10/24/2016

CORELAII CLINICE I METODE ANALITICE

I. Aminoacizi, peptide, proteine

Enzime
Glucide i metabolii glucidici
Lipide i lipoproteine
Gaze sanguine, pH, sisteme tampon (echilibru acido-bazic)
Electrolii (echilibru hidroelectrolitic)
II. Compui azotai neproteici
Porfirine
Microelemente

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

AMINOACIZI, PEPTIDE, PROTEINE

Obiective de nvare:

Recunoatere aminoacizi
Difereniere aminoacizi funcie de prop. radicalului R
Caracterizare proprieti aminoacizi
Recunoatere peptide
Caracterizare proteine
Exemplificare proprieti

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

1
 10/24/2016

Peptide, proteine - produi de condensare a aminoacizilor unii

prin legturi peptidice, neramificai

Formarea legturii peptidice:

R CH COOH + HN CH COOH R CH CO HN CH COOH + H2O
1 2 1
NH 2 R2 NH2 R2

rest N-terminal rest C-terminal

- existente n mediile intracelulare i extracelulare

- compoziie diferit
- sintetizate specific pentru funcia ndeplinit
- funcii biologice importante
- prin hidroliz chimic sau enzimatic formeaz aminoacizi

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Aminoacizii formula general

atom de C central

grup amino grup carboxil

radical lateral
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

2
 10/24/2016

Aminoacizii
- precursori pt. peptide i proteine cu funcii biologice variate
(hormoni, antibiotice, enzime, anticorpi, proteine contractile,
proteine transportoare)
- intervin n procese metabolice
- nume comune indic sursa de izolare sau unele proprieti
- aa. au o prescurtare de trei litere sau un simbol de o liter, utile
pentru scrierea secvenei peptidice
Tipuri biochimice
Aminoacizi proteinogeni standard 20 aa. codificai genetic
- n peptide i proteine
Aminoacizi proteinogeni nonstandard modificare aa. standard
ulterior sintezei proteinelor
Aminoacizi neproteinogeni nu intr n structura proteinelor
- alte funcii biologice importante
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Aminoacizii proteinogeni - caracteristici generale

- -aminoacizi - grup carboxil i amino la acelai atom C - C

- atomul C este centru chiral - C-asimetric
- optic activi - rotesc lumina polarizat () stnga (levogir)
(+) dreapta (dextrogir)
au 2 sau 4 enantiomeri
- L-aminoacizi conform conveniei Fischer indic config. absolut
pentru cei patru substitueni n jurul C chiral
- important pentru stereospecificitatea enzimelor

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

3
 10/24/2016

Clasificarea aminoacizilor proteinogeni

- cinci grupe structur, mrime, sarcin electric, proprieti R
(polaritate sau tendina de a interaciona cu apa la pH fiziologic)
- influeneaz proprietile biochimice ale peptidelor (solubilitate n ap,
proprietatile electrochimice)
- R poate fi - nepolar (hidrofob, insolubil n ap) - Rh
- slab polarizat, nencrcat electric - Rp
- puternic polarizat (hidrosolubil) - acid Rpa
- bazic Rpb
1. Aa. cu radical nepolar aa. monoaminomonocarboxilici (Rh)
CH2 -COOH CH3 -CH-COOH CH3 -CH-CH-COOH
NH2 NH2 CH3 NH2 2. Aa. aromatici, R relativ nepolar
glicina -alanina valina au ciclu omogen sau heterociclu
CH3 -CH-CH2 -CH-COOH CH3 -CH2 -CH-CH-COOH CH3 -S-CH2 -CH2 -CH-COOH

CH3 NH2 CH3NH2 NH2

leucina izoleucina metionina CH2 -CH-COOH CH2 -CH-COOH
CH2 -CH-COOH
NH2 NH2
NH2
N
H
OH
fenilalanina tirozina triptofan

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

3. Aa. cu Rp hidroxiaminoacizi, tioaminoacizi, iminoacizi, amide

CH2 -CH-COOH H N CH-COOH
CH2 -CH-COOH CH3 -CH-CH-COOH
H2C CH2
SH NH2 OH NH2 OH NH2 CH2
cisteina serina treonina prolina
O=C-CH2 -CH-COOH O=C-CH2 -CH2 -CH-COOH
NH2 NH2 NH2 NH2
asparagina glutamina

4. Aa. cu Rpb aa. diaminomonocarboxilici - sarcin pozitiv la pH 7

N CH2-CH-COOH
H2N-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COOH H2N-C-NH-(CH2 )3-CH-COOH
N NH2
NH2 NH NH2
H
lisina arginina histidina
5. Aa. cu Rpa aa. monoaminodicarboxilici sarcin negativ la pH7
HOOC-CH2 -CH-COOH HOOC-CH2 -CH2 -CH-COOH
NH2 NH2
acid aspartic acid glutamic

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

4
 10/24/2016

Aa. proteinogeni nonstandard

Acid -carboxiglutamic (GLA) - in proteine

ce leaga ioni Ca2+
Ex. protrombina, proteine GLA din matricea
proteica a osului si dintelui

Aminoacizi neproteinogeni
H2N-CH2-CH2-COOH H2N-CH2-CH2-CH2-CH-COOH H2N-C-NH-(CH2 )3-CH-COOH
NH2 O NH2
alanina ornitina citrulina
H2N-CH2-CH2-CH2-COOH HS-CH2-CH2-CH-COOH HO-CH2-CH2-CH-COOH
NH2 NH2
acid - aminobutiric homocisteina homoserina
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Aminoacizi neproteinogeni -alanina n cofactori, carnozin

NH2
CH3 H
N N O O
HO-CH2 -C C-CO-NH-CH2 -CH2 -COOH CH3 H
N N CH2 -O-P-O-P-O-CH2 -C C-CO-NH-CH2 -CH2 -CO NH-CH2 -CH2 -SH
CH3 OH O - -
acid pantotenic H H O O CH3 OH
H H
OH OPO 3H2
Coenzima A

Aminoacizi neproteinogeni homocisteina n metabolismul metioninei

Deficitul de cistationin beta-sintaz asociat

cu hiperhomocisteinemie i homocistinurie
Risc pentru afeciuni cardio- i cerebrovasculare

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

5
 10/24/2016

Aminoacizi
Aa. eseniali glucogeni si cetogeni
- nu pot fi sintetizai de ctre toate organismele
- furnizai prin alimentaie
Valina, Leucina, Izoleucina, Treonina, Lisina, Fenilalanina,
Metionina, Triptofan
Aa. semieseniali sintez n cant. redus - arginina, histidina
Aa. neeseniali toate organismele au ci de sintez a acestora
Aa. glucogeni - genereaz precursori ai gluconeogenezei
Aa. cetogeni genereaz precursori ai cetogenezei

Corpi cetonici

Excepie: Leucina

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Decarboxilarea aminoacizilor - formare de amine biogene

Aminoacid Amina rezultat la decarboxilare
Histidina Histamin (vasodilatator, reacii alergice)

Cistein Cisteamin (precursor al taurinei mediator metabolic, rol in

detoxifiere, antioxidant)
Serin Colamin (din colina, acetilcolina, lecitine, sfingomieline)
Triptofan Triptamin (neuromodulator)

Acid aspartic i -alanin

Acid glutamic Acid -aminobutiric (GABA) (neurotransmitor inhibitor)

Tirozin Tiramin (vasoconstrictie HTA, migrene)

Lisin Cadaverin (amin toxic, n procese de putrefacie)

Ornitin Putrescein (amin toxic, n procese de putrefacie, n cantitate mic

precursor al unor compui cu rol n mpachetarea ADN,
neuromediator)

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

6
 10/24/2016

Transaminarea - transferul grupei amino de pe aminoacid pe cetoacid

transaminaze
R1-CH-COOH + R2-C-COOH R1 C COOH + R2-CH-COOH
NH2 O O NH2
- donori de grupe amino - acid aspartic i acid glutamic
- acceptori de grupe amino - acid piruvic, -cetoglutaric, oxalilacetic
Transaminaza ALT (ALAT, GPT, TGP)
ALT = alanin transaminaz; ALAT = alanin aminotransferaz
GPT = glutamat piruvat transaminaza, TGP = transaminaza glutamic piruvic
ALT
H3C-CH-COOH + HOOC-CH2-CH2-C-COOH H3C C COOH + HOOC-CH2-CH2-CH-COOH
NH2 O O NH2
ALT= repartizat n ficat, rinichi, inim, muchi, pancreas
Transaminaza AST (ASAT, GOT, TGO) - AST = aspartat transaminaza; ASAT
= aspartat aminotransferaza, GOT = glutamat oxalilacetat transaminaza, TGO =
transamin. glutamic oxalilacetic
AST
HOOC-CH2-CH-COOH+ HOOC-(CH2)2-C-COOH HOOC-CH2-C-COOH + HOOC-(CH2)2-CH-COOH
NH2 O O NH2
AST= inim, ficat, muchi, rinichi, splin
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Acilarea conjugarea cu resturi acil rol n procese de detoxifiere

formare derivai carbamici
H2N-CH2-COOH + C6H5-CO~ SCoA C6H5-CO NH-CH2-COOH + CoASH

glicocol benzoilCoA acid hipuric

Dezaminarea oxidativ - cetoacizi intermediari metabolici

R-CH-NH2
dezaminare oxidativ R-C = O
+ NH3 - Relatie cu ciclul ureogenetic pentru
eliminarea amoniacului
COOH COOH
aminoacid cetoacid

Conjugarea cu grupe carbonil baze Schiff

formare aduci: proteine-glucoz, proteine-etanal
Ex. Proteine glicate - hemoglobina glicozilat (HbA1c)

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

7
 10/24/2016

Aduci proteine-aldehide efectele stresului oxidativ

Aduci proteine-aldehide :
mecanism biochimic n injuria celular

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Reacii determinate de grupe din radical

a. esterificare cu acid fosforic (fosforilare)
- grupe OH ale serinei, tirozinei i treoninei controlul activit.
enzimelor

b. oxidare grupe SH ale cisteinei rezult puni S-S-

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

8
 10/24/2016

c. S-conjugarea peptidelor i proteinelor

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Peptide - clasificare
a) oligopeptide 2-10 aminoacizi
b) polipeptide 10 - 50 aminoacizi (<10 kDa)
Proprieti importante biochimic
a. ionizare n mediu apos
b. solubilitate n mediu apos - datorit compoziiei
c. proprieti electrochimice utile pentru caracterizare prin
electroforez

Ionizare. Caracter amfoter

- ioni dipolar (amfiioni) - la dizolvarea n ap
+ +
+ -H + - -H -
H3N-CH-COOH H3N-CH-COO H2N-CH-COO
+ +
+H R +H R
R

- pI punct izoelectric pH la care suma sarcinilor pozitive este

egal cu suma sarcinilor negative
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

9
 10/24/2016

Glutation n celule, 90% GSH, 10% GSSG peptid neribozomal

- grupa SH activ biologic
- antioxidant reacioneaz cu peroxizii
- protejeaz hematiile de liz
- transportul aminoacizilor donor de acid glutamic

HOOC-CH-CH2-CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH

NH2 CH2-SH Sinteza glutationului

-glutamil-cisteinil-glicin

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Enzime glutation-dependente
glutation peroxidaza
2 G-SH + H2O 2 G-S-S-G + 2 H2O
cu seleniu
glutation reductaza
2 G-SH + X G-S-S-G + H2X

Mecanism de aciune

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

10
 10/24/2016

Glutation rol n tiolarea proteinelor

Glutation n faza a II-a de biotransformare

a unor xenobiotice electrofile glutat.conjugare
- n sinteza leucotrienelor

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Exemple de peptide cu activitate biologic

Peptida Denumire Funcia biologic

Tripeptide Tireoliberina (TRH) Stimuleaz eliberarea TSH hipofizar

Pentapeptide Met-encefaline, Leu-encefaline Liganzi pentru receptorii opiaceelor

Nonapeptide Ocitocina (Oxitocina) Contracia musculaturii netede a uterului

Ejecia laptelui
Vasopresina Hormon antidiuretic
Bradikinina Aciune vasodilatatoare
Decapeptide Angiotensina II Aciune hipertensiv
Controleaz secreia de aldosteron
Undecapeptide Substanta P Perceptia durerii, voma, vasodilatator
Polipeptide MSH 13 aa Stimuleaz sinteza/dispersia melaninei
(h. melanocitostimulator) Hormon hiperglicemiant
Glucagon (29 aa) Hormon hipocalcemiant, saietate
Calcitonin (32 aa) Hormon hipoglicemiant
Insulin (51 aa) Relaxare muchi netezi tub digestiv
Peptid vasoactiv intestinal (28aa) Stimuleaz secreia de ap n bil, bicarbonat n
sucul pancreatic, inhib secretia acid gastric

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

11
 10/24/2016

Exemple de peptide cu activitate biologic

Peptida Denumire Funcia biologic

Polipeptide Gastrine (cca. 17 aa) Stimuleaz secreia HCl i pepsinei n celulele
parietale din stomac, secreia pancreatic

Endoteline (cca 21 aa) Aciune vasoconstrictoare

Secretina (27aa) Stimuleaz irigarea pancreasului, secreia de

ap i bicarbonat

Grelina (28 aa) Hormon orexigen circulant

Colecistokinine (CCK33, CCK39) Stimuleaz contracia vezicii biliare,

fluxul biliar, secreia pancreatic de
amilaz i secreia de enzime n intestin
Polipeptida pancreatic (36 aa) Inhib secreia de insulin, bicarbonat i
enzime n pancreas

Neuropeptida Y (36 aa) Neuromediator orexigen

Amilina (37 aa) Aciune sinergic insulinei,n metabolism osos

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Proteine produi de condensare a aminoacizilor, neramificai

Lungime lan polipeptidic - 100 - 1800 aminoacizi (miozina)
Masa medie - peste 10 kDa
- aproximativ 31,7 KDa (pentru aproximativ 280 aa)
Nr. lanuri polipeptidice - monomerice
multimerice - protomer, nr. par
- asociere necovalent
Masa molecular Numr aminoacizi Numr lanuri
(Da)
Citocrom c (uman) 13000 104 1
Ribonucleaza A (pancreas bovin) 13700 124 1
Mioglobina (inim de cal) 16890 153 1
Chimotripsina (pancreas bovin) 21600 241 3
Hemoglobina (uman) 64500 574 4
Albumina seric (uman) 68500 609 1
Hexokinaza (drojdie) 102000 972 2
Apolipoproteina B (uman) 513000 4536 1
Glutamin sintetaza (E.coli) 619000 5628 12

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

12
 10/24/2016

Procent variat de aminoacizi n diferite proteine

Aminoacid Ribonucleaz Mioglobin Colagen

Alanin 6,9 9,8 11,7

Arginin 3,7 1,7 4,9
Asparagin 7,6 2 1
Acid aspartic 4,1 5 3
Acid glutamic 4,2 8,7 4,5
Cistein 6,7 0 0
Fenilalanin 2,4 4,6 1,2
Glutamin 6,5 3,5 2,6
Glicocol 3,7 9 32,7
Histidin 3,7 7 0,3
Izoleucin 3,1 5,1 0,8
Leucin 1,7 11,6 2,1
Lisin 7,7 13 3,6
Metionin 3,7 1,5 0,7
Prolin 4,5 2,5 22,5
Serin 12,2 3,9 3,8
Tirozin 4 1,3 0,5
Treonin 6,7 3,5 1,5
Triptofan 0 1,3 0
Valin 7,1 4,8 1,7
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Criterii de clasificare: compoziie, solubilitate, form spaial

funcii biologice, origine
Holoproteine albumina, protamine, histone, chimotripsina
Heteroproteine proteine conjugate aa + grupa prostetica
glicoproteine lant oligoglucidic - imunoglobuline
lipoproteine lipide - beta-lipoproteina
cromoproteine hem - hemoglobina, mioglobina
nucleoproteine acizi nucleici - ribonucleoproteine
metaloproteine metale - ceruloplasmina, feritina
fosfoproteine - caseina
P. globulare - solubile in ap P. fibrilare - insolubile in ap
Albumin seric Keratine
Globuline Actina
Histone Colagen
Protamine Elastina
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

13
 10/24/2016

Caracteristicile proteinelor fibrilare:

lanuri polipeptidice cu secvene proteice regulate
insolubile n ap i soluii diluate de electrolii
rol structural
rol de protecie mecanic i rezisten
rol n contracia muscular motoare celulare

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Caracteristicile proteinelor globulare:

structuri dinamice
forma aproape sferic
solubile n ap i n soluii diluate de electrolii
funcii biologice variate
Funcie biologic Exemple
Enzime Tripsina, chimotripsina, lizozim, alcool
dehidrogenaza
Transportori Albumina seric, globuline (transferina)

Hormoni TSH, insulin, parathormon

Proteine de rezerv Faseolin, zein, ovalbumin

Proteine ce leag O2 Mioglobin, hemoglobin

Imunologic Imunoglobuline, proteine din venin
Factori de coagulare Trombin
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

14
 10/24/2016

Nivele de organizare structural

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Structura primar
numr, natur, ordine aminoacizi n lan polipeptidic
legatur peptidic
Importana cunoaterii
omologia de secven proteic
gradul de varietate structural
caracterizarea unei proteine anormale Ribonucleaza
Ex. formarea de hemoglobine anormale n talasemii
Substituire conservativ i neconservativ n Hb
Hb anormal Aa. normal Aa. substitut
Modificri n catena
Torino Fenilalanin 43 Valin
M-Boston Histidin 58 Tirozin
Tarrant Acid aspartic 126 Asparagin
G-Georgia Prolin 95 Leucin
Modificri n catena
S Acid glutamic 6 Valin
Genova Leucin 28 Prolin
Zurich Histidin 63 Arginin
M-Milwakee Valin 67 Acid glutamic
Hiroshima Histidin 146 Acid aspartic
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

15
 10/24/2016

Structura spaial str. secundar legtura de H

Model alfa-helix

Model n foaie pliat

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Structura spaial - structura secundar

Proteina % -helix
Mioglobina 78 %
Hemoglobina 76 %
Ovalbumina 31 %
Chimotripsina 16 %

Mb

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

16
 10/24/2016

Structura spaial - structur suprasecundar

Modele de legare de ADN

Model helix-loop-helix

- Factori de transcriptie
- Importante pentru dezvoltare
- Neurogeneza
- Miogeneza
- Hematopoeza

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Structura spaial - structura teriar

- plierea proteinelor n spaiu structura nativ

legtura disulfuric

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

17
 10/24/2016

1. Proteine ce asist procesul de pliere (chaperonele moleculare)

2. Enzime ce catalizeaz reacii de izomerizare
1. Chaperonele - reacioneaz cu polipeptide parial/impropriu pliate
- asigur condiiile necesare plierii, doua clase:

a. Proteinele de oc termic (heat shock protein, Hsp)

- mas de 70 kDa (Hsp70)
- abund n celulele aflate n condiii de stres termic
- se leag la zone bogate n Rh, previn agregarea incorect
- blocheaz plierea unor proteine ce trebuie s fie transportate
prin membrane (proteine din mitocondrii, cloroplaste)
- legarea Hsp 70 la proteine se face cu consum de ATP
b. Chaperonine (Hsp60) - complexe cu masa 60 kDa pt.pliere
(folding) proteine ce nu se pliaz spontan
2. Dou sisteme enzimatice - reacii de izomerizare:
Izomerazele disulfurice - formarea S-S- din conformaia nativ
Peptid-prolil cis-trans izomeraze

Boli prionice sinteza de prioni defecte de pliere

Encefalopatia spongiform
Boala Creutzfeldt-Jacobs
Maladia Alzheimer

Normal

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM Prion (+)

18
 10/24/2016

Structura spaial - structura cuaternar

Legturi caracteristice legturi de H intercatenare
legturi ionice
interacii hidrofobe

Motive pentru agregarea ca multimeri nr. par de monomeri:

Stabilitatea - raport suprafa-volum mai mic dc. raza crete
- interaciuni mai puine
Economia i eficiena genetic - cantitate mai mic de ADN pentru a codifica un
monomer, erori genetice mai mici
Asocierea situsurilor catalitice - prin contribuia mai multor monomeri
Cooperativitatea - mai multe situsuri de legare ligand
cooperativitate pozitiv/negativ
rol n reglare procese biochimice
Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Proprietile proteinelor

a. Solubilitatea

proteine globulare
influentata de electroliti (sruri)
salting in
- salting out
modificarea pH-ului precipitare
Aplicaie - fracionarea proteinelor
din medii biologice

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

19
 10/24/2016

b. Denaturarea

proteina nativa proteina denaturata

consecinele denaturarii
a) diminuarea solubilitii cu precipitarea proteinei
b) creterea numrului de grupe SH libere datorit ruperii S-S-
(puni disulfurice)
c) modificarea vscozitii i a presiunii osmotice
d) creterea susceptibilitii la hidroliz
e) pierderea activitii biologice

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

c. Proprietatile electrochimice

Sarcina net a unei proteine depinde de pH-ul mediului

n care este dizolvat
pI pH la care sarcinile pozitive compenseaz sarcinile
negative proteina nencrcat electric
Permit caracterizarea proteinelor prin diferite metode:
electroforez
cromatografie
focalizare izoelectric
Western blotting

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

20
 10/24/2016

Focalizare izoelectric

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Cromatografie schimb ionic

Gel filtrare

Cromatografie de afinitate

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

21
 10/24/2016

Imunoblotting Western blotting separare pe baza prop.

electrochimice i imunologice

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

Catalina Pisoschi Biochimie clinic Master LCAM

22