4/21/2016

INVESTIGAREA LIPIDELOR SI
LIPOPROTEINELOR SERICE/PLASMATICE

Evaluare status metabolic i tulburri metabolice

Evaluare risc pentru ateroscleroz i boli cardiovasculare
Screening i monitorizare dislipidemii primare i secundare

Analiza aspectului serului jeun: limpede, opalescent sau lactescent

Chilomicroni - se ridic la suprafa, dop chilomicronic, limpezire plasm

IDL i VLDL n exces - serul rmne lactescent, dispersare omogen
Chilomicroni, IDL, VLDL - dup 24 ore se ridic la suprafa un dop lipidic,
iar serul rmne lptos

Determinarea (calcularea) lipemiei

Determinarea colesterolului total
Determinarea HDL-colesterolului i a LDL-colesterolului
Determinarea triacilglicerolilor
Separarea electroforetic a fraciunilor lipoproteice
Determinarea ApoAI i ApoB100;

Apo A-I - 95 200 mg/dl

Apo B100 - 60 - 135 mg/dl
Apo A-I sczut, Apo B100 crescut risc crescut pentru BCV

Determinri specifice: sdLDL, LDLox, Lp(a)

1
 4/21/2016

Determinarea lipemiei - analiz de screening

Lipemia - valoare de ansamblu a lipidelor totale - colesterol liber, esterificat,
triacilgliceroli, fosfolipide, acizi grai liberi, componente lipidice
minore (vitamine liposolubile, hormoni steroizi)
Valoare normal - 400-700 mg/dl plasm
Variaii fiziologice n funcie de: vrst, sex, alimentaie, echilibru
neuroendocrin, clim, hipolipemie la nou-nscui

Hipolipemii Hiperlipemii

Stri de denutriie a. primare

Hipertiroidism Hiperlipemie esenial
Ciroz hepatic b. secundare
Cancer hepatic Ateroscleroz
Diabet zaharat
Hipotiroidism
Sindrom nefrotic

Lipemia se coreleaz cu valorile CT, TAG

Metoda de dozare colorimetric - cu amestec fosfosulfovanilinic
Calcul lipemie: lipide totale (mg/dl) = 2,25xCT + TAG + 90

Metoda cu reactiv fosfosulfovanilinic

a) Hidroliza lipidelor plasmatice prin fierbere cu H2SO4 conc. formndu-se acizii grai i alcoolii:
Trigliceride
Glicerofosfolipide R -(CH2)n-COOH + R-(CH2)n -CHCH-COOH + Glicerol + Colesterol
Colesterol esterificat

b) Transformarea acizilor grai rezultai i a celor existeni liberi n plasm n ioni de carboniu:
R-(CH2)n-CH=CH-COOH +H+ R-(CH2)n-CH+-CH2-COOH

c) Reacia ionului carboniu cu fosfovanilina rezultat la esterificarea vanilinei cu H3PO4 sau KH2PO4:
OH OPO3H2
OCH3 OCH3
H3PO4
- H2 O
CHO CHO

OPO3H2 OPO3H2

OCH3 OCH3
+
+ [R-]

CHO + C-O-R

Rezult un compus de culoare roz-violaceu colorimetrabil la =530 nm

2
 4/21/2016

Dozarea colesterolului total metoda enzimatic-colorimetric

Aduli - Optim <200 mg/dl, Borderline 200-240 mg/dl, Crescut >240 mg/dl
Copii, adolesceni - Optim < 170 mg/dl, Crescut > 200 mg/dl

Dozarea triacilglicerolilor metoda enzimatic-colorimetric

Optim <150 mg/dl, Borderline < 199 mg/dl, Crescut > 200 mg/dl
Dozarea HDL-colesterolului separare cu acid fosfowolframic
- metoda enzimatic colorimetric
Normal > 40 mg/dl
Factor protector >60 mg/dl
Risc crescut < 40 mg/dl
Calcul LDL-colesterol:
Formula Friedewald: LDL-c = CT (HDL-c + VLDL-c) = CT (HDL-c + TG/5)
Aduli: Optim < 100 mg/dl
Risc sczut < 130 mg/dl
Borderline 130-159 mg/dl
Risc crescut > 160 mg/dl
Copii i adolesceni: Crescut > 130 mg/dl

Raport CT/HDL-c = 4-6 brbai (3,7-5,7 femei)

Dozarea colesterolului - metoda enzimatic-colorimetric

colesterol
esteraza + R C OH
+ H2O
R C O HO O
O

colesterol
oxidaza + H2O2
+ O2
HO O

ONa
H3C NH2 H3C N O
POD
2H2O2 + N +
N + 4H2O
H3C N O N O
H3C
C6H5 C6H5

Se evalueaz absorbia chinoniminei la 510-520 nm.

3
 4/21/2016

Specimen recoltat snge venos

Recipient de recoltare vacutainer fr/cu anticoagulant
Prelucrare separare ser/plasm, conservare la 4oC (o spt.)
-20oC 3 luni
-70oC - ani
Volum prob minim 0,5 ml ser/plasm
Erori ser hemolizat, snge recoltat postprandial
Valori de alert clinic > 300 mg/dl
Liniaritate pn la 600-700 mg/dl
Variaii fiziologice sezonier (mai mari iarna), diet bogat n colesterol,
valori crescute n perioada sarcinii
CV 1,5-2,5%

Limite i interferene bilirubin (>5 mg/dl), ascorbat, Hb

Medicamente:
Creteri ascorbat, androgeni, aspirin, catecolamine, antibiotice, beta-
blocante, glucocorticosteroizi, vitamin D, diuretice, ibuprofen, etc.
Scderi acid aminosalicilic, colestiramin, estrogeni, fibrai, statine,
tiroxin, niacin, coenzim Q10.

Variaii fiziologice - n funcie de vrst, alimentaie, sezonier (mai mari cu 8%

iarna), echilibru neuroendocrin (crete n sarcin)
Variaii patologice

Hipocolesterolemii Hipercolesterolemii

Leziuni hepatocelulare severe Hipercolesterolemie esenial IIa

Hipertiroidism HLP IIb, III, V
Malabsorbie lipidic Hipertensiune arterial
Malnutriie Ateroscleroz
Hipo/abetalipoproteinemie Obstrucii biliare, colestaz
BoalTangier Hipotiroidism
Inflamaii, arsuri, infecii severe Diabet zaharat, obezitate
Sindrom nefrotic
Alcoolism
Diet bogat n lipide
Boli pancreatice

4
 4/21/2016

Dozarea HDL-colesterolului metode indirecte i directe

Recomandri evaluarea riscului de boal coronarian

evaluarea hiperlipoproteinemiilor
Principiu: Precipitare chilomicroni, VLDL i LDL cu acid fosfowolframic i
sruri de magneziu
Centrifugare (1500xg)
Dozare HDL-c n supernatant - metoda enzimatic
Raport CT/HDL:
Risc sczut 3,3-4,4
Risc mediu 4,4-7,1
Risc moderat 7,1-11
Risc crescut > 11
Scderi HDL-c Creteri HDL-c
HipoalfaLP (boala Tangier) HiperalfaLP familial
Leziuni hepatocelulare HipobetaLP
Deficit de apoAI, apoCIII Hepatopatie cronic
Colestaz, afectare renal cronic Clearance crescut TAG
Hipertiroidism, DZ

Specimen recoltat snge venos

Recipient de recoltare vacutainer fr/cu anticoagulant (EDTA)
Prelucrare separare ser/plasm, conservare la 4oC (o spt.)
-20oC 3 luni
-70oC ani

Volum prob minim 0,5 ml ser/plasm

Erori ser hemolizat, snge recoltat postprandial
Valori de alert clinic <40 mg/dl risc crescut de boal coronarian
Limite i interferene
Medicamente:
Creteri etanol, contraceptive orale, estrogeni, fibrai, statine, acid
nicotinic, coenzima Q10, niacin, nifedipin, verapamil etc.
Scderi androgeni, beta-blocante, acid chenodezoxicolic, probucol,
progestative, diuretice, tiazide etc

5
 4/21/2016

Determinarea direct a HDL-c sistem omogen

Nu presupune separarea HDL-c de celelalte fraciuni, ns acestea

(VLDL, LDL, chilomicroni) sunt mpiedicate s reacioneze n
metoda de dozare prin:
a. Blocare cu anticorpi specifici
b. Polimeri
c. Ageni de complexare de tip ciclodextrine

Dozarea LDL-colesterolului metode indirecte i directe

Recomandri evaluarea riscului pentru boli cardiovasculare

Indirect: - formula Friedewald la valori TAG<400 mg/dl
- -cuantificare ultracentrifugare la 105000xg, 18 ore, 10oC
dozare LDL-c prin metoda enzimatic
Direct: Precipitare selectiv cu polivinil sulfat sau heparin la pH sczut
Eliminare VLDL; IDL; HDL cu anticorpi anti-apoAI i apoE
Dozare LDL-c prin metoda enzimatic-colorimetric
Raport LDL/HDL:
Femei 2,9
Brbai 3,3
Variaii fiziologice crete posprandial, sarcin

Scderi LDL-c Creteri LDL-c

Hipo/a-betaLP Hipercolesterolemie familial IIa
Boal Tangier HiperLP IIb, III
Leziuni hepatocelulare severe Diet bogat n lipide
Hipertiroidism Hipotiroidism, DZ
Boli inflamatorii articulare Sindrom nefrotic, IRC
Anemii Colestaz

6
 4/21/2016

Specimen recoltat snge venos

Recipient de recoltare vacutainer fr/cu anticoagulant
Prelucrare separare ser/plasm, conservare la 4oC (o spt.)
-20oC 3 luni
-70oC ani

Volum prob minim 0,5 ml ser/plasm

Erori ser hemolizat, snge recoltat postprandial
Valori de alert clinic >190 mg/dl risc crescut de BCV
Limite i interferene
Medicamente:
Creteri steroizi anabolizani, beta-blocante, antihipertensive,
progestative, carbamazepin
Scderi estrogeni p.o

Dozarea triacilglicerolilor prin metoda enzimatic-colorimetric

TAG + H2O lipaz Glicerol + Acizi grai

glicerol kinaz
Glicerol + ATP Glicerol-3-fosfat + ADP

glicerol-3-P oxidaz
Glicerol-3-P + O2 Dihidroxiaceton fosfat + H2O2

peroxidaz
2 H2O2 +2 clorfenol + 4 aminoantipirin
chinonimin + HCl + 4H2O

Se evalueaz absorbia chinoniminei la 510-520 nm.

7
 4/21/2016

Specimen recoltat snge venos

Recipient de recoltare vacutainer fr anticoagulant sau cu
anticoagulant
Prelucrare separare ser/plasm ntr-o or, conservare la 4oC (o spt.)
-20oC 3 luni
-70oC - ani
Volum prob minim 0,5 ml ser/plasm
Erori ser hemolizat
Valori de alert clinic > 500 mg/dl (n pancreatit);
>1000 mg/dl risc de pancreatit
Liniaritate 700 mg/dl
Glicerol endogen - <10mg/dl poate fi neglijat
CV-2-3%
Limite i interferene
Creteri beta-blocante, estrogeni, catecolamine,glucocorticosteroizi,
colestiramin, etanol, retinol, isotretinoin, diuretice, etc
Scderi acid ascorbic, acid aminosalicilic, fibrai, heparin, acizi
omega 3, niacin, progestative
Probele intens lipemice trebuie diluate 1:4 cu NaCl 0,9%

Variaiile fiziologice - n funcie de sex (mai mari la brbai), zon geografic,

vrst, intraindividual (minim dimineaa, maxim prnz), valori crescute n diet bogat,
consum alcool, perioada sarcinii, obezitate, sedentarism, fumat

Variaii patologice

Hipotrigliceridemii Hipertrigliceridemii

Hipertiroidism Hiperlipemie esenial

Abetalipoproteinemie Ateroscleroz
Malnutriie Hipotiroidism
Malabsorbie Diabet zaharat
BPOC Boli renale, sindrom nefrotic
Boli hepatice, alcoolism
Gut, pancreatit

8
 4/21/2016

- Sindromul metabolic si dislipidemia cu

sdLDL risc aterogen caracterizat de:
TG crescute
- HDL-sczut
- particule sdLDL numeroase
- sdLDL mai mici, mai srace n colesterol
mai aterogene dect LDL
densitate 1.044-1.063 g/ml
diametru 22-25.5 nm
- Aterogenitate crescut:
mai penetrante
- mai multe
- mai susceptibile la oxidare
- interacioneaz mai uor cu PG
- 1/3 din brbai i 1/5 din femei p.m.:
- fenotip LDL B - sdLDL
- risc pentru BCV i IMA de 2-3 ori >
dect subiecii normali
- risc de 4.5 7 ori > pentru valori
sdLDL>100mg/dl

Metode pentru investigarea sdLDL:

1. Ultracentrifugare in gradient de densitate

2. Spectroscopie RMN
3. Electroforeza in conditii speciale
4. Precipitare si dozare chimica

a. Precipitare LDL normal cu agenti de precipitare de tip polianioni

(heparina) si cationi bivalenti (Mg2+)

b. Centrifugare
c. Dozarea sdLDL-c prin metoda chimica in doua etape:
1. Descompunere HDL cu detergent specific si dozare colesterol
2. Dozare colesterol din sdLDL met. colorimetric-enzimatica

9
 4/21/2016

- Lp(a) varianta a LDL ce contine apo B si apo (a)

Lp(a)
- Apo(a) se sintetizeaz n ficat 300- 800 KDa
- Forma final dup legare de LDL cu o legtur S-S-
- Elibereaz colesterol la locul injuriei vasculare
- Nivel determinat genetic < 20 mg/dl
- Nivelul Lp(a) din copilarie indice al riscului pentru CVD mai bun dect alte LP
- Aterogenicitate de 10 ori mai mare dect LDL
- Metode de determinare imunologice (ELISA, imunoturbidimetrie, nefelometrie)

- Lp(a) factor de risc independent pentru BCV prematur

- Lp(a) legtura ntre ateroscleroz i tromboz
- Lp(a) foarte trombogenic i antifibrinolitic omologie cu plasminogenul
Lp(a) colesterol mortal (LDL-c - ru;HDL-c bun;VLDL colesterol urt)
- Lp(a) interactioneaz cu celulele renale - proteoliz
- Lp(a) fragmentat se elimin n urin forma activ aterogen a Lp(a)
- Reducerea aterogenitii intervenie n asamblarea Lp(a) i fragmentarea apo(a)

10
 4/21/2016

Formarea oxLDL

Normal aprox. 287 ng/ml

Metode de determinare a oxLDL imunochimice

ELISA sandwich direct placa cu anticorpi anti oxLDL

1. Captura oxLDL la anticorpii din placa
2. Adaugare anticorp conjugat cu peroxidaza
3. Developare cu tetrametilbenzidina (TMB) si acid sulfuric
4. Citire la 450 nm (galben) si integrare in curba de etalonare

11
 4/21/2016

Separarea lipoproteinelor prin electroforeza + cuantificare

Specimen recoltat snge venos

Recipient de recoltare vacutainer fr anticoagulant sau cu
anticoagulant
Prelucrare separare ser/plasm ntr-o or, conservare la 4oC (72 ore)
- nu se congeleaz
Valori de referin chilomicroni 0-2%
betaLP 38,6-69,4%
pre-betaLP 4,4-23,1%
alfa-LP 22,3-53,3%
Limite i interferene
Cresc VLDL diet hipercaloric, alcool, estrogeni, progesteron,
glucocorticosteroizi, colestaz, hepatite cronice, sindrom nefrotic, IR,
hipotiroidism
Cresc LDL hipotiroidism, nicotin, estrogeni, progesteron,
glucocorticosteroizi, sindrom nefrotic, cancer hepatic
Cresc HDL alcool, hipotiroidism, estrogeni, glucocorticosteroizi
Scad HDL nicotin,diet hipercaloric, progesteron, cancer hepatic,
sindrom nefrotic, IR

12
 4/21/2016

Hiperlipoproteinemii i ateroscleroza
I IIa IIb III IV V
HiperTG Hipercolest. Hiperlipemie HiperTG HiperTG HiperTG
amilial ereditar mixt indus de indus de indus
indus de (30%) (28%) glucide cu glucide de lipide
grsimi (1%) hipercolest fr i glucide
(1%) hipercolest (1%)
(40%)
Aspect cremos clar clar/ opalescent lactescent lactescent/
plasm opalescent opalescent
CT normal/ intens crescut crescut normal/ uor
crescut crescut crescut crescut
TAG crescut normal crescut intens intens intens
(>2000mg/dl) crescut crescut crescut
LP chilomic. LDL LDL Banda VLDL chilomic.
crescute VLDL prebeta
lat
Incidena copii tineri/ tineri/ aduli aduli aduli
(vrst) aduli aduli
Risc mic foarte foarte mare mare mare mic
arterial xantoame mare xantoame xantoame xantoame
eruptive xantoame

13
 4/21/2016

Apo A-I - 95 200 mg/dl

Apo B100 - 60 - 135 mg/dl

Nivel crescut Apo B-100 nivel crescut LDL-c, risc crescut pentru BCV
Indus de o diet hiperlipidic sau de un clearance redus al LDL din snge
Apo B-100 poate fi crescut n:
Hiperlipidemie, diabet zaharat, hipercolesterolemie familial
Tratament cu: h. androgeni, beta blocante, diuretice, progestative
Hipotiroidism
Sindrom nefrotic
Sarcin (temporar, scade dup natere)
Apo B-100 scade cnd e afectat sinteza lipoproteinelor n ficat:
Tratament cu estrogeni, statine, niacin, tiroxin
Hipertiroidism, ciroz
Malnutriie, scdere n greutate
Abetalipoproteinemie rar, genetic
Un raport sczut Apo A-I/Apo B-100 (A/B) risc crescut pentru BCV
Metode de dozare ELISA
- imunoturbidimetrie

14