1.

Material și metodă

1.1 Recoltarea exudatului faringian

Recoltarea se face cu tamponul faringian steril. Timpul optim de recoltare este fie
dimineaţa pe nemâncate, înainte de toaleta cavităţii bucale, pentru a nu diminua flora
bacteriană prin acţiunea de curăţire mecanică a mucoaselor prin toaleta cavităţii bucale
sau în timpul alimentaţiei, fie la 3-4 ore după toaleta cavităţii bucale, gargarisme cu
antiseptice sau ingestia de alimente.
Tehnica de recoltare: pacientul este aşezat cu gâtul în uşoară extensie, cavitatea
bucală deschisă la maximum, faringele bine expus prin iluminare, baza limbii (faţa
dorsală) deprimată cu o spatulă (apăsător de limbă) sterilă. Bolnavul este invitat să
pronunţe tare vocala A. Tamponul se introduce fără a atinge limba şi palatul (pentru a
nu contamina proba cu flora bucală) şi mai ales lueta (pentru a nu declanşa reflexul de
vomă). Se tamponează ferm, printr-o mişcare circulară şi se şterge suprafaţa
amigdalelor, peretele posterior al faringelui precum şi orice zonă inflamată, ulcerată sau
cu depozite purulente. Tamponul este scos cu precauţie, se reintroduce în tubul
protector şi se trimite imediat la laborator sau se introduce în mediu de transport până la
prelucrare.

1.2 Recoltarea exudatului nazal

Examenul microbiologic al exsudatului nazal (secretiei nazale)este metoda de laborator

clinic indicata in depistarea portajului de Staphylococcus aureus sau Streptococcus
pyogenes.

Prin examenul bacteriologic al exsudatului nazal se pot identifica si alti germeni:

meningococ- cu o rata de portaj de 5 – 30 %, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae, serotipul B, Corynebacterium diphtheriae si chiar enterobacterii.

Recoltarea tamponului nazal se face in mod diferentiat, in functie de scopul urmarit, de

prezenta si locul leziunii.
Astfel, pentru cercetarea starii de portaj se introduce tamponul de uz general umectat
cu solutie salina izotonica, in fosele nazale atat cat este posibil si se roteste usor pentru
a face posibila desprinderea secretiei.

Atunci cand se constata leziuni la nivelul vestibulului nazal se procedeaza la ridicarea

lobului nazal cu policele unei maini, restul palmei fiind asezat in fruntea bolnavului. In
acest fel se descopera vestibulele nazale, se indreapta fasciculul de lumina in dreptul
leziunii si se rcolteaza cu tamponul.

1.3 Recoltarea de prod din cavitatea bucală

1.4 Examenul microscopic

Examenul microscopic are un rol fundamental în microbiologie, fiind o etapă importantă
în examinarea produselor biologice. Examenul microscopic direct restrânge aria de
investigaţii, indicând modalităţile ulterioare de diagnostic microbiologic. El se poate
efectua la:

1) microscopul cu câmp luminos - la care se examinează preparatele colorate sau

preparate native,
2) microscopul cu fond întunecat - la care se examinează preparatele native, între
lamă şi lamelă, efectuate direct dintr-un produs în care se caută bacterii a căror
lăţime nu depăşeşte 0,1-0,2 µm (ca, de exemplu, evidenţierea treponemelor din
şancrul sifilitic),
3) microscopul cu contrast de fază - se foloseşte la examinarea preparatelor native
în care microorganismele şi celulele au aspect tridimensional,
4) microscopul cu lumină UV se utilizează pentru examinarea preparatelor colorate
cu substanţe fluorescente.

Prin microscopie se examinează:

1. preparate native între lamă,

2. frotiuri fixate, colorate,
3. preparate colorate cu substanţe fluorescente la microscopul cu lumină UV.
 1.5 Însămânțarea pe medii de cultură

Insamantarea produselor patologice reprezinta introducerea acestora pe medii de

cultura potrivite, pe suprafata sau in profunzime, cu scopul obtinerii de culturi
microbiene pure. Insamantarea se face in mod steril, cu ansa, tamponul de exudat sau
pipeta, folosind medii de cultura sterile si de compozitie adecvata.
Se recomanda insamantarea imediata a probelor; daca nu exista posibilitati imediate
acestea se vor pastra la 4°C.
Pentru obtinerea unor rezultate corecte trebuie sa se tina seama de anumite
reguli:
- folosirea de instrumentar steril: ansa bacteriologica, pipeta Pasteur sau gradata;
- flambarea orificiilor recipientelor (baloane, eprubete) ce contin mediile de cultura,
dopurile flacoanelor se vor tine intre degetul mic si podul palmei drepte);
- nu se vorbeste, nu se tuseste, usile si ferestrele trebuie inchise (se prefera boxe
sau camere separate) pentru a impiedica contaminarea cu flora din aer sau cavitatea
bucala a manipulatorului.

Insamantarea se face pe medii lichide si solide, primele favorizand o prima inmultire

numerica a bacteriilor. Dezavantajul lor este posibilitatea insamantarii la inceput
(insamantare primara) din materialul patologic al unui amestec bacterian nedorit. De
aceea este obligatoriu in toate cazurile ca insamantarile pe mediile lichide sa fie urmate
ulterior de insamantari pe medii solide pentru a obtine colonii izolate.

1. INSAMANTAREA IN MEDII LICHIDE

a. Cu ansa
Ansa se tine in mana dreapta. Se sterilizeaza prin incalzire la incandescenta,
utilizand becul Bunsen. Daca produsul patologic se afla intr-o ebrubeta, se scoate dopul
de vata intre degetul mic si palma miinii drepte, tinand recipientul in mana stanga. Se
flambeaza gura eprubetei, se ia din produsul patologic cu varful ansei, se flambeaza din
nou gura recipientului, se pune dopul la loc. Eprubeta cu mediu se tine in mana stanga,
usor inclinata pentru a evita riscurile contaminarii cu microorganisme din aer, se scoate
dopul, se flambeaza, se depune continutul ansei pe peretele eprubetei deasupra
mediului lichid si se omogenizeaza apoi cu acesta. Urmeaza repunerea dopului dupa
flambarea si sterilizarea ansei.

b. Cu pipeta Pasteur
Se rupe varful pipetei si se flambeaza trecand-o prin flacara. Dupa racirea
pipetei, se scoate dopul eprubetei cu produsul patologic, se flambeaza si se aspira 0,5-l
ml din produs. Continutul pipetei se introduce in eprubeta cu mediu, dupa ce s-au
respectat regulile de asepsie. Urmeaza incubarea la termostat. Pipeta folosita este pusa
in vasul cu amestec sulfocromic.

Daca se insamanteaza in anaerobioza, mediul se fierbe in baia de apa 20-30

minute, se raceste la 40-450C si se introduce continutul pipetei in mediu, avand grija sa
nu se introduca bule de aer.

2. INSAMANTAREA PE MEDII SOLIDE

In operatia de insamantare pe medii solide avem doua situatii:

a. insamantarea in suprafata: pe medii solide in pozitie inclinata si pe medii
solide turnate in placi Petri;
b. insamantarea in profunzime: pe medii solide turnate in coloana dreapta si
pe medii solide in placi Petri: metoda placii turnate si metoda intre doua
straturi.

a. Insamantarea in suprafata

Cu ansa
- Pe geloza inclinata. Se sterilizeaza ansa si dupa racire se incarca cu produsul
respectiv. Se introduce ansa aproape de fundul eprubetei cu mediu, dar deasupra
lichidului de condens si se trece usor pe suprafata mediului in zig-zag sau in linie
dreapta, fara a zgaria suprafata mediului.
- Pe geloza in placi Petri. Se inclina placa cu mediu si se depune produsul aproape de
margine. Se trag striuri paralele cu ansa, prin miscari scurte si dese pe o suprafata mica
la polul superior al mediului, fara a zgaria suprafata mediului. Apoi ansa se trece pe
suprafata mediului trasandu-se linii paralele si perpendiculare, in forma de pentagon
(regula pentagonului pentru obtinerea de colonii izolate)

Cu pipeta Pasteur
- Pe geloza inclinata. Se insamanteaza lichidul de condens al mediului cu cateva
picaturi din produsul patologic aflat in pipeta. Prin usoara agitare si inclinare a
eprubetei, lichidul se raspandeste pe toata suprafata mediului.
- Pe geloza in placi Petri. Se depune pe suprafata mediului aproximativ 1 ml din
produsul lichid si se raspandeste uniform pe toata suprafata prin inclinarea placii sau cu
pipeta Pasteur indoita. Se tine inclinata si se aspira excesul de lichid cu pipeta.
- In mediul Veillon pentru anaerobioza. Geloza Veillon se topeste pe baia de apa, se
raceste la 450C si se introduce continutul pipetei fara bule de aer. Apoi se aseaza
eprubetele in apa rece pentru solidificare rapida.
b. Insamantarea in profunzime

Insamantarea pe medii solide turnate in coloana dreapta

Se deschide eprubeta cu mediu de cultura, se rastoarna cu gura in jos, iar
insamantarea se face prin prin inteparea in profunzime a mediului, utilizand ansa fir
pentru a strapunge mediul, fara a-l deplasa (exemplu insamantarea mediului MIU).

Insamantarea pe medii solide in profunzime:

 - metoda intre doua straturi: produsul se insamanteaza pe suprafata placii
cu geloza, dupa care se toarna un alt strat subtire de geloza deasupra
zonei de descarcare a produsului;
- metoda placii turnate: in placa Petri se pune o cantitate de produs, se
toarna geloza, se amesteca si se lasa sa se solidifice. Prin aceasta
metoda se creaza conditii de semianaerobioza necesare izolarii unor
bacterii patogene (exemplu: insamantarea urinii).

1.6 Identificarea meticilinorezistenței

______________________________________________ extras

Definiția transportului persistent și tranzitoriu variază în funcție de studiu, dar, în general, este
descrisă ca o singură cultură pozitivă pe un tampon nazal (tranzitorie), comparativ cu cel puțin
două culturi pozitive consecutive într-o singură săptămână (persistentă). Colonizarea este, de
asemenea, mai frecventă în rândul copiilor mai mici, al pacienților cu HIV și diabetului (4).

Deși colonizarea predispune un individ la infecția cu S. aureus, un studiu arată că după infecția
nosocomială, indivizii colonizați au boală S. aureus mai puțin severă comparativ cu indivizii ne-
colonizați (7). Acest lucru ridică problema dacă colonizarea ar putea induce imunitate adaptivă
scăzută, astfel încât infecțiile ulterioare să devină mai blânde. În sprijinul acestei concepții, un
studiu a arătat că transportul S. aureus care conține Toxinul Sindromului de Toxic Șoc (TSST)
este asociat cu producerea și întreținerea anticorpilor la toxină (10). În schimb, majoritatea
persoanelor care dobândesc sindromul de șoc toxic Staphylococcus nu au anticorpi la TSST.

Pentru S. aureus, colonizarea nasului uman prezintă o provocare semnificativă care

necesită nu numai aderarea la celulele epiteliale nazale, ci și capacitatea de a face față apărării
gazdei și microorganismelor rezidente concurente. S. aureus aderă și invadează celulele epiteliale
gazdă folosind o varietate de molecule denumite în mod colectiv MSCRAMM (componente de
suprafață microbiale care recunoaște molecule adezive de matrice). Un număr de produse
bacteriene (inclusiv MSCRAMM) au fost sugerate a fi importante pentru adeziunea și atașarea la
celulele epiteliale nazale, dar doi factori (factorul agregat B și acidul teichoic asociat cu pereții)
au roluri dovedite până acum în colonizarea nazală a oamenilor și a șobolanilor (11, 12).