SUBIECTE EXAMEN PRACTIC MICROBIOLOGIE – SEM 1

1. Interpretarea imaginii unui frotiu efectuat din cultura bacteriana sau

produs patologic

- cultura pura/ produs patologic

- tip de coloratie

- forma

- mod de distribuire

2. Etapele efectuarii frotiului

• produs patologic

• bulion

• colonie bacteriana

I. Intinderea frotiului pe lama curata, degresata, se pune cu ansa o picatura de ser fiziologic in care se
descarca produsul/ colonia bacteriana recoltate cu ansa sterila, se omogenizeaza foarte bine. Daca
se face frotiu din bulion nu este necesara picatura de ser fiziologic.

II. Uscarea la temperatura camerei (aspect de pelicula foarte fina si subtire).

III. Fixarea - la cald - trecerea lamei cu partea opusa celei pe care se gaseste frotiul pe deasupra
flacarii becului de gaze de 2 , 3 ori (5-6 sec). Are loc aderarea preparatului la suprafata lamei,
concomitent cu coagularea proteinelor, dar cu pastrarea structurii celulare a microorganismului
studiat, cresterea afinitatii pentru coloranti.

3. Coloratia Gram: timpi, interpretare , exemple

- se acopera lama cu violet de gentiana (proaspat filtrat, fara precipitate), 1-2 min
- se indeparteaza colorantul si lama se acopera cu lugol ( mordant = fixator) 3min
- se indeparteaza lugolul, se picura alcool acetona ( 3 parti alcool 960 si o parte acetona) 7 sec
- se acopera lama cu fuxina diluata extemporaneu 1/10 - 2 min
- se spala frotiul cu apa de la robinet si se usuca

!!! se formeaza complexe insolubile cu ARN celular, de culoare violet. Diferenţa dintre bacteriile
Gram pozitive şi Gram negative constă în diferenţa de permeabilitate a peretelui celular pentru
aceste complexe (datorita structurii sale diferite la Gram pozitive/negative). Membrana peretelui
extern al bacteriilor gram negative permite decolorarea cu alcool-acetonă. Bacteriile Gram pozitive
păstrează complexele violet pe când cele Gram negative le pierd, devenind incolore(bacteriile Gram
pozitive păstrează complexele violet numai dacă structura peretelui este intact).
Bacterii gram pozitive:
- Coci: Staphylococcus, Streptococcus
- Bacili: Corynebacterium, Bacillus, Clostridium

Bacterii gram negative:

- Coci: Neisseria
- Bacili: E. coli, Vibrio, Pseudomonas

4. Coloratia Albastru de metilen , timpi,

interpretare , exemple
- Albastru de metilen 3-4 minute
- Spalare cu apa de la robinet
- Uscare la temperature camerei sau prin tamponare cu
hartie de filtru
Din prod. patol -> morfologia si dispunerea bacteriana
Bacteriile capsulate-> halou necolorat

Exemple: Neisseria gonorrhoeae

5. Coloratia Ziehl Neelesen , timpi, interpretare , exemple

- Se acopera suprafata lamei cu fuxina fenicata Ziehl, se incalzeste lama prin trecerea flacarii becului
de gaz pe sub lama aflata pe un suport, pana la emiterea de
vapori se repetă procedura de 2, 3 ori (intr-un interval de 5
minute)
- Se spala lama cu apa de la robinet
- Se. acopera lama cu amestec de 3 parti acid clorhidric si 97
parti alcool de 760 1 minut
- Se spala lama cu apa de la robinet
- Recolorare cu albastru de metilen 1 minut
- Se spala lama cu apa de la robinet

Exemple: Mycobacterium tuberculosis sp. hominis (B. Koch)

6. Tehnica recoltarii produselor patologice: exsudatului faringian, urina, LCR,

materii fecale, secretie conjunctivala
 Exsudat faringian
Prelevarea se face de dimineata, inainte de a consuma alimente sau lichide, deoarece acestea sterg
agentii patogeni existenti pe suprafata amigdalelor si/sau mucoasei faringiene. Este important sa nu
se efectueze igiena orala in dimineata recoltarii deoarece pasta de dinti contine substante
antibacteriene ce modifica flora microbiana orala. In caz contrar, recoltarea se va face la 3-4 ore
dupa ultima masa sau dupa ultimul periaj dentar.
Pacientul va trebui sa incline capul pe spate sis a deschida gura pe cat de mult posibil. Se deprima
baza limbii cu apasatorul. Cu ajutorul unui tampon steril se vor preleva prin miscari rotative secretii
de la nivelul partii posterioare a faringelui, din jurul amigdalelor si de la nivelul oricarei zone
inflamate a cavitatii bucale. Se introduce tamponul in tubul protector simplu/ prevazut cu mediu de
transport (Stuart) si se eticheteaza corespunzator.

 Urina
Pacientul trebuie sa aiba realizata toaleta de dimineata. Din prima urina din zi, acesta va urina o
cantitate mica in toaleta si va colecta in recipientul primit de la laborator urina din jetul mijlociu, atat
pentru SUMARUL DE URINA, cat si pentru UROCULTURA. Pentru urocultura se foloseste un recipient
care se deschide doar in momentul recoltarii probei. Se va evita atingerea recipientului in interior
sau de zona genitala. Se transporta in maxim 2 ore de la recoltare deoarece urina este un mediu de
cultura foarte bun pentru bacterii si astfel se poate modifica raportul intre bacteria care a produs
infectia si restul microorganismelor prezente.

 LCR
Pacientul este asezat in decubit lateral curbat (pozitie fetala) cu coapsele, genunchii si barbia flectate
spre piept pentru a deschide spatiile interlaminare. Se poate folosi o perna pentru a sustine capul.
Se toaleteaza planul tegumentare cu antiseptic în 3 rânduri, precum şi policele stâng al medicului;
acesta va repera spaţiul interspinos ales pentru puncţie intre vertebrele lombare L3/L4, L4/L5 sau
L5/S1. Se face anestezie locală la nivelul locului de puncţie.
Se realizeaza infiltrarea plan cu plan; patrunderea se face cu acul cu mandren perpendicular pe linia
mediana,in mijlocul spatiului interspinos. Introducerea acului se va face progresiv in ligamentul
interspinos, ligamentele galbene şi duramater, însoţită de retragerea periodică a mandrenului
pentru a verifica poziţia acului; penetrarea ligamentului galben şi a durei mater conferă medicului
senzaţia de diminuare a rezistenţei la avansarea acului.
Scoaterea mandrenului, observând scurgerea primelor picături de LCR pe ac; recoltarea de LCR se va
face în eprubete sterile. Retragerea bruscă a acului la finalul puncţiei si masarea locului de puncţie cu
un tampon cu antiseptic. Daca lichidul este tulbure, purulent ni se poate indica o infectie bacteriana
(ex. Meningococ = Neisseria meningitides), iar daca lichidul este clar poate fi vorba despre o infectie
cu mycobacterium tuberculosis. Meningococcus trebuie transportat la 37 grade, iar mediul
preincalzit la termostat la aceeasi temperatura.

 Materii fecale
Materiile fecale se recoltează în recipiente speciale (coprorecoltoare) care conţin un mediu de
transport (Carry-Blair). Recoltarea se face din proba emisă spontan. Se alege o porţiune
reprezentativă (cu mucozităţi, striuri de sânge, consistenţă mai moale, etc) şi se ia o cantitate cât
încape în linguriţa coprorecoltorului. Materiile fecale astfel recoltate se introduc în mediul de
transport conţinut de coprorecoltor şi se amestecă cu acesta pentru a se asigura viabilitatea
microbilor până la prelucrarea probei.

 Secretie conjunctivala
Recoltarea se face cu un tampon steril imbibat in ser fiziologic, de unica folosinta, cu pozitionarea
pacientului cu gatul in usoara extensie, cu ochiul deschis, dupa care se sterge mucoasa de la nivelul
unghiului intern al ochiului, cu colecterea secretiilor de la nivelul sacului lacrimal, fara a atinge
tegumentul. Se introduce apoi in tubul protector si se trimite la laborator.

7. Tehnici de insamantare pe medii de cultura solide, lichide

Medii de cultura solide – placi petri
METODA PENTAGONULUI DESCHIS
-se descarca produsul patologic cu ansa/ tampon pe mediul de cultura , dupa care cu ansa
bacteriologica sterila, se descrie prima latura a pentagonului prin trasarea unor linii subțiri ( striuri )
de insămanțare, paralele astfel încat produsul să se intinda pe suprafața mediului ( a se evita
patrunderea ansei în profunzimea mediului)
- se inchide placa Petri , se sterilizeaza ansa
- se deschide placa Petri , se raceste bucla ansei intr-o zonă a mediului curate
- se descrie a doua latură a pentagonului pornind de la latura inițiala
- se repetă procedura pană cand se ajunge la ultima latura a pentagonului care nu trebuie sa se
uneasca cu prima latura

METODA
ALTERNATIVA

In cazul UROCULTURII – insamantare sub forma de BRADUT

Se traseaza pe mijlocul mediului de cultura o linie verticala si
apoi se descriu niste striuri de sus pana jos.
Urocultura – cantitativa – are ca scop determinarea
numarului de UFC/mL urina care sa ne ajute in stabilirea
prezentei sau nu a unei infectii urinare (> 10 5 UFC/mL urina =
infectie urinara).
  Medii de cultura lichide
- Tuburi cu dop de vata / capac cu filet
- Gatul eprubetei se flambeaza dupa deschidere si inainte de inchidere – prevenirea
contaminarii
Se inclina tubul cu mediu lichid la 45 grade si se depune produsul de insamantat la
interfata dintre lichid si peretele eprubetei astfel incat atunci cand tubul revine la
pozitia inițiala, produsul insamantat se afla in mediul de cultura. Ansa incarcata se
mai poate descarca direct in mediul lichid.

 Medii de cultura semisolide – TSI, Simmonds- identificarea enterobacteriilor -> medii drepte
semisolide, medii cu o portiune dreapta si o portiune inclinata sau medii semiinclinate
I. TSI – mediu cu o portiune dreapta si o portiune inclinata
- se inteapa portiunea drepta si pe portiunea inclinata se descriu niste striuri
II. Koser’s citrate medium (Simmonds) – mediu semiinclinat
-la baza eprubetei avem o picatura de condensare de lichid in care se descarca ansa incarcata cu
produs patologic si ulterior se descriu niste striuri pe portiunea inclinata
III. portiune dreapta – mediul se inteapa pur si simplu

8. Tipuri de medii de cultura

Clasificarea mediilor de cultura ( artificiale) :
• dupa starea de agregare: lichide (bulion)
solide (geloza)
semisolide(gelatina)
• dupa complexitatea ingredientelor : medii naturale(lapte, bila)
medii artificiale(geloza, bulion)
medii mixte(geloza-sange)
• dupa sursa ingredientelor : medii cu proteine animale(bulion sange)
medii cu proteine vegetale(cartof, soia)
medii sintetice si semisintetice( Lodder)
• dupa complexitatea ingredientelor: medii complexe- electiv(Loeffler)
selectiv(Loewenstain)
de imbogatire(Muller- Kauffman)
diferential(AABTL)
• dupa scopul urmarit prin utilizarea lor: medii de transport(Carry- Blair, Stuart)
medii de izolare(electiv, selectiv, de diferentiere)
medii de identificare (TSI, MIU)
medii de conservare(Loewenstein)
• dupa continutul in apa: normale (umiditate obisnuita)
uscate (deshidratate) in scopul conservarii

Mediul Electiv: contine ingrediente ce convin cel mai bine dezvoltarii precoce a unei bacterii, fara a
inhiba cresterea altori specii bacteriene.
Ex: m. Loeffler(contine ser coagulat de bou si bulion glucozat) - pentru bacilul difteric; permite
cresterea in 8-12 ore a acestuia (celelalte bacterii cresc dupa 18-24 ore de incubare)
Mediul Selectiv: contine substante bacteriostatice ce inhiba dezvoltarea unei populatii microbiene
favorizand dezvoltarea unei anumite specii (BK)
Ex: m.Loewenstein: prin verdele malachit inhiba flora de asociatie; contine saruri minerale, amidon,
ou, glicerina
!! mediile lactozate sunt folosite pentru dezvoltarea bacililor ( nu cresc cocii)

Cele mai simple medii de cultura lichide : bulionul (macerat de carne de vita, peptonă și 0,5% NaCl) +
apa peptonata

Mediul de imbogatire: functioneaza concomitent si ca mediu selectiv si ca mediu electiv.

Ex: m.Chapman solid - clorura de sodiu, manita, rosu fenol – permite diferentierea S. Aureus
(fermenteaza manita din mediu, coloniile si mediul devin galbene) de S.epidermidis (nu
fermenteaza).

Mediul diferential: mediu solid ce contine unele substraturi (sange, zaharuri, indicatori de ph,) care
sub actiunea echipamentului enzimatic bacterian, pot fi sau nu modificate vizibil.
Ex: AABTL(agar, albastru de brom timol ,lactoza) pentru Enterobacterii: diferentiaza bacteriile
lactozo pozitive(se modifica pH-ul mediului -> se modifica culoarea mediului) de cele lactozo
negative

Mediul geloza-sange diferentiaza bacteriile hemolitice de cele

nehemolitice (evidentierea producerii de hemolizine):
-hemolizina: hemoliza de culoare verzuie din jurul coloniilor datorită
degradării parțiale a hematiilor (Streptococcus pneumoniae, streptococi
viridans)
β-hemolizina: zona clară de hemoliză în jurul coloniilor, datorită lizei
complete a hematiilor (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes)
-hemolizina: absența hemolizei (streptococii nehemolitici).

9. Tipuri de creștere bacteriană pe medii de cultura lichide, solide

In mediile lichide cresterea bacteriana este caracterizata de aparitia/ lipsa unei turbiditati a mediului
dupa 18-20h de incubare la termostat (37 grade C). Aspectul turbiditatii poate fi:
• omogen, crestere de tip S(smooth) -> crestere pentru tulpini tinere, virulente ce disperseaza rapid
si uniform (ex: Staphylococcus);
• mediul ramane limpede cu depozit grunjos pe pereti sau la fundul eprubetei, caracterizeaza
cresterea de tip R (rough) a tulpinilor avirulente, imbatranite, degradate antigenic; in anumite
situatii apare si o membrana groasa plisata la suprafata mediului ramas limpede -> caracteristica
unei tulpini virulente (Mycobacterium tuberculosis).
Cresterea bacteriana poate evidentia si propietatea pigmentoasa cu aparitia unui pigment
extracelular ce coloreaza mediul (Pseudomonas aeruginosa – pigment verde albastrui) dar si aparitia
unui miros characteristic (miros aromat).

Cresterea pe mediile solide poate fi:

• tip S (smooth neted) – suprafata neteda, lucioasa, margini regulate, consistent untoasa – tulpini
tinere, virulente
• tip R (rough aspru) – suprafata rugoasa, aspra, uscata, margini crenelate, sunt colonii friabile – in
general tulpini avirulente, dar exista si exceptii de tulpini virulente (Corynebacterium diphteriae,
Mycobacterium tuberculosis, Bacilus antracis)

• tip M (mucoid) – cresterea bacteriilor cu capsula, suprafata coloniei este neteda, mucoasa, colonia
seaman cu o picatura de miere, consistent vascoasa, coloniile au tendinta de a conflua (Klebsiella
pneumoniae)

• tip G - colonii pitice – rezulta in urma actiunii antibioticelor asupra germenilor care in mod normal
sunt responsabili de aparitia coloniilor mari

Aspecte particulare ale cresterii pe medii solide:

• fenomenul de catarare – Proteus – enterobacterie cu cili peritrihi care permite cresterea pe geloza
inclinata sub forma de valuri suprapuse
• cresterea cu aspect de cap de medusa pe geloza simpla ptr
B.Anthracis
 10. Identificare bacteriana - interpretarea unei baterii de
teste biochimice ( mediile TSI, MIU, Simmons)
• Mediul TSI (glucoza, lactoza , rosu fenol citrat feric)
Neinsamantat: In portiunea dreapta : glucoza/ zaharoza
In portiunea inclinata: lactoza
Dupa insamantare si termostatare:
- o bază galbenă indică fermentarea glucozei (modif. pH)
- coloana inclinata = roz -> bacterii lactozo negative
- coloana inclinata = galbena -> bacterii lactozo pozitive
- bulele din mediu arată producția de gaz din glucoză
- înnegrirea mediului indică producția de hidrogen sulfurat

• Mediul MIU (Mobilitate Iodol Uree)

Testul Indol: Utilizat pentru a determina capacitatea unui organism de a cliva aminoacidul
triptofan în indol, amoniac și acid piruvic. Procedurile implică insamantarea unui mediu care
conține aminoacid triptofan. Dacă organismele au enzima triptofanază, îndepărtarea grupei
amino din triptofan formează indol. Indolul este ușor detectat prin adăugarea de reactivi
Kovacs și apariția culorii roșu-cireș. (mediul neinsamantat – verde)

Testul Ureazei -> indica daca enterobacteria secreta ureaza

Organismul testat este insamantat într-un bulion ce contine uree și
conține roșu de fenol, un indicator de pH și are un pH de 6,8. La acest pH
fenolul roșu are culoarea somon(mediu neinsamantat), când pH-ul crește
peste 8,1 fenol roșu capătă o culoare roz aprins (test pozitiv).

Motilitatea (pe mediu semisolid)

Bacteriile mobile “inoata” peste tot - >
mediu omogen
Bacteriile immobile cresc numai pe
traseul de insamantare

• Mediul Simmonds
Testul indica utilizarea citratului de catre enterobacterii sau de catre bacilli gram
negative ca unica sursa de carbon.
Indicatorul bromtimol se transforma din verde (mediul neinsamantat) in albastru ca
urmare a reactiei alcaline pozitive.
Rezultatele in urma testelor sunt comparate cu cele din tabel pentru a afla specia bacteriana

11.Antibiograma difuzimetrica: principiu, metoda,

interpretare
Antibiograma difuzimetrica testeaza sensibilitatea unei tulpini
isolate la diferite clase de antibiotic.
I .Se inundă suprafața mediului de cultură (geloza Muller–Hinton)
de pe placa Petri cu diametrul de 150 mm cu inoculul standardizat
(1-2x108UFC/ml).
II. Excesul este îndepărtat
III. Microcomprimatele cu antibiotic sau discurile impregnate cu
concentrații diferite de antibiotic (E-test) se depun pe mediu
IV. Placa este incubata peste noapte la termostat.
Interpretarea rezultatatelor se face măsurându-se diametrul zonei de inhibiție a creșterii din jurul
fiecărui comprimat. În funcție de dimensiunile zonei de inhibiție raportate la standardul CLSI se
interpretează ca: sensibil, intermediar sau rezistent la antibioticul respectiv. Analiza zonei de
inhibiţie a creşterii (exprimată în mm) este raportată la log2 CMI.
Daca nu apare nicio zona de inhibitie in jurul microcomprimatului bacteria este rezistenta la actiunea
acestuia. In cazul in care in aria de inhibitie a cresterii sunt vizualizate colonii, acelea sunt produsi de
multiplicare ale unor tulpini cu mutatii ce determina aparitia rezistentei.
Materiale necesare:
- Discuri cu antibiotice/ discuri de hartie de filtru cu antibioticul incorporat (E-test)
- Inocul standardizat
- Geloza Muller-Hinton.

Daca o tulpina este producatoare de beta lactamaze cu spectru extins (

actioneaza asupra antibioticelor beta lactamice si cefalosporinelor de
generatie 3 si 4) -> aspect de “gaura de cheie” / “fantoma” – apare
intre microcomprimatul de augumentin (amoxicilina + acid clavulanic)
si o cefalosporina de generatia a 3a sau a 4a.

Testul Epsilon(E test), zona de inhibiție a cresterii se incrucișează cu

gradientul antibioticului, CMI=0,25μg/ml
 12.Metode de determinare a CMI, CMB
Concentratia minima inhibitorie (CMI) = cea mai mica concentratie de antibiotic care inhiba
cresterea bacteriana.

Metoda macrodiluțiilor presupune utilizarea unei serii de cel puțin opt tuburi ce conțin 1-2ml bulion
în care se realizează diluţii binare de antibiotic.Inoculul standardizat ce contine 5x105 UFC/ml de
suspensie bacteriană este insămânţat în fiecare tub. După incubarea la 37°C, timp de 18 ore, cea mai
mică concentrație de antibiotic în care nu apare creştere bacteriană (aspect tulbure), reprezintă CMI.
Raportarea CMI se face impreuna cu raportarea calitativa a sensibilitatii la antibiotice a unei specii
bacteriene conform standardului CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute); sensibil,
intermediar, rezistent.

Metoda microdilutiilor permite determinarea CMI-urilor pentru un numar mai mare de antibiotice.
Testarea se face pe placă cu 96 de godeuri, care permite identificarea bacteriană în paralel cu
testarea CMI. Fiecare godeu este însamanțat cu inocul standard de 5x104 UFC/ml. După
incubare, citirea se poate face manual sau automat de către un fotometru care măsoară impedanța
de lumină monocromatică pentru fiecare godeu.
Cresterea bacteriana este vizualizata ca aparitia unui buton pe fundul godeului, iar in absenta
cresterii bacteriene, mediul ramane limpede.

Concentratia minima bactericida (CMB) = cea mai mica concentratie de antibiotic care omoara
bacteria.
Este determinata prin insamantarea pe mediu solid fara antibiotic ( geloza sange) + esantioanele din
tuburile pe care s-a determinat CMI unde nu a aparut cresterea bacteriana. Dupa incubarea la 37
grade C, 18-24h cea mai mica concentratie care a redus numarul de colonii cu 99,9% comparativ cu
martorul fara antibiotic reprezinta CMB.

13. Reacția de aglutinare, principiu, interpretare, exemple

Reacțiile de aglutinare sunt reacții antigen anticorp în care antigenele se află în stare corpusculară
naturală (bacterii, eritrocite) sau artificială (antigene macromoleculare legate de particule inerte –
latex).
În aglutinarea bacteriană forma aglutinatelor (agregatelor) variază în funcție de localizarea
antigenului în structura germenului. Există mai multe tipuri de aglutinare,ex. somatică de tip “O”,
flagelară de tip “H”/
Aglutinarea directă/activă – particula este purtatoare de determinanți antigenici ( hematii,leucocite)
Calitativă (pe lama) – evidențiază prezența anticorpilor din ser (ex. re. Hudelsson pentru diagnosticul
brucelozei)
Cantitativa (în tuburi) – măsoară titrul anticorpilor din serul pacientului, confirmă rezultatul
aglutinării pe lamă (ex. re. Widal pentru diagnosticul febrei tifoide cu detectarea și titrarea
anticorpilor anti Ag. O, H, Viș reacția Wright – dg. brucelozei
Aglutinare artificială: macromoleculele de antigen sunt fixate pe suprafața particulei (ex.
Eritrocitelor, latex,colesterol)
Într-o reacție pozitiva Ag-Ac, hematiile sunt aglutinate și depozitul de pe fundul unui godeu este cu
margini crenelate. Într-o reacție negativă, hematiile se depun pe fundul godeului
Coaglutinarea: este reacția în care de fragmentul Fc al IgG este legată proteina A stafilococică,
fragmentul Fab ramânând liber pentru a forma imunocomplexe cu alte antigene. În general reacția
este folosită pentru identificarea proteinei M streptococice.

14. Reacția de precipitare în gel – imunodifuzia radiala Mancini, principiu,

interpretare
Ag in forma solubila.
Imunodifuzia radială simplă (Reacția Mancini) este utilizată pentru determinarea cantitativă a IgG,
IgM, IgA, componente ale Complementului C3.
Anticorpul este incorporat în gel și antigenul ce va fi măsurat este pus într-un godeu stanțat în gelul
respective. Reacția se bazează pe difuzia spontană în gel (ce conține incorporat anticorpul
complementar antigenului de determinat) a unui component (Ag) din proba de cercetat (ser). Dupa
termostatare se măsoară diametrul cercului de precipitare format în jurul godeului în
care a fost pusă proba.
In placi de polistiren cu diametrul de 5cm se toarna gel de agar in care a fost inglobat, intr- o
cantitate optima, antiserul (Ac) corespunzator tipului de componenta proteica (Ag) pe care dorim sa
o identificam (ser anti- IgA, anti- IgM, anti- IgG,
anti- complement),
- in agar se efectueaza godeuri de 2 mm in
forma de rozeta, respectand distanta optima
intre ele
- in godeuri se introduc cate 5 μl din
preparatul proteic de identificat (seruri de
bolnav, ce contin cantitati necunoscute de Ag
corespunzator Ac inglobat in gel), cu ajutorul
unei micropipete,
- in godeul central se introduc 5 μl de ser
uman de referinta (cantitate cunoscuta dintr-
un Ag cunoscut, al carui Ac corespunzator este
inglobat in gel),
- placutele se termostateaza la 37°C timp de 24 ore pentru IgG, complement si 48 ore pentru
celelalte componente (Ig A, IgM),
- din godeuri va migra antigenul (a carui cantitate dorim s- o calculam), care va intalni anti- serul
corespunzator, inglobat in gel,
- dupa termostatare, in jurul godeurilor apar cercuri concentrice, de diametre variabile,
- se masoara diametrul zonelor de precipitare si se compara cu diametrul dat de serul standard, cu
concentratie cunoscuta, din centrul placii,
- astfel se poate stabili cantitatea de Ag (IgA, IgG, IgM sau complement), utilizand tabele intocmite
pe baza unor experimentari pe numeroase seruri, care stabilesc raportul dintre diametrul zonelor de
precipitare si cantitatea de Ig sau complemnt corespunzatoare.

15. Reacția de seroneutralizare – ASLO, principiu, interpretare

Reacția ASLO ne ajuta sa monitorizam evolutia infectiei cu Streptococul b hemolitic de grup A. Dupa
o infectie acuta cu acest streptococ, dupa un tratament de 10 zile cu acesta ar trebui ca titrul acestor
Ac sa scada. Exista riscul evolutiei spre o boala poststreptococica tardiva (-> dupa 3 saptamani de la
debutul bolii titrul Ac nu scade, ci creste.

PRINCIPIU: dozarea anticorpilor antistreptolizina O se bazeaza pe efectul neutralizant al acestora

asupra streptolizinei O (hemolizina O). Seroneutralizarea streptolizinei O (SLO) prin existenta in ser a
antistreptolizinei O, este vizualizata prin absenta hemolizei unor eritrocite – test, care constituie
substratul celular indicator. In absenta anticorpilor antistreptolizina O, streptolizina O isi exercita
efectul litic pe hematii, efect tradus prin prezenta hemolizei.

MATERIALE SI REACTIVI NECESARI:

ser de cercetat (sau seruri- pereche, recoltate la interval de 2 saptamani),
SLO liofilizata (standardizata de catre producator),
Sange defibrinat de iepure/ berbec,
Solutie salina izotona, solutie de Rivanol 0,4%,
Eprubete, pipete gradate,
Baie apa, centrifuga.

TEHNICA DE LUCRU:
* prima etapa a reactiei ASLO:
- serul de bolnav recoltat in conditii sterile, se inactiveaza 30 min la 56°C si se trateaza cu Rivanol
0,4%, pentru indepartarea inhibitorilor nespecifici,
- se efectueaza dilutia 1/ 10 a serului si se mentine 30 min la 56°C,
- se realizeaza dilutii succesive, binare, de ser si se pun in contact cu SLO (cantitate constanta, cate
0,5 mL/ tub); se agita tuburile si se mentin 15 min la 37°C (REACTIA DE NEUTRALIZARE),
* a II-a etapa a reactiei:
- se adauga suspensia de hematii (5%), cantitate fixa, 0,5 mL in fiecare tub,
- se agita pentru omogenizare si se incubeaza 45 min la 37°C plus peste noapte la 4°C,
- citire finala a doua zi.
 16. Reacția de imunofluorescență directă/ indirect
Reacții de imunofluorescență au la bază proprietatea substanțelor fluorescente (fluoresceină,
rodamină) de a se lega stabil (covalent) de molecule de anticorpi fără alterarea specificității acestora
facandu-Ie vizibile în lumina UV (la microscopul cu fluorescență) Aceasta permite evidențierea
antigenelor pentru care acești anticorpi sunt specifici
Exista două tipuri de reacții:
•IF directă când un antigen necunoscut interacționează direct cu un anticorp cunoscut marcat cu
fluoresceina
•IF indirectă când un antigen cunoscut interacționează cu anticorp necunoscut (din serul de
cercetat) și ulterior complexul format interacționează cu anticorpi anti gama globulină umană
marcați cu fluoresceină

17. Reacția ELISA , principiu, interpretare

ELISA= enzyme-linked immunosorbent assay
Acest tip de reacție este utilizat pentru determinarea cantitativă a antigenelor sau anticorpilor din
proba pacientului.
Determinarea cantității de anticorpi implică atașarea antigenului cunoscut pe o suprafață (fundul
godeului unei plăcute de plastic). Se adăugă diluții diferite din serul de cercetat, se incubează, se
spăla și se reincubează plăcuța după ce s-au adăugat anticorpi anti IgG umană marcați enzimatic.
Măsurarea activității enzimatice se face după ce s-a adăugat substratul pentru
enzimă.
Citirea se face colorimetric la spectofotometru; cantitatea de anticorpi este proporțională cu
activitatea enzimatică. Titrul anticorpilor reprezintă cea mai mare diluție de ser la care reacția este
pozitivă.
Pentru detectarea antigenică reacția respectă același principiu doar că anticorpii cunoscuți sunt cei
atașat pe fundul godeului de plastic.

18. Reactia de fixare a Complementului, principiu, interpretare, exemple

Reacția de fixare a Complementului (RFC) are la baza proprietatea C de a se lega de fragmentul Fc al
unei Ig angajate într-un imunocomplex Ag-Ac și de a se activa pe calea clasica. Utilizată în
diagnosticul serologic (sifilis - reacția Bordet-Wassermann RBW).
Complementul nu variază în procesul de imunizare, titrul său nefiind influențat de prezența
anticorpilor. Inactivarea Complementului prin încălzirea serului de cercetat, 30min la 560C nu
influențează titrul anticorpilor din ser.RFC poate fi calitativă și cantitativă și se desfasoară în două
etape:
- în prima etapă se pun în contact antigenul cunoscut cu serul de cercetat și C adus în reacție de
serul de cobai
- în a doua etapă se adăugă sistemul indicator hemolitic format din eritrocite de oaie + anticorpi anti
eritrocite de oaie
Complementul adăugat în reacție trebuie titrat (determinarea unitătii alexinice, cea mai mica
cantitate de C capabilă sa producă liza 1 ml de sistem hemolitic)

Interpretarea reacției:
- în cazul unei reacții pozitive: în prima etapa se formează imunocomplexul Ag-Ac ( deci există în
serul de cercetat anticorpi față de antigenul adăugat în reacție) și C se leagă de Ac din imunocomplex
activându-se; adăugând sistemul hemolitic în a doua etapă acesta rămâne intact , eritrocitele nu vor
fi lizate
- în cazul unei reacții negative, nu se formează imunocomplexele (în serul cercetat nu există anticorpi
față de antigenul din reacție), C rămâne liber și se leagă de anticorpul antieritrocit din
imunocomplexul sistemului hemolitic, eritrocitele vor fi lizate
În cazul RBW antigenul este cardiolipina (extrasă din cordul bovin), reacția se desfasoară în 8 tuburi
din care 6 sunt tuburi martor), primele 2 conținând diluții diferite de ser de cercetat.