă a vitaminelor liposolubile A, D, E, și K din intestin precum şi în
manifestarea activităţii unor enzime – enzimele microzomale (ex.: glucozo – 6 – fosfataza) și
enzimele mitocondriale (ex.: β- hidroxibutirat dehidrogenaza). În organismul uman, un derivat
lipidic, colesterolul, este precursorul unor compuşi importanţi cum ar fi: corticosteroizii
suprarenalieni, hormonii sexuali și vitamina D3 (colecalciferolul). O mare parte din lipidele
mamiferelor se găsesc subcutanat și acționează ca izolator împotriva pierderilor de căldură excesivă
cu mediul înconjurător.
Clasificarea lipidelor:
 Lipide simple - esteri ai acizilor grași cu glicerol și alcooli monohidroxilici. În funcție de
componenta alcoolică ele sunt subdivizate în uleiuri sau grăsimi și ceruri.
Grăsimile denumite și triacilgliceroli sunt esteri ai acizilor grași cu glicerol; ex: uleiurile vegetale
din plante și unt.
Cerurile sunt esteri ai acizilor grași și alcooli alții decât glicerol; ex: ceara din plante (carnauba),
ceara de insecte (ceara de albine), ceara animală (lanolina).
 Lipide compuse – esteri conținând grupări chimice în plus față de alcool și acizi grași. În
funcție de gruparea chimică conținută ele se subdivid în fosfolipide, glicolipide, sulfolipide și
lipoproteine.
1
Fosfolipidele conțin gruparea fosfat şi pot fi:
 Glicerofosfolipide, dacă alcoolul constituent este glicerol (ex: lecitina)
 Sfingofosfolipide, dacă alcoolul este sfingozină (ex: sfingomielina)
Glicolipidele conțin unități de hexoză – de preferință galactoză împreună cu acizi grași sau alcool
(ex: cerebrozide).
Sulfolipidele din plante conțin hexoză sulfatată cu acizi grași și alcool.
Lipoproteinele sunt constituite din subunități proteice şi lipide, fiind clasificate în funcție de
densitate și componenta lipidică în: chilomicroni, VLDL, LDL și HDL.
 Lipide derivate – substanțe derivate din lipidele simple și compuse prin hidroliza alcoolilor,
acizilor grași, aldehidelor, cetonelor, sterolilor și hidrocarburilor.
Lipidele sunt compuși insolubili în apă care conțin fie regiuni hidrofobe (nepolare), fie
amfipatice (regiuni polare și nepolare).
Cele mai bine cunoscute componente ale lipidelor sunt acizii graşi. Acizii graşi sunt acizi
carboxilici cu lanţ lung sintetizaţi prin condensarea şi reducerea unităţilor de acetil SCoA de către
acid gras sintaza. Cei mai importanţi au nume nesistematic în utilizarea uzuală. Acizii stearic (C18)
şi palmitic (C16) sunt saturaţi (fără duble legături), acidul oleic (C18:Δ9) şi acizii linoleic (C18:Δ9,12)
şi linolenic (C18:Δ9,12,15) sunt polinesaturaţi. Toţi aceşti acizi graşi comuni sunt acizi graşi cis (E).
Datorită legăturilor din lanţ provocate de dublele legături, acizii graşi nesaturaţi tind să fie lichizi
la temperatura camerei (ei sunt mai uşor de împachetat împreună pentru a forma un solid).
Bacteriile şi plantele (care nu au sistem de termoreglare) vor folosi mai mulţi acizi nesaturaţi în
membranele lor celulare când sunt expuse la frig: aceasta ajută la menţinerea fluidităţii
membranare.
Acizii graşi esenţiali

Organismul uman nu poate sintetiza toţi acizii graşi care se găsesc în acesta. Aceşti acizi
graşi care nu sunt sintetizaţi în organism, dar sunt necesari pentru creşterea şi dezvoltarea normală
se numesc acizi graşi esenţiali şi ei trebuie suplimentaţi prin dietă. Aceştia sunt: acidul linoleic
(omega 6), acidul linolenic (omega 3) şi acidul arahidonic. Acidul arahidonic este present în
mâncare, dar el poate fi sintetizat şi de către organism din acidul linolenic. Sistemul de denumire
al acestora omega (ω) indică poziţia dublei legături prin numărare de la celălalt capăt al moleculei
(de la carbonul ω).
Lipoproteine
Lipidele sunt transportate prin sânge ca lipoproteine, conţinând un miez format din
triacilgliceroli alimentari, colesterol esterificat şi lipide endogene (fosfolipide cu caracter slab polar
- fosfatidiletanolamina, inozitolfosfatide, sfingolipide), înconjurat de o sferă formată din lipide
polare (fosfatidilcolina, fosfatidilserina), colesterol liber şi apoproteine. Apoproteinele
(apolipoproteine, aproteine) reprezintă componenta proteică a lipoproteinelor care îndeplinesc
importante funcţii biologice: asigură menţinerea în soluţie a lipidelor plasmatice şi transportul lor;
2
sunt cofactori importanţi ai unei reacţii enzimatice în metabolismul lipidelor (de ex.: apo C II este
cofactor al lipoproteinlipazei, apo A I este cofactor al enzimei LCAT); o serie de apoproteine (de
ex.: apo B-100, apo B-48, apo E) reprezintă liganzi, prin intermediul cărora receptorii celulari
recunosc şi captează lipoproteinele respective în vederea catabolizării lor. Lipidele componente ale
lipoproteinelor sunt: colesterol (aproximativ 70% din totalul colesterolului este esterificat cu acizi
graşi nesaturaţi), triacilgliceroli şi fosfolipide. Triacilglicerolii rezultaţi prin absorbţia intestinală
sau din ficat nu sunt transportaţi în formă liberă prin sânge, ci sub formă de chilomicroni, VLDL
şi sub formă de complexe albumină - acizi graşi liberi.
Există două funcţii majore ale lipoproteinelor: solubilizează lipidele şi reglează transportul
lipidelor în şi din celulele şi ţesuturile ţintă specifice.
Clasele de lipoproteine plasmatice se deosebesc prin:
 raportul dintre proteine şi lipide;
 raportul dintre diferitele componente lipidice pe care le transportă (triacilgliceroli,
fosfolipide, colesterol);
 natura apoproteinelor din compoziţia lor.
Lipoproteinele sunt clasificate prin ultracentrifugare în gradient de densitate în:
 Chilomicroni.
chilomicroni  VLDL (Very Low Density
VLDL Lipoproteins) – lipoproteine cu
LDL densitate foarte mică;
HDL  LDL (Low Density Lipoproteins) –
lipoproteine cu densitate mică;
 HDL (High Density Lipoproteins) –
lipoproteine cu densitate mare.
Lipoproteinele sunt clasificate pe baza proprietăţilor lor electroforetice în:

- α - lipoproteine (HDL);
- pre-β- lipoproteine (VLDL);
- β- lipoproteine (LDL);
- chilomicroni.
3
chilomicroni
linia
de LDL VLDL HDL
start
- sensul de migrare +
Între fracţiunile lipoproteice rezultate prin ultracentrifugare şi fracţiunile lipoproteice
separate prin separare electroforetică în gel de agaroză există următoarea corespondenţă
aproximativă: chilomicronii corespund alfa2 – lipoproteinelor şi care rămân pe linia de start, LDL
care corespund beta-lipoproteinelor, VLDL care corespund pre-beta lipoproteinele şi HDL care
corespund alfa1-lipoproteinelor.
Lipidele au un rol important în structura coloidală a umorilor: au acţiune asupra
suprafeţelor celulare, participă la rezistenţa eritrocitelor la hemoliză. După o hrană bogată în lipide,
concentraţia lipidelor totale sanguine (colesterol liber şi esterificat, triacilgliceroli, fosfolipide,
acizii graşi liberi şi componente lipidice minore - vitamine liposolubile şi hormoni steroizi) -
lipemia, creşte simţitor şi se menţine ridicată timp de 6-7 ore după care revine la normal (500-800
mg/dl plasmă). Cunoaşterea valorii lipemiei este utilă în orientarea investigaţiilor în faţa unei
hiperlipemii, deoarece studiile clinice au evidenţiat o corelare a diferitelor suferinţe organice, ca
tipul de boală, cu nivelul lipemiei.
Creşteri peste limita superioară a valorilor lipemiei sunt denumite hiperlipemii. Acestea
pot fi:
 fiziologice: sarcină, status post-prandial, vârstă, sex, rasă, echilibru neuroendocrin, climă
 patologice, care la rândul lor se subîmpart în : primare şi secundare
Hiperlipemii primare:
 hiperlipemia esenţială;
Hiperlipemii secundare:
 mixedem;
 sindrom nefrotic;
 icter mecanic;
 diabet zaharat;
 hemocromatoză;
 stări hipoglicemice (hiperlipemii de mobilizare).
Scăderile valorilor lipemiei sub limita inferioara a normalului sunt denumite hipolipemii.
La nou-născuţi poate apărea o hipolipemie fiziologică.
4
Hipolipemii patologice:
 hipertiroidism
 steatoree
 insuficienţă hepatică gravă
În urină concentraţia de lipide este de 8,5 mg/24 de ore. Valorile crescute se întâlnesc în
glomerulonefrite.
Determinarea concentraţiei lipidelor totale se poate face prin metoda colorimetrică cu
fosfovanilină (metoda Woodman-Price): lipidele din ser, în mediu acid şi în prezenţa reactivului
fosfo-vanilinic, dau compuşi coloraţi în roz, Intensitatea culorii obţinute fiind proporţională cu
concentraţia lipidelor din proba analizată.
În raport cu diverşi factori nutriţionali, metabolici şi hormonali există modificări
semnificative ale importantelor cantităţi de lipide vehiculate de plasmă şi numeroase studii au
evidenţiat legătura strânsă care există între modificările lipidelor plasmatice şi incidenţa bolilor
cardiovasculare şi a aterosclerozei.
Chilomicronii reprezintă forma de transport şi de distribuire a lipidelor exogene
(componenta lipidică majoră - triacilgliceroli) către diferite ţesuturi ale organismului: ţesut adipos
40%, ficat 20%, plămân 20%, muşchi şi rinichi 20%.
VLDL sunt lipoproteinele cu conţinut ridicat de lipide (90-93%) în care sunt predominaţi
triacilglicerolii (de provenienţă endogenă ~56%). Funcţia primordială a VLDL este transportul
triacilglicerolilor de origine endogenă sintetizaţi în ficat, spre ţesuturile extrahepatice. Alimentaţia
hipercalorică şi obezitatea, stimulează sinteza hepatică de triacilgliceroli şi implicit formarea de
VLDL. După un post de 8-16 ore la un subiect normal sângele recoltat dimineaţa este complet
lipsit de VLDL, acestea fiind catabolizate sub acţiunea lipoproteinlipazei. În inaniţie sau în diabet,
plasma cuprinde VLDL, ca rezultat al unei sinteze pronunţate de triacilgliceroli hepatici pe seama
acizilor graşi liber circulanţi.
LDL au drept componentă majoritară colesterolul (esterificat 48% şi liber 10%),
cuprinzând însă şi triacilgliceroli 13% şi fosfolipide 28%. VLDL reprezintă lipoproteinele
parentale din care rezultă LDL în plasmă, după îndepărtarea triacilglicerolilor sub acţiunea
lipoproteinlipazei şi îmbogăţire în colesterol. LDL cuprinde aproximativ 70% din colesterolul total
plasmatic şi sunt prezente în sângele recoltat dimineaţa după un post de 8-10 ore, alături de HDL.
Datorită conţinutului ridicat în colesterol, LDL au rolul de a furniza tuturor ţesuturilor, această
substanţă.
HDL sunt formate din particule heterotrofe, cu conţinut în lipide totale de aproximativ 67%
în care predomină fosfolipidele 43%, dar şi colesterolul esterificat 31%. Funcţia HDL este aceea
de a tranporta sunt sintetizate în ficat ca particule născânde de formă discoidală alcătuite dintr-un
dublu strat lipidic format din fosfolipide, colesterol liber şi apolipoproteine (apo A şi apo E).
Particulele HDL devin mature prin schimburi între celelalte lipoproteine plasmatice şi particulele
HDL născânde. LCAT (lecitincolesterol acil transferaza) plasmatică este enzima activată de apo
AII (găsită în HDL născânde) cu rol în esterificarea colesterolului în plasmă.
5
O
li
O CH2-O- C-R1
li +
R2 C O CH O
t + / CH3
N CH3
CH2 O P O CH2 CH2
CH3 HO
OH
lecitina colesterol
O
li
CH2-O- C-R1
+
HO CH O
CH2
t + / CH3
N CH3
O
O P O CH2 CH2 li
OH
"'-CH3 R2 C O
lizolecitinã colesterol esterificat
Acil-colesterolul migrează în interiorul particulei HDL contribuind la formarea miezului

hidrofob, locurile vacante din stratul superficial fiind ocupate de colesterolul preluat din
chilomicroni şi din ţesuturi, astfel că până la nivelul particulelor mature de HDL conţinutul
acestora în colesterol va creşte. Receptorii de pe suprafaţa hepatocitelor vor interacţiona cu
particulele HDL prin intermediul apo-E, vor fi internalizaţi şi componentele degradate – ficatul
fiind sediul catabolismului colesterolului. Aproximativ 30% din colesterolul total din plasmă este
sub formă de HDL.
Subiecţii care prezintă nivele ridicate ale colesterolului - HDL şi apolipoproteinei A,
prezintă un risc scăzut de a face ateroscleroză.
Prin dislipidemie sau dislipoproteinemie se înţelege modificarea concentraţiei lipidelor
totale plasmatice (ţinând cont de faptul că lipidele sunt încorporate în lipoproteine), a uneia dintre
fracţiunile lipoproteice sau a raportului dintre diversele componente. Dislipidemiile pot fi
hipolipoproteinemii (rar întâlnite) şi hiperlipoproteinemii. Ultimele presupun creşteri ale
concentraţiilor fracţiunilor normale LDL şi HDL sau apariţia şi persistenţa fracţiunilor lipoproteice
care ar trebui să fie absente într-un ser recoltat dimineaţa după o noapte de post (chilomicroni
şi/sau VLDL). Hiperliproteinemiile pot fi primare (ereditare sau familiale) şi secundare altor
afecţiuni.
Hiperlipoproteinemiile ereditare, primare, familiale – determinate de alterarea genelor care
codifică sinteza, transportul sau utilizarea lipoproteinelor au fost clasificate de Fredrickson în cinci
tipuri:
 Tipul I numit şi hipertrigliceridemie familială se caracterizează prin: chilomicronemie
şi hiper-VLDL, cu creşterea trigliceridelor şi ser lactescent datorat deficitului de lipoproteinlipază
sau de apoCII.
6
 Tipul II.a numit şi hipercolesterolemie familială este caracterizat prin: creşterea
colesterolului şi a LDL, cu ser clar datorată deficitului în receptori apoB 100.
 Tipul II.b numit şi hiperlipidemie combinată familială presupune: creşterea
concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser clar, sau opalescent. Cresc concomitent LDL
şi VLDL.
 Tipul III este o anomalie ereditară rar întâlnită (boala benzii "beta lată") manifestată
prin creşterea concomitentă a colesterolului şi a trigliceridelor, ser lactescent. Este datorat
deficitului de clarificare hepatică a IDL şi chilomicronilor remanenţi şi lipsei de apoE şi de
lipoproteinlipază hepatică.
 Tipul IV presupune creşterea trigliceridelor endogene (VLDL), ser clar sau opalescent.
 Tipul V manifestat prin creşterea chilomicronilor endogeni şi exogeni, a colesterolului,
cu LDL şi VLDL crescute, HDL scăzute, ser opalescent sau uneori lactescent.
Colesterolul este un lipid amfipatic component al particulelor de lipoproteine plasmatice şi
component structural al membranelor plasmatice celulare. Aproximativ jumătate din colesterolul
din organism este sintetizat, în timp ce cealaltă jumătate este absorbită din alimente. O parte din
colesterol este excretat în lichidul biliar. Transformarea colesterolului în săruri biliare ajută la
digestia şi solubilizarea lipidelor. Transportul colesterolului de către VLDL în circulaţie spre
ţesuturi joacă un rol important în formarea membranelor celulare şi în biosinteza hormonilor
steroizi.
Dozarea colesterolului total şi liber
Principiu:
Metoda presupune extragerea colesterolului liber din ser cu etanol şi precipitarea ulterioară
a acestuia cu digitonină. Colesterolul esterificat se obţine prin diferenţa dintre valoarea
colesterolului total şi cea a colesterolului liber.
Reactivi:
- 2,5 g FeCl3x6H2O în 100 ml H3PO4 85%;
- reactivul de culoare: 4 ml soluţie de clorură ferică în 50 ml H 2SO4 concentrat;
- soluţie de digitonină 1% (1g digitonină în 50 ml etanol 95% şi completat la 100 ml cu apă
bidistilată) care se poate păstra la întuneric timp de 6 luni;
- standard de colesterol (200 mg/dl).
Dozarea colesterolului total
Mod de lucru:
Ser 0,1 ml - -
Acid acetic glacial 6 ml 6 ml 6 ml
Reactiv de culoare 4 ml 4 ml 4 ml
7
Se citesc absorbanţele probei şi standardului după 10 minute la λ = 550 nm în cuva de 1
cm faţă de blanc şi se calculează valoarea colesterolului total plasmatic după următoarea formulă:
mg% colesterol total = (AP/AS) x conc. standard
Dozarea colesterolului liber
Mod de lucru:
Ser 0,1 ml - -
Acetonă-95% etanol (1:1,v/v) 1 ml - -
Sol. digitonină 1 ml 1 ml 1 ml
Se agită, se lasă în repaus 10 minute şi se centrifughează la 3000 rpm timp de 5 minute. Se
aruncă supernatantul şi se usucă precipitatul timp de 5 minute în curent de N2. Reziduul se
resuspendă în 4 ml acetonă, apoi se vortexează. Se centrifughează, se decantează supernatantul şi
se usucă precipitatul timp de 5 minute.
Precipitat + + -
CH3COOH glacial 6 ml 6 ml 6 ml
Reactiv de culoare 4 ml 4 ml
După 10 minute se citeşte absorbanţa probei la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc.

Calcul:
mg% colesterol liber = (AP/AS) x conc. standard
mg% colesterol esterificat = mg% colesterol total - mg% colesterol liber
Valori normale: reprezintă 60-80% din valoarea colesterolului total. Astfel, raportul colesterol
esterificat/colesterol total se încadrează în mod normal în intervalul 0,60-0,80. Acest raport este
scăzut în afecţiuni hepatice grave (comă hepatică) şi este util în diagnosticul şi diferenţierea
icterelor:
- normal în icterele obstructive;
- moderat scăzut în icterele catarale;
- scăzut în icterele parenchimatoase grave.
Dozarea colesterolului total din ser se mai poate realiza şi utilizând metoda enzimatică.
Principiu:
Esterii de colesterol sunt hidrolizaţi în prezenţa colesterol - esterazei cu eliberarea
colesterolului şi a acizilor graşi. Colesterolul rezultat suferă o reacţie de oxidare în prezenţa
colesterol oxidazei cu formarea 4-Δ colestenonei şi apă oxigenată. Apa oxigenată reacţionează cu
fenolul şi 4-amino antipirina în prezenţa peroxidazei formând un compus chinonic colorat în roşu,
măsurabil la spectrofotometru.
8
Reacţiile care au loc sunt următoarele:
O
O
colesterol-esterazã li
R- C-O
+ H2O HO
+ R- C-OH
Esteri de colesterol Colesterol Acizi graşi
HO
colesterol-oxidazã O
+ O2 + H2O2
Colesterol 4-Δ Colestenona
peroxidazã
2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirină Chinonimină (culoare roşie) + 4H2O
Reactivi:
- reactivul de lucru conţine în soluţie tampon de pH 7,0: colesterol esterază ˃ 0,2 U/ml,
colesterol oxidază ˃ 0,1 U/ml, peroxidază ˃ 0,8 U/ml, fenol 28 mmol/l, 4-amino-antipirină 0,5
mmol/l;
- standard de colesterol 200 mg/dl (5,18 mmol/l)
Mod de lucru:
Standard de colesterol - 10 μl -
Ser 10 μl - -

concentraţia de colesterol din proba de analizat conform formulei:
sau fluorură. Colesterolul este stabil în probele de ser sau plasmă 7 zile la 2-8 0C.
9
Nivelul colesterolului seric se corelează cu variaţiile fiziologice ale lipemiei: vârsta, sexul,
rasa, alimentaţia, echilibrul neuro-endocrin, profesia reprezentând factori care pot influenţa
valorile acestuia.
Hipercolesterolemiile pot apărea în: hipercolesterolemie esenţială, hiperlipemie esenţială,
hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom nefrotic (nefroze lipoidice), ateroscleroză,
intoxicaţii cu fosfor, CCl4, alcool, morfină, icter mecanic, pancreatite, alcoolism.
Hipocolesterolemiile pot apărea în:
 afecţiuni genetice precum: analfalipoproteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia;
 hepatite acute, hepatite cronice şi ciroze decompensate (numai colesterolul esterificat - prin
deficit al enzimelor implicate în acest proces), hipertiroidism;
 infecţii bacteriene: pneumonie, tuberculoză, difterie, lepră;
 hemopatii severe: leucemii.
Colesterolemia este influenţată în mare măsură de colesterolul endogen şi în mai mică
măsură de cel de origine exogenă.
Evaluarea nivelelor HDL-colesterolului şi LDL-colesterolului este importantă în infarctul
miocardic. Pentru persoanele cu hipercolesterolemie este foarte importantă determinarea HDL-
colesterolului, care conferă protecţie împotriva riscului cardio-vascular, nivelul scăzut de HDL,
eventual coroborat cu nivele crescute ale trigliceridelor serice indicând un risc crescut coronarian.
Determinarea LDL-colesterolului este importantă la pacienţii:
a) tineri cu boli vasculare;
b) cu xantoame;
c) cu hipercolesterolemie secundară.
Determinarea nivelului trigligeridelor serice este important la pacienţii:
a) cu nivel scăzut al HDL-colesterolului;
b) cu hipertrigliceridemie secundară;
c) cu ocluzie a arterelor periferice.
Lipide şi lipoproteine care influenţează riscul aterosclerotic.

Riscul aterosclerotic este:
Normal uşor crescut crescut
Colesterol total < 220 220 – 260 > 260
Trigliceride < 150 150 - 200 > 200
LDL-colesterol < 150 150 - 190 > 190
HDL-colesterol bărbaţi > 55 35 - 55 < 35
HDL-colesterol femei > 65 45 - 65 < 45
Valorile sunt în mg/dl.
10
Se determină colesterolul total, HDL-colesterolul şi triacilglicerolii. Fracţiunile plasmatice
VLDL şi LDL precipită în prezenţa ionilor de Ca/Mg/Mn şi polianioni/polianioni sulfaţi. După
centrifugare se determină HDL-colesterolul în supernatant.
Determinarea nivelului seric al HDL- colesterolului

Separarea HDL
Fracţiunile VLDL şi LDL-colesterol şi chilomicronii din proba de analizat precipită în
prezenţa acidului fosfotungstic şi al MgCl2. După centrifugare conţinutul în HDL - colesterol al
supernatantului va fi determinat spectrofotometric după reacţiile de mai jos:
Esteri de colesterol + H2O Colesterol + Acizi graşi
colesterol-oxidazã
Colesterol + ½ O2+ H2O Colestenona + H2O2
peroxidazã
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + Diclorfenilsulfonat Chinonimina + 4H2O
Reactivi:
- soluţie 2 M MgCl2;
- reactiv de precipitare: 32 g/l acid fosfotungstic: 0,4 mmol/l MgCl2 4:1;
- plasma sau ser.
Mod de lucru:
Peste 500 μl plasmă se adaugă 50 μl reactiv de precipitare; se agită probele şi se
centrifugheză la 10000 rpm 15 minute la 40C; după centrifugare în supernatant rămâne numai
HDL, iar colesterolul conţinut în acesta se determină prin metoda enzimatică.
Triacilgliceroli
Triacilglicerolii sunt cele mai simple lipide alcătuite din acizi graşi şi glicerol. Se mai
numesc şi trigliceride, grăsimi sau grăsimi neutre. Triacilglicerolii sunt alcătuiţi din trei acizi graşi
esterificaţi cu cele trei grupări hidroxil ale glicerolului. Triacilglicerolii care sunt solizi la
temperatura camerei sunt cunoscuţi drept grăsimi, în timp ce triacilglicerolii lichizi sunt cunoscuţi
ca uleiuri. Grăsimile sunt de obicei bogate în acizi graşi saturaţi, în timp ce în uleiuri predomină
acizii graşi nesaturaţi.
Trigliceridele sunt formate din trei acizi graşi esterificaţi cu glicerol.
O
li
O CH2-O- C-R1
li
R2- C -O- CH
O
li
CH2-O- C-
C-R3
11
Determinarea trigliceridelor serice
Principiu:
Triacilglicerolii sunt hidrolizaţi la glicerol şi acizi graşi în prezenţa lipazei. Glicerolul
rezultat este fosforilat de glicerol kinază în prezenţa ATP cu formarea glicerol-3-fosfatului care în
prezenţa glicerol-3-fosfat oxidazei determină formarea dihidroxi acetonfosfatului şi a apei
oxigenate. Apa oxigenată în prezenţa unui cromogen şi a peroxidazei determină formarea unei
chinonimine colorate roşu colorimetrabilă. Concentraţia triacilglicerolilor prezenţi în probă poate
fi calculată prin măsurarea absorbanţelor probelor şi standardului.
O
li
CH2-O- C-R CH2-OH
O
li lipaza
R- C -O- CH + H2O HO-CH + 3R-COOH
O
li
CH2-O- C-
C-R CH2--OH
Triacilgliceroli Glicerol Acizi graşi

glicerol kinazã
Glicerol + ATP Glicerol-3-fosfat + ADP
glicerol-3-fosfat oxidazã
Glicerol-3-fosfat + O2 Dihidroxi acetonfosfat + H2O2
peroxidazã
2H2O2 + 2-clorfenol + 4-aminoantipirină Chinonimină + 4H2O + HCl
Reactivi:
- reactivul de lucru conţine în soluţie tampon de pH 7,0: lipază ˃ 100 U/ml, glicerol kinază
˃ 1,5 U/ml, glicerol -3-fosfat oxidază ˃ 4 U/ml, peroxidază ˃ 0,8 U/ml, 2-clorofenol 6 mmol/l, 4-
amino-antipirină 0,75 mmol/l, argilă 45 mmol/l, clorură de magneziu 5 mmol/l, ATP 0,9 mmol/l;
- standard de trigliceride: glicerol echivalent la 200 mg/dl (2,26 mmol/l) trioleină.
Mod de lucru:
Se pipetează în tuburi etichetate conform tabelului:
Standard de trigliceride - 10 μl -
Ser sau plasmă 10 μl - -

concentraţia de trigliceride din proba de analizat conf*orm formulei:
12
sau fluorură. Trigliceridele sunt stabile în probele de ser sau plasmă 5 zile la 2-8 0C.
Calcularea concentraţiei de LDL-colesterol

Calcularea conţinutului de LDL-colesterol din probele de analizat se face după următoarea
ecuaţie:
LDL-colesterol = Colesterol total - (HDL-colesterol + trigliceride/5)
Observaţie: ecuaţia de mai sus nu se poate aplica pentru probele pacienţilor care au o concentraţie
de trigliceride ≥ 400 mg/dl sau pentru pacienţii cu hiperlipoproteinemie de tip I şi III! Determinarea
LDL-colesterolului poate fi efectuată la pH 5.12 (precipitarea izoelectrică cu heparină)
13
Semnificaţia clinică a compuşilor azotaţi neproteici.

Dozarea ureei în ser şi urină.
Obiective:
- Definirea ureei din punct de vedere metabolic;
- Însuşirea termenului de ureogeneză şi caracterizarea etapelor acestui proces;
- Interpretarea valorilor normale şi a variaţiilor patologice;
- Cunoaşterea principalelor metode de dozare a ureei.
În urma proceselor metabolice, prin degradarea proteinelor, se formează compuşi azotaţi

neproteici ce trebuie eliminaţi din organism, în special pe cale renală. Principalii compuşi azotaţi
neproteici sunt reprezentaţi de: uree, creatinină, acid uric, amoniac.
Studierea acestor compuşi şi determinarea concentraţiei lor în ser şi urină sunt necesare în
practica medicală deoarece oferă informaţii despre stări patologice care au la bază fie un
catabolism anormal al proteinelor, o eliminare necorespunzătoare a acestora din organism sau o
activitate deficitară a unui anumit organ care este implicat în sinteza acestor compuşi.
Ureea
Ureea este produsul final principal al catabolismului proteinelor şi reprezintă aproximativ
75% din compuşii azotaţi neproteici ce se elimină urinar. Peste 90% din uree se îndepărtează la
nivel glomerular, iar aproximativ 40-70% din uree depăşeşte tubii renali.
Biosinteza ureei are loc în ficat, procesul purtând denumirea de ureogeneză. Amoniacul,
eliminat în ficat din glutamină împreună cu amoniacul adus de la nivel intestinal prin circulaţia
portală la nivel hepatic este transformat în uree printr-o serie de reacţii ce poartă denumirea de
ciclu ureogenetic. Spre deosebire de amoniac, care este un produs cu toxicitate crescută, în special
pentru celulele nervoase, ureea este un produs cu toxicitate redusă şi hidrosolubil ce poate fi
transportat în cantităţi crescute în sânge şi eliminat pe cale renală. În concluzie, ureogeneza poate
fi considerată un proces de detoxifiere a organismului.
În condiţiile unei funcţii renale indemne, cantitatea de uree eliminată urinar este direct
proportională cu intensitatea catabolismului proteic. În cazul unor afecţiuni renale, concentraţia
ureei serice creşte.
1
L- citrulina L- citrulina
Mitocondria
I. carbamoil fosfat
sintetaza
Pi L-aspartat
2ATP + HCO3- + NH4 Carbamoil fosfat
II. L-ornitin
carbamoil ATP
2ADP + Pi transferaza
III. Arginino
L- ornitina
succinat sintetaza
AMP + PPi
Argininosuccinat
L- ornitina Citosol
IV. Arginino
H2O succinat
liaza
V. Arginaza
L- arginina Fumarat
O
li
H2N-C-NH2
Ureea
Figura 1. Ciclul ureogenetic
Valori normale şi variaţii patologice

Valori normale: uree serică (adulţi): 15-40 mg/100ml
uree urinară: 13,2-36,6 g/24h
Ureea serică şi urinară variază:
a) direct proporţional cu:
- vârsta (nivelul ureei sanguine la pacienţii cu vârsta peste 60 de ani este mai crescut decât
la adulţi);
- dieta (un regim bogat în proteine creşte nivelul ureei sanguine);
- diureza (hemoconcentraţia creşte nivelul ureei sanguine - ureea redifuzează din tubii
distali în sânge).
b) invers proporţional cu:
- sarcina (poate să scadă nivelul ureei sanguine);
- stările de convalescenţă;
- în perioadele de creştere.
Modificări patologice ale concentraţiei plasmatice normale a ureei pot fi consecinţa fie a
scăderii sintezei hepatice, fie a afectării excreţiei renale, de aceea dozarea ureei trebuie însoţită şi
de dozarea acidului uric şi a creatininei, pentru ca rezultatele să fie corelate.
2
Creşterea nivelului ureei peste 40 mg/100 ml poartă denumirea de azotemie. Azotemiile
pot fi renale sau extrarenale (prerenale şi postrenale). Azotemiile extrarenale indică incapacitatea
rinichiului de a elimina o cantitate crescută de uree datorate unei ureogeneze exacerbate.
Azotemii Azoturii
Renale extrarenale hiperazoturii hipoazoturii
- IRA/IRC - hemoragii - stări febrile - afecţiuni renale
- nefrita gastrointestinale - intoxicaţii cu metale (nefrite)
acută/cronică - diabet zaharat grele - afecţiuni
- tuberculoza renală - insuficienţă cardiacă - diabet zaharat şi hepatice (ciroză,
- rinichi polichistic - boli infecţioase acute azoturic cancer)
- calculi renali - boala Addison - acidoze
- diaree, vărsături
DOZAREA UREEI
Iniţial pentru dozarea ureei din sângele total s-a utilizat un filtrat proteic deproteinizat
pentru măsurarea cantităţii de azot, analiză numită BUN - blood urea nitrogen. Prin înmulţirea
valorii concentraţiei obţinute pentru azotul ureic cu 2,14 se obţine concentraţia de uree din proba
de determinat.
De-a lungul timpului, s-au folosit multiple metode de dozare a ureei, precum:
- Metoda azotometrică (Kowarsky)
- Metoda colorimetrică cu diacetilmonoxima (Kitamwa-Juky)
- Metoda enzimatică cu ureeaza (Berthelot)
În prezent, cea mai utilizată metodă de dozare a ureei este metoda enzimatică.
Metoda enzimatică colorimetrică
Principiu: Ureaza hidrolizează ureea cu formare de amoniac şi dioxid de carbon. Ionul de
amoniu rezultat reacţionează, conform reacţiei Berthelot, cu hipoclorit de sodiu şi salicilat de sodiu
în prezenţa nitroprusiatului de sodiu ca şi catalizator, rezultând un complex colorat albastru ce
poate fi dozat spectrofotometric.
H2N
ureaza
C O + H2O 2 NH4+ + CO2
H2N
NH4+ + Salicilat + NaClO nitroprusiat Indofenol
Reactivi:
- Reactiv A: Salicilat de sodiu 62 mmol/l, nitroprusiat de sodiu 3,4 mmol/l, tampon fosfat 20
mmol/l, pH 6,9, Urează ˃500 U/ml;
3
- Reactiv B: Hipoclorit de sodiu 7 mmol/l, hidroxid de sodiu 150 mmol/l;
- Standard de uree 50 mg/dl.
Mod de lucru:
Proba Standard Blanc
Proba 10 μl - -
Standard de uree - 10 μl -
Reactiv A 1 ml 1ml 1 ml
Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 370C
Reactiv B 1 ml 1 ml 1 ml
Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 370C

concentraţia de uree din proba de analizat conform formulei:
Concentraţie probă = Aprobă/Astandard x Cstandard x Factorul de diluţie al probei
 probele de urină se diluează 1/50 cu apă distilată înainte de dozare.
Când determinarea se realizează pe plasmă, anticoagulantul folosit este heparina. Ureea este stabilă
în probele de ser sau plasmă 7 zile la 2-8 0C.
Metoda enzimatică cinetică
Principiu: Ureea este hidrolizată sub acţiunea ureazei şi este transformată în amoniac şi
dioxid de carbon. Amoniacul este transformat în prezenţa glutamat-dehidrogenazei
(oxidoreductază), enzimă NAD-dependentă.
H2N
ureaza
C O + H2O 2 NH4+ + CO2
H2N
+ glutamat dehidrogenaza
NH4 + alpha-cetoglutarat L-glutamat
+ +
NADH, H NAD
Reactivi:
- α-cetoglutarat 5,6 mmol/l, ureaza ˃140 U/ml, glutamat dehidrogenaza ˃140 U/ml, NADH,H+ 1,5
mmol/l, azida de sodiu 9,5 g/l, etilenglicol 220 g/l, Tris 100 mmol/l, pH 8
- standard de uree 50 mg/dl
Mod de lucru:
Se aduc reactivii la 370C şi se pipetează conform tabelului:
Probă Standard
Probă 10 μl -
Standard - 10 μl
4
Reactiv de lucru 1,5 ml 1,5 ml
Se agită, se introduc în cuva spectrofotometrului şi se porneşte cronometrul. Se măsoară scăderea
absorbţiei la =340 nm după 30 (A1) şi, respectiv 90 de secunde (A2) şi se calculează concentraţia
de uree din proba de analizat conform formulei:
(A1 - A2)proba
Cproba = x Cstandard x Factorul de dilutie al probei*
(A1 - A2)standard
Când determinarea se realizează pe plasmă, anticoagulantul folosit este heparina. Ureea este stabilă
în probele de ser sau plasmă 7 zile la 2-8 0C.
Dozarea ureei se efectuează în următoarele situaţii:
- în cadrul testelor serice de rutină;
- în prezenţa unor simptome nespecifice;
- pentru testarea funcţionalităţii renale, eficacităţii dializei (împreună cu creatinina);
- în cadrul testelor serice de monitorizare a pacienţilor cu boli cronice, insuficienţă cardiacă.
Dozarea ureei este recomandată împreună cu dozarea creatininei, deoarece este de o mare
importanţă clinică raportul stabilit între cei doi compuşi:
- Raport uree/creatinină > 12 => regim proteic deficitar, sinteză redusă de uree, afecţiune
hepatică cronică;
- Raport uree/creatinină > 16 => afecţiune renală.
5

Dozarea creatininei în ser şi urină
Obiective:
- Cunoaşterea precursorilor creatinei, fosfocreatinei şi creatininei precum şi localizarea
tisulară a acestora;
- Definirea noţiunii de “clearance”;
- Cunoaşterea metodei de dozare a creatininei.
Creatina (acid metilguanidinacetic) este un compus sintetizat din trei aminoacizi

(arginina, glicocolul şi metionina) la nivelul următoarelor organe: ficat, rinichi, pancreas. După
sintetizare, creatina este preluată de circulaţia sanguină şi transportată la nivel muscular (în
proporţie de 98%) şi la nivel cerebral. La aceste nivele, creatina este transformată în fosfocreatină,
printr-o reacţie cataliazată de creatin kinază. O mică parte din fosfocreatină (constantă pentru masă
musculară constantă) pierde gruparea fosfat şi reformează creatina liberă.
H OH
NH2
I I
HN C I creatinkinaza
HN - C
I ,- N ~ P OH
+ ADP
+ ATP O
\ N- CH2- COOH \ N - CH2- COOH
CH3 CH3
Datorită instabilităţii creatinei la pH –uri acide sau bazice, aceasta suferă un proces de
deshidratare intramoleculeculară cu formarea creatininei, care trece în sânge şi se elimină din
organism pe cale renală. Cantitatea de creatină transformată în creatinină este constantă, fiind
proporţională cu masa de ţesut muscular al individului. Creatinina este cel mai stabil compus azotat
neproteic, nefiind influenţat de aportul protidic exogen, de aportul hidric, ci este în stransă legătură
cu procesele metabolice ce au loc la nivel muscular, fiind un compus final de metabolism.
H
I 1----- I H
N H HO
HN - (
C ~----_ŢI~
C O
- H2O
HN - C
/
N- C= O
N CH2 \N CH2
CH3
I
CH3
VALORI NORMALE. VARIAŢII FIZIOLOGICE. VARIAŢII PATOLOGICE

1
VALORI NORMALE: - Creatinina serică: B: 0,7-1,2 mg/100 ml
F: 0,6- 1,1 mg/100 ml
- Creatinina urinară: 1-1,8 g/24 h
Exista situaţii în care nivelul creatininei poate avea:
- valori crescute:
- sarcină;
- dietă bogată în protein;
- după efort fizic intens;
- la copii;
- la bărbaţi (datorită masei musculare mai mari).
- valori scăzute:
- la persoanele vârstnice;
- la persoanele cu masă musculară redusă.
Hipercreatininemii:
1. afecţiuni renale: insuficienţa renală, nefrite cronice
2. afecţiuni musculare: distrofii musculare
3. afecţiuni endocrine: acromegalie, diabet zaharat
Hipercreatininurii:
1. afecţiuni musculare: atrofie musculară, distrofie musculară, miastenia gravis, amiotonie
congenital;
2. afecţiuni endocrine: acromegalie, diabet zaharat, hipotiroidism, boala Addison;
3. alte afecţiuni: pneumonie, stări febrile, tifos.
Valorile patologice (creşterea nivelului de creatinină serică şi urinară) apar în următoarele
situaţii:
- Când există o producţie normală de creatină la nivel hepatic, dar o masă musculară
redusă (prin distrugerea celulelor musculare);
- Când există o producţie crescută de creatină;
- Nivelul de creatinină serică poate creşte atunci când există o perturbare a funcţiei renale,
care reduce excreţia de creatinină.
Deoarece toată creatinina filtrată glomerular este excretată în urină, pentru estimarea ratei
filtrării glomerulare se determină clearance-ul de creatinină. Noţiunea de “clearance” a fost
introdusă de Van Slyke şi, pentru o substanţă dată, reprezintă cantitatea de plasmă epurată de
rinichi în unitatea de timp. Clearance-ul se calculează cu ajutorul formulei:
V
C=Ux
P ,
Unde: C = clearance-ul substanţei;
U = concentraţia substanţei în urină exprimată în mg/mL;
2
V = debitul urinar exprimat în mL/min.;
P = concentraţia substanţei în plasmă exprimată în mg/mL.
În general există două categorii de substanţe pentru care se calculează clearance-urile:
• substanţe ce nu se reabsorb şi nu se secretă de către tubii renali – filtratul glomerular;
• substanţe care sunt epurate complet – fluxul plasmatic renal.
Dozarea creatininei: Metoda colorimetrică Folin –Wu

Principiu: Creatinina din proba de analizat reacţionează cu acidul picric în mediu alcalin,
rezultând picraţi de creatinină de culoare galben-portocaliu (reacţia Jaffe). Intensitatea culorii
obţinute se determină imediat spectrofotometric la lungimea de undă de 500 nm, pentru a evita
interferarea cu alţi compuşi. Reacţia nu este specifică pentru creatinină putând fi folosită şi pentru
dozarea ureei şi glucozei serice.
Reactivi:
- Acid picric 25 mmol/l;
- Hidroxid de sodiu 0,4 mol/l;
- Standard de creatinină 2 mg/dl.
H
H N C O-
NO2 H2N C
li
N C O HO N CH
NaOH O
HN C +
l
N CH2 CH3 Na+

N O
-Q
O2N NO2
CH3 O
Creatininã Acid picric O2N NO2
Mod de lucru:
Probă Standard
Probă 50 μl -
Standard - 50 μl
Reactiv de lucru 1 ml 1 ml
Se agită, se introduc în cuva spectrofotometrului şi se porneşte cronometrul. Se citeşte absorbanţa
la =500 nm la 30 (A1) şi, respectiv 90 de secunde (A2) şi se calculează concentraţia de creatinină
din proba de analizat conform formulei:
(A2 - A1)proba
Cproba = x Cstandard x Factorul de dilutie al probei*
(A2 - A1)standard
3
Când determinarea se realizează pe plasmă, se pot utiliza ca şi anticoagulanţi EDTA,
heparină, oxalat sau fluorură. Creatinina este stabilă în probă 24 de ore la 2-8 0C.
Dozarea creatininei se efectuează în următoarele situaţii:
- În cadrul testelor serice de rutină;
- În prezenţa unor simptome nespecifice;
- Pentru evaluarea funcţiei renale (împreună cu ureea şi acidul uric);
- Monitorizarea unor afecţiuni cronice.
4

Dozarea creatininei în ser şi urină
Obiective:
- Cunoaşterea precursorilor creatinei, fosfocreatinei şi creatininei precum şi localizarea
tisulară a acestora;
- Definirea noţiunii de “clearance”;
- Cunoaşterea metodei de dozare a creatininei.
Creatina (acid metilguanidinacetic) este un compus sintetizat din trei aminoacizi

(arginina, glicocolul şi metionina) la nivelul următoarelor organe: ficat, rinichi, pancreas. După
sintetizare, creatina este preluată de circulaţia sanguină şi transportată la nivel muscular (în
proporţie de 98%) şi la nivel cerebral. La aceste nivele, creatina este transformată în
fosfocreatină, printr-o reacţie cataliazată de creatin kinază. O mică parte din fosfocreatină
(constantă pentru masă musculară constantă) pierde gruparea fosfat şi reformează creatina liberă.
H OH
NH
I I
2 N ~ P OH
_/ creatinkinaza + ADP
HN C
\ N CH + ATP HN - C I\ O'
2 COOH N CH2 COOH
CH3 CH3
Datorită instabilităţii creatinei la pH –uri acide sau bazice, aceasta suferă un proces de
deshidratare intramoleculeculară cu formarea creatininei, care trece în sânge şi se elimină din
organism pe cale renală. Cantitatea de creatină transformată în creatinină este constantă, fiind
proporţională cu masa de ţesut muscular al individului. Creatinina este cel mai stabil compus
azotat neproteic, nefiind influenţat de aportul protidic exogen, de aportul hidric, ci este în stransă
legătură cu procesele metabolice ce au loc la nivel muscular, fiind un compus final de
metabolism.
H
I 1----- I H
N H HO C O
HN - C ( ~----s- I ~ - H2O
HN C
/
N C O
N CH2 \N CH2
CH3
I
CH3
1
VALORI NORMALE. VARIAŢII FIZIOLOGICE. VARIAŢII PATOLOGICE
VALORI NORMALE: - Creatinina serică: B: 0,7-1,2 mg/100 ml

F: 0,6- 1,1 mg/100 ml
- Creatinina urinară: 1-1,8 g/24 h
Exista situaţii în care nivelul creatininei poate avea:
- valori crescute:
- sarcină;
- dietă bogată în protein;
- după efort fizic intens;
- la copii;
- la bărbaţi (datorită masei musculare mai mari).
- valori scăzute:
- la persoanele vârstnice;
- la persoanele cu masă musculară redusă.
Hipercreatininemii:
1. afecţiuni renale: insuficienţa renală, nefrite cronice
2. afecţiuni musculare: distrofii musculare
3. afecţiuni endocrine: acromegalie, diabet zaharat
Hipercreatininurii:
1. afecţiuni musculare: atrofie musculară, distrofie musculară, miastenia gravis, amiotonie
congenital;
2. afecţiuni endocrine: acromegalie, diabet zaharat, hipotiroidism, boala Addison;
3. alte afecţiuni: pneumonie, stări febrile, tifos.
Valorile patologice (creşterea nivelului de creatinină serică şi urinară) apar în următoarele
situaţii:
- Când există o producţie normală de creatină la nivel hepatic, dar o masă musculară
redusă (prin distrugerea celulelor musculare);
- Când există o producţie crescută de creatină;
- Nivelul de creatinină serică poate creşte atunci când există o perturbare a funcţiei
renale, care reduce excreţia de creatinină.
Deoarece toată creatinina filtrată glomerular este excretată în urină, pentru estimarea ratei
filtrării glomerulare se determină clearance-ul de creatinină. Noţiunea de “clearance” a fost
introdusă de Van Slyke şi, pentru o substanţă dată, reprezintă cantitatea de plasmă epurată de
rinichi în unitatea de timp. Clearance-ul se calculează cu ajutorul formulei:
V
C =Ux
P ,
2
Unde: C = clearance-ul substanţei;
U = concentraţia substanţei în urină exprimată în mg/mL;
V = debitul urinar exprimat în mL/min.;
P = concentraţia substanţei în plasmă exprimată în mg/mL.
În general există două categorii de substanţe pentru care se calculează clearance-urile:
• substanţe ce nu se reabsorb şi nu se secretă de către tubii renali – filtratul glomerular;
• substanţe care sunt epurate complet – fluxul plasmatic renal.
Dozarea creatininei: Metoda colorimetrică Folin –Wu

Principiu: Creatinina din proba de analizat reacţionează cu acidul picric în mediu alcalin,
rezultând picraţi de creatinină de culoare galben-portocaliu (reacţia Jaffe). Intensitatea culorii
obţinute se determină imediat spectrofotometric la lungimea de undă de 500 nm, pentru a evita
interferarea cu alţi compuşi. Reacţia nu este specifică pentru creatinină putând fi folosită şi
pentru dozarea ureei şi glucozei serice.
Reactivi:
- Acid picric 25 mmol/l;
- Hidroxid de sodiu 0,4 mol/l;
- Standard de creatinină 2 mg/dl.
H
I
H N C O-
NO 2 H2N _ C / li
HN _C/
N
I
C
I
O HO NaOH O
- "" N - CH
-""-
I
N
CH3
CH2
+
O 2N NO 2
O
N O
I
CH3
+
Na
Creatininã Acid picric O 2N NO2
Mod de lucru:
Probă Standard
Probă 50 μl -
Standard - 50 μl
Reactiv de lucru 1 ml 1 ml
Se agită, se introduc în cuva spectrofotometrului şi se porneşte cronometrul. Se citeşte
absorbanţa la =500 nm la 30 (A1) şi, respectiv 90 de secunde (A2) şi se calculează concentraţia
de creatinină din proba de analizat conform formulei:
3
(A2 - A1)p roba *
C p roba = x C standard x Factorul de dilutie al probei
(A2 - A1)standard

probele de urină se diluează 1/50 cu apă distilată înainte de dozare.
Când determinarea se realizează pe plasmă, se pot utiliza ca şi anticoagulanţi EDTA,
heparină, oxalat sau fluorură. Creatinina este stabilă în probă 24 de ore la 2-8 0C.
Dozarea creatininei se efectuează în următoarele situaţii:
- În cadrul testelor serice de rutină;
- În prezenţa unor simptome nespecifice;
- Pentru evaluarea funcţiei renale (împreună cu ureea şi acidul uric);
- Monitorizarea unor afecţiuni cronice.
4
Explorarea tulburărilor metabolismului purinic. Dozarea acidului uric seric şi urinar.
Obiective:
- Definirea acidului uric din punct de vedere metabolic;
- Cunoaşterea metodei de dozare a acidului uric.
Acidul uric reprezintă la om și la primatele superioare produsul final de catabolism al
bazelor azotate purinice (adenina şi guanina) din componența acizilor nucleici ingerați (proveniență
exogenă) sau rezultați din distrugerea celulară (proveniență endogenă). Celelalte specii de
mamifere au posibilitatea conversiei acidului uric, într-o etapă de degradare ulterioară, în alantoină,
produs caracterizat de o hidrosolubilitate superioară acestuia.
Asupra acizilor nucleici acționează inițial enzime de tipul nucleotidazelor, care generează
nucleozide. Asupra nucleozidelor acționează ulterior nucleozidaze, cu eliberarea bazelor azotate,
care sunt ulterior supuse unui proces de dezaminare, cu formare de hipoxantină și xantină. Acestea
sunt degradate sub acțiunea xantinoxidazei până la acid uric. Xantinoxidaza este o enzimă din clasa
dehidrogenazelor, care este localizată cu precădere la nivel hepatic și intestinal. Enzima hepatică
este responsabilă de sinteza de novo a acidului uric, în timp ce enzima intestinală realizează sinteza
acidului uric din acizii nucleici de origine alimentară.
Concentrația plasmatică a acidului uric poartă numele de uricemie. La valori ce depăşesc
concentraţia maximă, plasma este saturată și există posibilitatea formării de cristale de acid uric,
cu precipitarea acestora la nivel tisular. Deşi acidul uric se găseşte în sânge în forma enolică, la
pH-ul fiziologic al plasmei doar atomul de hidrogen de la C2 se comportă ca o grupare cu proprietăţi
acide.
O OH
~
Q-
NH N
HN N
y
J-
O
îl
OH
y
O N N N
H HO N
H H
Formele tautomere ale acidului uric (reprezentările ceto şi enolică)
1
NH2 O O O
N AMP dezaminaza H H H N
N N N N
N N
H2O NH4
N N N N N
N O N N H2N
O O O O
t t t H t
HO - P - O - CH2 HO - P - O - CH2
O O HO - P - O - CH2 HO - P - O - CH2
I I O O
OH H H
OH H H I H H
I H H
H OH OH
H H H H H
H H
OH OH OH OH OH OH OH OH
Adenozin 5` monofosfat Inozin 5` monofosfat Xantozin 5` monofosfat Guanozin 5` monofosfat

H2O H2O H2O H2O
Nucleotidaza Nucleotidaza Nucleotidaza Nucleotidaza
Pi Pi Pi Pi
Adenozin
Adenozina dezaminaza Inozina Xantozina Guanozina
H2O NH4 Pi Pi Pi
Purin nucleozid Purin nucleozid Purin nucleozid
fosforilaza fosforilaza fosforilaza
Ribozo-1-fosfat Ribozo-1-fosfat Ribozo-1-fosfat
Hipoxantina Xantin oxidaza Xantina Guanin dezaminaza Guanina
O 2 + H2O H2O 2 H2O NH4

H2O + O 2
Xantin
oxidaza
H2O 2
Acid uric
Biosinteza acidului uric
2
Cea mai mare parte a acidului uric circulă în sânge sub formă de urat monosodic (˃90%),
iar restul ca acid uric liber. La pH normal al plasmei solubilitatea uratului de sodiu este mai mare
decât cea a acidului uric liber
OH
N
N
OH
NaO N N
H
Structura uratului monosodic
Hiperuricemiile se definesc ca valori ale acidului uric plasmatic mai mari decât limita
superioară a normalului. În funcție de mecanismul de producere, hiperuricemiile se împart în două
mari categorii: hiperuricemii primare și hiperuricemii secundare.
• Hiperuricemiile primare sunt enzimopatii, de obicei ereditare.
• Hiperuricemiile secundare sunt consecința unor afecțiuni, iar creșterea concentrației
plasmatice a acidului uric se datorează fie hiperproducției de acid uric, fie eliminării
deficitare a acestuia.
Deoarece s-a demonstrat că trigliceridele, corpii cetonici și acidul lactic sunt în competiție cu acidul
uric pentru eliminarea la nivelul tubilor renali, afecțiunile caracterizate de o creștere a valorilor
acestor metaboliți sunt însoțite secundar de creșteri ale valorilor acidului uric.
Hipouricemiile sunt mult mai rare decât hiperuricemiile; reprezintă scăderea valorilor
plasmatice sub limita inferioară a normalului. Se poate datora unor afecțiuni hepatice
parenchimatoase grave (ficatul este sediul sintezei acidului uric), unor deficite enzimatice (deficitul
de xantinoxidază determină xantinuria ereditară) sau administrării de medicamente: Allopurinol
(inhibă competitiv activitatea xantinoxidazei prin analogie structurală cu hipoxantina, scăzând
astfel producția de acid uric), 6- Mercaptopurina (scade sinteza nucleotidelor purinice prin inhibiție
competitivă a enzimelor responsabile de procesul de sinteză).
O S
N
HN HN
N
N N N
N H H H
Allopurinol 6-Mercaptopurina
Hiperuricemiile. Guta reprezintă manifestarea clinică a unei hiperuricemii, fie ea primară

sau secundară. Afectează în special bărbații cu vârste cuprinse între 30 și 50 de ani și este
caracterizată de depunerea cristalelor de acid uric și urați, sub formă de tofi gutoși, la nivelul
articulațiilor, anumitor țesuturi și rinichi. Manifestările clinice ale bolii sunt determinate de iritația
mecanică pe care cristalele o exercită asupra zonei de depunere, dar și de contribuției factorului
3
inflamator. Cristalele sunt fagocitate de leucocitele polimorfonucleate (PMN), care eliberează
mediatori ai inflamației și activează factorul XII al coagulării din lichidul sinovial, ceea ce va duce
la activarea sistemului kinină- kalicreină, se eliberează factori chemotactici, care vor atrage
leucocitele; se creează astfel un cerc vicios, care întreține boala.
Atacul acut de gută poate fi precedat sau însoțit de manifestări generale, precum inapetență,
greață, insomnie. Manifestările articulare se traduc prin dureri articulare care cresc progresiv în
intensitate. În 75% din cazuri prima articulație afectată este articulația metatarso- falangiană a
halucelui, care suferă modificările caracteristice unei inflamații: tumor, dolor, rubor, calor și
impotență funcțională. Pot fi interesate și alte articulații: gleznă, genunchi, coate, pumn. Fără
tratament, atacul se ”stinge” în câteva zile, crizele ulterioare repetânduse la intervale variate de
timp, precipitate de traumatisme, stres, nerespectarea regimului alimentar hipoproteic sau ingestia
crescută de alcool. În timp, boala se cronicizează, perioadele asimptomatice dintre crize se
scurtează, apar tofii gutoși, artralgiile și redoarea articulară. Aproximativ 20% dintre cazuri
prezintă și nefropatie gutoasă.
Dozarea acidului uric se realizeză cel mai ușor utilizând metoda enzimatică cu uricază.
Principiul metodei:
Acidul uric este degradat sub acțiunea uricazei la alantoină, cu formare de H 2O2, care va
oxida un amestec cromogen cu formarea unei chinonimine de culoare roșie.
O
NH O NH
HN uricaza H2N
O + 2 H2O + O2 O + H2O2 + CO2
O N N N N
H O
H H H
peroxidaza
2H2O2 + 4 aminoantipirina + diclorofenilsulfat chinoniminã + 4H2O
Reactivi:
- reactiv de lucru: fosfat 100 mmol/l, detergent 1,5 g/l, diclorofenilfosfat 4 mmol/l, uricaza ˃
o,12 U/ml, ascorbat oxidaza ˃5 U/ml, peroxidaza ˃1 U/ml, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/l,
pH 7,8;
- standard acid uric 6 mg/dl (357 µmol/l).
Mod de lucru:
Probă 25 μl - -
Standard de acid uric - 25 μl -
Apă distilată - - 25 μl
Reactiv de lucru 1 ml 1ml 1 ml
Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 37 0C.
4
concentraţia de acid uric din proba de analizat conform formulei:
Cprobă = Aprobă/Astandard x Cstandard x Factorul de diluţie al probei

sau fluorură. Acidul uric este stabil în probele de ser sau plasmă 7 zile la 2-8 0C, iar cel din urină 4
zile la temperatura camerei dacă se ajustează pH-ul cu NaOH la valori ˃8.
Valori normale:
Ser/plasmă Urină
Femei: 2,6 – 6,0 mg/dl
250 – 750 mg/24h
Bărbaţi: 3,5 – 7,2 mg/dl
5
Explorarea tulburărilor metabolismului purinic. Dozarea acidului uric seric şi urinar.
Obiective:
- Definirea acidului uric din punct de vedere metabolic;
- Cunoaşterea metodei de dozare a acidului uric.
Acidul uric reprezintă la om și la primatele superioare produsul final de catabolism al
bazelor azotate purinice (adenina şi guanina) din componența acizilor nucleici ingerați
(proveniență exogenă) sau rezultați din distrugerea celulară (proveniență endogenă). Celelalte
specii de mamifere au posibilitatea conversiei acidului uric, într-o etapă de degradare ulterioară,
în alantoină, produs caracterizat de o hidrosolubilitate superioară acestuia.
Asupra acizilor nucleici acționează inițial enzime de tipul nucleotidazelor, care generează
nucleozide. Asupra nucleozidelor acționează ulterior nucleozidaze, cu eliberarea bazelor azotate,
care sunt ulterior supuse unui proces de dezaminare, cu formare de hipoxantină și xantină.
Acestea sunt degradate sub acțiunea xantinoxidazei până la acid uric. Xantinoxidaza este o
enzimă din clasa dehidrogenazelor, care este localizată cu precădere la nivel hepatic și intestinal.
Enzima hepatică este responsabilă de sinteza de novo a acidului uric, în timp ce enzima
intestinală realizează sinteza acidului uric din acizii nucleici de origine alimentară.
Concentrația plasmatică a acidului uric poartă numele de uricemie. La valori ce depăşesc
concentraţia maximă, plasma este saturată și există posibilitatea formării de cristale de acid uric,
cu precipitarea acestora la nivel tisular. Deşi acidul uric se găseşte în sânge în forma enolică, la
pH-ul fiziologic al plasmei doar atomul de hidrogen de la C2 se comportă ca o grupare cu
proprietăţi acide.
O OH
~
Q-
NH N
HN N
O
y OH
îl
y
O N N N
H HO N
H H
Formele tautomere ale acidului uric (reprezentările ceto şi enolică)
1
NH 2 O O O
N AMP dezaminaza H H H N
N N N N
N N
H2O NH4
N N N N N
N O N N H2N
O O O O
t t t H t
HO - P - O - CH2 HO - P - O CH 2
O -
O HO P O CH2 HO - P - O - CH 2
O O
I
OH H H I H H I H
OH OH H H OH H
H H H H H H H H
OH OH OH OH OH OH OH OH
Ade nozin 5` monofosfat Inozin 5` monofosfat Xantozin 5` monofos fat Guanozin 5` monofosfat
ţ ţ
H2O H2O H2 O H2O
Nucleotidaza Nucleotidaza Nucleotidaza Nucleotidaza
Pi Pi Pi Pi
Adenozin
Ade nozina
H2~ ,·+
dezaminaza Inozina Xantozina Guanozina
ţ ţ
O NH4 Pi Pi Pi
Purin nucleozid Purin nucleozid Purin nucleozid
fosforilaza fosforilaza fosforilaza
Ribozo-1-fosfat Ribozo-1-fosfat Ribozo-1-fosfat
Hipoxantina
~-
Xantin oxidaza
O 2 + H2O H2 O 2
Xantina
H2 O
Guanin dezaminaza
NH4
Guanina
ţ
H2O + O 2
Xantin
oxidaza
H2O 2
Acid uric
Biosinteza acidului uric
2
Cea mai mare parte a acidului uric circulă în sânge sub formă de urat monosodic (˃90%),
iar restul ca acid uric liber. La pH normal al plasmei solubilitatea uratului de sodiu este mai mare
decât cea a acidului uric liber
OH
N
N
OH
NaO N N
H
Structura uratului monosodic
Hiperuricemiile se definesc ca valori ale acidului uric plasmatic mai mari decât limita
superioară a normalului. În funcție de mecanismul de producere, hiperuricemiile se împart în
două mari categorii: hiperuricemii primare și hiperuricemii secundare.
 Hiperuricemiile primare sunt enzimopatii, de obicei ereditare.
 Hiperuricemiile secundare sunt consecința unor afecțiuni, iar creșterea
concentrației plasmatice a acidului uric se datorează fie hiperproducției de acid
uric, fie eliminării deficitare a acestuia.
Deoarece s-a demonstrat că trigliceridele, corpii cetonici și acidul lactic sunt în competiție cu
acidul uric pentru eliminarea la nivelul tubilor renali, afecțiunile caracterizate de o creștere a
valorilor acestor metaboliți sunt însoțite secundar de creșteri ale valorilor acidului uric.
Hipouricemiile sunt mult mai rare decât hiperuricemiile; reprezintă scăderea valorilor
plasmatice sub limita inferioară a normalului. Se poate datora unor afecțiuni hepatice
parenchimatoase grave (ficatul este sediul sintezei acidului uric), unor deficite enzimatice
(deficitul de xantinoxidază determină xantinuria ereditară) sau administrării de medicamente:
Allopurinol (inhibă competitiv activitatea xantinoxidazei prin analogie structurală cu hipoxantina,
scăzând astfel producția de acid uric), 6- Mercaptopurina (scade sinteza nucleotidelor purinice
prin inhibiție competitivă a enzimelor responsabile de procesul de sinteză).
O S
N
HN HN
N
N N N
N H H H
Allopurinol 6-Mercaptopurina
Hiperuricemiile. Guta reprezintă manifestarea clinică a unei hiperuricemii, fie ea primară

sau secundară. Afectează în special bărbații cu vârste cuprinse între 30 și 50 de ani și este
caracterizată de depunerea cristalelor de acid uric și urați, sub formă de tofi gutoși, la nivelul
articulațiilor, anumitor țesuturi și rinichi. Manifestările clinice ale bolii sunt determinate de
iritația mecanică pe care cristalele o exercită asupra zonei de depunere, dar și de contribuției
3
factorului inflamator. Cristalele sunt fagocitate de leucocitele polimorfonucleate (PMN), care
eliberează mediatori ai inflamației și activează factorul XII al coagulării din lichidul sinovial,
ceea ce va duce la activarea sistemului kinină- kalicreină, se eliberează factori chemotactici, care
vor atrage leucocitele; se creează astfel un cerc vicios, care întreține boala.
Atacul acut de gută poate fi precedat sau însoțit de manifestări generale, precum
inapetență, greață, insomnie. Manifestările articulare se traduc prin dureri articulare care cresc
progresiv în intensitate. În 75% din cazuri prima articulație afectată este articulația metatarso-
falangiană a halucelui, care suferă modificările caracteristice unei inflamații: tumor, dolor, rubor,
calor și impotență funcțională. Pot fi interesate și alte articulații: gleznă, genunchi, coate, pumn.
Fără tratament, atacul se ”stinge” în câteva zile, crizele ulterioare repetânduse la intervale variate
de timp, precipitate de traumatisme, stres, nerespectarea regimului alimentar hipoproteic sau
ingestia crescută de alcool. În timp, boala se cronicizează, perioadele asimptomatice dintre crize
se scurtează, apar tofii gutoși, artralgiile și redoarea articulară. Aproximativ 20% dintre cazuri
prezintă și nefropatie gutoasă.
Dozarea acidului uric se realizeză cel mai ușor utilizând metoda enzimatică cu uricază.
Principiul metodei:
Acidul uric este degradat sub acțiunea uricazei la alantoină, cu formare de H2O2, care va
oxida un amestec cromogen cu formarea unei chinonimine de culoare roșie.
O
NH O NH
HN uricaza H2N
O + 2 H2O + O2 O + H2O 2 + CO2
O N N N N
H O
H H H
peroxidaza
2H2O2 + 4 aminoantipirina + diclorofenilsulfat chinoniminã + 4H2O
Reactivi:
- reactiv de lucru: fosfat 100 mmol/l, detergent 1,5 g/l, diclorofenilfosfat 4 mmol/l, uricaza
˃ o,12 U/ml, ascorbat oxidaza ˃5 U/ml, peroxidaza ˃1 U/ml, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/l,
pH 7,8;
- standard acid uric 6 mg/dl (357 µmol/l).
Mod de lucru:
Probă 25 μl - -
Standard de acid uric - 25 μl -
Apă distilată - - 25 μl
Reactiv de lucru 1 ml 1ml 1 ml
Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 370C.
4
concentraţia de acid uric din proba de analizat conform formulei:
Cprobă = Aprobă/Astandard x Cstandard x Factorul de diluţie al probei
probele de urină se diluează 1/10 cu apă distilată înainte de dozare.

sau fluorură. Acidul uric este stabil în probele de ser sau plasmă 7 zile la 2-8 0C, iar cel din urină
4 zile la temperatura camerei dacă se ajustează pH-ul cu NaOH la valori ˃8.
Valori normale:
Ser/plasmă Urină
Femei: 2,6 – 6,0 mg/dl
250 – 750 mg/24h
Bărbaţi: 3,5 – 7,2 mg/dl
5
Oligoelemente I. Roluri biologice, semnificaţie diagnostică
Obiective:
- Definirea termenului de oligoelemente
- Cunoaşterea importanţei oligoelementelor pentru organismul uman.
Oligoelementele sunt substanţe minerale care îndeplinesc rolul de catalizator în unele

procese biologice şi care se găsesc în organism în cantităţi foarte mici (mai puţin de 0,1% din
greutatea organismului). Din categoria oligoelementelor fac parte: fluor, mangan, crom, zinc, cupru,
iod, cobalt, seleniu, molibden şi fier.
Fluor
Se găseşte în apa potabilă fluorurată, în produse animale (oase, dinţi), în cereale (grâu, orz,
orez), fructe (nuci, portocale, piersici, coacăze, mere, căpşuni, struguri, caise) legume (ridichii,
cartofi, roşii) şi ceai. Nu se găsește în natură decât sub formă de compuși (fluorită sau fluorură de
calciu, criolită, apatită).
Necesarul zilnic este de 1,5-3 mg. Este un agent protector al oaselor (rol important în metabolismul
calciului) şi al tendoanelor astfel că deficitul de fluor al organismului duce la apariţia cariilor
dentare, rahitismului, osteoporozei. În doze crescute are rol dăunator ducând la calcifierea
tendoanelor şi a ligamentelor, încetinirea creşterii scheletice, cu afectarea diverselor organe (rinichi,
ficat, inimă, glande endocrine, sistem nervos).
Prin fluorizarea apei potabile în exces sau prin ingestia de suplimente nutritive în exces apare
fluoroza, o afecţiune caracterizată prin dinţi friabili care capătă un aspect pătat datorită unor pete
alb-gălbui de pe suprafaţa smalţului.
Mangan
Este un oligoelement cu importanţă deosebită, care poate fi asimilat din alimente precum:
cereale, legume (varză, ţelina, morcov, ceapă, cartofi, spanac), nuci, alune şi ceai. Aportul zilnic
necesar organismului este de 2-3 mg. Odată absorbit în organism, circulă în plasmă legat de
albumină fiind transportat astfel la ficat, rinichi, pancreas şi glande endocrine. Are un rol important
în reglarea metabolismului proteinelor, glucidic, lipidic, stimulează sinteza colagenului, rol în
producerea insulinei de către celulele beta din pancreas, intra în alcătuirea enzimei superoxid
dismutaza, rol esenţial în creşterea rezistenţei osoase şi în funcţia de reproducere.
Hipomanganemia determină anemie, dificultăţi în coordonarea mişcărilor, sterilitate,
scăderea imunităţii şi a rezistenţei osoase, tulburări de creştere, convulsii şi chiar paralizii.
Intoxicaţia cu mangan apare după inhalare de pulbere de mangan la persoanele care lucrează în
mine sau la prelucrarea minereului şi se caracterizează prin astenie, anorexie, agitaţie, cefalee,
halucinaţii, crampe la nivelul membrelor, tulburări de vorbire, auz şi mers.
Crom
Este un mineral indispensabil organismului care poate fi luat din: drojdie, ficat, cartofi,
fructe şi legume proaspete, condimente. Având în vedere că necesarul zilnic de crom este foarte
1
mic, o dietă variată asigură o cantitate optimă de crom necesară bunei funcţionări a întregului
organism.
Funcţii biologice: controlează nivelul glicemiei din sânge, având deci un rol important la pacienţii
diabetici; scade tensiunea arterială şi nivelul colesterolului din sânge; participă în metabolismul
grăsimilor (arderea acestora, ducând la pierderea în greutate) şi al proteinelor; un nivel optim de
crom scade riscul afecţiunilor oculare. Excesul de crom în organism poate avea efect iritant asupra
tegumentelor, plămânilor, tractului gastrointestinal şi poate determina hipoglicemie, insuficienţă
renală cronică, chiar cancer pulmonar la cei cu expunere profesională la acest mineral.
Zinc
Acest mineral nu poate fi sintetizat de organismul uman (alături de fier şi cupru), el putând fi
procurat din carne, peste, fructe de mare (stridii), ouă, brânzeturi, drojdia de bere, fasolea. Din
alimente numai 30-50% din cantitatea de zinc conţinută este absorbită de organism, absorbţie care
se realizează la nivelul intestinului. Zincul ajută activitatea a numeroase enzime (ARN-polimeraze,
în special), are proprietăţi antioxidante ducând la creşterea imunitătii organismului, ajută la procesul
de formare a celulelor sanguine, grăbeşte procesul de vindecare al arsurilor şi rănilor, rol important
în activitatea pancreasului şi a organelor sexuale, precum şi în buna funcţionare a sistemului nervos.
În organism zincul se află în cantitate de cca 1,8 gr, iar dintre organe cea mai mare cantitate se află
în prostată, deficitul de zinc putând determina atrofie testiculară. În caz de alimentaţie
necorespunzătoare sau creşterea necesităţilor fiziologice la femeile însărcinate sau copii în perioada
de creştere poate apare un deficit de zinc manifestat prin întârziere a creşterii, unghii casante,
căderea părului, întârzierea cicatrizării plăgilor, anemie, alterarea simţului gustativ, infecţii,
afectarea acuităţii vizuale, cu posibilitatea apariţiei de malformaţii la femeile însărcinate.
Cupru
Este un mineral cu rol antiinfectios (folosit de organism în infecţii, ex. gripa), antiviral,
anticancerigen şi antiinflamator. Cuprul ajută la fixarea fierului şi la formarea hemoglobinei, este
anticoagulant, ajută la dezvoltarea creierului şi în procesul de formare al colagenului, elastinei şi
melaninei. Cuprul joacă un rol important şi în sănătatea oaselor şi dinţilor precum şi în buna
funcţionare a inimii şi a sistemului vascular. Se poate lua din diverse alimente: cereale, legume,
fructe, migdale, nuci, alune, polen, organe (ficat), stridii. După ce e absorbit cuprul este legat de
albumină şi ceruloplasmina fiind depozitat la nivelul ficatului. Principala cale de eliminare a
cuprului este cea biliară şi numai în cantităţi extrem de mici pe cale renală.
Doza zilnică recomandată este de 2-3 mg/zi la adulţi. În cazul unui consum mărit cuprul
devine toxic, intoxicaţia manifestându-se prin icter şi anemie. Nivelul crescut mai poate să apară şi
în cazul infecţiilor acute (ceruloplasmina este un reactant de faza acută), infarctului miorcardic,
leucemiei, bolilor inflamatorii. Hipocupremii pot aparea în sindrom nefrotic, anemie, malnutriţie
infantilă, nefroza, malabsorbţie, în cursul unor tratamente medicamentoase (glucocorticoizi), boala
Wilson. Boala Wilson este o afecţiune autozomal-recesivă caracterizata prin scăderea concentraţiei
cuprului legat de ceruloplasmină cu creşterea concentraţiei ionului liber, a complexului cupru-
albumină cu retenţie excesivă a cuprului în ficat şi creşterea excreţiei urinare a cuprului. Pacientul
diagnosticat cu boala Wilson prezintă afectare hepatică, renală, neurologică, leziuni corneene şi
anemie hemolitică.
2
Iod
Este oligoelementul necesar sintezei hormonilor tiroidieni (tiroxina și triiodotironina),
hormoni care au influenţă asupra metabolismului bazal, rol în procesul de creştere la copii şi în
producerea de energie. Iodul este indispensabil pentru dezvoltarea creierului. În organismul uman
este întâlnit în glanda tiroidă în aprox. 80 % din cantitatea totală, restul se găseşte în glandele
salivare, glanda pituitară, stomac şi ovare. Pentru adulţi necesarul zilnic de iod este de 150 µg,
putând ajunge până la 200 µg la femeia însărcinată. Sursa cea mai importantă de iod o reprezintă
sarea iodată.Iodul se mai găseşte şi în alimentele marine (alge, fructe de mare, cod, creveţi, biban)
precum şi în ciuperci, produsele lactate şi ouă. În zonele cu deficit de iod prin consumul unor
alimente ca varza, gulia, conopida, broccoli, cartofii dulci există pericolul încetinirii absorbţiei
iodului în organism. Pe parcursul sarcinii gravida trebuie să aibă o dietă alimentară bogată în iod
deoarece deficitul acestui mineral duce la avort, naştere prematură şi retard mintal la copil. Se
recomandă consumul de peste de 3-4 ori pe săptămână.
Deficitul de iod în organism determină scăderea hormonilor tiroidieni cu apariţia
hipotiroidismului care dacă apare la naştere rezultă un nanism dizarmonic, iar la adult insuficienţă
tiroidiană determină apariţia mixedemului. Pacientul acuză o stare de oboseală, somnolenţă,
intoleranţă la frig, căderea şi albirea precoce a părului care este aspru şi fără luciu, fragilitatea
unghiilor, scăderea capacităţii intelectuale, creştere în greutate, tendinţa la depresie şi izolare,
constipaţie, precum şi afectare cardiacă. Excesul de iod determină hipertiroidia cu apariţia bolii
Basedow, cea mai completă formă de hiperfuncţie tiroidiană. Boala afectează mai frecvent femeile
decât barbaţii şi se caracterizează prin exoftalmie bilaterală şi simetrică, fotosensibilitate,
hiperfagie, iritabilitate, transpiraţie excesivă, tulburări de ritm cardiac. Aceşti pacienţi sunt agitaţi,
vorbesc repede, prezintă tendinţa la diaree şi intoleranţa la căldură.
Cobalt
Acest mineral cu proprietăţi vasodilatatoare intră în compoziţia vitaminei B12, contribuie la
menţinerea integrităţii sistemului nervos şi participă la procesele de creştere şi regenerare tisulară.
Este un antianemic, participând la procesul de formare a hematiilor alături de fier şi cupru.
Necesarul zilnic de cobalt este redus fiind estimat la max. 8 µg/zi. Administrarea cronică de cobalt
poate duce la hipertrofia glandei tiroide, iar deficitul acestui mineral determină simptome asociate
cu deficitul vitaminei B12.
Seleniu
Este un antioxidant cu rol protector al organismului împotriva virusurilor şi agenţilor
cancerigeni, fiind ştiut faptul că scade incidenţa cancerului de prostată, pulmonar şi colorectal. Se
presupune că are rol antiaterogen şi că încetineşte îmbătrânirea astfel că preparatele pe baza de
seleniu sunt recomandate în special bătrânilor. Acest mineral se regăsește în carne (ficat, rinichi),
fasole uscată, peste, varză, ouă, ciuperci şi cereale. Trebuie acordată o atenţie deosebită
administrării acestui mineral deoarece în caz de depăţire a dozei terapeutice pot apare tulburări de
respiraţie, paralizia muşchilor, chiar orbire.
Molibden
Reprezintă un co-factor al unor enzime, participând astfel la procesul de formare a
hemoglobinei şi ardere a grăsimilor, contribuie la producerea energiei şi intervine în procesul de
creştere la copii. Molibdenul se găseşte în coacaze negre, fasole, mazăre, cereale. Pacienţii hrăniţi
artificial timp îndelungat pot prezenta scăderea concentraţiei acestui mineral în organism.
3
Oligoelemente II.
Dozarea fierului seric şi determinarea capacităţii totale de
legare pe transferină
Obiective:
- Cunoaşterea proteinelor care transportă şi depozitează fierul, precum şi caracterizarea lor;
- Însuşirea valorilor normale, a variaţiilor patologice şi a principiului metodei de dozare a
fierului.
Fier
Microelement indispensabil organismului deoarece reprezintă un element primordial al
hemoglobinei şi participă la transportul oxigenului în sânge. Deasemenea el intră în alcătuirea unor
proteine şi enzime, ajută la procesul de creştere şi măreste rezistenţa la îmbolnăvire. În organism
fierul se găseşte în compuşii heminici (în special hemoglobina şi mioglobina) în cea mai mare parte
şi într-o cantitate foarte mică în anumite enzime (peroxidaze, catalaze, ribonucleotid-reductaze).
60% din cantitatea de fier din organsim se află sub formă de fier heminic care se găseşte în carnea
roşie (carne de vită şi organe: ficat, inima, rinichi) şi peşte, fierul neheminic luându-se din lactate,
fructe uscate (struguri, caise), cereale integrale şi legume verzi (fasole, sparanghel, spanac, morcov,
varză, patrunjel) care însă nu poate asigura nevoile cotidiene şi este mai dificil de absorbit de
organism. Absorbţia fierului are loc în intestinul subţire proximal şi este facilitată de aciditatea
gastrică şi vitamina C, iar calciul şi teina din ceai îi încetinesc absorbţia, iar apoi este preluat de
transferina care-i asigură transportul prin sânge. Excreţia de fier are loc prin urină, prin
descuamarea epiteliilor, prin pierderile celulare la nivel gastrointestinal, prin materiile fecale şi
pierderile menstruale la femeie, realizându-se astfel un echilibru între fierul care se absoarbe şi cel
care se elimină. Eritrocitele senescente care ating vârsta de 120 zile sunt degradate la nivelul
sistemului reticulocitar (splina, ficat, măduvă osoasă şi intestin) astfel că fierul rezultat este
reutilizat cu depozitarea acestuia sub formă de feritină şi hemosiderină.
În plasma feritina se află în concentraţie mică, este sărăcă în fier şi este prima care scade în
deficitul de fier, după care apare anemia şi alte modificări hematologice.
Valori normale: 30-300 µg/l. Valori crescute apar în boala cronică de rinichi, anemii
(megaloblastică, hemolitică, talasemie), ciroză, hipertiroidism, IMA, supraîncărcare cu fier la
transfuzaţi sau dializaţi. Este considerată un marker tumoral fiind crescută în leucemii, limfoame,
cancer pancreatic, bronsic, precum şi în carcinomul hepatocelular. Scăderi ale feritinei apar în
anemia feriprivă.
Hemosiderina medulară se prezintă sub formă unor granule albastre pe frotiurile medulare
colorate cu albastru de Prusia, granule evidenţiate la microscopul optic. Depozitele de fier se pot
evalua şi prin testul de absorbţie intestinală a fierului şi testul de excreţie urinară a fierului.
Sideremia reprezintă concentraţia fierului liber în plasmă (fier plasmatic, fier circulant).
Sângele se va recolta dimineaţa pe nemâncate (valoarea fierului este mai crescută în această
perioadă a zilei), înaintea administrării de preparate de fier sau transfuzii de sânge, evitându-se
deprivarea de somn (scade sideremia) sau chelatorii de fier într-un vacutainer fără anticoagulant cu
sau fără gel separator. După recoltare proba este centrifugată la 3000 rotaţii/min timp de 10 minute
cât mai repede posibil. Se foloseşte pentru determinare metoda cu ferozină (metoda colorimetrică).
Valori de referinţă:
1
barbati 65-175 µg/dl (11,6- 31,3 µmol/L), femei 50-100 µg/dl (9.0-30,4 µmol/L).
Metoda cu ferozină pentru determinarea fierului plasmatic
Fierul este eliberat din transferină în mediu acid şi redus la forma sa feroasă pentru a se
combina cu un cromogen pentru măsurarea colorimetrică. Cu această metodă se poate măsura
fierul direct fără a fi nevoie de etapa precipitării proteinelor şi fără interferenţa cuprului endogen.
Metoda presupune existenţa unei concentraţii mari de clorhidrat de guanidina în scopul prevenirii
precipitării proteinelor din plasmă şi din probele paraproteinemice.
Principiul metodei.
Ionul feric este disociat din proteina transportoare, transferina, în mediu acid şi redus la
ionul feros. Ionul feros este apoi complexat cu ferozina, un indicator sensibil de fier pentru a
produce un cromofor colorat, reacţie ce are loc la o lungime de undă cuprinsă între 571 - 658 nm.
mediu acid
Transferinã (Fe3+) Apotransferinã + Fe3+
Fe3+ + Acid ascorbic Fe2+
Fe2+ + Ferozinã Complex Fe2+- ferozinã (violet)
Probele hemolizate pot cauza o importantă interferenţă cu această metodă.
Scăderea fiziologică a sideremiei are loc în timpul menstruaţiei, datorită administrării unor
medicamente (aspirina, alopurinol), valori scăzute după-amiaza şi foarte scăzute seara. Scăderi
patologice apar în anemia feriprivă, infecţii şi tumori maligne, postoperator, sindromul nefrotic,
atransferinemia congenitală (lipsa totală a transferinei), avitaminoza C, scăderea aportului prin dieta
inadecvată, scăderea absorbţiei (rezecţii de stomac sau intestin, sindrom de malabsorbţie). Pot apare
creşteri ale nivelulului fierului seric în hemocromatoza idiopatică, în diferite anemii (aplastice,
sideroblastice, hemolitice), hepatita acută virală, talasemie, în cazul administrării timp îndelungat a
preparatelor cu fier.
Dozarea fierului seric (metoda Heilmeyer modificată)
Principiu:
Se tratează serul sanguin cu acid clorhidric când se eliberează Fe3+ din legătura sa cu
proteinele (transferina). Se precipită proteinele serice cu acid tricloracetic, după filtrare Fe3+ din
filtrat este redus cu hidrochinona la Fe2+.
Ionii de Fe2+ formează cu ortofenantrolina şi, mai specific, cu α,α’ -dipiridil, un complex colorat în
roşu. Intensitatea coloraţiei roşii va fi proporţională cu concentraţia fierului din probă.
2+
N N
3 + Fe2+ Fe
N N
3
o- fenantrolinã o-fenantrolinã feroasã
(rosu)
Reactivi:
- Soluţie HCl 1N;
- Soluţie CCl3COOH 20%;
2
- Soluţie hidrochinonă 2%;
- Soluţie ortofenantrolină clorhidrică 1% (se poate utiliza şi ortofenantrolină, iar pentru dizolvare se
acidulează iniţial cu 2-3 picături de HCl concentrat)
- Soluţie semisaturată de CH3COONa. Se diluează extemporaneu o soluţie saturată (la temperatura
camerei cu apă bidistilată) în proporţie de 1:1
- Soluţie standard concentrată de fier 10 mg%: 0,0497 g FeSO4 x 7H2O, ad 100 ml cu apă bidistilată
sau 0,0702 g Fe(NH4)2(SO4)2 x 6H2O, ad 100 ml cu apă bidistilată. Standardul concentrat se
păstrează la frigider. Se diluează extemporaneu 1 ml la 100 ml cu apă bidistilată obţinându-se un
standard de lucru de 100 µg Fe % cu stabilitate limitată la 1-2 luni.
Mod de lucru:
În trei eprubete se pipetează conform tabelului:
Proba (ml) Standard (ml) Blanc (ml)
Sol. HCl 1 N 1 1 1
Ser nehemolizat 2 - -
Apa bidistilată - - 2
Solutie standard de Fe - 2 -
(100 µg %)
Agitare, 10 min. Repaus
Acid tricloracetic 20% 2 2 2
10 min filtrare, repaus şi apoi în eprubete
Filtrat 2 2 2
Sol. Hidrochinona 2% 0,2 0,2 0,2
Sol. o-fenantrolina 1% 0,1 0,1 0,1
Sol. Acetat de sodiu 2 2 2
Fiecare eprubetă se agită şi după 5 minute se citeşte absorbanţa probei (Ap) şi a standardului (As)
faţă de blanc, în cuva de 1 cm, la λ= 510 nm.
Calcul: Sideremia se calculează cu următoarea formulă:
Concentraţie Fe (µg%) = Aprobă/Astandard x C standard
Cstandard = concentraţia standardului de fier = 100 µg%
Capacitatea totală de legare a fierului (CTLF) - măsoară capacitatea totală de transport a

transferinei (TIBC-transferrin iron-binding capacity). Aproape o treime din situsurile de legare
pentru fier ale transferinei sunt ocupate de acesta, deci transferina serică are rezerve considerabile
privind capacitatea de legare a fierului. Creşteri ale CTLF apar în anemia feriprivă, sarcină, utilizare
de contraceptive orale. Valori scăzute apar în ciroza hepatică, afecţiuni maligne, boli inflamatorii
cronice, talasemie.
Valori de referinţă: adulţi: 250 - 425 μg/dl,
copii: 100 – 400 μg/dl
Prin raportarea fierului seric la capacitatea de legare a fierului de către transferină se obţine
saturaţia procentuală a transferinei, ale cărei valori normale sunt de 30 - 50%. În anemia feriprivă
apar valori ale saturaţiei sub 20%.
Principiu:
3
Pentru a satura transferina serică se adaugă exces de Fe3+. Se precipită fierul necomplexat cu
carbonat de hidroxid de magneziu şi se dozează spectrofotometric din supernatant fierul legat de
proteine.
Reactivi:
A. Clorură ferică 0,12 mmol/l;
B. Carbonat de hidroxid de magneziu (pudră).
Mod de lucru:
Se pipetează 0,5 ml ser sau plasmă cu 1 ml reactiv A, se agită şi se incubează eprubetele
pentru 5-30 de minute la temperatura camerei. Se adaugă apoi o linguriţă reactiv de precipitare
(reactiv B), urmată de agitare energică şi depozitare la temparatura camerei timp de 30-60 de
minute (în acest interval de timp se mai agită eprubetele pentru omogenizare). Se centrifughează 10
minute la 3000 rpm şi se extrage cu grijă supernatantul. Se determină în final concentraţia fierului
din supernatant folosind o metodă spectrofotometrică.
TIBC = concentrația fierului în supernatant x 3 (diluţia)
Saturaţia de fier (%) = 100 x concentraţia serică a fierului/ TIBC
4
Explorarea metabolismului hemoglobinei. Dozarea bilirubinei. Semnificaţia

fiziopatologică a bilirubinei în afecţiunile hepatobiliare
Obiective:
- Însuşirea procesului de biosinteză a formelor de bilirubină;
- Caracterizarea şi interpretarea icterelor;
- Cunoaşterea principiului metodei de dozare a formelor de bilirubină.
Hemoglobina este o heteroproteină de mari dimensiuni (GM=64000 Da), alcătuită în

proporție de 97% din globină, restul de 3% fiind reprezentat de Hem, format la rândul său din
protoporfirina IX și Fe2+.
V M
M 1 2 V
N N O2 H2O alfa - hidroxihemina (legata de globina
hemoxigenaza
Fe
cit P450 cu OH la carbonul metinic si Fe3+)
N N
3 M NADPH,H+ NADP
+
4
M NADPH,H+ O2
cit P450
P P
NADP+ CO
hem (legat de globina)
verdoglobina
-aminoacizi ____ I globina I . . . .
/
,-------- 14-----_::=-
sinteza unei noi molecule
Fe3+
de hemoglobina
I _
depozitat ca feritina si hemosiderina

biliverdina
1
HOOC I COOH
I
CH2 CH2 CH2
li CH2
I I li
H3C CH H3C CH2 CH2 CH3 H3C CH
2 3 4 1
C C O
HH HH
O N N C N N
H H H H H H
biliverdina
+
NADPH, H
biliverdin
reductaza
)
+
NADP
HOOC I COOH
I
CH2 CH2 CH2
li CH2
I I li
H3C CH H3 C CH2 CH2 CH3 H3C CH
O N C N C H2 N C N O
H H H H H H
bilirubina
Hemoglobina se găsește în interiorul eritrocitelor, unde îndeplinește multiple roluri
(transportul gazelor sanguine, asigurarea homeostaziei plasmatice prin intermediul sistemelor
tampon, ș.a.), astfel încât catabolismul hemoglobinei este în strânsă legătură cu durata de viață
a hematiilor, care este de aproximativ 120 de zile. Hemoliza fiziologică este declanșată de
îmbătrânirea eritrocitului, care este asociată cu apariția unor modificări la nivelul
componentei proteice a hemoglobinei. Procesul de hemoliză se desfășoară în marea majoritate
a cazurilor (90%) extravascular, în celulele sistemului reticulo-endotelial (SRE), unde
componentele hemoglobinei urmează căi specifice:
- fierul va fi preluat de transferină și depozitat sub formă de feritină sau
hemosiderină sau utilizat pentru sinteza altor molecule de Hem;
- globina va fi degradată la aminoacizii constituenți care vor fi ulterior utilizați
pentru sinteză de proteine;
- protoporfirina IX va fi degradată la bilirubină.
În 10% din cazuri procesul de hemoliză are loc intravascular, hemoglobina fiind
eliberată direct în sânge, unde va avea loc disocierea în dimeri a și b. Acestea vor fi preluate
de haptoglobină și transportate la nivelul SRE din splină, ficat, ganglioni limfatici, măduvă
osoasă și degradate asemănător hemolizei fiziologice. În cazul unei crize hemolitice severe,
când cantitatea de haptoglobină devine insuficientă, dimerii liberi fie se filtrează la nivel
renal, fiind ulterior absorbiți și transformați în hemosiderină, fie sunt oxidați la
2
methemoglobină, cu preluarea moleculei de Hem de către hemopexină, care o transportă la
nivel hepatic pentru a fi degradată. Surplusul de Hem, care nu poate fi preluat de către
hemopexină formează cu albumina plasmatică methemalbumină, formă în care va fi reținut
până când alte molecule de hemopexină vor deveni libere pentru a realiza transportul către
ficat. Dacă hemoliza depășește 5 g/zi, atunci cantități variabile de hemoglobină și
methemoglobină se vor elimina ca atare la nivel renal și se vor regăsi în urină.
Etapele succesive de degradare a hemoglobinei încep cu acțiunea hemoxigenazei,
având ca rezultat verdoglobina, compus aciclic oxidat al hemului legat de globină. După
eliberarea hemului și globinei, verdoglobina este transformată în biliverdină. Biliverdina este
redusă sub acțiunea biliverdinreductazei la bilirubină indirectă. Denumirea de bilirubină
indirectă sau directă este atribuită de Van der Berg în 1916, după ce a observat că o fracțiune
a bilirubinei (bilirubina liberă, neconjugată) prezintă o accelerare a reacției de diazotare după
adăugarea alcoolului. Astfel, fracțiunea care reacționează imediat cu reactivul diazo, descris
de Ehrlich, în lipsa alcoolului, este bilirubina directă (conjugată). Pentru situațiile în care
bilirubina se obține în alte țesuturi decât ficatul, aceasta va fi transportată prin sânge la ficat,
realizând un complex cu albumina serică datorită insolubilității în apă a bilirubinei indirecte.
Capacitatea de legare a bilirubinei de către albumină este limitată, odată depășită bilirubina
indirectă putând difuza, datorită liposolubilității caracteristice, prin membrana celulară și se
poate depune la nivel tisular. Legarea acesteia de către albumină este inhibată competitiv de
anumite medicamente (antiinflamatoare, sulfamide, substanțe de contrast) sau poate fi
diminuată prin modificările conformaționale induse albuminei serice de către acizii grași
liberi în exces.
Membrana hepatocitară are receptori specifici pentru albumina serică și odată ajunsă la
polul vascular al celulei hepatice, eliberează bilirubina indirectă, care pătrunde în interiorul
celulei prin mecanism de difuzie facilitată. Odată ajunsă în citoplasma hepatocitului,
bilirubina indirectă va fi preluată de două proteine citosolice, Y (ligandina) și Z. Acestea
prezintă afinitate diferită pentru bilirubină, proteina Z legând bilirubina la concentrații mari
ale acesteia, după saturarea ligandinei. Scopul acestor proteine este de a împiedica
pătrunderea în organitele celulare, dar și reîntoarcerea în torentul sanguin și totodată de a
realiza transportul bilirubinei indirecte la nivel microzomal, unde, sub acțiunea enzimei UDP
glucuronil transferaza se va realiza conjugarea bilirubinei indirecte cu acidul glucuronic,
rezultând bilirubina directă. Conjugarea bilirubinei cu resturi glucuronil se realizează la
nivelul resturilor propionil ale acesteia. După legarea unei molecule de glucuronil rezultă
bilirubinmonoglucuronidul, iar după legarea a două molecule de glucuronid,
bilirubindiglucuronidul. Sub acțiunea dismutazei, două molecule de bilirubinmonoglucuronid
pot forma bilirubindiglucuronid, conform reacției:
3
COOH
H O H
HOH H O
HO O CI
COOH
I
H OH
CH2 CH2
li-o
2 I I
M
HP4 1-r V M CH2 CH2 M M V
O N C N C H2 N C N O
H H H H H H
bilirubin monoglucuronid
î
dismutaza
COOH COOH
H O H H O H
HOH
~-1111 -10 H O O H HOH
HO O C
I
C
I O OH HOOC I COOH
I
H OH OH H CH2 CH2
CH2
I CH2
I li I
CH2 CH 2
I li
M V M CH2 CH2 M M V H3C CH H3C CH2 CH2 CH3 H3 C CH
H1-Y:'ţ]{H VµH V
O N C N CH2 N C N O O N C N C H2 N C N O
H H H H H H H H H H H H
bilirubin diglucuronid bilirubina
+
Bilirubina conjugată va fi transportată activ prin membrana hepatocitară, la nivelul
polului biliar al acesteia. Intră în compoziția bilei și va fi deversată în duoden în perioadele
interprandiale. La nivel intestinal, sub acțiunea enzimei β glucuronidază, bilirubina directă va
fi deconjugată și va suferi reacții de reducere succesive determinate de reductaze bacteriene.
Primul compus rezultat este urobilinogenul, acesta fiind redus ulterior la stercobilinogen. Prin
oxidare, urobilinogenul și stercobilinogenul se transformă în urobilină și stercobilină. Dacă
urobilinogenul și stercobilinogenul sunt incolori, formele oxidate ale acestora sunt pigmenți
colorați. Urobilinogenul și stercobilinogenul sunt absorbiți la nivel intestinal și ajung prin
intermediul venei porte la ficat, fiind ulterior excretați în bilă și încheind astfel ciclul entero-
hepatic al pigmenților biliari. O cantitate mică din urobilinogenul absorbit va fi eliminat pe
cale renală.
Concentrația plasmatică a bilirubinei poartă numele de bilirubinemie. Valoarea
normală a bilirubinemiei totale este de 0,4-1 mg%.
BT = BD + BI
BD = 0,2-0,4 mg%
BI = 0,4- 0,8 mg%
Când concentrația plasmatică a bilirubinei crește, bilirubina difuzează din sânge în
țesuturi, determinând colorarea în galben a acestora, respectiv ICTERUL.
4
Icterul este un semn clinic observat în afecţiunile hepatice, biliare, pancreatice sau
hematologice caracterizat prin coloraţia galbenă a pielii, sclerei şi mucoaselor, datorită
impregnării acestora cu bilirubină aflată în concentraţie crescută în circuitul sanguin. Este
nevoie de o concentraţie serică a bilirubinei de 2- 2,5 mg/100 ml pentru ca icterul să fie
descoperit la examenul obiectiv al bolnavului, însă la pacienţii care prezintă edeme sau au
tegumente brune constatarea icterului este mai dificilă. Concentraţia plasmatică a bilirubinei
totale este de 0,3-1 mg/100 ml cu predominenţa bilirubinei indirecte (aprox. 90-95%). Există
anumite situaţii însoţite de colorarea în galben a tegumentelor şi mucoaselor, dar cu o
concentraţie normală a bilirubinei serice precum hipercarotinemia (care nu influenţează
sclerele) sau ingestia de acid picric.
Cea mai mare parte a bilirubinei rezultă din degradarea hematiilor îmbătrânite şi mai
puţin din proteine non-hemoglobinice (citocromi, mioglobina, enzime ce conţin hem) sau prin
eritropoieza ineficientă a măduvei osoase prin distrugerea prematură a eritrocitelor tinere.
Iniţial se formează bilirubina neconjugată sau indirectă insolubilă în apă, care nu trece filtrul
renal şi care circulă în sânge legată de albumina până la ficat unde are loc conjugarea şi
convertitea ei într-un component hidrosolubil care se poate excreta în canaliculele biliare la
polul biliar al hepatocitului. Conjugarea bilirubinei cu acid glucuronic are loc la nivelul
reticului endoplasmic hepatocitar şi este catalizată de enzima uridin-difosfat glucuronil
transferaza rezultând bilirubina conjugată sau directă care ajunge în bilă şi ulterior în intestin.
În ileonul terminal şi colon, flora microbiană saprofită deconjugă şi reduce bilirubina care este
transformată în urobilinogen din care o parte este eliminat prin fecale sub formă de
stercobilinogen colorând materiile fecale în brun, o mică fracţiune ajunge în urină sub formă
de urobilinogen, iar cea mai mare parte este reabsorbită de intestinul subţire, ajunge prin
circulaţia portală la ficat (circuitul entero-hepatic) de unde este reexcretată prin bilă.
Tulburarile metabolismului bilirubinei cuprind:
- producţia crescută de bilirubină peste capacităţile de preluare ale ficatului;
- deficit de captare a bilirubinei;
- deficit de conjugare a bilirubinei;
- deficit de excreţie a bilirubinei.
Primele trei categorii sunt asociate cu bilirubinemie predominant neconjugată, iar
ultima cu bilirubinemie predominant conjugată.
Clasificarea icterelor:
- ictere prehepatice
- ictere hepatocitare
- ictere posthepatice (obstructive).
Icterele prehepatice apar cel mai frecvent în bolile hemolitice (talasemie, anemie
megaloblastică, sferocitoza ereditară, eliptocitoza ereditară, deficit de glucozo-6-fosfat
dehidrogenază) şi mai rar în infarctele pulmonare, resorbţie de hematoame, prezenţa unor
toxine sau paraziţi (malaria), colecţii hematice intratisulare (postoperatorii sau
posttraumatice). Icterul este moderat, fără prurit tegumentar caracterizat prin
hiperbilirubinemie neconjugată şi prezenţa anemiei, bolnavii fiind mai mult palizi decât
icterici. Scaunele pot fi închise la culoare datorită creşterii stercobilinogenului fecal şi urinile
5
hipercrome prin creşterea urobilinogenului. Bilirubina este absentă în urina iar testele hepatice
(GOT, GPT, fosfataza alcalină) sunt normale.
Icterele hepatocitare sunt determinate de hepatitele virale acute sau cronice, hepatitele
alcoolice, administrarea unor medicamente (acetaminofen, estrogenul, eritromicina,
antitiroidiene) sau substanţe de contrast, ciroza hepatică, metastazele hepatice,
hemocromatoza, boala Wilson, icterul recurent din cadrul sarcinii, maladii ereditare
(sindromul Dubin-Jonson, sindromul Rotor). Acest tip de icter se caracterizează prin creşterea
atât a bilirubinei directe cât şi a fracţiunii indirecte, dar cu o uşoară predominanţă a celei
directe. Icterul hepatocelular are o nuanţă discret rubinie şi poate fi precedat de urini intens
hipercrome care conţin atât bilirubină directă cât şi urobilinogen şi scaune decolorate prin
reducerea cantităţii de stercobilina.
Icterele posthepatice sau obstructive apar în litiaza biliară, afecţiuni neoplazice (cancer
de cap de pancreas, cancerul hepatic, neoplasm de coledoc), ghem de ascarizi, amiloidoză,
atrezie de căi biliare, ciroza biliară primară. Aceste ictere cu bilirubina directă, intens
pruriginoase şi cu o nuanţă caracteristică verzuie se caracterizează prin existenţa unui obstacol
mecanic pe calea biliară principală care impiedică scurgerea bilei în duoden ducând la apariţia
scaunelor decolorate şi steatoreice, fiind afectată şi absorbţia grăsimilor precum şi urini cu o
culoare comparată cu berea neagră datorită prezenţei bilirubinei conjugate. La o valoare a
bilirubinei totale care depăşeste 20 mg/100 ml putem vorbi de obstrucţia completă a căii
biliare.
În primele 2-5 zile de viaţă a nou-născutului, datorită incapacităţii enzimei UDP-
glucuronil-transferazei de a conjuga bilirubina produsă apare icterul fiziologic al nou-
născutului în care are loc o acumulare a bilirubinei neconjugate care nu depaşeşte valoarea de
5 mg/100 ml. Acest tip de icter nu trebuie să apară de la naştere şi odată cu maturarea
enzimei, în câteva zile are loc şi normalizarea icterului.
Determinarea bilirubinei serice
Principiu: Acidul sulfanilic diazotat (reactivul diazo) reacționează cu bilirubina din
proba de cercetat, rezultând un azopigment a cărui culoare variază în funcție de pH,
intensitatea culorii obţinute putând fi măsurată spectrofotometric. Bilirubina directă
reacționează direct cu reactivul diazo, în timp ce bilirubina indirectă va reacționa cu acesta
după adăugarea unui reactiv de solubilizare/accelerator (cofeină, alcool). Se determină
valorile bilirubinei totale și ale bilirubinei directe, valorile bilirubinei indirecte fiind
determinate prin diferența acestora.
Reactivi:
- reactiv BT: acid sulfanilic 29 mmol/l, acid clorhidric 0,2 mol/l, reactiv de
solubilizare cetrimide 50 mmol/l; de lucru
- reactiv BD: acid sulfanilic 35 mmol/l, acid clorhidric 0,24 mol/l;
- reactiv de lucru BT: 1 ml reactiv BT şi 4 ml azotat de sodiu 11,6 mmol/l;
- reactiv de lucru BD: 1 ml reactiv BD şi 4 ml azotat de sodiu 11,6 mmol/l;
- standard de bilirubină: 4,39 mg/dl.
Mod de lucru pentru bilirubina totală:
Proba Standard Blanc reactivi Blanc probă
6
Proba 100 μl - - 100 μl
Standard - 100 μl -
Apă distilată - - 100 μl -
Reactiv BT - - - -
Reactiv de lucru BT 1 ml 1ml 1 ml -
Se agită şi se incubează 2 minute la temperatura camerei.
Se citeşte absorbanţa blanc probă la λ = 540 nm faţă de apă distilată şi absorbanţa probei
şi standardului faţă de blancul de reactivi. Se calculează concentraţia de bilirubină totală din
proba de analizat conform formulei:
Cprobă = (Aprobă- Ablanc probă)/Astandard x Cstandard
Mod de lucru pentru bilirubina directă:

Proba Blanc reactivi Blanc probă
Proba 100 μl - 100 μl
Apă distilată - 100 μl
Reactiv BD - - 1 ml
Reactiv de lucru BD 1 ml 1 ml -
0
Se agită şi se incubează 5 minute la 37 C.
Se citeşte absorbanţa blanc probă la λ = 540 nm faţă de apă distilată şi absorbanţa probei
faţă de blancul de reactivi. Se calculează concentraţia de bilirubină directă din proba de
analizat conform formulei:
Cprobă = (Aprobă- Ablanc probă)/Astandard x Cstandard
mg BI/dl = mg BT/dl – mg BD/dl
7
Laborator 11 Medicina
Semnificaţia determinărilor ionice în afecţiunile paratiroidei.

Dozarea calciului, magneziului şi fosfaţilor
Obiective:
- Cunoaşterea principalelor roluri biologice ale calciului, magneziului şi fosforului;
- Interpretarea valorilor normale şi a variaţiilor patologice ale calcemiei, magneziemiei şi
fosfatemiei;
- Însuşirea principiilor metodelor de dozare ale calciului, magneziului şi fosforului.
Calciul
Calciul (Ca) plasmatic sub forma sa ionică este fracţiunea fiziologic activă în procesele
de homeostazie şi de excitabilitate neuromusculară, activitatea lui fiind reglată de PTH şi
vitaminele D. Concentraţia plasmatică a calciului este tot timpul constantă, concentraţia calciului
se află sub control hormonal, acesta fiind absorbit la nivelul tractului intestinal şi excretat la
nivelul rinichilor. Calciul se găseşte în fluxul sanguin în concentraţie de 9-11 mg/100 ml, din
care Ca ionic (liber) este în proporţie de 4,4- 5,5 mg/dl.
Organele principale care sunt implicate în homeostazia calciului sunt intestinul subţire,
scheletul, rinichii. Sistemul osos este rezervorul de calciu al organismului, deşi calciul este luat
doar din surse externe, acesta fiind depozitat 99% în schelet (sub forma cristalelor de
hidroxiapatită) restul de 1% regăsindu-se în lichidul extracelular fiind implicat în schimburile
intercelulare (50% ionizat, 40% legat de proteine - cea mai frecventă fiind albumina, 10% legat
în complexe: citrat, fosfat).
Balanţa Ca:
La copii, scheletul fiind în formare o să avem o balanţă pozitivă a calciului (formarea >
resorbţia), la adulţi există o stare de echilibru (formarea = resorbţia), iar la vârstnici există o stare
de depleţie a calciului (formarea < resorbţia). Calciul este luat din produsele lactate şi din carne,
absorbţia lui în intestin fiind sub controlul vitaminei D (calcitriol).
Funcţiile calciului în organism:
1. Intră în componenţa scheletului (hidroxiapatita, fosfat tricalcic);
2. Se comportă ca substanţă de semnalizare pentru conducerea nervoasă;
3. Este implicat în exocitoză;
4. Este implicat în contracţia musculară;
5. Acţionează ca şi cofactor în coagularea sângelui;
6. Este implicat în activarea unor enzime (acţionând ca un cofactor: fosfataza alcalină, lipaza,
fosfodiesteraza, etc.);
7. Are rol în menţinerea ritmului sinusal la nivelul cordului;
8. Este implicat în metabolismul renal deoarece excesul de ioni de calciu poate induce o
scădere a capacităţii de concentrare renală).
1
Homeostazia calciului
Hormonii cei mai importanţi implicaţi în reglarea homeostaziei calciului şi receptorii lor
sunt parathormonul (PTH) cu receptorul PTH (PTHR), 1,25(OH)2 D cu receptorul vitaminei D şi
calciul ionic cu receptorul pentru acesta. Calcitonina este un alt hormon implicat şi are un rol
inhibitor.
O scădere a calcemiei în ser inactivează receptorii de calciu (RCa) de la nivelul
paratiroidei care activează secreţia de PTH crescând reabsorbţia calciului de la nivel tubului
renal, iar la nivelul scheletului acţionează prin creşterea resorbţiei osoase. Ca răspuns la acţiunea
hormonului, nivelul calciului din ser se normalizează şi se opreşte reabsorbţia calciului, acest
mecanism fiind cunoscut sub denumirea de feedback negativ.
Factori care scad absorbţia calciului şi nivelul seric: deficitul de vitamina D3, oxalatul, fosfatul,
inozitol hexafosfat.
Factori care cresc absorbţia calciului: nivel crescut de vitamina D3, A, C, lactoza, HCl.
Remodelarea osoasă
Un rol important pe care îl deţine calciul este în mineralizarea scheletului, fiind implicat
în maturarea celulelor osoase, sub influenţa unui număr mare de hormoni: calcitriol, PTH,
calcitonina, estrogen. Osteoblaştii depozitează colagen, calciu şi fosfor (P), în timp ce
osteoclaştii secretă ioni de hidrogen şi colagenază, care la nivel local produc distrucţia osoasă,
prin aceasta producându-se remodelarea osoasă.
Valorile normale ale calcemiei
Ser, plasmă Copii 7-14 ani Ca total 4,5 -5,5 mEq/l 9-11 mg/100ml
Ca ionic 2,12- 2,88 mEq/l 4,25- 5,75 mg/100 ml
Adulţi Ca total 4,5 -5,5 mEq/l 9-11 mg/100ml
Ca ionic 2,14 – 3,16 mEq/l 4,3 – 6,3 mg/100ml
Urină Adulţi Ca total 5 – 15 mEq / l 100 – 300 mg/24h
Variaţii fiziologice: calcemia scade cu vârsta.
2
Os
o
(J\J PTH
(j)_ (±)
Calc1triol PTH
~_)
Intestin Vas de sange
Metabolismul Calciului
Hipercalcemia (Ca plasmatic > 10 – 11 mg/dl) poate fi produsă prin:
1. Absorbţia intestinală crescută - se produce datorită patologiei ce menţine un nivel crescut de
1,25 (OH)2D cum se întâmplă în sarcoidoză, intoxicaţie cu vitamina D sau consum mare de
calcitriol şi analogii săi.
2. Remodelarea osoasă se produce prin rata mare de resorbţie osoasă ce se produce în
metastazele osoase osteoclastice (prin catabolism activ în tumorile maligne),
hiperparatiroidismul primar (hiperplazia paratiroidei sau adenomul de paratiroidă, uneori în
boala von Reclinghausen), intoxicaţia cu vitamina D.
3. Excreţia renală a calciului
- hipercalcemie prin reabsorbţia tubulară ce se întâlneşte în hiperparatiroidismul primar,
depleţia Na, insuficienţa cardiacă, medicaţia cu diuretice tiazidice.
- hipercalcemia glomerulară se produce când filtrarea glomerulară nu este eficientă. Ex:
atacul de gută.
Hipocalcemia (Ca plasmatic < 9 mg/dl) poate fi produsă prin:
1. Hipocalcemia prin absorbţie intestinală scăzută - se întâlneşte rar datorită mecanismelor
de reglare a Ca seric prin depleţia calciului din oase. Cu toate acestea întâlnim un nivel scăzut de
Ca în deficitul cronic de vitamina D, osteomalacie, tetanie, rahitism.
2. Hipocalcemia prin remodelare osoasă se produce prin formarea osoasă crescută ce se
produce postoperator paratiroidectomiei şi în metastazele osoase în fază osteoblastică.
3
3. Hipocalcemia prin scăderea reabsorbţiei renale la nivel tubular se produce postoperator în
cazul paratiroidectomiei din hipoparatiroidsmului, anomalii la nivelui receptorului de PTH.
Metode de dozare a Ca pot fi: complexonometrice (Elliot), colorimetrice,
flamfotometrice, cu electrozi ion-selectivi, prin spectrofotometrie de absorbţie atomică.
Metoda complexonometrică:
Principiu:
Calciul reacţionează cu murexidul formând un complex de culoare roşie. Prin titrare cu
EDTA în mediu alcalin (pH > 12,5), murexidul se decomplexează şi se formează complexul Ca-
EDTA care este incolor. Reacţia ia sfârşit prin virarea culorii de la roşu (culoarea complexului
Ca-EDTA) la violet (culoarea murexidului liber).
Reactivi: plasmă, apa distilată, NaOH, EDTA, murexid
Mod de lucru:
Se folosesc 2 pahare Erlenmeyer de 100 ml (o probă şi un martor) în care se pipetează:
Reactivi Martor Proba
Apa distilată 52 ml 50 ml
Plasmă - 2 ml
NaOH 0,2 ml 0,2 ml
Indicator Murexid Câteva picături Câteva picături
EDTA 0,01N titrându-se pănă la culoare violet M P
Culoare reacţie Roz- violet Roz

Calcul:
Ca mg % = (P - M) ×0,2×50
Metoda colorimetrică:
Principiu: În mediu alcalin, calciul reacţionează cu orto-crezoftaleina, formând un complex
(roşu-violet) ce absoarbe între 500 – 580 nm.
Reactivi:
- Tampon etanolamina 500 mM;
- Orto crezolftaleina 0,62 mM, 8-hidroxichinoleina 69 mM;
- Standard de calciu 10mg / 100 ml;
Mod de lucru:
Reactivi Martor Standard Proba
Plasma - - 0,02 ml
Standard - 0,02 ml -
Tampon 1 1 ml 1 ml 1 ml
Cromogen 1 ml 1 ml 1 ml
Se agită şi se lasă 5 minute la temperatura camerei. Se citesc extincţiile pentru probă (EP) şi
martor (EM) la 570 nm.
4
Calcul:
x mg/100 ml = 10 × (EP - EM)/(ES - EM)
Metodă este liniară pentru valori de până la 18 mg/100 ml. Pentru valori mai mari se fac
diluţii din plasmă cu ser fiziologic în raport de 1:2. Urina va fi de asemenea diluată.
Fosforul
Fosforul este unul din componenţii principali ai organismului reprezentând aproximativ
1% din masa totală. Din acesta 87% se găseşte în schelet împreună cu Ca sub forma cristalelor de
hidroxiapatită şi de fosfat tricalcic. Concentraţia plasmatică a fosforului este menţinută într-un
interval de 2 – 5 mg/dl în special prin reglarea la nivel renal până în stadiile terminale ale
insuficienţei renale cronice. Fosforul se găseşte în mare parte la nivel intracelular şi mai puţin de
1% se întâlneşte liber în plasmă.
Fosforul este absorbit în intestinul subţire datorită mediului mai alcalin, astfel la nivelul
ileonului unde avem un ph ≈ 7 există cea mai intensă absorbţie a fosforului, fiind la fel ca şi în
cazul calciului stimulat de concentraţia de 1,25(OH)2 D.
Fosforul se găseşte în serul sanguin:
 În structura proteinelor sau acizilor nucleici (fosfoproteine sau nucleoproteine);
 Forma acidosolubilă – fosfor anorganic (acid ortofosforic);
– nucleotide;
…… .– acid fosfogliceric, fosfopiruvic, creatinfosforic, acizi trifosforici;
 Fosfolipide (lecitine, sfingomieline).
Funcţiile fosforului şi compuşilor cu fosfor în organismul uman:
 Este o componentă structurală a scheletului;
 Intră în constituţia fosfolipidelor din membrana celulară;
 Are rol în reglarea presiunii osmotice;
 Intra în componenţa ATP –ului şi altor molecule care depozitează energie;
 Intră în componenţa acizilor nucleici;
 Are rol în contracţia muşchilor;
 Are rol în conducerea nervoasă;
 Are rol în menţinerea ritmului sinusal la nivelul cordului;
 Sunt implicaţi în activarea unor enzime (acţionează ca şi cofactori);
 Sunt implicaţi în numeroase reacţii biochimice;
 Au un rol important în metabolismul intermediar;
 Intră în structura sistemelor tampon (Na2HPO4, K2HPO4) etc.
Homeostazia fosforului:
La nivel plasmatic concentraţia fosforului este controlată de aceleaşi substanţe care
controlează şi calciul: PTH, 1,25(OH)2 D şi calcitonina. În procesele de absorbţie a fosforului
sunt implicaţi mai mulţi receptori printre care co-transportorii tip 1 şi tip 2 de sodiu şi fosfor,
tranpostorii de tip 3 pentru fosfor.
5
Interacţiunea Calciu - Fosfor:
La nivelul scheletului Ca şi P acţionează sinergic cu osteoblastul, osteoclastul şi
proteinelor matrixului extracelular pentru a mineraliza osteoidul. La nivelul celorlalte ţesuturi
sistemele de reglare previn depozitarea calciului sub forma de hidroxiapatită la nivelul ţesuturilor
moi. În insuficienţa renală cronică unde balanţa calciu – fosfor este alterată producându-se
numeroare calcificări la nivelul ţesuturilor moi, vaselor de sânge ceea ce se corelează cu o
mortalitate ridicată.
Cele mai importante sisteme hormonale implicate în homeostazia fosforului şi
compuşilor cu fosfor sunt: factorul de creştere al fibroblaştilor (FGF-23) şi PTH. Astfel o
creştere a fosfatului seric produce o stimulare a secreţiei FGF 23 de la nivelul oaselor care
acţionează la nivelul tubular proximal în rinichi, reducând reabsorbţia fosfatului şi concomitent
reduce secreţia de calcitriol ce produce reducerea absorbţiei intestinale a fosforului. În cazul
fosfatului o concentraţie plasmatică crescută a PTH –ului scade reabsorbţia renală a fosfatului şi
o scădere a fosfatemiei. O scădere a PTH-ului produce o creştere a reabsobţiei fosforului la nivel
renal şi o creştere a fosfatemiei.
Homeostazia calciului şi a fosforului sunt intrepătrunse existând astfel o dereglare a unui
sistem (cum se produce în IRC) produce o dereglare în coodonarea celuilalt sistem producându-
se calcificări în ţesuturile moi.
Fosforul se întâlneşte în concentratie mai mare la copii, scăzând cu vârsta.
Valoarea normală a fosfatemiei:
Plasma, ser Copii 4 -7 mg/100 ml 2,03 – 3,19 mEq/l
Adulţi 2 – 5 mg/100 ml 1,16 – 2,90 mEq/l
Urina 0,7 – 1,5 g/24 h
Patologie
Variaţiile patologice pot caracteriza dereglările metabolismului osos, funcţiei paratiroidei,
funcţiei renale.
Hiperfosfatemiile se produc fie prin creşterea consumului sau absorţiei de P, cum se întâmplă în
dieta bogată în fosfor sau o excreţie renală scăzută a fosforului:
 Pseudohiperfosfatemii (întâlnite în mielomul multiplu);
 Consumul crescut de fosfaţi (prin administrare de fosfaţi sub formă de intravenoasă sau
capsule, sau sindroamele de liză tumorală);
 Excreţia scăzută de fosfat (insuficienţa renală cronică în stadiile avansate sau insuficienţa
renală acută, coma diabetică, hipoparatiroidism, acromegalie, deficitul de vitamina D)
Hipofosfatemiile se produc prin:
 Absorbtie inadecvată la nivel intestinal (întâlnită în malnutriţia cronică, consumul excesiv de
antiacide);
 Dezechilibrul fosfatului la nivel intra şi extracelular (osteomalacie, rahitism,
hiperparatiroidism, acidoze metabolice);
6
 Nivel scăzut de fosfaţi prin pierderea crescută de fosfor prin urină (defecte renale
congenitale a glomerulului, osteomalacie, diureza osmotică, acidoza diabetică).
Dozarea fosfatului din ser prin deproteinizare (metoda Briggs)

Principiu:
Proteinele se precipită cu acid tricloracetic (TCA). În mediul acid, fosfatul anorganic
reacţionează cu molibdatul de amoniu şi formează fosfomolibdatul de amoniu (formând un
complex colorimetric de culoare galbenă).
Reacţia prin care se formează fosfomolibdatul de amoniu este:
12(NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21HNO3----> (NH4)3H4P(Mo2O7)6+ 21NH4 NO3+ 10H2O
Se continuă prin reducerea la albastru de molibden, în mediu acid, de către hidrochinonă şi apoi
sulfit de sodiu. Intensitatea culorii albastre este proportională cu concentraţia fosforului din ser.
Reactivi:
- Acid tricloracetic 10%;
- Soluţie de molibdat de amoniu în mediu acid (25 g molibdat de amoniu cu completare cu H2O
până la 500 ml);
- Soluţie de hidrochinonă 1% mediu acid;
- Sulfit de sodiu 20%;
- Soluţie standard de fosfor;
- Soluţie etalon, diluţie 1:10 din stocul de standard de fosfor.
Mod de lucru:
Reactivi Standard Martor Proba
Ser/urină (1:10) - - 2 ml
TCA - - 4 ml
Standard 3 ml - -
Apa distilată 2 ml 5 ml 4 ml
Agitare cu filtrarea probei
Filtrat - - 5 ml
Molibdat de amoniu 1 ml 1 ml 1 ml
Sulfit de sodiu 1 ml 1 ml 1 ml
Hidrochinonă 1 ml 1 ml 1 ml
Apa distilată 2 ml 2 ml 2 ml
Agitare, apoi se păstrează 20 de minute la întuneric. Extincţiile se citesc la 720 nm.
Calcul: concentraţia fosfatului mg/100 ml ser = 3 × (EP - EM)/(ES - EM)
Magneziul
Magneziu, se găseşte într-o proporţie mai mică decât calciul în schelet, fiind dispus
intracelular în proporţie de 45% regăsindu-se în miocard, ficat, muşchii scheletici şi numai 1% se
găseşte în lichidele extracelulare şi sânge.
7
Ca şi calciul, acesta este absorbit la nivelul intestinului, absorbţia magneziului fiind crescută de
nivelul de parathormon, iar excreţia se face pe cale renală. În plasmă magneziul se găseşte în
forma sa ionică, în compuşi cu citrat, fosfat, bicarbonat sau legat de proteinele plasmatice (în
principal albumină).
Funcţiile magneziului în organismul uman:

 Are un rol important în metabolismul glucozei şi homeostazia insulinei;
 Este important pentru funcţionarea în parametrii normali a ATP –ului (adenozin trifosfat);
 Este implicat în contracţia şi relaxarea musculară;
 Are rol plastic;
 Este important în menţinerea tensiunii arteriale;
 Este util în terapia aritmiilor cardiace;
 Are rol de antiagregant plachetar;
 Este important în homeostazia Ca, Na şi fosfatului;
 Este cofactor în activarea enzimelor în peste 300 de reacţii.
Hipermagnezemia
Hipermagnezemia reprezintă creşterea nivelului seric peste 3 mg/dl. Se întâlneşte aproape
constant ca urmare a suplimentării medicamentoase a Mg (utilizarea laxativelor pe baza de Mg
este o cauză frecventă la vârstnici). Însă cea mai frecventă cauză de hipermagneziemie este cea
întâlnită în insuficienţa renală. Nivelul foarte ridicat al magneziului poate produce hipotensiune,
bradicardie şi chiar stop cardiorespirator.
Hipomagnezemia
Mult mai frecvent întâlnită clinic decât hipermagneziemia, la un nivel seric mai mic de
1,8 mg/dl. Se datorează în principal absorbţiei scăzute la nivel intestinal (rezecţii
gastrointestinale), creşterea pierderilor renale (afecţiuni renale, cetoacidoza diabetică,
medicamente: diuretice, digoxin). Alte afecţiuni în care întâlnim hipomagnezemia:
hipertiroidismul, hipercalcemie, rahitism, tetanie, diabet zaharat, consumul cronic de alcool,
arsuri, sepsis.
Metode de determinare a magneziului: colorimetrice, flamfotometrice, cu electrozi ion- selectivi,
spectrometrie de absorbţie atomică.
Metoda colorimetrică:
Principiu: În mediul alcalin, magneziul reacţionează cu calmagitul formând un complex de
culoare purpurie ce este absorbit la 500 -550 nm.
Reactivi:
- Aminometilpropanol 1 mmol/l, EGTA 0,2 mmol/l;
- Calmagit 0,3 mmol/l;
- Standard magneziu 2 mg/100 ml.
8
Mod de lucru:
Reactivi Martor Standard Proba
Plasma - - 0,02 ml
Standard Mg - 0,02 ml -
Amestec din reactivi 2 ml 2 ml 2 ml
Se agită. Se lasă 5 minute la temperatura camerei, extincţiile citindu-se la 520 nm.

Calcul: x mg Mg/100 ml = 2 × (EP -EM)/(ES - EM)
Metoda este liniară până la 5 mg/100 ml. Pentru probe mai concentrate se face diluţie 1:2 cu ser
fiziologic.
9
Examen sumar de urină.

Semnificaţia diagnostică a determinării unor compuşi patologici în urină.
Obiective:
- Cunoaşterea şi caracterizarea principalelor componente urinare cu semnificaţie
patologică;
- Întepretarea la microscop a unui frotiu realizat din sediment urinar.
Examenul sumar de urină este una din analizele uzuale de o mare importanţă pentru
diagnosticul afecţiunilor renale şi extrarenale, analiză de rutină prescrisă de către medicii de
familie şi medicii specialişti. Un diagnostic corect în afecţiunile renale se poate pune numai
pe baza unui examen complet al urinii care presupune:
- examenul macroscopic al urinii (aspect, culoare);
- examenul fizico-chimic (pH, densitate, proteine, glucide, corpi cetonici, pigmenţi urinari,
pigmenţi sangvini, biliari şi săruri biliare);
- examenul microscopic al sedimentului urinar;
- examenul citologic şi bacteriologic.
Componente urinare cu semnificaţie patologică
În anumite afecţiuni patologice, unele substanţe care se găsesc în urină în cantităţi
foarte mici ajung să fie eliminate în cantităţi considerabile şi anume:
- prezenţa proteinelor în urină este cauzată de boli primare ale nefronului sau afecţiuni
extrarenale, dar cu afectarea ulterioară a nefronului;
- prezenţa glucozei este cauzată de diabet zaharat, afecţiuni hepatice;
- prezenţa corpilor cetonici este cauzată de diabetul zaharat decompensate;
- prezenţa pigmenţilor şi a sărurilor biliare în urină apare în bolile hepatobiliare;
- prezenţa hemoglobinei şi a proteinelor Bence Jones este cauzată de anumite afecţiuni
hematologice.
Examenul fizico-chimic al urinii se efectuează cu ajutorul unor bandelete impregnate
cu anumite substanţe cu ajutorul cărora se identifică aprox. 10-11 parametrii (densitate, pH,
eritrocite, leucocite, glucoză, corpi cetonici, proteine, nitriti, urobilinogen, bilirubină, acid
ascorbic), iar rezultatul este o reacţie de culoare a cărei interpretare se face fie vizual
comparând cu scala ce însoteşte benzile respective, fie de către analizoare de urină
semiautomate sau automate.
Glucide urinare
În mod normal, după străbaterea barierei de filtrare glomerulară, glucoza este
reabsorbită activ la nivelul tubilor contorţi proximali, astfel că urina nu conţine decât cantităţi
foarte mici de glucoză. În anumite afecţiuni glucoza poate fi prezentă în urină în cantităţi
mari, atunci când se depăşeşte pragul renal de eliminare de 160-180 mg/dl, iar prezenţa
glucozei în urină se numeşte glucozurie. Pe lângă glucoză mai pot fi prezente în urină şi alte
1
glucide cum ar fi galactoză, fructoza, lactoza, maltoza şi diferite pentoze însă doar glucoza şi
galactoza au semnificaţie clinică importantă.
Glucozuria poate fi permanentă sau tranzitorie. O glucozurie tranzitorie poate fi
întâlnită în hipertiroidism, de origine alimentară sau la femeile însărcinate (aprox. 70% din
gravide pot avea o glucozurie fără semnificaţie patologică). Glucozuria cu hiperglicemie
apare cel mai frecvent în diabetul zaharat, dar şi în anumite boli endocrine sau afecţiuni
cerebrale. Mai poate fi întâlnită o glucozurie cu normoglicemie când este afectată reabsorbţia
tubulară a glucozei în boli infecţioase (scarlatina, difteria) şi diferite intoxicaţii (plumb, arsen,
morfina).
Reacţia Benedict
Este o reactie pozitivă pentru toate glucidele reducătoare, reacţie în care are loc
reducerea Cu2+ din reactivul Benedict la Cu+ cu formarea unui compus Cu2O de culoare roşie-
cărămizie.
Mod de lucru: într-o eprubetă ce conţine 0,5 ml urină se pipetează 5 ml reactiv Benedict, iar
amestecul se încălzeşte 5 minute într-o baie de apă. Prezenţa glucidului în urina este indicată
de apariţia unui precipitat verde până la roşu-cărămiziu.
Reactia Selivanoff
Este folosită pentru identificarea fructozei urinare care în contact cu rezorcina, în
prezenţa HCl concentrat formează un compus de condensare colorat în roşu-vişiniu.
Mod de lucru: într-o eprubetă ce contine 1-2 ml reactiv Selivanoff se pipetează aceeaşi
cantitate de urină după care eprubeta se încălzeşte pe baie de apă timp de 10 minute. Apariţia
unei culori roşu-vişiniu atestă prezenţa fructozei în urină.
Proteine urinare
Unele afecţiuni renale sau extrarenale determină apariţia în urină a unor cantităţi
anormale de proteine, situaţie denumită proteinurie. Proteinuria poate fi fizilogică sau
patologică. Proteinuria fiziologică nu este evidenţiată de examenele obişnuite, iar cantitatea
totală de proteine urinare nu depăşeşte valoarea de 150 mg/zi, însă atunci când excreţia
urinară de proteine depăşeşte valoarea de 300 mg/zi putem vorbi de o proteinurie patologică.
Proteinuria mai mare de 3,5 g/24 h se numeşte sindrom nefrotic. Există situaţii când prezenţa
proteinelor în urină este tranzitorie, fără existenţa unei leziuni renale şi anume în insuficienţa
cardiacă, boli infecţioase sau stările febrile. Proteinuria intermitentă apare în condiţii de efort,
oboseală sau postură şi dispare spontan pe timpul nopţii.
Există mai multe tipuri de proteinurii:
- proteinuria prerenală;
- proteinuria renală;
- proteinuria postrenală.
Proteinuria prerenală se întâlneşte mai rar spre deosebire de celalalte două şi
presupune excreţia proteinelor cu masă moleculară mică în urina finală atunci când este
depăşită capacitatea de reabsorbţie tubulară. Proteinele urinare pot avea următoarele etiologii:
- proteina Bence-Jones apare în mielom multiplu, leucemii, tumori şi metastaze osoase;
- mioglobinuria însoţită de creşterea enzimei creatin-kinaza;
- hemoglobina în malarie;
- anemii hemolitice;
2
- insuficienţa cardiacă;
- infarctul de miocard;
- accidentele vasculare cerebrale.
Proteinuria renală se caracterizează prin afectarea nefronului sau în boli extrarenale
cu interesarea secundară a nefronului şi anume:
- glomerulonefrita acută şi cronică;
- glomerulonefroze (lupică, diabetică);
- pielonefrite;
- rinichi polichistic;
- rinichi gutos;
- afecţiuni extrarenale cu interesare renală: feocromocitom, tromboza venei cave, hemoragie
cerebrală.
Proteinuria postrenală apare în:
- inflamaţii ale căilor urinare (pielite, uretrite, cistite);
- sângerări ale căilor urinare prin litiază renală, tuberculoza renală, tumori ale vezicii urinare
sau ale bazinetului.
Reacţii pentru identificarea proteinelor urinare
Reacţia cu acid azotic (proba Heller)
Reactiv: acid azotic concentrat
Mod de lucru:
Într-o eprubetă în care am pipetat 1 - 2 ml acid azotic concentrat se introduc aceeaşi
cantitate de urină lăsând să se prelingă pe peretele eprubetei cu ajutorul unei pipete efilate,
având grijă să nu se amestece cele două straturi, iar prezenţa proteinelor (albuminei) este
indicată de apariţia după câteva minute, a unui inel la zona de contact dintre cele două soluţii.
Pot apare reacţii fals pozitive în cazul în care urina analizată conţine uree şi uraţi în cantitate
mare. Atunci când apare un inel deasupra limitei de separare a celor două straturi este
prezentă o pseudoalbumină, iar prezenţa a două inele semnifică existenţa atât a albuminei cât
şi a pseudoalbuminei.
Corpii cetonici urinari
Prezenţa corpilor cetonici în urină poartă numele de cetonurie şi presupune existenţa a
trei compuşi: β-hidroxibutirat (78%), acetoacetat (20%) şi acetona (2%). În urina normală
prezenţa corpilor cetonici nu poate fi decelată prin examenul sumar de urină, prezenţa lor
fiind semnalată în urină în diabetul zaharat datorită incapacităţii organismului de utilizare a
carbohidraţilor, în caz de ingestie insuficientă de carbohidraţi (inaniţie, anorexie, exerciţiu
fizic intens), pierdere de carbohidraţi prin vărsături frecvente şi diaree prelungită, după
anestezie cu eter sau cloroform, anumite boli rare (boala von Gierke), hipertiroidism, febră,
sarcină, lactaţie. Pot apare rezultate fals pozitive atunci când urina conţine concentraţii mari
de pigmenţi urinari, precum şi datorită unor medicamente (captopril, acetaminofen) sau
rezultate fals negative în caz de recoltare şi depozitare incorectă a urinei de analizat.
Reacţia Imbert-Legal
Prin reacţia nitroprusiatului de sodiu cu acetona şi acidul acetilacetic în mediu alcalin
va rezulta un inel la limita de separare dintre cele două lichide, inel de culoare violetă. Reacţia
3
nu este specifică pentru acidul β- hidroxibutiric care nu este detectat ci numai pentru ceilalţi
doi.
Reactivi:
- reactiv Imbert-Legal
- amoniac concentrat
Mod de lucru: Într-o eprubetă cu 10 ml urină se pipetează 10-15 picături reactiv Imbert-Legal
urmată de 1 ml amoniac lăsând să se prelingă uşor pe pereţii eprubetei rezultând în final un
inel violet care va dispare prin fierberea eprubetei.
Pigmenţi urinari
În intestin sub influenţa bacteriilor are loc reducerea bilirubinei în anumiţi derivaţi
(urobilinogen, strecobilinogen, strecobilina, urobilina), după care o parte din ei sunt
reabsorbiţi ajungând la nivelul ficatului, între 35-140 mg ajung în urină, iar cea mai mare
parte este metabolizată.
Reactia Erlich
Principiu: urobilinogenul şi stercobilinogenul dau în prezenţa reactivului Erlich o coloraţie
intens roşie.
Mod de lucru: într-o eprubetă ce conţine 3 ml urină proaspată se pipetează 3-4 ml reactiv
Erlich şi după o perioadă de 1 minut timp în care eprubeta este lăsată la temperatura camerei
apariţia unei coloraţii roşii presupune existenţa unei concentraţii crescute de urobilinogen.
Există anumite afecţiuni însoţite de eliminarea crescută de pigmenţi urinari şi anume:
icter hepatocelular, ciroză, intoxicaţii, hepatite, icter mecanic.
Pigmenţi biliari
Prezenţa pigmenţilor urinari (bilirubină si biliverdină) în urină determină o colorare a
acesteia în galben verzuie sau brună. Bilirubina se formează în cea mai mare parte din
distrugerea eritrocitelor circulante senescente care eliberează hemoglobina din care rezultă
mai apoi bilirubina, precum şi prin distrugerea precursorilor seriei roşii în măduvă, sau a altor
proteine ce conţin gruparea hem (mioglobina, citocromi). Creşterea concentraţiei plasmatice
şi urinare a bilirubinei apare cu mult timp înaintea apariţiei icterului (coloraţia galbenă a
pielei, mucoaselor şi sclerei datorită bilirubinei în exces în circuitul sanguin). Icterele prin
obstrucţia căilor biliare şi icterul parenchimatos hepatic se caracterizează prin excreţia urinară
crescută de bilirubină.
Reacţia Popper
Principiu: este o reacţie care în prezenţa iodului are loc oxidarea bilirubinei la biliverdină.
Mod de lucru: într-o eprubetă se introduc 5 ml urină, apoi cu precauţie se pipetează 2 ml
reactiv, astfel încât să se formeze două straturi distincte. Urina care conţine bilirubina va duce
la apariţia unui inel verde la zona de contact a celor două lichide.
Pigmenţi sanguini
În anumite afecţiuni în urina pot fi prezente hemoglobina liberă situaţie numită
hemoglobinurie, sau hemoglobina din eritrocite denumită hematurie. În ambele situaţii, în
funcţie de cantitatea de hematii sau de hemoglobină existente, urina prezintă o coloraţie care
variază între roz-roşu-maro astfel încât singura diferenţă între ele o reprezintă examenul
sedimentului urinar când se observă prezenţa hematiilor la microscop numai în cazul
prezenţei hematuriei nu şi în cazul hemoglobinuriei.
4
Hematuria traduce prezenţa calculilor renali, tumorilor renale, tuberculoză renală,
colagenoze, glomerulonefrită sau pielonefrită, iar hemoglobinuria apare în afecţiuni însoţite
de hemoliză intravasculară (anemii hemolitice, reacţii posttransfuzionale), în arsuri, exerciţii
fizice intense, în anumite infecţii (sifilis, mycoplasma).
Reacţia cu benzidina
Principiu: în prezenţa apei oxigenate are loc oxidarea benzidinei de către hemoglobină cu
formarea unui compus de culoare albastră.
Mod de lucru: într-o eprubetă cu 3 ml urină se adaugă respectând ordinea 2-3 picături soluţie
benzidină şi 2 ml apă oxigenată 3%. Amestecul se agită rezultând o coloraţie albastră în caz
de prezenţa a pigmenţilor sanguini.
Săruri biliare
În urină, pe lângă pigmenţi biliari mai întâlnim şi săruri biliare, prezenţa acestora este
denumită colalurie şi apare în caz de icter mecanic determinat de obstrucţia canalului coledoc
sau în caz de icter dat de hepatită.
Reactia Hay este cea care poate pune în evidenţă sărurile biliare datorită faptului că acestea în
contact cu floarea de sulf scad tensiunea superficială a lichidelor care le conţin cu depunerea
la fundul eprubetei a florii de sulf.
Mod de lucru: într-o eprubetă care conţine urină adăugăm floare de sulf, prezenţa sărurilor
biliare în urină ducând la depunerea florii de sulf la fundul eprubetei, iar în absenţa lor sulful
pluteşte la suprafaţa urinii.
5
Examen sumar de urină II.

Analiza sedimentului urinar.
Interpretarea unui buletin de analiză a urinei
Obiective:
- Cunoaşterea şi caracterizarea principalelor componente urinare cu semnificaţie
patologică;
- Întepretarea la microscop a unui frotiu realizat din sediment urinar.
Examenul sumar de urină este una din analizele uzuale de o mare importanţă pentru
diagnosticul afecţiunilor renale şi extrarenale, analiză de rutină prescrisă de către medicii de
familie şi medicii specialişti. Un diagnostic corect în afecţiunile renale se poate pune numai
pe baza unui examen complet al urinii care presupune:
- examenul macroscopic al urinii (aspect, culoare);
- examenul fizico-chimic (pH, densitate, proteine, glucide, corpi cetonici, pigmenţi urinari,
pigmenţi sangvini, biliari şi săruri biliare);
- examenul microscopic al sedimentului urinar;
- examenul citologic şi bacteriologic.
Analiza sedimentului urinar
Se examinează urina de dimineaţă recoltată într-un recipient steril numit urocultor la
cel mult 4 ore de la emisie. Se centrifughează 10 ml de urină la 1500 rotaţii/minut timp de 5
minute, apoi se aruncă supernatantul rămânând aproximativ 0,5 ml, iar din sediment se ia o
picatură care se aşează pe lamă, iar deasupra o lamela şi se examinează la microscop.
Sedimentul urinar este format din elemente organizate şi elemente neorganizate.
Sedimentul urinar organizat este format din celule epiteliale, leucocite, hematii,
cilindrii şi pseudocilindrii, floră microbiană, eventual celule levurice, spermatozoizi sau
paraziţi (Trichomonas vaginalis la femei, ouă de Enterobius vermicularis).
Celulele epiteliale prezintă forme diferite în funcţie de locul de unde provin şi se
găsesc în număr mic într-un sediment urinar normal, prezenţa lor în număr mare indicând o
inflamaţie la nivelul căilor urinare. Celulele epiteliale renale sunt puţin mai mari decât
leucocitele de care sunt uneori dificil de diferenţiat, au formă ovală, nucleu mare şi pot
indicaprezenţa unui proces patologic la nivelul tubilor renali dacă sunt prezente în urină
alături de cilindrii epiteliali sau granuloşi. Celule epiteliale tranziţionale care provin din
epiteliul ce captuşeşte tractul urinar au formă rotundă, formă de pară, măciucă, rachetă sau
forma fusiformă. Mai există şi celule epiteliale scuamoase care provin din uretră sau vagin,
celule de talie mare, voluminoase de formă neregulată adesea dispuse în placarde. Uneori este
dificil de determinat provenienţa exactă a acestor celule.
Leucocitele sunt celule sferice granulare cu unul sau mai mulţi nuclei, de mărimi
diferite, dispuse izolat sau grupat. În urina normală pot fi prezente rare leucocite, iar atunci
când se găsesc în număr mare în urină semnifică o infecţie acută a căilor urinare, boli non-
infecţioase ca glomerulonefrita, pielonefrita, acidoza tubulară renală, stările de deshidratare
1
sau afecţiuni acute non-renale, ca apendicita, metroanexita acută sau cronică sau pancreatita.
În caz de piurie sau puroi sunt prezente neutrofile în număr mare, dezintegrate iar urina are un
miros urât şi un aspect tulbure.
Hematiile au formă de disc biconcav, lipsite de nucleu care prezintă dublu contur dacă
mişcăm din viza micrometrica. Hematiile pot fi găsite şi în urina normală, dar sunt rare.
Atunci când urina conţine numeroase hematii, practic tot câmpul microscopic este acoperit de
hematii putem vorbi de o hematurie macroscopică. Hematiile care au un aspect deformat se
numesc dismorfe iar dacă sunt prezente într-un procent mai mare de 30% ne sugerează o
glomerulonefrita. În urină hematiile pot fi confundate cu picăturile de grăsime care sunt
incolore şi intens refringerente sau cu celulele levurice care sunt ovalare, de mărimi variate şi
nu prezintă dublu contur dacă mişcam din viza micrometrică. În acest caz se recomandă
examenul secreţiei vaginale.
Cilindrii urinari sunt formaţiuni alungite, cilindrice de diferite lungimi şi grosimi,
bine colorate cu capetele rotunde, niciodată ascuţite care se formează prin condensarea
secreţiilor de la suprafaţa tubilor renali, luând forma tubilor renali pe care se mulează cu
fixarea elementelor organizate: celule renale, leucocite, hematii, celule grăsoase, săruri.
Tipuri de cilindrii întâlniţi:
a) cilindrii hialini - cei sunt incolori şi translucizi ce pot apare chiar şi în urina normală
în număr mic după palparea rinichiului sau stres, precum şi în stări de deshidratare sau
afecţiuni renale uşoare. Se întâlnesc cel mai frecvent dintre toate tipurile de cilindrii urinari.
b) cilindrii hematici - conţin conglomerate de hematii intacte sau distruse şi semnifică
o leziune glomerulară.
c) cilindrii leucocitari - se formează prin aglomerarea leucocitelor depuse pe mucus
sau pe cilindrii hialini şi se întâlnesc în pielonefrite.
d) cilindrii epiteliali - apar mai rar datorită aglomerării celulelor epiteliale tubulare
descuamate şi pot fi întâlniţi în necroza tubulară acută şi în nefritele acute.
e) cilindrii granulose - sunt opaci şi prezintă granulaţii inegale, fine sau grosolane
provenite din dezintegrarea elementelor celulare. Ei apar în faza terminală a bolilor renale
severe.
f) cilindrii ciroşi - sunt bine conturaţi, laţi, cu marginile crestate, aparând în stadiile
terminale ale insuficienţei renale cronice având un prognostic grav.
g) cilindrii grăsosi - conţin picături de grăsime care supraîncarcă cilindrii hialini sau
granuloşi. Acest tip de cilindru apare în sindroamele nefrotice sau în proteinurii masive.
h) pseudocilindrii - rezultă din aglomerarea de uraţi, fosfaţi, bacterii sau hemoglobină
fără să aibă semnificaţie patologică.
Într-o infecţie urinară pe lângă leucocite întâlnim şi flora microbiană sub formă de
coci sau bacilli, iar pentru determinarea germenului respectiv este necesară efectuarea unei
uroculturi.
Sedimentul urinar neorganizat al urinii acide este alcătuit din urat amorf, oxalat de
calciu, acid uric, fosfat de calciu şi sulfat de calciu. Urina alcalină conţine fosfat amorf, fosfat
amoniaco-magnezian, urat de amoniu şi carbonat de calciu.
Uraţii amorfi apar sub forma unor granulaţii mici, maronii asemănătoare nisipului şi
sunt alcătuiţi din sărurile de sodiu, potasiu, calciu sau magneziu ale acidului uric care prin
2
adăugarea de acid acetic se transformă în acid uric. Apariţia uratului amorf în urină nu
prezintă semnificaţie clinică.
Cristalele de oxalat de calciu sunt incolore de mărimi variate care apar la orice pH al
urinii având formă de plic de scrisoare, pişcot sau trunchi de copac şi apar în urină în mod
fiziologic după o alimentaţie bogată în legume (tomate, spanac, asparagus) sau citrice, sau în
mod patologic în caz de intoxicaţie cu etilen glicol sau în boli renale cronice.
Cristalele de acid uric au o culoare galben-brună, forme variate (prisme hexagonale,
patrulatere, lance de fier, stea, cruce) şi apar doar în urinile cu pH sub 5,7. Aceste cristale pot
apare în urina normală sau în afecţiuni precum: guta sau după administrarea unor
medicamente citotoxice.
Sulfatul de calciu apare sub forma unor ace fine, incolore sub formă de rozetă destul
de rar în sedimentul urinii acide.
Fosfatul de calciu apare sub forma unor cristale strălucitoare, izolate sau adunate sub
formă de rozete.
Fosfatul amorf se găseşte în urina alcalină sub forma unor granule de nisip incolore
care dacă se găseşte în cantitate mare oferă urinii respective un aspect albicios spre deosebire
de uratul amorf care colorează urina în maroniu.
Fosfatul amoniaco-magnezian apare în urina pacienţilor sănătoşi având formă de
cristale incolore, refringente sau prisme rombice, triunghiulare, pătrate care seamănă foarte
bine cu un capac de coşciug. Uneori apar în infecţiile de tract urinar şi pot determina formarea
calculilor.
Uratul de amoniu are forma unor sfere galben-brune care prezintă striaţii pe suprafaţa
lor asemănătoare ţepilor de pe invelişul castanelor sălbatice. Ele apar în urina stocată timp
îndelungat şi în condiţii necorespunzătoare sau în caz de hidratare inadecvată a pacientului.
Carbonatul de calciu se prezintă sub forma unor granule mici, incolore sau albe
cenuşii care apar în perechi grupate câte 2-6, dar şi ca agregate mari ce pot fi confundate
uneori cu bacteriile, fără semnificaţie clinică.
Destul de rar apar în urină cristale de cistină în cistinurie, cristale de leucină şi tirozina
în procese degenerative hepatice, febra tifoidă sau scarlatină, cristale de bilirubină în boli
metabolice, cristale de colesterol în sindromul nefrotic şi chilurie, cristale de xantină sau
sferule de grăsime.
biurat de amoniu fosfat amoniaco-magnezian

Biochimie s2 Toate LP

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Biochimie s2 Toate LP

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Laborator 2 Medicină

Glucide. Teste calitative de identificare a glucozei si corpilor cetonici.

Metodele colorimetrice sunt tehnici folosite pentru a determina concentraţia compuşilor

CH2OH CH2OPO 3H2

Valori de referinţă: 74- 106 mg/dL (4.1-5.9 mmol/L)

Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 370C.

Metode de oxido-reducere a glucidelor

Reactivi:- reactiv Seliwanoff

- pozitivã 4. Reactia Bial

CuSO 4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO 4

Reactivi: - reactivul Molisch

Reactivi: - acid picric 0,5%

Teste de evaluare a tulburărilor metabolismului glucidic

Colesterolul este un lipid amfipatic component al particulelor de lipoproteine plasmatice

După 10 minute se citeşte absorbanţa probei la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc.

Esteri de colesterol Colesterol Acizi graşi

Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei (16-25oC) sau 5 minute la 370C.

Lipide şi lipoproteine care influenţează riscul aterosclerotic.

Determinarea nivelului seric al HDL- colesterolului

Calcularea concentraţiei de LDL-colesterol

Lipide. Dozarea trigliceridelor. Lipidograma. Diagnosticul de laborator al dislipidemiilor.

Acizii graşi esenţiali

Lipoproteinele sunt clasificate pe baza proprietăţilor lor electroforetice în:

lizolecitinã colesterol esterificat

Acil-colesterolul migrează în interiorul particulei HDL contribuind la formarea miezului

După 10 minute se citeşte absorbanţa probei la λ = 550 nm în cuva de 1 cm faţă de blanc.

Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei (16-25oC) sau 5 minute la 370C.

Lipide şi lipoproteine care influenţează riscul aterosclerotic.

Determinarea nivelului seric al HDL- colesterolului

Triacilgliceroli Glicerol Acizi graşi

Se agită şi se incubează 15 minute la temperatura camerei (16-25oC) sau 5 minute la 370C.

Calcularea concentraţiei de LDL-colesterol

Semnificaţia clinică a compuşilor azotaţi neproteici.

În urma proceselor metabolice, prin degradarea proteinelor, se formează compuşi azotaţi

Valori normale şi variaţii patologice

NH4+ + Salicilat + NaClO nitroprusiat Indofenol

Se citeşte absorbanţa probei şi a standardului faţă de blanc la λ = 600 nm şi se calculează

Semnificaţia clinică a compuşilor azotaţi neproteici.

Creatina (acid metilguanidinacetic) este un compus sintetizat din trei aminoacizi

VALORI NORMALE. VARIAŢII FIZIOLOGICE. VARIAŢII PATOLOGICE

Dozarea creatininei: Metoda colorimetrică Folin –Wu

N CH2 CH3 Na+

Creatininã Acid picric O2N NO2

Semnificaţia clinică a compuşilor azotaţi neproteici.

Creatina (acid metilguanidinacetic) este un compus sintetizat din trei aminoacizi

VALORI NORMALE: - Creatinina serică: B: 0,7-1,2 mg/100 ml

Dozarea creatininei: Metoda colorimetrică Folin –Wu

Creatininã Acid picric O 2N NO2

Adenozin 5` monofosfat Inozin 5` monofosfat Xantozin 5` monofosfat Guanozin 5` monofosfat

O 2 + H2O H2O 2 H2O NH4

Hiperuricemiile. Guta reprezintă manifestarea clinică a unei hiperuricemii, fie ea primară

Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 37 0C.

Cprobă = Aprobă/Astandard x Cstandard x Factorul de diluţie al probei

 probele de urină se diluează 1/10 cu apă distilată înainte de dozare.

Biosinteza acidului uric

Hiperuricemiile. Guta reprezintă manifestarea clinică a unei hiperuricemii, fie ea primară

Se agită şi se incubează 10 minute la temperatura camerei sau 5 minute la 370C.

Cprobă = Aprobă/Astandard x Cstandard x Factorul de diluţie al probei

probele de urină se diluează 1/10 cu apă distilată înainte de dozare.

Oligoelemente I. Roluri biologice, semnificaţie diagnostică

Oligoelementele sunt substanţe minerale care îndeplinesc rolul de catalizator în unele

Capacitatea totală de legare a fierului (CTLF) - măsoară capacitatea totală de transport a

Explorarea metabolismului hemoglobinei. Dozarea bilirubinei. Semnificaţia