10/24/2016

ENZIME
TEME ABORDATE

Enzime generaliti
Factorii ce influeneaz activitatea enzimelor

Specificitatea de actiune

Metode de determinare a activitii enzimatice

Reglarea activitatii enzimatice

Ribozime

Enzimele - generaliti

Biocatalizatori
Putere catalitic mare (1016 ) Energie de activare
Specificitate de aciune
(de substrat i de reacie)
Nu dau reacii secundare
Scad energia de activare,
accelernd viteza reaciei
Au capacitate de reglare
Cantitate f. mic, eficiente
Acioneaz la temp. de
aproximativ 37oC, la pH, n
general, neutru i presiune
normal

1
 10/24/2016

Reactia enzimatic E + S = ES = E + P

Denumire uzual nume substrat + aza

Denumire conform EC a IUB - numr de cod
- nume sistematic
Clasificare: 1. Oxidoreductaze;
2. Transferaze;
3. Hidrolaze;
4. Liaze;
5. Izomeraze;
6. Ligaze
Numele sistematic conine informaii referitoare la :
a. natura donorului;
b. natura acceptorului;
c. tipul reaciei catalizate

Exemplu: EC 1.1.1.27 L-lactat: NAD+oxidoreductaza

(uzual lactat dehidrogenaza)
L-lactat + NAD+ = piruvat + NADH + H+

2
 10/24/2016

Structura enzimelor
Proteine globulare - unitare i, mai ales, binare
Holoenzima = Apoenzima + Cofactor
Studiul structurii: difracie de raze X, dicroism circular,
fluorescen, analize n UV i IR, RMN, spectrometrie Raman
Apoenzima proteina, sintetizat n ribozomi
- structur complex
- proteine globulare, heteromultimerice
- nedializabil i termolabil
- confer specificitate de substrat
- conine situsul catalitic (i alosteric)
Cofactorii - structur variat (coenzime, ioni metalici)
- termostabili i dializabili
- indispensabili pentru activitatea enzimei
- confer specificitate de reacie
- induc conformaia optim a apoenzimei

Cofactori enzimatici

Ioni Enzima Coenzim Grupa Enzima

metalici transferat

Cu2+ Citocrom NAD+ H+ Lactat

oxidaza dehidrogenaza
Zn2+ Alcool FAD H+ Succinat
dehidrogenaza dehidrogenaza
Mg2+ Hexokinaza PALPO NH2 Aspartat
Fe2+, Catalaza aminotransferaza
Fe3+ Biotina CO2 Propionil CoA
carboxilaza
FH4 -CHO Timidilat sintaza
-CH3

3
 10/24/2016

Structura enzimelor
Centrul activ al enzimelor situs catalitic

Ser Asp
Glu His

Enzime alosterice

4
 10/24/2016

Sisteme multienzimatice (enzime polifuncionale)

Oxidoreductaze oxidaze (glucozoxidaza)

peroxidaze (glutation peroxidaza)
dehidrogenaze (LDH)
monoxigenaze (hem oxigenaza)

Coenzime - NAD+ sau NADP+ (de la vitamina PP)

FAD sau FMN (de la vitamina B2)

Ex: EC 1.1.1.27 L-lactat: NAD+oxidoreductaza (LDH)

L-lactat + NAD+ = piruvat + NADH + H+

+ +
CH3 NAD NADH,H CH
3

HO C H C O
COOH + + COOH
NADH,H NAD
acid L-lactic acid piruvic

5
 10/24/2016

Transferaze aminotransferaze (transaminaze)

metiltransferaze
formiltransferaze
fosfotransferaze - kinaze

Coenzime piridoxal fosfat (vitamina B6)

tiamin pirofosfat (vitamina B1)
biotina
coenzima B12
coenzime folice
nucleotid trifosfati (ATP)

Ex: EC 2.7.1.1 ATP:D-hexozo-6-fosfotransferaz (hexokinaz)

D-hexoz + ATP = D- hexozo-6-fosfat + ADP

Hidrolaze esteraze (colesterol esteraza, colinesteraza)

glicozidaze (amilaza)
fosfataze (nucleotidaza)
peptidaze (tripsina)

Ex: EC 3.1.3.9 D-glucozo-6-fosfat-fosfohidrolaza

(glucozo-6-fosfataza)
D-glucozo-6-fosfat + H2O = D-glucoz + Pi

Liaze aldolaze
hidrataze
sintaze
decarboxilaze
Ex: EC 4.1.1.22 L-histidin-carboxi-liaz (histidin decarboxilaza)
Histidin = Histamin + CO2

6
 10/24/2016

Izomeraze racemaze
epimeraze
izomeraze cis-trans
mutaze

Ex: EC 5.1.1.1 Alaninracemaza

L(+)-alanina = D(-)-alanin
Ligaze amidosintetaze
peptid sintetaze
carboxilaze

Ex: EC 6.3.1.2 L-glutamat:amoniac ligaza (glutamin sintetaza)

L-glutamat + ATP + NH3 = L-glutamin + ADP + Pi

EC 6.4.1.1 piruvat carboxilaza

L-piruvat + CO2 = L-oxalilacetat

Localizarea intracelular a enzimelor

Metode de analiz- separare organite, ultracentrifugare,
identificare prin imunohistochimie
Enzime ubicuitare i echipamente enzimatice specifice
Profil enzimatic de organ - enzimele din diferite
compartimente celulare
Membrana celular- enzime cu rol n transport
Mitocondriile enzime n procese energetice
Nucleul - enzimele din metabolismul acizilor nucleici
Ribozomii - enzime din biosinteza proteinelor
Citoplasma - enzime glicolitice, biosinteza AG etc.
Lizozomii - proteaze, ribonucleaze, hidroliza PG etc.
Complex Golgi - exportul proteinelor sintetizate n RE,
maturarea PG si glicoproteinelor
Enzime cu localizare mixt - AST, MDH, ICDH
Importana cunoaterii localizrii enzimelor
- scop diagnostic, identificare cu enzime marker

7
 10/24/2016

Izoenzime

Definiie forme moleculare multiple, catalizeaz aceeai

reacie cu vitez diferit
Deosebiri: - mobilitate electroforetic
- putere catalitic diferit
Exemple: LDH 5 izoenzime 2 forme parentale: M4 i H4
3 f. hibride:M3H, M2H2, MH3

Semnificatia izoenzimelor

- prognostic nefavorabil LDH1 > LDH2,

-LDH2 > LDH1, iar CK-MB > 6% - afectare cardiac,

dar nu infarct

8
 10/24/2016

CK 3 izoenzime 2 forme parentale: M2(MM), MB (2), B2(BB)

CK-MM predominant normal

CK-MB < 6% - normal
IMA: CK-MM crescut
CK-MB > 6% - IMA

9
 10/24/2016

Specificitatea de actiune

de reacie dat de cofactor

de substrat dat de apoenzim

Specificitatea de reacie
R-CH2-NH2

Decarboxilaz

R-CH-COOH R-CH-COOH R-C-COOH

Oxidaz Transaminaz
OH NH2 O

Dezaminaz

R-C-COOH + NH3
O

Specificitatea de substrat
stereochimic
relativ de grup
absolut
Specificitatea stereochimic
- transformarea unui izomer geometric (cis sau trans)
- formarea unui izomer geometric sau optic
- transformarea unui substrat aparinnd
unei sterice D sau L

10
 10/24/2016

Lactat dehidrogenaz sintez asimetric

+ +
CH3 NAD NADH,H CH
3

HO C H C O
COOH + + COOH
NADH,H NAD
acid L-lactic acid piruvic

Succinat dehidrogenaza formeaz izomer trans (acid fumaric)

COOH
FAD FADH 2 COOH H
CH2
C C
CH2 SDH
H COOH
COOH

Specificitatea relativ de grup

- actioneaz pe o clas de compui, asupra unui anumit tip de
legatur chimic
Ex. glicozidaze, hexokinaze, fosfataze

Alcool dehidrogenaza

ADH
R CH2 OH R CHO

+ +
NAD NADH,H

11
 10/24/2016

Specificitatea absolut
recunoate substratul n ntregime
ureaza, arginaza, anhidraza carbonic

ureaza
H2N-C-NH2 + H2O CO2 + 2NH3
O

arginaza
H2N-C-NH-(CH2)3-CH-COOH H2N-C-NH2 + H2N-CH2)3-CH-COOH
O NH2 O NH2

CO2 + H2O H2CO3

Factorii ce influeneaz viteza reaciilor enzimatice

Temperatura, pH-ul, concentraia substratului
efectorii enzimatici: activatori i inhibitori

Efectul temperaturii
Influenta a doi factori:
- creterea vitezei de reacie
- denaturare termic a enzimei
Temperatura optim - diferit
- organism uman 37-400C
- plante 50-600C
- microorganisme ape termale
(Taq polimeraza - PCR)
Coeficient Q10

12
 10/24/2016

Efectul pH-ului

pH optim pt. o enzima

Efect - disocierea grupelor
ionizabile, acide sau bazice, din
centrul activ i implicit modificarea
vitezei de reacie
pH optim - 5-9
Unele enzime acion. La pH extrem:
pepsina pH 1,5-2
fosfataze alcaline pH 9-10
fosfataze acide pH 4,5-5
Concentraia substratului ec.Michaelis-Menten

v max S
v
K m S
Semnificaia Km constanta Michaelis

Activatori enzimatici

stimuleaz activitatea enzimelor

activatori ai unor proenzime: H+ pt. pepsinogen-pepsin
activatori propriu-zii: fosfataze - Mg2+
peptidaze - Mn2+
alcool dehidrogenaza - Zn2+
amilaz - Cl- etc
activatori prin antiinhibiie: vitamine E, C
substane cu caracter reductor protejeaz grupele SH din
centrul activ al enzimei, ex. glutation, cisteina
Enzim-SH + GSH = Enzim S SG + 2H+

activare prin modificare covalentfosforilare/defosforilare

Enzim-Ser-OH + ATP = Enzim-Ser-OPO3H2 + ADP

13
 10/24/2016

activatori ai subunitilor reglatoare

AMPc - activator al proteinkinazei A

Inhibiia enzimatic
Inhibitorii enzimatici - influen negativ definitiv
sau temporar
Afecteaz situsul catalitic al enzimei sau alt regiune
a moleculei implicat n legarea substratului

14
 10/24/2016

Inhibitie competitiva

inhibitor analog structural substratului, afinitate pentru situsul

catalitic al enzimei
competiie ntre inhibitor i substrat pentru ocupare situs catalitic

Reprezentare: E +S
k1
ES
k3
E+ P
k2
- modificare Km ki
E + I EI
k-i
- reversibil

Exemplu:

Inhibitori acid oxalic,

malic, malonic

15
 10/24/2016

Inhibiie necompetitiv

inhibitorul nu se leag la acelai situs cu substratul, nu prezint asemnare structural

efectul I nu poate fi nlturat prin creterea concentraiei de substrat
inhibitorul necompetitiv interacioneaz numai cu complexul ES

k1 k3
E +S ES E+ P
k2
ki'
ES + I ESI
-ki' - scdere Vmax
- insensibil modificare Km

16
 10/24/2016

Inhibiie non-competitiv

inhibitorul se leag la alt situs (alosteric)

nu prezint asemnare structural cu S
efectul I nu poate fi nlturat prin creterea concentraiei de substrat
inhibitorul non-competitiv interacioneaz cu enzima sau cu ES

Reprezentare:
k1 k3
E +S ES E+ P
k2
ki
E+I
k-i
EI - modificare Vmax - pur

ES + I ESI

17
 10/24/2016

-modificare Vmax mixt

-modificare Km

Exemple de inhibitori non-competitivi:

- Ag, Pb, Hg la nivelul grupelor SH ale enzimei
- ferochelataza
- insecticide - inhibitoare ale acetilcolinesterazei
- oubaina - inhibitoare a pompei de sodiu i potasiu;
- ageni de chelatare (EDTA)
- medicamente

Inhibiie ireversibil - inactivare

- Combinare covalent la o grup funcional esenial pentru
aciunea enzimei
- Efect net - pierderea cantitii de enzim activ

Exemple:
- inhibitori alchilani iodoacetamid fosfataze
alchilare SH
- pesticide organofosforice chimotripsin
acetilcolinesteraz
O O

Enz-CH2-OH + F P-O-CH-CH3 Enz-CH2-O P-O-CH-CH3

-HF
O CH3 O CH3
H3C CH-CH3 H3C CH-CH3

18
 10/24/2016

ioni sau molecule ce acioneaz la nivelul unor cofactori:

CN-,CO inhib citocromoxidaza

COOH
OCOCH3
E OH Ser350
COX activ
acid acetilsalicilic
(aspirin)
COOH
OH
E OCOCH3 Ser350

COX inactiv
acid salicilic

medicamente - penicilina legare la Ser din centrul activ al

glicoprotein peptidazei (inhib formarea peretelui bacterian)
- aspirina acetilare Ser din COX, blocare sinteza icosanoide

Importana inhibitorilor enzimatici:

- controlul proceselor biochimice
- nelegerea mecanismelor de aciune a unor medicamente,
droguri, toxice
- urmrirea unor etape dintr-un proces metabolic
- stoparea reaciilor enzimatice

19
 10/24/2016

Reglarea activitii enzimatice

a) Modificarea cantitii de enzim
Cantitate enzim functie de raport intre rata de sintez i de
degradare a enzimei codificate genetic (turnover)
ks>kd - enzima inductibil
ks<kd - enzima represibil
b) Alterarea eficienei catalitice a enzimei mediat de inhibitori
c) Modificarea covalent - Fisher i Krebs (1992)
Fosforilarea - defosforilarea la resturi de serin, tirozin
activeaz sau inactiveaz enzimele
d) Sinteza sub form de zimogeni inactivi
- adopt conformaia specific n
anumite condiii de pH, activatori
e) Sinteza sub form de izoenzime - specifice pentru anumite condiii
f) Reglarea alosteric - enzime alosterice

Enzime alosterice - modulate de liganzi

E. alosterice - n etapele determinante de vitez ale cilor metabolice
- reglarea proceselor metabolice
Enzime alosterice 2 stri - tensionat (T) - inactiv
- relaxat (R) - activ

Activatorii favorizeaz forma relaxat - activa

Inhibitorii favorizeaz forma tensionat - inactiva

20
 10/24/2016

Retroinhibiia - caz al inhibiiei alosterice, produsul final al cii

metabolice este inhibitor (inhibiie feed-back)

RIBOZIME
Relaia enzime proteine corect pn n anii 90
Ribozime - molecule de ARN ce acioneaz ca enzime
Catalizeaz modificri covalente n structura substratului
Implicate n procesarea altor tipuri de ARN:
- ARN transfer (tRNA)
- ARN ribozomal (rRNA)
- ARN mesager (mRNA)
Pot realiza autocataliza sau cataliza unor substraturi externe
5 clase de ribozime - (1) grupa I Tetrahymena
(2) RNA aza P
(3) ribozima cap de ciocan
(4) ribozima n ac de pr
(5) ribozima virus hepatitic delta
Ribozime n terapie degradeaz ARNm ce codific unele
molecule active
Ex. ribozime anti ARNm de receptor VEGF n cancer

21
 10/24/2016

Metode de determinare a activitii enzimatice

- Msurarea scderii concentraiei S sau creterii conc. P
format n condiii optime

Metode cu timp fix de incubare

Martor (enzima inactivat)
Prob (enzima activ)
Timp determinat n condiii optime inactivare prob
Diferena prob martor raportat la timpul de incubare

Ex: Determinarea activitii aminotransferazelor prin

reacia cu 2,4 - dinitrofenilhidrazin

H3C-C-COOH + H2N-HN NO2 HOOC-C=N-HN NO2

-H2 O
O CH3
NO2 NO2

Metode cinetice

Testul optic - spectrofotometric

22
 10/24/2016

H H
CONH2 + CONH2
+ 2H
+ +
N +H
N
- 2H +
+ + + +
NAD (NADP ) NADH,H (NADPH,H )

NH2 NH2

N N N N
CONH2 CONH2
+ O O N N + O O N N
N N
CH2 -O-P-O-P-O-H2C CH2 -O-P-O-P-O-H2 C
O - O O O
-
O O O - O-
H H H H H H H H
H H H H H H H H
OH OH OH OH HO OH OH OPO3 H2

NAD
+ NADP +
NICOTINAMID ADENIN DINUCLEOTID FOSFAT
NICOTINAMID ADENIN DINUCLEOTID

Test optic simplu pentru r. catalizat de o dehidrogenaz

NAD+ - dependent
Ex: Determinarea activitii lactat dehidrogenazei (LDH)
L-lactat + NAD+ = piruvat + NADH + H+
Test optic cuplat - reacia catalizat de enzima de interes
- reacie indicatoare - catalizat de o DH

Ex: Determinarea activitii aminotransferazei ALT:

ALT
L-alanina + -cetoglutarat = L-glutamat + piruvat

LDH
Piruvat + NADH,H+ = L - lactat + NAD+

23
 10/24/2016

Test optic cuplat reacie de analizat cuplat cu o reacie

auxiliar i o reacie indicatoare catalizat
de o DH NAD-dependent
Ex: Determinarea activitii creatin kinazei (CK)
CK
Creatinfosfat = Creatin + Pi
ADP + Pi = ATP
HK
Glucoz + ATP = Glucozo- 6-fosfat + ADP
G-6-P DH
Glucozo- 6-P+ NADP+ = 6-fosfogluconat + NADPH, H+

Test cinetic colorimetric

- determinarea activitii fosfatazelor, amilazei,
-glutamil transpeptidazei (transferaz)

Ex: Determinarea activitii fosfatazei acide

Pac.
-naftilfosfat + H2O = -naftol + acid fosforic

-naftol + Fast Red TR = Colorant azoic

Metode specifice colinesteraz, nucleotidaz etc.

24
 10/24/2016

Exprimarea activitii enzimatice

UI - cantitatea de enzim care transform un mol substrat

pe minut la 250C, n condiii optime.

Calculul activitii enzimatice:

- utilizare ser standard - cantitate cunoscut de enzim
- folosirea coeficientului molar de extincie
- metoda grafic

Exprimarea activitii enzimatice

EP 1 V
UI = xCx10 6 x x F moli/min/l
ES t V
V (ml) - volumul materialului de analizat;
VF (ml) volumul final;
C (moli/l) concentraia substratului sau a produsului;
EP, ES extinciile probei, respectiv standardului;
t (minute) timpul de incubare.

25
 10/24/2016

Exprimarea activitii enzimatice

UI =
E min V moli/min/l
x10 6 x F
d V
E/min variaia exticiei probei pe minut;
VF (ml) volumul materialului de analizat;
V (ml) volumul probei;
d (cm) grosimea cuvelor;
coeficientul molar de absorbie (pt. substrat sau produs)
NADH - 6220

26