10/17/2016

Investigarea aminoacizilor i
proteinelor plasmatice

Teme abordate:
Aminoacidemie. Aminoacidopatii
Proteinemie
Investigarea proteinelor plasmatice
Electroforeza proteinelor

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Aminoacidemia aminoacizi plasmatici liberi (5-8 mg/dl)

Variaii fiziologice cretere postprandial
Variaii patologice - aminoacidopatii
- tulburri n metab. aa. i derivailor lor metabolici
- nsoite de aminoacidurie

Aminoacidurii primare genetice

- deficite enzimatice: fenilcetonurie, tirozinemie,
alcaptonurie, homocistinurie,
boala urinii cu miros de sirop
de arar
Aminoacidurii secundare afecteaz mai muli aminoacizi
- afeciuni hepatice deficit de utilizare
- afeciuni renale reabsorbie defectuoas

!!! Diagnosticare dozarea compuilor n snge i urin

- depistarea precoce a defectelor analiza genic

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

1
 10/17/2016

FENILCETONURIA 1:14000
- Deficit de Phe hidroxilaz

fenillactat
fenilacetat
fenilacetilglutamin
o-hidroxifenilacetat

Diagnosticare test de evaluare Phe n snge < 3mg/dL

- dozarea Phe, Tyr n ser i urin - HPLC
- test ADN pentru depistarea defectului genetic - amniocentez
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

2
 10/17/2016

BOALA URINII CU MIROS DE SIROP DE ARTAR

(MAPLE SYRUP DISEASE)

- 1:180000
- crescut n caz de cosangvinizare

Leucina Cetoacid IzovalerilCoA AcetilCoA

Ileucina Cetoacid MetilbutirilCoA AcetilCoA + SuccinilCoA

Valina Cetoacid IzobutirilCoA

Deficit -cetoacid dehidrogenaz decarboxilare aa ramificai

- encefalopatie
- neurodegenerare progresiv infantil

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

HOMOCISTINURIA

Metionina SAM SAH Homocisteina Cistationina Cisteina

Deficit de cistationin -sintaz

- tromboz, osteoporoz
- tulburari neurologice
- defect de formare a cristalinului
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

3
 10/17/2016

Proteinemia - concentraia proteinelor plasmatice

- Componente fundamentale cca 100 n plasm sintetizate n ficat,
noduli limfatici, splin, plasmocite, mduva osoas
- Funcii variate transport, imunitate, tampon, meninere presiune
oncotic, inhibitori proteaze, enzime
- Parametru sanguin meninut constant prin mecanisme complexe
- Echilibru ntre cantitatea sintetizat de ficat/intestin i cea utilizat
Valoare normal - 6,4 8,3 g/dL ser/plasm (aduli)
Modificat de factori practici ortostatism cretere cu 10-20%
- aplicare garou cretere
Variaiile proteinemiei - cauze principale:
modificarea volumului apei din plasm
- hiperproteinemie - deshidratare (hemoconcentrare)
- hipoproteinemie - hemodiluie
modificarea conc. proteinelor n stri patologice
- hipoproteinemie pierderi (renale, digestive), bilant azotat -
- hiperproteinemie - producere excesiv (mai ales de -globuline)
diferene ntre sintez, eliminare i distribuie

Variaii fiziologice vrst, sarcin, efort, menstruaie, temperatur,

perfuzii (cu snge, proteine)
Variaii patologice

Hipoproteinemii Hiperproteinemii

Af. hepatice: ciroz hepatic, Artefactual staz venoas

intoxicaii cronice Deshidratare din diverse cauze:
Af. renale: glomerulonefrite, - vrsturi, diaree, diabet zaharat,
sindrom nefrotic diabet insipid
Stri catabolice - arsuri, hemoragii Infecii acute i cronice
Cretere permeabilitate capilar Hepatite virale evolutive
(septicemie, condiii inflamatorii) Mielom multiplu
Colagenoze Macroglobulinemie Waldenstrm
Malnutriie
Malabsorbie

4
 10/17/2016

Evaluarea diferitelor fraciuni proteice

Separare pe baza - sarcinii diferite
- masei moleculare n prezena SDS
Separare prin precipitare cu sruri neutre:
albumin - 3,4 5,2 g/dl
globuline - 1,5 3,5 g/dl
raport albumin /globuline - 1,3-1,9

Fraciuni separate prin electroforez pe baza mobilitii diferite

Albumina 54,3 - 66%
1 1,2 3,3 %
2 8,3 15% Globuline
(1+2) 6,5 11%
2,5 7%
7 19,5%
Fibrinogen - 0,2 0,4 g/dL Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Investigarea clinic a proteinelor serice/plasmatice:

- dozare proteine totale serice (plasmatice)

- dozare albumin i determinare albumin/globuline
- dozare fibrinogen plasmatic asociat testelor de coagulare
- separare electroforetic proteine serice
- identificare/dozare proteine specifice metode imunologice

5
 10/17/2016

Dozarea proteinelor serice/plasmatice

A. Proteine totale - metode colorimetrice metoda biuretului,
- 546nm sau 540 +/-20nm
Principiu: Peptidele cu cel puin dou leg. peptidice
reacioneaz cu reactivul biuret (CuSO4 n mediu
bazic) formnd un complex de culoare violet prin
coordinarea ionilor Cu2+ la atomii de azot din
legturile peptidice, care are abs. maxim la 546 nm.
Intensitatea culorii este proporional cu conc.
proteinelor n proba analizat
pH > 12
Cu 2+ + proteine (ser) ---- Complex Cupru-Proteine
25-37C

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Material biologic: ser, plasm recoltat pe heparin

Stabilitate 1 spt. la RT, 1 lun la 2-8oC
2 luni congelare la -20oC
Calibrare variabil, verificat cu cel puin dou controale
de conc. diferit
- obligatoriu la schimbare reactiv
Control de calitate zilnic (recomandat)
Linearitate pn la 18,4 g/dl
LOD 0,5g/dl
Interferene unele medicamente, Hb, TG
Valori normale ser nou nscui 4,6-7 g/dL
<1 an 5,1-7,3
1-2 ani 5,6-7,5
> 3 ani 6-8
aduli 6,4-8,3
> 60 ani 6,2-8,1
- plasm valori mai mari
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

6
 10/17/2016

B. Metode de dozare fraciuni proteice

-Albumina m. colorimetric (verde de bromocrezol BCG, 630 nm)
(purpuriu de bromocrezol BCP, 610 nm)
- Globuline m. colorimetric (cu acid glioxilic, 565 nm)
- Fibrinogen colorimetric pp. cu CaCl2 + metoda biuretului
- coagulometric (pp. cu trombin n exces, metoda Clauss)
- turbidimetric
- imunologice ELISA, EIA

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Albumina - cea mai abundent protein

rol de transport, presiunea coloid-osmotic

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

7
 10/17/2016

Variaii fiziologice - vrst ( mai mare la natere, scade dup 9 luni,

valori sczute >60 ani), sarcin t1/2 20 zile
Variaii patologice:
Hipoalbuminemii cauze diferite apariie edeme
- Sintez redus malnutriie, malabsorbie, afec. hepatice cronice
- Hiperhidratare, creterea permeabilitii capilare septicemie
- Creterea eliminrii/degradrii - pierderi digestive, afeciuni renale
arsuri, hemoragie, stri catabolice
Analbuminemie (rar, < 250 mg/L)
- transport lipide afectat
Bisalbuminemie congenital
- fistule pancreatice
- interferen medicamente

Hiperalbuminemii: artefacte (staz venoas), deshidratare

Recomandare pt. det. albuminemiei investigarea funcie hepatic

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

8
 10/17/2016

Metode colorimetrice de dozare a albuminei

- cu colorani care au afinitate mare pentru albumin
- verde de bromocrezol BCG
- purpuriu de bromocrezol - BCP

Principiu: Colorantul (BCG sau BCP) se leag specific de albumin

formnd un complex colorat cu absorbie maxim la 610-630 nm.
Intensitatea culorii este proporional cu conc. albuminei n proba de
analizat.
Material biologic numai ser - se obin valori crescute n prezena
fibrinogenului i heparinei
Stabilitate: 20-25 C 2,5 luni
o

2-8oC 5 luni;
-20oC- 3 luni recomandat, nu trebuie s apar precipitate

Calibrare variabil, verificat cu cel puin dou controale de

conc. diferit
- obligatoriu la schimbarea reactivului
Control de calitate zilnic (recomandat)
Linearitate pn la 10,5 g/dl
LOD 0,3g/dl
Interferene unele medicamente, Hb, bilirubin, TG

Fr acuratee atunci cnd sunt modificate i alte proteine

Valori normale ser nou nscui 2,8-4,4 g/dL

<14 ani 3,8-5,4
14-18 ani 3,2-4,5
20-60 ani 3,4-5,2
> 60 ani 3,2-4,6

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

9
 10/17/2016

Electroforeza proteinelor serice

Principiu: Separarea proteinelor serice n 5 fraciuni (albumin, 1,

2, i globuline) la pH 9.2 sau n 6 fraciuni (albumin, 1, 2, 1,
2 i globuline) la pH 8.5 sub aciunea unui cmp electric extern.

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Electroforegrama proteinelor serice

Alb 1 2

Anod Catod

Alb

1 2 1 2

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

10
 10/17/2016

Etapele electroforezei proteinelor

1. Impregnare folii acetat de celuloz/gel de agaroz
2. Aplicare probe
3. Migrare
4. Colorare/decolorare Amidoschwarz, Ponceau/acid acetic 5%
5. Uscare
6. Densitometrare i raportare n funcie de proteinemie

Albumina 54,3 - 66%

Globuline
1 1,2 3,3%
2 8,3 15%
(1+2) 6,5 11%
2,5 7%
7 19,5%
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Recomandri pt. electroforeza proteinelor serice:

- Analiz de precizare de diagnostic cnd alte analize sunt modificate

(PT, ALB, GLOB, proteinurie, hipocalcemie, HLG modificat)

- Analiz iniial, n funcie de simptome condiii inflamatorii, boli

autoimune, infecii acute i cronice, afeciuni hepatice sau renale,
pierdere de proteine, simptome ce sugereaz mielom multiplu
(oboseal, anemie, dureri osoase, fracturi, infecii recurente)

- Pentru monitorizarea evoluiei sau a tratamentului

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

11
 10/17/2016

Material biologic ser

- fibrinogenul apare ca band suplimentar
Stabilitate: 2-8oC 1 sptmn
-20oC - 1lun
Factori de interferen - plasma ca specimen band ntre -
- tratament cu anticoagulante - dublare peak n
zona 2 sau
- hemoliza
- congelare probe - band suplimentar n punctul
de aplicare a probei
- LDL i HDL crescute (HDL -2; LDL-)
Control de calitate dou controale de concentraie diferit
- la fiecare serie de migrare

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Aspect comparativ electroforegram proteine ser/plasm

Fibrinogen

Ser normal Plasm normal

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

12
 10/17/2016

Sistem automat Hydrasys Sebia

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Sistem complet automatizat Interlab

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

13
 10/17/2016

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Prealbumin (Transtiretin) - leag T4 i retinol n ser i LCR

- asociat bolilor de amiloid
Hipoalbuminemii cauze diferite determin edeme, ascit
- Protein de faz acut negativ
- Sintez redus malnutriie, malabsorbie, afec. hepatice cronice
- Hiperhidratare, creterea permeabilitii capilare septicemie
- Creterea eliminrii/degradrii - pierderi digestive, afeciuni renale,
arsuri

14
 10/17/2016

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Proteine specifice informaii utile n diagnostic

- modificri dup intervenii chirurgicale,
traume, inflamaii, infecii, cretere tumoral
Proteina Funcia Motiv determinare
1-antitripsin Inhibitor proteazic Scade n deficit de 1-antitripsin
(elastaz)
2-microglobulin Subunitate antigen HLA Crete n disfuncii tubulare renale
Ceruloplasmin Enzim antioxidant Scade n boala Wilson
Proteina C-reactiv Rspuns imun Crete n inflamaii acute
Feritin Depozitare Fe Indicaii despre depozitele de Fe
Haptoglobin Leag Hb Scade n condiii de hemoliz
TBG (Tiroxin- Leag h. tiroidieni Modificri n disfuncii tiroidiene
binding-globulin)
SHBG (Sex hormone Leag testosteron i Investigat n rezistena la
binding globulin) estradiol androgeni i la insulin
Transferin Transport fier n snge Investigare status Fe i rspuns la
suport nutriional

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

15
 10/17/2016

Proteine de faz acut pozitive

- interleukine (IL-1 i Il-6) - ageni primari ce det. eliberarea lor
- conc. sanguin crete de 50-1000 ori n boli inflamatorii i neoplazii
- proteina C reactiv stimul. activitatea complementului
corelat cu riscul pt. BCV
- ceruloplasmina feroxidaz, rol antioxidant
crete n inflamaii, boli de colagen, boli maligne
- 1-antitripsina serpin
deficitul determin ciroz, emfizem
scade n sindrom nefrotic
- 1-glicoproteina acid (orosomucoid) indicator colit ulcerativ
- fibrinogen, haptoglobin
Proteine de faz acut negative
- proteine care scad n timpul rspunsului inflamator
- albumin
- transtiretin, RBP
- transferin index turnover proteic mai bun dect albumina

1-globuline
Sczute - emfizem pulmonar congenital (deficit de 1-AT)
af. hepatice severe, sindrom nefrotic
Crescute inflamaii acute/cronice (PR, LES), sarcin, cancer hepatic

Alfa1-antitripsina inhibitor de proteaze

Alfa1-glicoproteina acid
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master
Alfa 1-fetoproteina cancer hepatic LCAM

16
 10/17/2016

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

2-globuline Alfa2 macroglobulin

Sczute hipertiroidism Haptoglobin
af. hepatice severe Ceruloplasmin
hemoliz, anemie megaloblastic TBG
malnutriie, enteropatii Transcortin
Crescute sindrom nefrotic
inflamaii acute/cronice
tratament cu corticosteroizi

17
 10/17/2016

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

-globuline Transferin
Scdere malnutriie -lipoprotein
ciroz Complement C3
LDL sczut 2-microglobulin
Proteina C reactiv
Cretere - hipercolesterolemie
anemie feripriv
sindrom nefrotic
ciroz biliar
hipotiroidism, Cushing, diabet
sarcin trim. III
uneori n mielom multiplu

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

18
 10/17/2016

IgG - 1,4 g/L

IgA - 3,5
IgM - 1,5
IgD - 0,03
IgE

Gamma globuline
Sczute af. genetice
deficiene imune secundare
Cresteri:
policlonale af. inflamatorii cronice (PR, LES, ciroz)
infecii acute/cronice
imunizri recente
fenitoina, metadona, IgG, contraceptive
- monoclonale macroglobulinemie Waldenstrom
- mielom multiplu
- gamapatii monoclonale

Electroforegrama - mielom
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

19
 10/17/2016

Fibrinogen
Hiperfibrinogenemie inflamaii (pneumonie, pleurezii, reumatism)
traumatisme, neoplasm hepatic
boli coronariene
Hipofibrinogenemie - afeciuni hepatice grave
leucemii
neoplasm de pancreas

Functii biologice
- coagulare
- fibrinoliz
- interacii n MEC
- interacii celulare
- rspuns inflamator
- vindecare rni

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Tipuri de disproteinemii
Disproteinemia din inflam. acut: cresc 1 i 2, scade
albumina, crete fibrinogen
Disproteinemia din inflam. cronic: albumina discret
scazut, 2 normal, -crescut
Disproteinemie cu pierdere renal de proteine: scad mult
PT, albumina, crete marcat 2, puin , scade
Disproteinemia prin pierdere enteral de proteine: scad
PT, creste 2
Disproteinemia din af. hepatice-fct. etiologie i stadiu
- hepatite virale scade albumina, cresc moderat
- hepatite cronice cresc difuz
- ciroz hepatic alb.sczut, apare o punte ;
- neoplasm hepaticn stadii avansate scade alb., cresc
1 si , prezent -fetoproteina;
Disproteinemie cu hipergamaglobulinemie monoclonal
sau oligoclonal: mielom multiplu, macroglobulinemie
Waldenstrm, boala lanurilor grele, leucemia cu
plasmocite

20
 10/17/2016

Profil biclonal n alfa 2 i gama

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Profil monoclonal n gama

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

21
 10/17/2016

Profil monoclonal n alfa 2 i gama (IgG)

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Profil monoclonal n alfa 2 i gama

Prealbumin

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

22
 10/17/2016

Profil monoclonal n gama - IgA

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

19 Hemoliz 28 - Fibrinogen

23